Изучение ингибирования тромбина аптамерными олигонуклеотидами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Завьялова, Елена Геннадиевна

• Завьялова, Елена Геннадиевна
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Завьялова, Елена Геннадиевна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

§ 1.1 Образование и функции тромбина в крови

Каскад свертывания крови

Методы изучения каскада свертывания крови in vitro

Коагуляция

Тест генерации тромбина

§ 1.2 Ферментативная активность тромбина

Структура а-тромбина

Низкомолекулярные субстраты тромбина

Гидролиз фибриногена тромбином

§ 1.3 Ингибиторы ферментативной активности тромбина

Классификация ингибиторов

Ингибиторьгпептидомиметики

Белковые ингибиторы тромбина

Антитромбин III

Кофактор II гепарина

Тромбомодулин

Гирудины

Ботроярацин

Гемадин

Пептидные ингибиторы тромбина

Гиругены

EGF-пентид

Бивалентные пептидные ингибиторы тромбина

Гирулоги

Модификация гирулогов

Гирунормы

Другие ингибиторы активного сайта, соединенные с

гиругеном

Вариегин

Ингибиторы по экзосайту II тромбина

Гепарин

у'-пептид

Синтетический ингибитор к экзосайту II

§ 1.4 Аптамерные олигонуклеотиды - новая парадигма

ингибиторов тромбина

15-ТВА - минимальный G-квадруплекс-фармакофор

Дуплексные элементы структуры в комбинации с

G-квадруплексным фармакофором

Соединение нескольких G-квадруплексных фармакофоров

G-квадруплекс содержащий ДНК-аптамер к экзосайту II

тромбина

Бифункциональные ДНК-аптамеры к тромбину

РНК-аптамеры к тромбину

Глава II. Экспериментальная часть

§ 2.1 Материалы

§ 2.2 Методы исследования

Разделение фибринопептидов

Идентификация фибринопептидов

Получение и очистка Е-домена фибриногена

Поверхностный плазмонный резонанс: связывание тромбина

и Е-домена фибриногена

Определение радиусов гирации фибриногена и

ассоциатов фибрина

АСМ ассоциатов фибрина

ПЭМ ассоциатов фибрина

Определение мутности раствора турбидиметрическим методом

Изучение ингибиторов тромбина турбидиметрическим методом

3

Преформирование аптамеров

Проведение экспериментов с конкурирующими лигандами

Изучение ингибирования аптамерами тромбинов животных

Изучение влияния гиругена и аптамеров на гидролиз

низкомолекулярного субстрата разными формами тромбина

Получение плазмы крови животных

Проведение коагуляционных тестов

Нормирование результатов коагуляционных тестов

для разных препаратов тромбинов

Эксперименты in vivo

Построение и моделирование кривых

Глава Ш. Результаты и их обсуждение

§ 3.1 Теоретическое моделирование гидролиза фибриногена

тромбином

Схема реакции

Выбор приближения для описания кинетики

гидролиза фибриногена

Описание кинетики гидролиза фибриногена в

квазиравновесном приближении

Моделирование образования протофибрилл и

последующего отщепления фибринопептида В

§ 3.2 Описание экспериментальных данных разработанной моделью...75 Определение констант ассоциации и диссоциации

комплекса тромбин-фибриноген

Моделирование отщепления фибринопептидов и

образования промежуточных форм фибрина

Определение степени ассоциации фибрина по

динамическому светорассеянию

§ 3.3 Моделирование турбидиметрической кривой

Светорассеяние

Геометрия фибрина и его ассоциатов

4

Определение связи между оптической плотностью

раствора и геометрией ассоциатов фибрина

§ 3.4 Определение связи между кинетикой гидролиза

фибриногена и формой турбидиметрической кривой

Исследование ассоциатов фибрина

Параметризация турбидиметрической кривой

Определение констант и типа ингибирования

§ 3.5 Изучение турбидиметрическим методом ингибиторов

тромбина, охарактеризованных другими методами

Ингибиторы активного сайта тромбина

Ингибиторы экзосайта I тромбина

Ингибиторы активного сайта и экзосайта I тромбина

Ингибиторы экзосайта II тромбина

Ингибиторы активного сайта и экзосайта II тромбина

Ингибиторы ассоциации фибрина

Сравнение результатов с данными, опубликованными ранее

§ 3.6 Изучение турбидиметрическим методом аптамерных

олигонуклеотидов к тромбину

Аптамеры с известным сайтом связывания

Аптамеры с G-квадруплексом и дополнительными

элементами вторичной структуры

Моделирование комплексов 31-ТВА и RA-36 с тромбином

Подбор условий преформирования G-квадруплекс

содержащих аптамеров

Изучение влияния дополнительных структурных элементов на ингибируюшую активность G-квадруплекс

содержащих аптамеров

Определение констант связывания ДНК-аптамеров

с протромбином

Изучение видоспецифичности G-квадруплекс

содержащих аптамеров турбидиметрическим методом

5

Выравнивание первичных структур тромбинов

человека и животных

§ 3.7 Изучение ДНК-аптамеров к тромбину в биологических

жидкостях in vitro и in vivo

Изучение видоспецифичности G-квадруплекс содержащих

аптамеров в коагуляционных тестах

Изучение ингибирующей активности RA-36 in vivo

Изучение действия антидота к RA-36

§ 3.8 Изучение влияния ДНК-аптамеров на гидролиз

тромбином низкомолекулярных субстратов

Конкуренция ДНК-аптамеров с гиругеном в

ингибировании тромбина

Исследование влияния ДНК-аптамеров и гиру гена на

гидролиз низкомолекулярного субстрата тромбина

Конформация тромбина в комплексах с ингибиторами

Выводы

Благодарности

Литература

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM атомнсгсиловая микроскопия

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ дитиотреитол

КД круговой дихроизм

о.е. оптические единицы

осч особо чистый

ПЭМ просвечивающая электронная микроскопия

РНК рибонуклеиновая кислота

РСА рентгеноструктурный анализ

чда чистый для анализа

ЯМР ядерный магнитный резонанс

FpA и FpB фибринопептиды А и В G-квадруплекс гуаниновый квадруплекс IU international units (международные единицы

активности)

MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization (матрично-

активированная лазерная десорбция/ионизация) HMDS гексаметилдисилазан

РРАСК ^-Р11е)РгоА^-хлорметилкетон

SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential

Enrichment (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) ТВА thrombin-binding aptamer (тромбин-связывающий

аптамер)

TOF time of flight (времяпролетный)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение ингибирования тромбина аптамерными олигонуклеотидами»

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин - ключевая пептидаза каскада свертывания крови, катализирующая гидролиз фибриногена до фибрина. Фибрин ассоциирует в фибриновые нити - каркас тромба. Избыточное тромбообразование приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям с высокой смертностью и инвалидизацией, что обуславливает неугасающий интерес к антитромботическим препаратам, в частности, к ингибиторам тромбина.

Для клинического применения одобрены ингибиторы тромбина разной природы: полисахариды (гепарины), белки (гирудин, антитромбин III, бивалирудин) и пептидомиметики (аргатробан, дабигатран). Они обладают рядом недостатков: гепарин вызывает геморрагические осложнения, а остальные не имеют «антидота», что осложняет корректировку неудачно подобранной дозы; белковые ингибиторы могут вызывать иммунный ответ.

Поиск безопасных антикоагулянтов привел к получению ингибитора тромбина на основе дезоксирибоолигонуклеотида — 15-ТВА (минимального фармакофора). Этот 15-мер образует G-квадруплексную структуру, которая связывается с фибриноген-связывающим сайтом (экзосайтом I) тромбина с кажущейся константой диссоциации 24 нМ и ингибирует свертывание крови in vitro и in vivo. Однако, клиническое применение 15-ТВА ограничено его малым временем выведения -5 минут»' повышение массы олигонуклеотидов увеличивает этот параметр. Поэтому дополнительные элементы вторичной структуры к 15-ТВА могут улучшить его свойства^ примеры более активных ингибиторов — аптамеры 31-ТВА и NU172. Низкая токсичность и иммуногенность, возможность масштабного химического синтеза и направленной модификации,

наличие «антидота» (комплементарной последовательности) - это преимущества нового поколения ингибиторов тромбина.

Поскольку гидролиз низкомолекулярных субстратов не ингибируется лигандами к экзосайтам тромбина, кинетика ингибирования аптамерами не изучена. Потому представляется актуальной разработка метода, основанного на гидролизе фибриногена, для изучения эффективности и механизма действия аптамеров. Изучение кинетики ингибирования тромбина серией аптамеров позволит выяснить роль дополнительных элементов вторичной структуры, оптимальные условия для образования G-квадруплексного фармакофора, механизмы ингибирования и исследовать действие «антидота».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель - изучение кинетики ингибирования тромбина аптамерами в сравнении с известными ингибиторами, выявление механизма и детерминант ингибирующей активности.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи•

1. Разработать метод, основанный на гидролизе фибриногена тромбином, для изучения аптамеров к тромбину.

2. Верифицировать метод на хорошо изученных ингибиторах тромбина.

3. Сравнить ДНК- и РНК-аптамеры с известными ингибиторами.

4. Выявить влияние катионов и дополнительных элементов вторичной структуры на активность фармакофора.

5. Изучить особенности ингибирования тромбина аптамерами в биологических жидкостях in vitro и in vivo.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Завьялова, Елена Геннадиевна

выводы

1. Предложен новый метод определения констант и типа ингибирования тромбина, основанный на измерении светорассеяния ассоциатов фибрина. Этим методом охарактеризованы все классы ингибиторов тромбина- не только ингибиторы активного сайта, но и ингибиторы связывания белковых субстратов - гируген и аптамерные олигонуклеотиды.

2. Впервые получены кинетические характеристики ингибирования тромбина различными аптамерами, содержащими фармакофор и дополнительные структурные элементы. Тип ингибирования определяется как сайтом связывания аптамера, так и дополнительными элементами вторичной структуры ингибиторов.

3. Согласно данным экспериментов in vitro и in vivo высокая видоспецифичность ДНК-аптамеров к тромбину человека обусловлена комбинацией G-квадруплексного фармакофора и дополнительных элементов структуры аптамеров.

4. Эффективность ингибирования и активации тромбина аптамерами определяется конформационной подвижностью как аптамера, так и тромбина.

5. Несмотря на различную химическую природу, гируген и ДНК-аптамер 15-ТВА конкурируют за связывание с тромбином по экзосайту I, ингибируют гидролиз фибриногена по одному типу и одинаково активируют гидролиз низкомолекулярного субстрата тромбина.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность научному руководителю, проф. Алексею Михайловичу Копылову за поддержку на всех этапах выполнения работы, за плодотворные дискуссии и новые идеи.

Благодарю за совместную работу по микроскопии ассоциатов фибрина группу д.ф.-м.н., проф. Яминского Игоря Владимировича, особенно к.ф.-м.н. Анну Протопопову (МГУ им. М.В. Ломоносова, Физический факультет).

Благодарю за проведение экспериментов на животных группу д.б.н. Павловой Галины Валериевны, особенно к.б.н. Татьяну Тимошенко и Надежду Куст (Институт биологии развития РАН).

Благодарю за помощь в проведении экспериментов на плазме крови д.б.н. Дрозд Наталью Николаевну (ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава РФ) и Очан Тамару Борисовну (Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова).

Благодарю за консультации и предоставленные модели аптамеров к.х.н. Головина Андрея Викторовича и к.ф.-м.н. Решетникова Романа Владимировича (МГУ им. М.В. Ломоносова, Факультет биоинженерии и биоинформатики).

Особенно хочу поблагодарить свою семью за бесценную помощь, поддержку и понимание.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Завьялова, Елена Геннадиевна, 2013 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Monroe, D. M., and M. Hoffman. 2006. What does it take to make the perfect clot? Arterioscler Thromb Vase Biol 26-41.

2. Davie, E. W. 2003. A brief historical review of the waterfall/cascade of blood coagulation. J Biol Chem 278-50819.

3. Davie, E. W., K. Fujikawa, and W. Kisiel. 1991. The coagulation cascade1 initiation, maintenance, and regulation. Biochemistry 30-10363.

4. Raber, M. N. 1990. Coagulation tests. In clinical methods: The history, physical, and laboratory examinations. 3rd edition. Ed. Walker H. K. et al.- Butterworths. pp. 739-742.

5. Mitrophanov, A. Y., and J. Reifman. 2011. Kinetic modeling sheds light on the mode of action of recombinant factor Vila on thrombin generation. Thromb Res 128:381.

6. Danforth, С. M., T. Orfeo, S. J. Everse, K. G. Mann, and К. E. Brummel-Ziedins. 2012. Defining the boundaries of normal thrombin generation: investigations into hemostasis. PLoS ONE 7-e30385.

7. Yin, E. Т., S. Wessler, and J. V. Butler. 1973. Plasma heparin: A unique, practical submicrogram sensitive assay. J Clin Lab Med 81:298.

8. Sara, L., J. Mardiguian, and M. Samama. 1990. In vitro effect on Heptest® of low molecular weight heparin fractions and preparations with various anti-IIa and anti-Xa activities. Thromb Res 57'-585.

9. Nowak, G. 2003. The ecarin clotting time, a universal method to quantify direct thrombin inhibitors. PathophysiolHaemost Thromb 33-173.

10. Castro, H. C., R. B. Zingali, M. G. Albuquerque, M. Pujol-Luz, and C. R. Rodrigues. 2004. Snake venom thrombin-like enzymes: from reptilase to now. Cell Mol Life Sci 61843.

11. Mani, H., C. Wagner, E. Lindhoff-Last. Influence of new anticoagulants on Coagulation Tests. Интернет-ресурс Siemens Healthcare:

http://www.medical.siemens.com/siemens/en_GLOBAL/gg_diag_FBAs/files /HemostasisMntcglnts_WP_Final_Single.pdf.

12. Gosselin, R. C., J. H. King, K. A. Janatpour, W. E. Dager, E. C. Larkin, and J. T. Owi. 2004. Comparing direct thrombin inhibitors using aPTT, ecarin clotting times, and thrombin inhibitor management testing. Ann Pharmacother 38-1383.

13. van Ryn, J., J. Stangier, S. Haertter, K.-H. Liesenfeld, W. Wienen, M. Feuring, A. Clemens. 2010. Dabigatran etexilate - a novel, reversible, oral direct thrombin inhibitor: Interpretation of coagulation assays and reversal of anticoagulant activity. Thromb Haemost 103-1116.

14. Castoldi, E., and J. Rosing. 2011. Thrombin generation tests. Thromb Res 127-S21.

15. Corral-Rodriguez, M. A., S. Macedo-Ribeiro, P. J. B. Pereira, and Pablo Fuentes-Prior. 2010. Leech-derived thrombin inhibitors: from structures to mechanisms to clinical applications. J Med Chem 53-3847.

16. Chandler, W. L., and M. Roshal. 2009. Optimization of plasma fluorogenic thrombin-generation assays. Am J Clin Pathol 132-169.

17. Hemker, H. C., R. Al Dieri, E. De Smedt, and S. Beguin. 2006. Thrombin generation, a function test of the haemostatic thrombotic system. Thromb Haemost 96-553.

18. Tanaka, K. A., F. Szlam, H. Y. Sun, T. Taketomi, and J. H. Levy. 2007. Thrombin generation assay and viscoelastic coagulation monitors demonstrate differences in the mode of thrombin inhibition between unfractionated heparin and bivalirudin. Anesth Analg 105-933.

19. Cristofaro, R. De, and E. De Candia. 2003. Thrombin domains: structure, function and interaction with platelet receptors. J Thromb Thrombolysis 15-151.

20. Lancellotti, S., and R. De Cristofaro. 2009. Nucleotide-derived thrombin inhibitors: a new tool for an old issue. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem 7-19.

21. Richardson, J. L., B. Kroger, W. Hoeffken, J. E. Sadler, P. Pereira, R. Huber, W. Bode, and P. Fuentes-Prior. 2000. Crystal structure of the human alpha-thrombin - haemadin complex: an exosite II-binding inhibitor. EMBO 19=5650.

22. Lord, S. T., M. M. Rooney, K.-P. Hopfner, and E. Di Cera. 1995. Binding of fibrinogen Aal-50-B-galactosidase fusion protein to thrombin stabilizes the slow form. J Biol Chem 270-24790.

23. Tsiang, M., A. K. Jain, K. E. Dunn, M. E. Rojas, L. L. Leung, and

C. S. Gibbs. 1995. Functional mapping of the surface residues of human thrombin. J Biol Chem 270:16854.

24. Grutter, M. G., J. P. Priestle, J. Rahuel, H. Grossenbacher, W. Bode, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1990. Crystal structure of the thrombin -hirudin complex^ a novel mode of serine protease inhibition. EMBO 9-2361.

25. Naski, M. C., J. W. Fenton, J. M. Maraganore, S. T. Olson, and

J. A. Shafer. 1990. The COOH-terminal domain of hirudin. An exosite-directed competitive inhibitor of the action of crthrombin on fibrinogen. J Biol Chem 265-13484.

26. Jackman, M. P., M. A. A. Parry, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1992. Intrinsic fluorescence changes and rapid kinetics of the reaction of thrombin with hirudin. J Biol Chem 267-15375.

27. Vijayalakshmi, J., K.P. Padmanabhan, K.G. Mann, and A. Tulinsky. 1994. The isomorphous structures of prethrombin2, hirugen-, and PPACK-thrombin: Changes accompanying activation and exosite binding to thrombin. Protein Sci 3=2254.

28. Jung, H., J.-Y. Kim, Y. Kim, G. Tae, Y. H. Kim, and D. Johannsmann. 2009. QCM and AFM analysis of anticoagulant activities of sulfonated polymers against fibrin formation. Langmuir 25-7032.

29. Abildgaard, U. 1968. Inhibition of the thrombin-fibrinogen reaction by heparin in the absence of cofactor. Scand JHaemat 5-432.

30. White, R., C. Rusconi, E. Scardino, A. Wolberg, J. Lawson, M. Hoffman, and B. Sullenger. 2001. Generation of species cross-reactive aptamers using "Toggle" SELEX. Mol Ther 4-567.

31. Maaroufi, R. M., M. Jozefowicz, J. Tapon-Bretaudiere, and

A.-M. Fischer. 1997. Mechanism of thrombin inhibition by antithrombin and heparin cofactor II in the presence of heparin. Biomaterials 18-203.

32. Johnson, D. J. D., T. E. Adams, W. Li, and J. A. Huntington. 2005. Crystal structure of wild-type human thrombin in the Na+-free state. Biochem J392:21.

33. Pineda, A. O., C. J. Carrell, L. A. Bush, S. Prasad, S. Caccia,

Z.-W. Chen, F. S. Mathews, and E. Di Cera. 2004. Molecular dissection of Na+-binding to thrombin. J Biol Chem 279-31842.

34. Rydel, T. J., M. Yin, K. P. Padmanabhan, D. T. Blankenship, A. D. Cardin, P. E. Correa, J. W. Fenton, and A. Tulinsky. 1994. Crystallographic structure of human ythrombin. J Biol Chem 269-22000.

35. Bukys, M. A., T. Orban, P. Y. Kim, D. O. Beck, M. E. Nesheim, and M. Kalafatis. 2006. The structural integrity of anion binding exosite I of thrombin is required and sufficient for timely cleavage and activation of factor V and factor VIII. J Biol Chem 281-18569.

36. Lai, M.-T., E. Di Cera, and J. A. Shafer. 1997. Kinetic pathway for the slow to fast transition of thrombin. Evidence of linked ligand binding at structurally distinct domains. J Biol Chem 272-30275.

37. Kroh, H. K., G. Tans, G. A. F. Nicolaes, J. Rosing, and P. E. Bock. 2007. Expression of allosteric linkage between the sodium ion binding site and exosite I of thrombin during prothrombin activation. J Biol Chem 282-16095.

38. Bush, L. A., R. W. Nelson, and E. Di Cera. 2006. Murine thrombin lacks Na+-activation- but retains high catalytic activity. J Biol Chem 281'7183.

39. Duffy, E. J., H. Angliker, B. F. le Bonniec, and S. R. Stone. 1997. Allosteric modulation of the activity of thrombin. Biochem J321:361.

40. Green, L., О. Safa, S. J. Machin, I. J. Mackie, K. Ryland, H. Cohen, and A. S. Lawrie. 2012. Development and application of an automated chromogenic thrombin generation assay that is sensitive to defects in the protein С pathway. Thromb Res 130-780.

41. Rosen, S. 2005. Chromogenic methods in coagulation diagnostics. Hamostaseologie 25-259.

42. Berkel, S. S. van, B. van der Lee, F. L. van Delft, R. Wagenvoord,

H. C. Hemker, and F. P. J. T. Rutjes. 2012. Fluorogenic peptide-based substrates for monitoring thrombin activity. Chem Med Chem 7-606.

43. Asselta, R., S. Duga, and M. L. Tenchini. 2006. The molecular basis of quantitative fibrinogen disorders. J Thromb Haemost 4-2115.

44. Brown, J. H., N. Volkmann, G. Jun, A. H. Henschen-Edman, and

C. Cohen. 2000. The crystal structure of modified bovine fibrinogen. PNAS 97Ш

45. Binnie, C. G., and S. T. Lord. 1993. The fibrinogen sequences that interact with thrombin. Blood 81-3186.

46. Mosesson, M. W. 2005. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost 3-1894.

47. Mosesson, M. W., K. R. Siebenlist, and D. A. Meh. 2001. The structure and biological features of fibrinogen and fibrin. Ann N YAcad Sci 936-11.

48. Pechik, I., J. Madrazo, M. W. Mosesson, I. Hernandez, G. L. Gilliland, and L. Medved. 2004. Crystal structure of the complex between thrombin and the central "E" region of fibrin. PNAS 101-2718.

49. Yakovlev, S., M. W. Mosesson, G. L. Gilliland, L. Medved, and

I. Pechik. 2006. Structural basis for sequential cleavage of fibrinopeptides upon fibrin assembly. Biochemistry 45-'3588.

50. Kollman, J. M., L. Pandi, M. R. Sawaya, M. Riley, and R. F. Doolittle. 2009. Crystal structure of human fibrinogen. Biochemistry 48-'3877.

51. Интернет-ресурс Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента, http://www.rlsnet.ru.

52. Интернет-ресурс The internet drug index. http7/www.rxlist.com.

53. Nutescu, E. A., and A. K Wittkowsky. 2004. Direct thrombin inhibitors for anticoagulation. Ann Pharmacother 38-99.

54. Ahrens, I., K. Peter, G. Y. H. Lip, and C. Bode 2012. Development and Clinical Applications of Novel Oral Anticoagulants. Part I. Clinically Approved Drugs. DiscovMed 13-433.

55. Ahrens, I., K. Peter, G. Y. H. Lip, and C. Bode 2012. Development and Clinical Applications of Novel Oral Anticoagulants. Part II. Drugs under clinical investigation. DiscovMed 13-445.

56. Mannucci, P. M., and M. Franchini. 2011. Old and new anticoagulant drugs^ A minireview. Annals of Medicine 43-116.

57. Mayer, G., F. Rohrbach, B. Potzsch, J. Muller. 2011. Aptamer-based modulation of blood coagulation. Hamostaseologie 31-258.

58. Markwardt, F. 2002. Historical perspective of the development of thrombin inhibitors. PathophysiolHaemost Thromb 32-15.

59. Kaplan, K. L., and C. W. Francis. 2002. Direct thrombin inhibitors. Semin Hematol 39-187.

60. Laux, V., E. Perzborn, S. Heitmeier, G. von Degenfeld, E. Dittrich-Wengenroth, A. Buchmuller, C. Gerdes, F. Misselwitz. 2009. Direct inhibitors of coagulation proteins - the end of the heparin and low-molecular-weight heparin era for anticoagulant therapy? Thromb Haemost 102-892.

61. Mousa, S. A. 2010. Novel anticoagulant therapy: principle and practice. In Anticoagulants, antiplatelets, and thrombolytics. Methods in molecular biology. Vol. 663, p. 157-179.

62. Bode, W., I. Mayr, U. Baumann, R. Huber, S. R. Stone, and

J. Hofsteenge. 1989. The refined 1.9 Â crystal structure of human a-thrombin: interaction with D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketone and significance of the Tyr-Pro-Pro-Trp insertion segment. EMBO J8-3467.

63. Bode, W., D. Turk, and A. Karshkov. 1992. The refined 1.9 À X-ray crystal structure of D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone-inhibited human a-thrombin: Structure analysis, overall structure, electrostatic properties,

detailed active-site geometry, and structure-function relationships. Protein Science 1-426.

64. Banner, D. W., and P. Hadvary. 1991. Crystallographic analysis at 3.0-A resolution of the binding to human thrombin of four active site-directed inhibitors. J Biol Chem 266-20085.

65. Kovach, I. M., P. Kelley, C. Eddy, F. Jordan, and A. Baykal. 2009. Proton bridging in the interactions of thrombin with small inhibitors. Biochemistry 48-7296.

66. Hakansson, K, A. Tulinsky, M. M. Abelman, T. A. Miller, G. P. Vlasuk, P. W. Bergum, M. S. L. Lim-Wilby, and T. K. Brunck. 1995. Crystallographic structure of a peptidyl keto acid inhibitor and human a-thrombin. Bioorg Med Chem 3:1009.

67. Hijikata-Okunomiya, A., and S. Okamoto. 1992. A strategy for a rational approach to designing synthetic selective inhibitors. Semin Thromb Hemost 18-135.

68. Nilsson, T., A. Sjoling-Ericksson, and J. Deinum. 1988. The mechanism of binding of low-molecular-weight active site inhibitors to human a-thrombin. J Enzyme Inhib 13-11.

69. Steinmetzer, T., B. Baum, A. Biela, G. Klebe, G. Nowak, and E. Bucha. 2012. Beyond heparinization: design of highly potent thrombin inhibitors suitable for surface coupling. Chem Med Chem 7-1965.

70. Figueiredo, A.C., C. C. Clement, S. Zakia, J. Gingold, M. Philipp,

P. J. B. Pereira. 2012. Rational design and characterization of d-Phe-Pro-d-Arg-derived direct thrombin inhibitors. PLoS ONE 7:e34354.

71. Sanderson, P. E. J., K. J. Cutrona, D. L. Dyer, J. A. Krueger, L. C. Kuo, S. D. Lewis, B. J. Lucas, and Y. Yan. 2003. Small, low nanomolar, noncovalent thrombin inhibitors lacking a group to fill the 'distal binding pocket'. Bioorg Med Chem Lett 13-161.

72. Ho, J. Z., T. S. Gibson, and J. E. Semple. 2002. Novel, potent noncovalent thrombin inhibitors incorporating P3-lactam scaffolds. Bioorg Med Chem Lett 12:743.

73. Simone, G. De, V. Menchise, S. Omaggio, C. Pedone, A. Scozzafava, and C. T. Supuran. 2003. Design of weakly basic thrombin inhibitors incorporating novel PI binding functions: molecular and X-ray crystallographic studies. Biochemistry 42=9013.

74. Reiner, J. E., D. V. Siev, G.-L. Araldi, J. J. Cui, J. Z. Ho, K. M. Reddy, L. Mamedova, P. H. Vu, K.-S. S. Lee, N. K. Minami, T. S. Gibson, S. M. Anderson, A. E. Bradbury, T. G. Nolan and J. E. Semple. 2002. Non-covalent thrombin inhibitors featuring P3"heterocycles with Pl-monocyclic arginine surrogates. Bioorg Med Chem Lett 12-1203.

75. Tapparelli, C., R. Metternich, C. Ehrhardt, M. Zurini, G. Claeson,

M. F. Scully, and S. R. Stone. 1993. In vitro and in vivo characterization of a neutral boron-containing thrombin inhibitor. J Biol Chem 268=4734.

76. Baum, B., L. Muley, A. Heine, M. Smolinski, D. Hangauer, and G. Klebe. 2009. Think twice: understanding the high potency of bis(phenyl)methane inhibitors of thrombin. JMol Biol 391=552.

77. Weir, M. P., S. S. Bethell, A. Cleasby, C. J. Campbell, R. J. Dennis,

C. J. Dix, H. Finch, H. Jhoti, C. J. Mooney, S. Patel, C.-M. Tang, M. Ward, A. J. Wonacott, and C. W. Wharton. 1998. Novel natural product 5,5-trans-lactone inhibitors of human a-thrombin: mechanism of action and structural studies. Biochemistry 37=6645.

78. Winquist, J., S. Geschwindner, Y. Xue, L. Gustavsson, D. Musil,

J. Deinum, and U. H. Danielson. 2013. Identification of structural-kinetic and structural-thermodynamic relationships for thrombin inhibitors. Biochemistry 52=613.

79. Dullweber, F., M. T. Stubbs, D. Musil, J. Sturzebecher, and G. Klebe. 2001. Factorising ligand affinity: a combined thermodynamic and crystallographic study of trypsin and thrombin inhibition. J Mol Biol 313=593.

80. Gustafsson, D., J.-E. Nystrom, S. Carlsson, U. Bredberg, U. Eriksson, E. Gyzander, M. Elg, T. Antonsson, K.-J. Hoffmann, A.-L. Ungell,

H. Sorensen, S. Nagard, A. Abrahamsson, and R. Bylund. 2001. The direct thrombin inhibitor melagatran and its oral prodrug H376/95: intestinal absorption properties, biochemical and pharmacodynamic effects. Thromb Res 101-171.

81. Gustafsson, D., T. Antonsson, R. Bylund, U. Eriksson, E. Gyzander,

I. Nilsson I, M. Elg, C. Mattsson, J. Deinum, S. Pehrsson, O. Karlsson, A. Nilsson, H. Sorensen. Effects of melagatran, a new low-molecular-weight thrombin inhibitor, on thrombin and fibrinolytic enzymes. Thromb Haemost 79-110.

82. Wienen, W., J.-M. Stassen, H. Priepke, U.-J. Ries, and N. Hauel. 2007. In-vitro profile and ex-vivo anticoagulant activity of the direct thrombin inhibitor dabigatran and its orally active prodrug, dabigatran etexilate. Thromb Haemost 98:155.

83. Okamoto, S., and A. Hijikata. 1981. Potent inhibition of thrombin by the newly synthesized arginine derivative No. 805. The importance of stereostructure of its hydrophobic carboxamide portion. Biochem Biopys Res Commun 101-440.

84. Kikumoto, R., Y. Tamao, T. Tezuka, S. Tonomura, H. Hara,

K. Ninomiya, A. Hijikata, and S. Okamoto. 1984. Selective inhibition of thrombin by (2R,4R)-4-MethyM-[N2-[(3-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-8-quinolinyl)sulfonyl] -1-arginyl]-2-piperidinecarboxylic acid. Biochemistry 23-85.

85. Brandstetter, H., D. Turk, H. W. Hoemen, D. Grosse, J. Sturzebecher, P. D. Martin, B. F. P. Edwards, and W. Bode. 1992. Refined 2.3 Ax-ray crystal structure of bovine thrombin complexes formed with the benzamidine and arginine-based thrombin inhibitors NAPAP, 4-TAPAP and MQPA. A starting point for improving antithrombotics. JMol Biol 226-1085.

86. Steinmetzer, T., A. Schweinitz, S. Kunzel, P. Wikstrom, J. Hauptmann, and J. Sturzebecher. 2001. Structure-activity relationships of new NAPAP-analogs. J Enzyme Inhibition Med Chem 16-241.

87. Malley, M. F., L. Tabernero, C. Y. Chang, S. L. Ohringer,

D. G. M. Roberts, J. Das, and J. S. Sack. 1996. Crystallographic determination of the structures of human a-thrombin complexed with BMS-186282 and BMS-189090. Prot Sci 5-221.

88. Law, R. H. P., Q. Zhang, S. McGowan, A. M Buckle, G. A Silverman, W. Wong, C. J. Rosado, C. G. Langendorf, R. N. Pike, P. I. Bird, and

J. C. Whisstock. 2006. An overview of the serpin superfamily. Genome Biol 7-216.

89. Rau, J. C., L. M. Beaulieu, J. A. Huntington, and F. C. Church. 2007. Serpins in thrombosis, hemostasis and fibrinolysis. J Thromb Haemost 5-102.

90. Longas, M. O., and T. H. Finlay. 1980. The covalent nature of the human antithrombin III-thrombin bond. Biochem J189-481.

91. Huntington, J. A., R. J. Read, and R. W. Carrell. 2000. Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation. Nature 407-923.

92. Tew, D. J., and S. P. Bottomley. 2001. Intrinsic fluorescence changes and rapid kinetics of proteinase deformation during serpin inhibition. FEBS Lett 494-30.

93. Mushunje, A, A. Zhou, R. W. Carrell, and J. A. Huntington. 2003. Heparin-induced substrate behavior of antithrombin Cambridge II. Blood 102:4028.

94. Danielsson, A., and I. Bjork. 1983. Properties of antithrombin-thrombin complex formed in the presence and in the absence of heparin. Biochem J 213-345.

95. Chang, W.-S. W., M. R. Wardell, D. A. Lomas, and R. W. Carrell. 1996. Probing serpin reactive-loop conformations by proteolytic cleavage. Biochem J314:647.

96. Maaroufi, R. M., M. Jozefowicz, J. Tapon-Bretaudiere, and

A.-M. Fischer. 1997. Mechanism of thrombin inhibition by antithrombin and heparin cofactor II in the presence of heparin. Biomaterials 18:203.

97. Rezaie, A. R., and S. T. Oison. 1997. Contribution of lysine 60f to Si' specificity of thrombin. Biochemistry 36:1026.

98. Holland, C. A., A. T. Henry, H. C. Whinna, F. C. Church. 2000. Effect of oligodeoxynucleotide thrombin aptamer on thrombin inhibition by heparin cofactor II and antithrombin. FEBSLett 484:87.

99. Sheehan, J. P., D. M. Tollefsen, and J. E. Sadler. 1994. Heparin cofactor II is regulated allosterically and not primarily by template effects. Studies with mutant thrombins and glycosaminoglycans. J Biol Chem 269:32747.

100. Myles, T., F. C. Church, H. C. Whinna, D. Monard, and S. R. Stone. 1998. Role of thrombin anion-binding exosite-I in the formation of thrombin-serpin complexes. J Biol Chem 273-31203.

101. Rogers, S. J., C. W. Pratt, H. C. Whinna, and F. C. Church. 1992. Role of thrombin exosites in inhibition by heparin cofactor II. J Biol Chem 267:3613.

102. Verhamme, I. M. 2012. Fluorescent reporters of thrombin, heparin cofactor II, and heparin binding in a ternary complex. Anal Biochem. 421:489.

103. Sheehan, J. P., Q. Wu, D. M. Tollefsen, and J. E. Sadler. 1993. Mutagenesis of thrombin selectively modulates inhibition by serpins heparin cofactor II and antithrombin III. Interaction with the anion-binding exosite determines heparin cofactor II specificity. J Biol Chem 268:3639.

104. Johnson, D. J. D., J. Langdown, W. Li, S. A. Luis, T. P. Baglin, and J. A. Huntington. 2006. Crystal structure of monomeric native antithrombin reveals a novel reactive center loop conformation. J Biol Chem 281-35478.

105. Li, W., D. J. D. Johnson, C. T. Esmon, and J. A. Huntington. 2004. Structure of the antithrombin-thrombin-heparin ternary complex reveals the antithrombotic mechanism of heparin. Nat Struct Mol Biol 11-'857.

106. Dementiev, A., M. Petitou, J.-M. Herbert, and P. G. W. Gettins. 2004. The ternary complex of antithrombin-anhydrothrombin-heparin reveals the basis of inhibitor specificity. Nat Struct Mol Biol 11-863.

107. Baglin, T. P., R. W. Carrell, F. C. Church, C. T. Esmon, and

J. A. Huntington. 2002. Crystal structures of native and thrombin -complexed heparin cofactor II reveal a multistep allosteric mechanism. PNAS 99-11079.

108. Fuentes-Prio, P., Y. Iwanaga, R. Huber, R. Pagila, G. Rumennik,

M. Seto, J. Morser, D. R. Light, and W. Bode. 2000. Structural basis for the anticoagulant activity of the thrombin-thrombomodulin complex. Nature 404-518.

109. Hofsteenge, J., H. Taguchi, and S. R. Stone. 1986. Effect of thrombomodulin on the kinetics of the interaction of thrombin with substrates and inhibitors. Biochem J237-243.

110. Adams, T. E., W. Li, and J. A. Hungtington. 2009. Molecular basis of thrombomodulin activation of slow thrombin. J Thromb Haemost 7^1688.

111. Baerga-Ortiz, A., A. R. Rezaie, and E. A. Komives. 2000. Electrostatic dependence of the thrombin-thrombomodulin interaction. J Mol Biol 296-651.

112. Kishida, A., M. Nakashima, N. Sakamoto, T. Serizawa, I. Maruyama, and M. Akashi. 2000. Study on complex formation between recombinant human thrombomodulin fragment and thrombin using surface plasmon resonance. Am JHematol 63-136.

113. Johnson, P. H„ P. Sze, R. Winant, P. W. Payne, and J. B. Lazar. 1989. Biochemistry and genetic engineering of hirudin. Semin Thromb Hemost 15-302.

114. Gajra, A., J. Husain, and A. Smith. 2008. Lepirudin in the management of heparin-induced thrombocytopenia. Expert Opin Drug Metab Toxicol 4-1131.

115. Nutescu, E. A., N. L. Shapiro, A. Chevalier, and A. N. Amin. 2005. A pharmacologic overview of current and emerging anticoagulants. Cleve Clin J Med 72-S2.

116. Lefevre, G., M. Duval, S. Gauron, L. J. Brookman, P. E. Rolan, T. M. Morris, A. J. Piraino, J. M. Morgan, M. Pahnisano, and P. Close. 1997. Effect of renal impairment on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of desirudin. Clin Pharmacol Ther 62-50.

117. Deitcher, S. R. 2003. Clinical utility of subcutaneous hirudins. Am J Health-SystPharm 60S27.

118. Lazar, J. B., R. C. Winant, and P. H. Johnson. 1991. Hirudin: amino-terminal residues play a major role in the interaction with thrombin. J Biol Chem 266-685.

119. Dodt, J., S. Kohler, and A. Baici. 1988. Interaction of site specific hirudin variants with a-thrombin^FEBSLett 22918.7..__

120. Winant, R. C., J. B. Lazar, and P. H. Johnson. 1991. Chemical modifications and amino acid substitutions in recombinant hirudin that increase hirudin-thrombin affinity. Biochemistry 30-1271.

121. Braun, P. J., S. Dennis, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1988. Use of site-directed mutagenesis to investigate the basis for the specificity of hirudin. Biochemistry 27-6517.

122. Heim, J., K. Takabayashi, B. Meyhack, W. Marki, and G. Pohlig. 1994. C"terminal proteolytic degradation of recombinant desulfato-hirudin and its mutants in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Eur JBiochem 226-341.

123. Liu, C. C., and P. G. Schultz. 2006. Recombinant expression of selectively sulfated proteins in Escherichia coli. Nat Biotechnol24-1436.

124. Schmitz, T., M. Rothe, and J. Dodt. 1991. Mechanism of the inhibition of a-thrombin by hirudin-derived fragments hirudin (l"47) and hirudin (45-65). Eur J Biochem 195:251.

125. Filippis, V. De, A. Vindigni, L. Altichieri, and A. Fontana. 1995. Core domain of hirudin from the leech Hirudinaria manillensischemical

synthesis, purification, and characterization of a Trp3 Analog of Fragment 1-47. Biochemistry 34-9552.

126. Betz, A., P. C. R. Hopkins, B. F. Le Bonniec, and S. R. Stone. 1994. Contribution of interactions with the core domain of hirudin to the stability of its complex with thrombin. Biochem J298:507.

127. Betz, A., J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1992. Interaction of the N-terminal region of hirudin with the active-site cleft of thrombin. Biochemistry 31-4557.

128. Myles, T., B. F. Le Bonniec, A. Betz, and S. R. Stone. 2001. Electrostatic steering and ionic tethering in the formation of thrombin-hirudin complexes^ the role of the thrombin anion-binding exosite-I. Biochemistry 40-4972.

129. Wallace, A., S. Dennis, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1989. Contribution of the N-terminal region of hirudin to its interaction with thrombin. Biochemistry 28-10079.

130. Rydel, T. J., K. G. Ravichandran, A. Tulinsky, W. Bode, R. Huber, C. Roitsch, and J. W. Fenton II. 1990. The structure of a complex of recombinant hirudin and human a-thrombin. Science 249-277.

131. Vitali, J., P. D. Martin, M. G. Malkowski, W. D. Robertson, J. B. Lazar, R. C. Winant, P. H. Johnson, and B. F. P. Edwards. 1992. The structure of

o

a complex of bovine a-thrombin and recombinant hirudin at 2.8-A resolution. J Biol Chem 267-17670.

132. Rydel, T. J., A. Tulinsky, W. Bode, and R. Huber. 1991. Refined structure of the hirudin-thrombin complex. J Mol Biol221-583.

133. Grutter, M. G., J. P. Priestie, J. Rahuel, H. Grossenbacher, W. Bode, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1990. Crystal structure of the thrombin -hirudin complex: a novel mode of serine protease inhibition. EMBOJ 9-2361.

134. Liu, C. C., E. Brustad, W. Liu, and P. G. Schultz. 2007. Crystal structure of a biosynthetic sulfo-hirudin complexed to thrombin. J Am Chem Soc 129-10648.

135. Stone, S. R., S. Dennis, and J. Hofsteenge. 1989. Quantitative evaluation of the contribution of ionic interactions to the formation of the thrombin-hirudin complex. Biochemistry 28=6857.

136. Ayala, Y. M., A. Vindigni, M. Nayal, R. S. Spolar, M. T. Record, and E. Di Cera. 1995. Thermodynamic investigation of hirudin binding to the slow and fast forms of thrombin: evidence for folding transitions in the inhibitor and protease coupled to binding. J Mol Biol253=787.

137. Garcia, R. A., D. Pantazatos, and F. J. Villarreal. 2004. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for investigating protein-ligand interactions. Assay Drug Dev Technol 2-81.

138. Stone, S. R., and J. Hofsteenge. 1986. Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin. Biochemistry 25=4622.

139. Cristofaro, R. De, J. W. Fenton, and E. Di Cera. 1992. Modulation of thrombin-hirudin interaction by specific ion effects. J Mol Biol226=263.

140. Krstenansky, J. L., T. J. Owen, M. T. Yates, and S. J. T. Mao. 1990. The C-terminal binding domain of hirullin P18 antithrombin activity and comparison to hirudin peptides. FEBS Lett 269=425.

141. Zingali, R. B., M. Jandrot-Perrus, M.-C. Guillin, and C. Bon. 1993. Bothrojaracin, a new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jararaca venom: characterization and mechanism of thrombin inhibition. Biochemistry 32=10794.

142. Arocas, V., R. B. Zingali, M.-C. Guillin, C. Bon, and M. Jandrot-Perrus. 1996. Bothrojaracin: a potent two-site-directed thrombin inhibitor. Biochemistry 35=9083.

143. Monteiro, R. Q., J. G. Raposo, A. Wisner, J. A Guimaraes, C. Bon, and R. B. Zingali. 1999. Allosteric changes of thrombin catalytic site induced by interaction of bothrojaracin with anion-binding exosites I and II. Biochem Biophys Res Commun 262=819.

144. Arocas, V., H. C. Castro, R. B. Zingali, M.-C. Guillin, M. Jandrot-Perrus, C. Bon, and A. Wisner. 1997. Molecular cloning and expression of

bothrojaracin, a potent thrombin inhibitor from snake venom. Eur J Biochem 248-550.

145. Zingali, R. B., M. S. Ferreira, M. Assafi, F. S. Frattani, and

R. Q. Monteiro. 2005. Bothrojaracin, a Bothrops jararaca snake venom-derived (pro)thrombin inhibitor, as an anti-thrombotic molecule. PathophysiolHaemost Thromb 34-160.

146. Oliveira-Carvalho, A. L., P. R. Guimaraesa, P. A. Abreu, D. L. S. Dutra, I. L. M. Junqueira-de-Azevedo, C. R. Rodrigues, P. L. Ho, H. C. Castro, and R. B. Zingali. 2008. Identification and characterization of a new member of snake venom thrombin inhibitors from Bothrops insularis using a proteomic approach. Toxicon 51-659.

147. Castro H.C., D. L. S. Dutra, A. L. Oliveira-Carvalho, and R. B. Zingali. 1998. Bothroalternin, a thrombin inhibitor from the venom of Bothrops alterna tus. Toxicon 36:1903.

148. Castro, H. C., M. Fernandes, R. B. Zingali. 1999. Identification of bothrojaracin-like proteins in snake venoms from Bothrops species and Lachesis muta. Toxicon 37-1403.

149. Strube, K.-H., B. Kroger, S. Bialojan, M. Otte, and J. Dodt. 1993. Isolation, sequence analysis, and cloning of haemadin an anticoagulant peptide from the Indian leech. J Biol Chem 268-8590.

150. Richardson, J. L., P. Fuentes-Prior, J. E. Sadler, R. Huber, and

W. Bode. 2002. Characterization of the residues involved in the human a-thrombin-haemadin complex^ an exosite II-binding inhibitor. Biochemistry 41-2535.

151. Krstenansky, J. L., and S. J. T. Mao. 1987. Antithrombin properties of C-terminus of hirudin using synthetic unsulfated N-acetyl"hirudin45 65. FEBS Lett 211-10.

152. Mao, S. J. T., M. T. Yates, T. J. Owen, and J. L. Krstenansky. 1988. Interaction of hirudin with thrombin: identification of a minimal binding domain of hirudin that inhibits clotting activity. Biochemistry 27-'8170.

153. Maraganore, J. M., B. Chao, M. L. Joseph, J. Jablonski, and K. L. Ramachandran. 1989. Anticoagulant activity of synthetic hirudin peptides. J Biol Chem 264-8692.

154. Krstenansky, J. L., T. J. Owen, M. T. Yates, and S. J. T. Mao. 1987. Anticoagulant peptides: nature of the interaction of the C-terminal region of hirudin with a noncatalytic binding site on thrombin. J Med Chem 30:1688.

155. Owen, T. J., J. L. Krstenansky, M. T. Yates, and S. J. T. Mao. 1988. N-Terminal requirements of small peptide anticoagulants based on hirudin54 65. J Med Chem 31-1009.

156. Liu, L.-W., T.-K. H. Vu, C. T. Esmon, and S. R. Coughlin. 1991. The region of the thrombin receptor resembling hirudin binds to thrombin and alters enzyme specificity. J Biol Chem 266-16977.

157. Betz, A., J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1991. Role of interactions involving C-terminal nonpolar residues of hirudin in the formation of the thrombin-hirudin complex. Biochemistry 30-9848-9853.

158. Ng, N. M.-Y., N. S. Quinsey, A. Y. Matthews, D. Kaiserman,

L. C. Wijeyewickrema, P. I. Bird, P. E. Thompson, and R. N. Pike. 2009. The effects of exosite occupancy on the substrate specificity of thrombin. Arch Biochem Biophys 489-'48.

159. Hortin, G, L., and B. L. Trimpe. 1991. Allosteric changes in thrombin's activity produced by peptides corresponding to segments of natural inhibitors and substrates. J Biol Chem 266-6866.

160. Liu, L.-W., J. Yell, A. E. Johnson, and C. T. Esmon. 1991. Proteolytic formation of either of the two prothrombin activation intermediates results in formation of a hirugen-binding site. J Biol Chem 266-23692.

161. Anderson, P. J., A. Nesset, and P. E. Bock. 2003. Effects of activation peptide bond cleavage and fragment 2 interactions on the pathway of exosite I expression during activation of human prethrombin 1 to thrombin. J Biol Chem 278:44482.

162. Anderson, P. J., A. Nesset, K. R. Dharmawardana and P. E. Bock. 2000. Characterization of proexosite I on prothrombin. J Biol Chem 275-16428.

163. Yegneswaran, S., T. K. Tiefenbrunn, J. A. Fernandez, and

P. E. Dawson. 2007. Manipulation of thrombin exosite I, by ligand-directed covalent modification. J Thromb Haemost 5-2062.

164. Stubbs, M. T., H. Oschkinat, I. Mayr, R. Huber, H. Angliker, S. R. Stone, and W. Bode. 1992. The interaction of thrombin with fibrinogen. A structural basis for its specificity. Eur JBiochem 206-187.

165. Zhang, E., and A. Tulinsky. 1997. The molecular environment of the Na+ binding site of thrombin. Biophys Chem 63-185.

166. Vitali, J., P. D. Martin, M. G. Malkowski, C. M. Olsen, P. H. Johnson, B. F. Edwards. 1996. Structure of a bovine thrombin-hirudin51"65 complex determined by a combination of molecular replacement and graphics. Incorporation of known structural information in molecular replacement. Acta Crystallogr D 52-453.

167. Skrzypczak-Jankun, E., V. E. Carperos, K. G. Ravichandran,

A. Tulinsky, M. Westbrook, and J. M. Maraganore. 1991. Structure of the hirugen and hirulog 1 complexes of a-thrombin. JMolBiol221-1379.

168. Mathews, 1.1., K. P. Padmanabhan, V. Ganesh, A. Tulinsky, M. Ishii, J. Chen, C. W. Turck, S. R. Coughlin, and J. W. Fenton. 1994. Crystallographic structures of thrombin complexed with thrombin receptor peptides* existence of expected and novel binding modes. Biochemistry 33-3266.

169. Priestle, J. P., J. Rahuel, H. Rink, M. Tones, and M. G. Grutter. 1993. Changes in interactions in complexes of hirudin derivatives and human a-thrombin due to different crystal forms. Protein Sci 2-1630.

170. Matthews, J. H., R. Krishnan, M. J. Costanzo, B. E. Maryanoff, and

A. Tulinsky. 1996. Crystal structures of thrombin with thiazole-containing inhibitors^ probes of the SI' binding site. Biophys J 71-2830.

171. Charles, R. S., J. H. Matthews, E. Zhang, and A. Tulinsky. 1999. Bound structures of novel p3-pl B-strand mimetic inhibitors of thrombin. J Med Chem 42-1376.

172. Recacha, R., M. J. Costanzo, B. E. Maryanoff, M. Carson, L. Delucas, and D. Chattopadhyay. 2000. Structure of human alpha-thrombin complexed with rwj-51438 at 1.7 A" unusual perturbation of the 60a-60i insertion loop. Acta Crystallogr D 56-1395.

173. Nardini, M., A. Pesce, M. Rizzi, E. Casale, R. Ferraccioli, G. Balliano, P. Milla, P. Ascenzi, and M. Bolognesi. 1996. Human a-thrombin inhibition by the active site titrant Na-(N,N-dimethylcarbamoyl)-cr azalysine-/rnitrophenyl ester^ a comparative kinetic and X-ray crystallographic study. JMol Biol258-851.

174. Howard, N., C. Abell, W. Blakemore, G. Chessari, M. Congreve,

S. Howard, H. Jhoti, C. W. Murray, L. C. A. Seavers, and R. L. M. van Montfort. 2006. Application of fragment screening and fragment linking to the discovery of novel thrombin inhibitors. J Med Chem 49:1346.

175. Qiu, X., M. Yin, K. P. Padmanabhan, J. L. Krstenansky, and

A. Tulinsky. 1993. Structures of thrombin complexes with a designed and a natural exosite peptide inhibitor. J Biol Chem 268-20318.

176. Mathews, 1.1., K. P. Padmanabhan, A. Tulinsky, J. E. Sadler. 1994. Structure of a nonadecapeptide of the fifth EGF domain of thrombomodulin complexed with thrombin. Biochemistry 33:13547.

177. Hrabal, R., E. A. Komives, and F. Ni. 1996. Structural resiliency of an EGF-like subdomain bound to its target protein, thrombin. Protein Sci 5-195.

178. Song, J., P. Xu, A. Koutychenko, and F. Ni. 2002. Stability of protein-bound conformations of bioactive peptides^ the folded conformation of an epidermal growth factor-like thrombomodulin fragment is similar to that recognized by thrombin. Biopolymers 65-373.

179. Hayashi, T., M. Zushi, S. Yamamoto, and K. Suzukie. 1990. Further localization of binding sites for thrombin and protein C in human thrombomodulin. J Biol Chem 265-20156.

180. Maraganore, J. M., P. Bourdon, J. Jablonski, K. L. Ramachandran, and J. W. Fenton. 1990. Design and characterization of hirulogs^ a novel class of bivalent peptide inhibitors of thrombin. Biochemistry 29-7095.

181. Witting, J. I., P. Bourdon, J. M. Maraganore, and J. W. Fenton. 1992. Hirulog-1 and -B2 thrombin specificity. Biochem J287-663.

182. Cuppiello, M., P. G. Vilardo, A. Lippi, M. Criscuoli, A. D. Corso, and U. Mura. 1996. Kinetics of human thrombin inhibition by two novel peptide inhibitors (Hirunorm IV and Hirunorm V). Biochem Pharmacol 52-1141.

183. Witting, J. I., P. Bourdon, D. V. Brezniak, J. M. Maraganore, and

J. W. Fenton. 1992. Thrombin-specific inhibition by and slow cleavage of hirulog-1. Biochem J283:737.

184. Finkle, C. D., A. S. Pierre, L. Leblond, I. Deschenes, J. DiMaio, and P. D. Winocour. 1998. BCH-2763, a novel potent parenteral thrombin inhibitor, is an effective antithrombotic agent in rodent models of arterial and venous thrombosis - comparisons with heparin, r-hirudin, hirulog, inogatran and argatroban. J Thromb Haemost 79-431.

185. Kline, T., C. Hammond, P. Bourdon, and J. M. Maraganore. 1991. Hirulog peptides with scissile bond replacements resistant to thrombin cleavage. Biochem Biophys Res Commun 177-1049.

186. Bourdon, P., J.-A. Jablonski, B. H. Chao, and J. M. Maraganore. 1991. Structure-function relationships of hirulog peptide interactions with thrombin. FEBS Lett 294:163.

187. Kelly, A. B., J. M. Maraganore, P. Bourdon, S. R. Hanson, and

L. A. Harker. 1992. Antithrombotic effects of synthetic peptides targeting various functional domains of thrombin. Proc Natl Acad Sci USA 89-6040.

188. Parry, M. A. A., J. M. Maraganore, and S. R. Stone. 1994. Kinetic mechanism for the interaction of hirulog with thrombin. Biochemistry 33-14807.

189. Krishnan, R., A. Tulinsky, G. P. Vlasuk, D. Pearson, P. Vallar,

P. Bergum, T. K. Brunck, and W. C. Ripka. 1996. Synthesis, structure, and structure-activity relationships of divalent thrombin inhibitors containing an a-keto-amide transition-state mimetic. Protein Sci 5'422.

190. Lombardi, A., F. Nastri, R. D. Morte, A. Rossi, A. De Rosa, N. Staiano, C. Pedone, and V. Pavone. 1996. Rational design of true hirudin mimetics^ synthesis and characterization of multisite-directed a-thrombin inhibitors. J Med Chem 39-2008.

191. Qiu, X., K. P. Padmanabhan, V. E. Carperos, A. Tulinsky, T. Kline, J. M. Maraganore, and J. W. Fenton. 1992. Structure of the hirulog 3 -thrombin complex and nature of the S' subsites of substrates and inhibitors. Biochemistry 31-11689.

192. Steinmetzer, T., M. Batdordshjin, F. Pineda, L. Seyfarth, A. Vogel, S. Reibmann, J. Hauptmann, and J. Sturzebecher. 2000. New bivalent thrombin inhibitors with Na(methyl)arginine at the Pl-position. Biol Chem 381-603.

193. DiMaio, J., B. Gibbs, J. Lefebvre, Y. Konishi, D. Munn, and S. Y. Yue, and W. Hornberger. 1992. Synthesis of a homologous series of ketomethylene arginyl pseudodipeptides and application to low molecular weight hirudin-like thrombin inhibitors. J Med Chem 35-3331.

194. Zdanov, A., S. Wu, J. DiMaio, Y. Konishi, Y. Li, X. Wu,

B. F. P. Edwards, P. D. Martin, and M. Cygler. 1993. Crystal structure of the complex of human a-thrombin and nonhydrolyzable bifunctional inhibitors, hirutonin-2 and hirutonin-6. Proteins 17-252.

195. Leblond, L., J. DiMaio, and P. D. Winocour. 1999. Insertion of the Asp-Ser/Phe sequence in the P9 position of hirutonin provides molecules having both antithrombin and disintegrin activity. Thromb Res 93-171.

196. Rehse, P. H., T. Steinmetzer, Y. Li, Y. Konishi, and M. Cygler. 1995. Crystal structure of a peptidyl pyridinium methyl ketone inhibitor with thrombin. Biochemistry 34:11537.

197. Cappiello, M., P. G. Vilardo, A. D. Corso, and U. Mura. 1998. Hirunorms, novel hirudin-like direct thrombin inhibitors. Gen Pharmac 30-565.

198. Lombardi, A., G. De Simone, F. Nastri, S. Galdiero, R. D. Morte,

N. Staiano, C. Pedone, M. Bolognesi, and V. Pavone. 1999. The crystal structure of a-thrombin-hirunorm IV complex reveals a novel specificity site recognition mode. Protein Sci8'91.

199. Simone, G. De, A. Lombardi, S. Galdero, F. Nastri, R. D. Morte,

N. Staiano, C. Pedone, M. Bolognesi, and V. Pavone. 1998. Hirunorms are true hirudin mimetics. The crystal structure of human a-thrombin-hirunom V complex. Protein Sci 7'-243.

200. Fethigre, J., Y. Tsuda, R. Coulombe, Y. Konishi, and M. Cygler. 1996. Crystal structure of two new bifunctional nonsubstrate type thrombin inhibitors complexed with human crthrombin. Protein Sci 5-1174.

201. Steinmetzer, T., M. Renatus, S. Kunzel, A. Eichinger, W. Bode, P. Wikstrom, J. Hauptmann, and J. Sturzebecher. 1999. Design and evaluation of novel bivalent thrombin inhibitors based on amidinophenylalanines. EurJBiochem 265-598.

202. Egner, U., G.-A. Hoyer, and W.-D. Schleuning. 1994. Rational design of hirulog-type inhibitors of thrombin. J Comp-Aid Mol Des 8-479.

203. Skordalakes, E., S. Elgendy, C. A. Goodwin, D. Green, M. F. Scully, V. V. Kakkar, J.-M. Freyssinet, G. Dodson, and J. J. Deadman. 1998. Bifunctional peptide boronate inhibitors of thrombin: crystallographic analysis of inhibition enhanced by linkage to an exosite 1 binding peptide. Biochemistry 37-14420.

204. Koh, C.Y., S. Kumar, M. Kazimirova, P. A. Nuttall,

U. P. Radhakrishnan, S. Kim, P. Jagadeeswaran, T. Imamura, J. Mizuguchi, S. Iwanaga, K. Swaminathan, and R. M. Kini. 2011. Crystal

structure of thrombin in complex with S-variegin^ insights of a novel mechanism of inhibition and design of tunable thrombin inhibitors. PLoS ONE 6-e26367.

205. Koh, C. Y., M. Kazimirova, A. Trimnell, P. Takac, M. Labuda,

P. A. Nuttall, and R. M. Kini. 2007. Variegin, a novel fast and tight binding thrombin inhibitor from the tropical bont tick. J Biol Chem 282.29101.

206. Koh, C. Y., M. Kazimirova, P. A. Nuttall, and R. M. Kini. 2009. Noncompetitive inhibitor of thrombin. ChemBioChem 10-2155.

207. Carter, W. J., E. Cama, and J. A. Huntington. 2005. Crystal structure of thrombin bound to heparin. J Biol Chem 280-2745.

208. Olson, S. T., H. R. Halvorson, and I. Bjork. 1991. Quantitative characterization of the thrombin-heparin interaction. Discrimination between specific and nonspecific binding models. J Biol Chem 266-6342.

209. Mosier, P. D., C. Krishnasamy, G. E. Kellogg, U. R. Desai. 2012. On the specificity of heparin/heparan sulfate binding to proteins. Anion-binding sites on antithrombin and thrombin are fundamentally different. PLoS ONE 7-'e48632.

210. Abildgaard, U. 1968. Inhibition of the thrombin-fibrinogen reaction by heparin in the absence of cofactor. Scand JHaemat 5-432.

211. Sato, H., A. Nakajima, and T. Shimohira. 1985. Kinetic study on the initial stage of the fibrinogen-fibrin conversion by thrombin. (IV) Effects of heparin and its analogues. Thromb Res 39-549.

212. Pospisil, C. H., A. R. Stafford, J. C. Fredenburgh, and J. I. Weitz. 2003. Evidence that both exosites on thrombin participate in its high affinity interaction with fibrin. J Biol Chem 278-21584.

213. Pineda, A. O., Z.-W. Chen, F. Marino, F. S. Mathews, M. W. Mosesson, and E. Di Cera. 2007. Crystal structure of thrombin in complex with fibrinogen y'-peptide. Biophys Chem 125-556.

214. Meh, D. A., K. R. Siebenlist, and M. W. Mosesson. 1996. Identification and characterization of the thrombin binding sites on fibrin. J Biol Chem 271:23121.

215. Fredenburgh, J. C., A. R. Stafford, B. A. Leslie, and J. I. Weitz. 2008. Bivalent binding to ya/y'" fibrin engages both exosites of thrombin and protects it from inhibition by the antithrombin-heparin complex. J Biol Chem 283-2470.

216. Lovely, R. S., M. Moaddely, and D. H. Farrell. 2003. Fibrinogen y' chain binds thrombin exosite II. J Thromb Haemost 1-124.

217. Siebenlist, K. R., M. W. Mosesson, I. Hernandez, L. A. Bush,

E. Di Cera, J. R. Shainoff, J. P. Di Orio, and L. Stojanovic. 2005. Studies on the basis for the properties of fibrin produced from fibrinogen-containing y' chains. Blood 106:2730.

218. Lancellotti, S., S. Rutella, V. De Filippis, N. Pozzi, B. Rocca, and

R. De Cristofaro. 2008. Fibrinogen-elongated y chain inhibits thrombin-induced platelet response, hindering the interaction with different receptors. J Biol Chem 283:30193.

219. Lovely, R. S., C. M. Rein, T. C. White, S. A. Jouihan, L. K. Boshkov, A. C. Bakke, O. J. McCarty, and D. H. Farrell. 2008. yA/y' fibrinogen inhibits thrombin-induced platelet aggregation. Thromb Haemost 100:837.

220. Lovely, R. S., L. K. Boshkov, U. M. Marzec, S. R. Hanson, and D. H. Farrell. 2007. Fibrinogen y! chain carboxy terminal peptide selectively inhibits the intrinsic coagulation pathway. Br J Haematol 139-494.

221. Aziz, M. H. A., P. S. Sidhu, A. Liang, J. Y. Kim, P. D. Mosier, Q. Zhou, D. H. Farrell, and U. R. Desai. 2012. Designing allosteric regulators of thrombin. Monosulfated benzofuran dimers selectively interact with Argl73 of exosite 2 to induce inhibition. J Med Chem 55:6888.

222. Sidhu, P. S., A. Liang, A. Y. Mehta, M. H. A. Aziz, Q. Zhou, and

U. R. Desai. 2011. Rational design of potent, small, synthetic allosteric inhibitors of thrombin. J Med Chem 54-5522.

223. Nimjee, S. M., C. P. Rusconi, and B. A. Sullenger. 2005. Aptamers: an emerging class of therapeutics. Annu Rev Med 56-555.

224. Keefe, A. D., S. Pai, and A. Ellington. 2010. Aptamers as therapeutics. Nat Rev Drug Discov 9-537.

225. Lee, J. F., G. M. Stovall, and A. D. Ellington. 2006. Aptamer therapeutics advance. Curr Opin Chem Biol 10'282.

226. Bouchard, P. R., R. M. Hutabarat, and K. M. Thompson. 2010. Discovery and development of therapeutic aptamers. Annu Rev Pharmacol Toxicol 50-237.

227. Keefe, A. D., and R. G. Schaub. 2008. Aptamers as candidate therapeutics for cardiovascular indications. Curr Opin Pharmacol 8-147.

228. Ahmad, K. M., Y. Xiao, and H. T. Soh. 2012. Selection is more intelligent than design: improving the affinity of a bivalent ligand through directed evolution. Nucleic Acids Res 40:11777.

229. Nitsche, A., A. Kurth, A. Dunkhorst, O. Panke, H. Sielaff, W. Junge, D. Muth, F. Scheller, W. Stocklein, C. Dahmen, G. Pauli, and A. Kage. 2007. One-step selection of Vaccinia virus-binding DNA aptamers by MonoLEX. BMC Biotech 7:48.

230. White, R., C. Rusconi, E. Scardino, A. Wolberg, J. Lawson, M. Hoffman, and B. Sullenger. 2001. Generation of species cross-reactive aptamers using "Toggle" SELEX. Mol Ther 4-567.

231. Miyachi, Y., N. Shimizu, C. Ogino, and A. Kondo. 2010. Selection of DNA aptamers using atomic force microscopy. Nucleic Acids Res 38-'e21.

232. Borbone, N., M. Bucci, G. Oliviero, E. Morelli, J. Amato, V. D'Atri, S. D'Errico, V. Vellecco, G. Cirino, G. Piccialli, C. Fattorusso, M. Varra, L. Mayol, M. Pérsico, and M. Scuotto. 2012. Investigating the role of T7 and T12 residues on the biological properties of thrombin-binding aptamer: enhancement of anticoagulant activity by a single nucleobase modification. J Med Chem 55:10716.

233. Bock, L. C., L.C. Griffin, J.A. Latheam, E.H. Vermass, and J.J. Toole. 1992. Selection of single stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355-564.

234. Macaya, R. F., P. Schultze, F. W. Smith, J. A. Roet, and J. Feigon. 1993. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. Proc Natl Acad Sci USA 90-3745.

235. Wang, K. Y., S. McCurdy, R. G. Shea, S. Swaminathan, and

P. H. Bolton. 1993. A DNA Aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA. Biochemistry 32-1899.

236. Marathias, V.M., and P. H. Bolton. 2000. Structures of the potassium-saturated, 2^1, and intermediate, VI, forms of a quadruplex DNA. Nucleic Acids Res 28-1969.

237. Schultze, P., R. F. Macaya, and J. Feigon. 1994. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(ggttggtgtggttgg). JMol Biol235-1532.

238. Mao, X., L. A. Marky, and W. H. Gmeiner. 2004. NMR structure of the thrombin-binding DNA aptamer stabilized by Sr2+. JBiomol Struct Dyn 22-25.

239. Marathias, V.M., K. Y. Wang, S. Kumar, T. Q. Pham, S. Swaminathan, and P. H. Bolton. 1996. Determination of the number and location of the manganese binding sites of DNA quadruplexes in solution by EPR and NMR in the presence and absence of thrombin. J Mol Biol 260-378.

240. Padmanabhan K., K. P. Padmanabhan, J. D. Ferrara, J.E. Sadler, and A. Tulinsky. 1993. The structure of a-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. J Biol Chem 268-17651.

241. Padmanabhan, K., and A. Tulinsky. 1996. An ambiguous structure of a DNA 15-mer thrombin complex. Acta Cryst D 52-272.

242. Krauss, I. R., A. Merlino, A. Randazzo, E. Novellino, L. Mazzarella, and F. Sica. 2012. High-resolution structures of two complexes between thrombin and thrombin-binding aptamer shed light on the role of cations in the aptamer inhibitory activity. Nucleic Acids Res 40-8119.

243. Kelly, J. A., J. Feigon, and T. O. Yeates. 1996. Reconciliation of the X-ray and NMR structures of the thrombin-binding aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). JMolBiol 256-417.

244. Cho, ML, Y. Kim, S.-Y. Han, K. Min, A. Rahman, Y.-B. Shim, and

C. Ban. 2008. Detection for folding of the thrombin binding aptamer using label-free electrochemical methods. BMB reports 41-126.

245. Reshetnikov, R. V., J. Sponer, O. I. Rassokhina, A. M. Kopylov,

P. O. Tsvetkov, A. A. Makarov, and A. V. Golovin. 2011. Cation binding to 15'TBA quadruplex DNA is a multiple-pathway cation-dependent process. Nucleic Acids Res 39-9789.

246. Kankia, B. I., and L. A. Marky. 2001. Folding of the thrombin aptamer into a G-quadruplex with Sr2+'- stability, heat, and hydration. J Am Chem Soc 123-10799.

247. Rache, A. De, I. Kejnovsk, M. Vorlckov, and C. Buess-Herman. 2012. Elongated thrombin binding aptamer: a G-quadruplex cation-sensitive conformational switch. Chem Eur J18-4392.

248. Lin, P.-H., R^-H. Chen, C.-H. Lee, Y. Chang, C.-S. Chen, and

W.-Y. Chen. 2011. Studies of the binding mechanism between aptamers and thrombin by circular dichroism, surface plasmon resonance and isothermal titration calorimetry. Colloids Surf B Biointerfaces 88'-552.

249. Bonder, M. A., M. Koziolkiewicz, and C. Watala. 2001. Aptamer inhibits degradation of platelet proteolytically activatable receptor, PAR-1, by thrombin. Thromb Res V-215.

250. Wu, Q., M. Tsiang, and J. E. Sadler. 1992. Localization of the single-stranded DNA binding site in the thrombin anion-binding exosite. J Biol Chem 267-24408.

251. Kretz, C. A., A. R. Stafford, J. C. Fredenburgh, and J. I. Weitz. 2006. HD1, a thrombin-directed aptamer, binds exosite 1 on prothrombin with high affinity and inhibits its activation by prothrombinase. J Biol Chem 28V37477.

252. Muller, J., D. Freitag, G. Mayer, and B. Potzsch. 2008. Anticoagulant characteristics of HD 1*22, a bivalent aptamer that specifically inhibits thrombin and prothrombinase. J Thromb Haemost 6-2105.

253. Dougan, H., J. B. Hobbs, J. I. Weitz, and D. M. Lyster. 1997. Synthesis and radioiodination of a stannyl oligodeoxyribonucleotide. Nucleic Acids Res 25-2897.

254. Hoon, S., B. Zhou, K. D. Janda, S. Brenner, and J. Scolnick. 2011. Aptamer selection by high-throughput sequencing and informatic analysis. BioTechniques 51-413.

255. Reyderman, L., and S. Stavchansky. 1998. Pharmacokinetics and biodistribution of a nucleotide-based thrombin inhibitor in rats. Pharm Res 15^904.

256. DeAnda, A., S. E. Coutre, M. R. Moon, C. M. Vial, L. C. Griffin,

V. S. Law, M. Komeda, L. L. K. Leung, and D. C. Miller. 1994. Pilot study of the efficacy of a thrombin inhibitor for use during cardiopulmonary bypass. Ann Thorae Surg 58-344.

257. Macaya, R. F., J. A. Waldron, B. A. Beutel, H. Gao, M. E. Joesten,

M. Yang, R. Patel, A. H. Bertelsen, and A. F. Cook. 1995. Structural and functional characterization of potent antithrombotic oligonucleotides possessing both quadruplex and duplex motifs. Biochemistry 34-4478.

258. Ikebukuro, K., Y. Okumura, K. Sumikura, and I. Karube. 2005. A novel method of screening thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm. Nucleic Acids Res 33 '-el08.

259. Ikebukuro, K., W. Yoshida, T. Noma, and K. Sode. 2006. Analysis of the evolution of the thrombin-inhibiting DNA aptamers using a genetic algorithm. Biotechnol Lett 28-1933.

260. Dolinnaya, N. G., A. V. Yuminova, V. A. Spiridonova,

A. M. Arutyunyan, and A. M. Kopylov. 2012. Coexistence of G-quadruplex and duplex domains within the secondary structure of 31-mer DNA thrombin-binding aptamer. JBiomol Struct Dyn 30-524.

261. Diener, J. L., J. Wagner-Whyte, D. Fontana. Aptamers that bind thrombin with high affinity. U.S. Patent 60/711,768, August 26, 2005.

262. Giusto, D. A. Di, and G. C. King. 2004. Construction, stability, and activity of multivalent circular anticoagulant aptamers. J Biol Chem 279:46483.

263. Tasset, D. M., M. F. Kubik, and W. Steiner. 1997. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. J Mol Biol 272:688.

264. Muller, J., B. Wulffen, B. Potzsch, and G. Mayer. 2007. Multidomain targeting generates a high-affinity thrombin-inhibiting bivalent aptamer. ChemBioChem 8-2223.

265. Рахметова, С. Ю., С. П. Радько, О. В. Гнеденко, Н. В. Бодоев, А. С. Иванов и А. И. Арчаков. 2010. Сравнительный термодинамический анализ взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией. Биомед химия 56-404.

266. Kim, Y., Z. Cao, and W. Tan. 2008. Molecular assembly for highperformance bivalent nucleic acid inhibitor. PNAS 105:5664.

267. Bompiani, К. M., D. M. Monroe, F. C. Church, and B. A. Sullenger. 2012. A high affinity, antidote-controllable prothrombin and thrombin -binding RNA aptamer inhibits thrombin generation and thrombin activity. J Thromb Haemost 10-870.

268. Long, S. В., M. B. Long, R. R. White, and B. A. Sullenger. 2008. Crystal structure of an RNA aptamer bound to thrombin. RNA 14-2504.

269. Jeter, M. L., L. V. Ly, Y. M. Fortenberry, H. C. Whinna, R. R. White, C. P. Rusconi, B. A. Sullenger, and F. C. Church. 2004. RNA aptamer to thrombin binds anion-binding exosite-2 and alters protease inhibition by heparin-binding serpins. FEBSLett 568-10.

270. Pizzo, S. V., M. L. Schwartz, R. L. Hill, and P. A. McKee. 1973. The effect of plasmin on the subunit structure of human fibrin. J Biol Chem 248:4574.

271. Singh, R. R., and J.-Y. Chang. 2003. Structural stability of human crthrombin studied by disulfide reduction and scrambling. Biochim BiophysActa 1651-85.

272. Seras-Franzoso, J., R. Affentranger, M. Ferrer-Navarro, X. Daura,

A. Villaverde, and E. Garcia-Fruitos. 2012. Disulfide bond formation and activation of Escherichia coli 6-galactosidase under oxidizing conditions. ApplEnviron Microbiol 78-2376.

273. Van Den Besselaar, A. M. H. P., T. W. Barrowcliffe, L. L. Houbouyan-Reveillard, J . Jespersen, M. Johnston, L . Poller, and A. Tripodi. 2004. Guidelines on preparation, certification, and use of certified plasmas for ISI calibration and INR determination. J Thromb Haemost 2-1946.

274. Field, K. J., W. J. White, and C. M. Lang. 1993. Anaesthetic effects of chloral hydrate, pentobarbitone, and urethane in adult male rats. Lab Anim 2T-258.

275. Vrzheshch, P. V. 2008. Quasi-equilibrium assumption in enzyme kinetics, necessary and sufficient conditions and accuracy of its application for single-substrate reactions. Biochemistry (Mosc) 73-1114.

276. Myszka, D. G., X. He, M. Dembo, T. A. Morton, and B. Goldstein. 1998. Extending the range of rate constants available from Biacore^ interpreting mass transport-influenced binding data. Biophys J 75'-583.

277. Onell, A., and K. Andersson. 2005. Kinetic determinations of molecular interactions using Biacore—minimum data requirements for efficient experimental design. JMol Recognit 18-307.

278. Shainoff, J. R., G. B. Smejkal, P. M. Di Bello, O. V. Mitkevich,

P. J. Levy, C. E. Dempfle, and H. Lill. 1996. Isolation and characterization of the fibrin intermediate arising from cleavage of one fibrinopeptide A from fibrinogen. J Biol Chem 271-24129.

279. Higgins, D. L., S. D. Lewis, and J. A. Shafer. 1983. Steady state kinetic parameters for the thrombin-catalyzed conversion of human fibrinogen to fibrin. J Biol Chem 258-9276.

280. Naski, M. С., and J. A. Shafer. 1991. A kinetic model for the a-thrombin-catalyzed conversion of plasma levels of fibrinogen to fibrin in the presence of antithrombin. J Biol Chem 266-13003.

281. Picozzi, M., and R. De Cristofaro. 1993. Effect of temperature on the association step in thrombin-fibrinogen interaction. Biochem J294-563.

282. Cristofaro, R. De, S. Akhavan, C. Altomare, A. Carotti, F. Peyvandi, and P. M. Mannucci. 2004. A natural prothrombin mutant reveals an unexpected influence of A-chain structure on the activity of human a-thrombin. J Biol Chem 279-13035.

283. Кантор Ч., Шиммел П. 1984. Биофизическая химия. (Под ред.

А. А. Богданова, Ю.С. Лазуркина, М. Д. Франк-Каменецкого). М.:Мир Т.2 С.445-450.

284. Santos, N. С., and М. A. R. В. Castanho. 1996. Teaching Ught scattering spectroscopy: the dimension and shape of tobacco mosaic virus. Biophys J 7V1641.

285. Weisel, J. W., and C. Nagaswami. 1992. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophys Soc 63-111.

286. Cacciafesta, P., A. D. L. Humphris, K. D. Jandt, and M. J. Miles. 2000. Human plasma fibrinogen adsorption on ultraflat titanium oxide surfaces studied with atomic force microscopy. Langmuir 16:8167.

287. Dennis, S., A. Wallace, J. Hofsteenge, and S. R. Stone. 1990. Use of fragments of hirudin to investigate thrombinhirudin interaction. Eur J Biochem 188:61.

288. Kuyas, C., and R. F. Doolittle. 1986. Gly-Pro-Arg-Pro derivatives that bind to human plasma albumin and prevent fibrin formation. Thromb Res 43-485.

289. Laudano, A. P., and R. F. Doolittle. 1981. Influence of calcium ion on the binding of fibrin amino terminal peptides to fibrinogen. Science 212-457.

290. Golovin, A. V., A. M. Kopylov, R. V. Reshetnikov, E. G. Zavyalova,

G. V. Pavlova, and V. E. Babiy. Antithrombin aptamers and a method of their structure stabilization. Patent PCT WO 2011/075004 Al, December 13, 2010.

291. Limongelli, V., S. De Tito, L. Cerofolini, M. Fragai, B. Pagano,

R. Trotta, S. Cosconati, L. Marinelli, E. Novellino, I. Bertini, A. Randazzo, C. Luchinat, and M. Parrinello. 2013. The G-triplex DNA. Angew Chem Int Ed 52-2269.

292. Marini, J.J., and A.P. Wheeler. 2010. Critical care medicine: the essentials, 4th ed.; Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, p.544.

293. Huntington J. A. 2008. How Na+ activates thrombin - a review of the functional and structural data. J Biol Chem 389-1025.

294. Bush-Pelc, L. A., F. Marino, Z. Chen, A. O. Pineda, F. S. Mathews, and E. Di Cera. 2007. Important role of the Cysi9i-Cys22o disulfide bond in thrombin function and allostery. J Biol Chem 282-27165.

295. Rydel, T. J., M. Yin, K. P. Padmanabhan, D. T. Blankenship, A. D. Cardin, P. E. Correa, J. W. Fenton, and A. Tulinsky. 1994. Crystallographic structure of human y'thrombin. J Biol Chem 269^22000.