Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат физико-математических наук Протопопова, Анна Дмитриевна

• Протопопова, Анна Дмитриевна
• кандидат физико-математических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Протопопова, Анна Дмитриевна

Введение

I Обзор литературы

1.1 Атомно-силовая микроскопия

1.2 Белок-белковые взаимодействия.

1.3 Свертывание крови.

1.3.1 Ранние работы по ПЭМ.

1.3.2 Исследования при помощи АСМ.

1.3.3 Современные работы по ПЭМ.

1.3.4 Растяжение фибриновых волокон: силовая спектроскопия и МД

1.4 Контейнеры на основе вирусных белков

1.4.1 Общие сведения о вирусах.

1.4.2 АСМ-эксперименты по изучению вирусных частиц.

1.4.3 Вирусы в нанотехнологии.

II Исследование процесса ассоциации фибрина

II. 1 Материалы и методы.

11.2 АСМ-исследование ассоциатов фибрина.

11.3 АСМ-исследование отдельных молекул фибриногена.

П.4 Исследование роли а-С-доменов в образовании первичных ассоциатов

IIIИсследование белковых капсидов на основе БО ХВК и ВМАльт

III. 1 Материалы и методы.

111.2 Сравнительный анализ РНП и ДНП с нативными вирионами.

111.3 Анализ РНП и ДНП методами ферментного анализа.

IV Силовое картирование вирусных частиц

V Выводы

VI Благодарности

Список иллюстраций

1.1 Потенциал Леннарда-Джонса взаимодействия двух атомов.

1.2 Схематический вид прямоугольного и треугольного кантилеверов длиной шириной w и с углом а при вершине.

1.3 Схематический вид типичной силовой кривой.

1.4 Общий вид силовых кривых и кривых разделения при разных типах взаимодействия зонда и образца.

1.5 Зависимость силы, действующей на канилевер при приложении напряжения, от расстояния между кончиком иглы и поверхностью образца.

1.6 Двойной электрический слой.

1.7 Кристаллографическая структура фибриногена.

1.8 Волокна из бычьего фибрина.

1.9 Схема образования волокон из бычьего фибрина.

1.10 Увеличенные изображения периодичности на фибриновых волокнах.

1.11 Изображения фибриногена.

1.12 Доменная структура фибриногена (слева) и модель формирования крупных волокон фибрина (справа), предложенные Холлом по данным ПЭМ

1.13 Данные светорассеяния из работы [37].

1.14 ПЭМ-изображения протофибрилл и поясняющая их схема [43].

1.15 Модель структуры первичных ассоциатов фибриногена, предложенная в работе [44].

1.16 Структуры ранних ассоциатов фибриногена, классифицированные в работе [44].

1.17 ПЭМ-изображения ранних ассоциатов фибрина (слева) и схема образования точек ветвления в ассоциатах (справа) [45].

1.18 Первое АСМ-изображепие молекулы фибриногена как трехдоменной структуры [46].

1.19 АСМ-изображения слоя фибриногена, адсорбированного на поверхность кремния из буфера с рН 8.

1.20 Изотермы адсорбции фибриногена при низкой ионной силе 2 мМ (А) и при высокой ионной силе 300 мМ (В).

1.21 АСМ-изображения отдельных молекул фибриногена на поверхности слюды и графита.

1.22 АСМ-изображения фибриногена на поверхности графита и слюды. Сканирование в жидкости [52], [53].

1.23 ПЭМ-изображения отдельных молекул фибриногена и фибрина [61], [58].

1.24 ПЭМ-изображения отдельных аС-доменов и содержащих их агрегатов различного рода [58].

1.25 Схема эксперимента по силовой спектроскопии фибриногена и полученная силовая кривая [64].

1.26 Результаты моделирования растяжения молекулы фибриногена при помощи молекулярной динамики.

1.27 Первое АСМ-изображение ВТМ [66].

1.28 АСМ-изображение кристалла сателитного вируса мозаики табака размером 1x1 мкм.

1.29 АСМ-изображение, показывающее рост двумерных кристаллов вируса мозаики костра.

1.30 АСМ-изображения вируса мятлика, вируса полосатой мозаики ячменя, ВТМ, ВМК и вируса мозаики люцерны.

1.31 АСМ-изображения ВТМ и высвобождающейся из его оболочек РНК и свободной РНК ВТМ на слюде.

1.32 АСМ-изображения высвобождения РНК из капсида риновируса 2.

1.33 АСМ-изображения отдельных частиц и агрегатов ВИЧ на стекле.

1.34 АСМ изображения вируса герпеса, лишенного пентонов.

1.35 Схема и результаты эксперимента по индентированию вируса герпеса.

1.36 Деформация капсида вируса герпеса под действием индентирования.

II. 1 АСМ-изображения агрегатов фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 9 //М за 30 секунд (А, Б); за 5-10 минут (В).

И. 2 АСМ-изображения ассоциатов фибрина на слюде, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 2 мкМ за 1 минуту (А), 3 минуты (Б) и 5 минут (В).

11.3 Зависимости высоты и длины волокон фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 2 мкМ, от времени, определенные по данные АСМ.

11.4 АСМ-изображения ассоциатов фибрина на слюде, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 0,2 мкМ за 1 минуту.

11.5 Результаты эксперимента по ДСР.

11.6 АСМ-изображения первичных ассоциатов фибрина — протофибрилл и профибрилл — на слюде (А, С, Е) и на ГМДС-слюде (В, D, F).

11.7 Возможные механизмы формирования фибриновых ассоциатов.

11.8 АСМ-изображения молекул фибриногена на слюде, ГМДС-слюде и ВОПГ.

11.9 АСМ-изображения отдельных доменов фибриногена на различных подложках.

11.10 АСМ-изображения des-Q-C-фибриногена на различных подложках.

11.11 Структура 3GHG из базы данных PDB [118].

11.12 Начальные и конечные конформации моделирования адсорбции фибриногена.

11.13 Модельная топография фибриногена на слюде (А) и ГМДС-слюде (Б).

11.14 АСМ-изображения молекул фибрина, образующих ассоциаты в присутствии ингибитора А- и B-дырок GPRP.

11.15 АСМ-изображения ассоциатов des-a-C-фибриногена, образующихся после добавления тромбина.

11.16 ПЭ М-изображения ранних ассоциатов фибрина и соответствующие схемы расположения молекул фибрина на подложке.

11.17 Ассоциаты смешанной структуры на слюде в АСМ и поясняющие их схемы.

III. 1 АСМ-изображения ХВК (а) и ВМАльт (б) на поверхности слюды. Сканирование на воздухе.

111.2 АСМ-изображения слоя БО ХВК на поверхности слюды и распределение агрегатов, встречающихся в этом слое, по высоте.

111.3 АСМ-изображения РНК ХВК на поверхности слюды в условиях сборки РНП и распределение агрегатов, встречающихся в этом препарате, по высоте.

111.4 АСМ-изображения ДНК-копии РНК ХВК на поверхности слюды.

III. 5 АСМ-изображения различных НП на поверхности свежесколотой слюды

III.6 АСМ-изображения ДНП, собранных при pH 8,0.

111.7 АСМ-изображения полимеров БО ВМальт.

111.8 Результаты электрофоретического анализа комплексов, полученных при инкубации БО ХВК с гомологичной и гетерологичной РНК и ДНК.

111.9 Результаты электрофоретического анализа препаратов РНК ХВК, выделенных из РНП, обработанных МН.

ШЛОРезультаты электрофоретического анализа ДНП, обработанных ДНКазой

I и МН.

Ш.ИРезультаты трипсинового теста.

IV. 1 Схема сил, действующих на кантилевер со стороны деформируемого объекта при разных взаимных положениях кантилевера и образца.

IV.2 Топографическое изображение сферических частиц риновируса 2 и соответствующая карта жесткости.

IV.3 Топографическое изображение частицы ВТМ и соответствующие силовые данные.

IV.4 Зависимость наблюдаемой жесткости кед от силы.

IV.5 Зависимости жесткости вируса и кантилевера от приложенной силы.

Список таблиц

1.1 Данные из статьи Хоуна и Портера [27].

1.2 Данные о форме и характерных размерах молекул фибриногена на различных подложках, известные из литературных источников. (*) — Молекулы такой формы присутствуют на изображениях, приведенных в статьях, но не обсуждаются авторами.

II. 1 Данные ДСР для ассоциатов фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 20 нМ.

11.2 Высоты доменов фибриногена и его фрагментов, определенные по АСМ-изображениям на различных подложках.

11.3 Сравнение данных АСМ и МД о высоте D доменов и общей протяженности адсорбированного фибриногена.

III. 1 Сравнение размеров и свойств различных нуклеопротеидов. * — Эксперименты по ПЭМ проведены нашими коллегами с Биологического факультета МГУ. ** н/о — не определялось.

Список используемых сокращений

АСМ — атомно-силовая микроскопия БО — белок оболочки ВМАльт — вирус мозаики альтернантеры ВТМ — вирус табачной мозаики ДНП — дезоксирибонуклеопротеид МД — молекулярная динамика НК — нуклеиновая кислота НП — нуклеопротеид

ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия РНП — рибонуклеопротеид СЗМ сканирующая зондовая микроскопия СК — силовое картирование ХВК — X вирус картофеля

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов»

Белки (протеины, полипептиды) — важнейшие полимеры в составе живых организмов. Pix количество в клетках превосходит какие бы то ни было другие органические соединения: на их долю приходится более 50% общей сухой массы клеток. Белки состоят из аминокислот — органических соединений с пептидной связью, в составе которых одновременно присутствуют карбоксильная и аминная группы. В большинстве случаев в белках используются только 20 стандартных аминокислот, кроме того, в живых организмах встречается небольшое количество редких аминокислот, а также известно свыше 150 аминокислот, которые не входят в состав белков, а встречаются в клетках в свободном или связанном виде, могут являться промежуточными продуктами на пути синтеза стандартных аминокислот.

Пептидные связи между аминокислотами могут образовываться в результате поликонденсации, но в живом организме последовательность аминокислот жестко контролируется и должна соответствовать генетическому коду белка, записанному на клеточной ДНК. Последовательность аминокислот, соединенных друг с другом пептидной связью в полипептидной цепи называют первичной структурой белка. Аминокислотная последовательность белка определяет его биологическую функцию. Кроме того, для всякого белка характерна особая пространственная структура, образующаяся за счет взаимодействия друг с другом несоседних аминокислотных звеньев, она называется третичной структурой (вторичной структурой называются отдельные элементы пространственной укладки белка, такие как а-спираль или /3-елой). Многие крупные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, удерживаемых вместе за счет гидрофобных взаимодействий, а также при помощи водородных и ионных связей. Способ совместной упаковки таких цепей называют четвертичной структурой белка.

Функции белков в организме более разнообразны, чем функции других органических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Это не только каталитическая (ферментативная) функция, но и структурная, защитная, регуля-торная, сигнальная, транспортная, резервная, рецепторная, моторная (двигательная). Как правило, в выполнении той или иной функции задействовано несколько белков, а ряд биологически значимых клеточных процессов выполняются огромными белковыми машинами, состоящими из десятков белковых молекул, объединенных за счет белок-белковых взаимодействий [1].

Под белок-белковыми взаимодействиями понимается связь двух и более белковых молекул друг с другом, как правило обратимая. Кроме того, белки способны взаимодействовать и с другими молекулами — с нуклеиновыми кислотами, с липидами, полисахаридами, ионами и атомами. Нарушение белок-белковых взаимодействий может приводить к возникновению различных заболеваний, включая опухолевые, нейро-дегенеративные, сердечно-сосудистые, аутоиммунные и др. Поэтому изучение взаимодействующих партнеров и анализ белковых сетей, образованных белок-белковыми взаимодействиями, представляет собой важный инструмент в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, а также эффективности тех или иных терапевтических подходов (2].

Группы физически взаимодействующих белков, которые функционируют в клетке совместно и скоординировано, контролируя взаимосвязанные процессы, образуют так называемые белковые сети. На сегодняшний день показано, что большинство белков имеют несколько функциональных центров (сайтов) и полифункциональны, то есть каждый может участвовать в нескольких независимых процессах. Поэтому белковые сети в клетке имеют сложно переплетенную структуру, и важной задачей на пути к пониманию механизмов работы всей клетки и всего организма является построение таких сетей. Для решения этой задачи необходимо проводить структурно-функциональное картирование белков, позволяющее локализовать их функционально важные участки, в том числе и те, благодаря которым осуществляются белок-белковые взаимодействия, а затем прослеживать участие этих функциональных участков в клеточных процессах — искать новых контрагентов.

Актуальность работы

Для исследований в этой сфере приходится пользоваться всеми доступными экспериментальными и теоретическими методами. Среди теоретических методов особо выделяется метод молекулярной динамики (МД). В числе экспериментальных методов: рентге-ноструктурный анализ, метод дрожжевого двугибридного анализа, фаговый дисплей, аффинная очистка в тандеме с масс-спектрометрией. Широкие возможности для исследования белок-белковых взаимодействий предлагают различные микроскопические методы, в том числе флуоресцентная микроскопия, электронная микроскопия, крио-электронная томография и сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ). В настоящей работе предложено исследовать крупные белок-белковые комплексы при помощи одного из методов СЗМ — атомио-силовой микроскопии (АСМ). Данный метод предназначен для визуализации закрепленных на подложке объектов с высоким пространственным разрешением на воздухе или в жидкой буферной среде, а также для исследования локальных механических свойств поверхности образца и для наблюдения динамики процессов. С его помощью можно получить информацию о физических свойствах объектов, не доступную другим методам, а также микроскопическую информацию, дополняющую результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Широкий спектр возможностей, предоставляемых АСМ для изучения биополимеров, обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Цель работы

Цель настоящей работы — разработать методики для исследования с помощью метода АСМ структуры, свойств и особенностей процесса формирования биомакромолекуляр-ных комплексов на примере двух биологически значимых систем — системы свертывания крови и вирусных частиц.

Первый объект исследования — белок фибриноген, играющий ключевую роль в процессе свертывания крови. Под действием тромбина он переходит в активную форму, называемую фибрином, и ассоциирует, образуя крупную сеть макроскопических волокон — основу будущего тромба. В настоящей работе исследовалась молекулярная структура ранних ассоциатов фибрина.

Второй объект — белок оболочки (ВО) X вируса картофеля (ХВК). Известно, что в определенных условиях БО ХВК может образовывать спирально-симметричную оболочку вокруг РНК. В настоящей работе исследовались структура, свойства и условия формирования комплексов, образованных БО ХВК с ДНК.

Основное различие между этими системами состоит в том, что ассоциаты фибрина — это чисто белковые структуры, в то время как вирусные частицы стабилизируются нуклеиновой кислотой и являются более сложным нуклеопротеидным комплексом.

Задачи

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методики для визуализации ассоциатов фибрина на разных стадиях реакции и исследовать структуру ранних ассоциатов фибрина методом АСМ.

2. Исследовать конформации молекул фибриногена, адсорбированных на различные подложки методами АСМ и молекулярной динамики (МД), сопоставить результаты моделирования с экспериментальными данными.

3. Исследовать условия формирования и структуру дезоксирибонуклеопротеидов (ДНИ), полученных in vitro на основе БО ХВК и ДНК, сравнить их структуру с рибону-клеопротеидами (РНП).

4. Исследовать возможность формирования ДНП на основе БО другого потексвиру-са — вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт).

5. Разработать методику для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования (СК).

Научная новизна диссертации

1. Разработана методика визуализации ассоциатов фибрина, образующихся на начальной стадии свертывания крови. Впервые показано, что наряду с протофиб-риллами существуют более тонкие ассоциаты — профибриллы, образованные при связывании а-С доменов соседних молекул друг с другом.

2. Проведено исследование процесса сорбции фибриногена на слюду и слюду, модифицированную ГМДС, методами АСМ и МД. Показано, что конформации молекул на гидрофильной и гидрофобной подложках существенно различаются.

3. Показана возможность формирования комплексов БО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования этих НП. Показано, что укладка белка в ДНП существенно отличается от структуры оболочки нативного вируса и РНП. Предположено, что БО ХВК связывается с малой бороздкой ДНК.

4. Показано, что при использовании БО другого потексвируса — ВМАльт — ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты БО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом СК.

Практическая значимость работы

Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны три результата: обнаружение тонких ассоциатов фибрина, в которых молекулы белка связанны, предположительно, за счет взаимодействия а-С доменов соседних молекул, определение особенностей структуры ДНП и определение жесткости вирусных частиц методом СК.

Важным методологическим результатом диссертации является разработанный алгоритм для анализа данных СК. Силовое картирование - весьма трудоемкий экспериментальный метод, требующий сложного анализа и имеющий серьезные артефакты, которые часто не учитываются при обработке. Настоящая работа вносит вклад в развитие этого метода.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях и школах:

• 2nd International School on Surface science «Technologies and Measurements on Atomic Scale», 2012, Sochi, Russia;

• Шестая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2012, Москва, Россия;

• X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова, 2011, Москва, Россия;

• 17th International Biophysics Congress, 2011, Beijing, China;

• 2nd International School «Nanomaterials and Nanotechnologies in Living Systems. Safety and Nanomedicine», 2011, Moscow region, Russia;

• Пятая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2011, Москва, Россия;

• XXIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2011, Москва, Россия;

• ESF-EMBO Research Conference «Molecular Perspectives on Protein-Protein Interactions», 2010, Sant Feliu de Guixols, Spain;

• 20tli Anniversary Korea-Russia Science and Technology Forum, 2010, Москва, Россия;

• Четвертая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2010, Москва, Россия;

• Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2009, Москва, Россия;

• Первая международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 2009, Россия.

Личный вклад автора

Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Эксперименты по динамическому светорассеянию проведены совместно с Завьяловой Еленой. Моделирование методом МД проведено совместно с Толстовой Анной, Оферкиным Игорем и Годзи Максимом. Эксперименты по ферментному анализу ДНП и РНП проведены совместно с Никитиным Николаем и Полозовым Василием.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликована 21 работа, в том числе 7 статей и 14 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Протопопова, Анна Дмитриевна

Выводы

1. Методом АСМ показано, что на ранних стадиях ассоциации фибрина наряду с двутяжевыми протофибриллами существуют более тонкие ассоциаты — короткие однотяжевые профибриллы, образованные при связывании а-С-доменов соседних молекул друг с другом.

2. Методом АСМ показано, что молекулы фибриногена сильно деформируются при адсорбции на гидрофильную слюду и в меньшей степени деформируются при адсорбции на гидрофобную ГМДС-слюду. Результаты АСМ подтверждены методом МД.

3. Показана возможность формирования комплексов БО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования ДНП. Показано, что укладка белка в ДНП не соответствует структуре оболочки нативного вируса.

4. Показано, что при использовании БО другого потексвируса — ВМАльт — ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты БО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования.

Глава VI

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Яминскому Игорю Владимировичу за предоставленную возможность свободно работать на экспериментальном оборудовании над интересными мне темами, за безоговорочную помощь и поддержку во всех моих начинаниях. Я также благодарна Копылову Алексею Михайловичу и Карповой Ольге Вячеславовне за поставленные научные задачи.

Я искренне благодарна Завьяловой Лене за великолепную творческую атмосферу совместной работы, а также всем моим коллегам, с кем мы совместно проводили эксперименты, обсуждали и обрабатывали их результаты: Анне Толстовой, Игорю Оферкину, Максиму Годзи, Арзуманян Ирине, Петровой Екатерине, Никитину Николаю, Моник Якобе и Елене Зивкович.

Большое спасибо Александру Филонову за предоставленное программное обеспечение и консультации по его работе. Хочу также выразить благодарность Евгению Дубровину за обучение различным методикам работы на АСМ, приготовлению образцов, многочисленные консультации и поддержку в ходе выполнения этой работы.

Я благодарю Александра Чертовича за консультации и помощь в проведении МД моделирования, Соколову Ольгу Сергеевну за помощь с экспериментами по ПЭМ и Анастасию Большакову за внимательное прочтение автореферата.

Особенную благодарность хочу выразить моей маме, Сушко Светлане Владимировне, заведующей редакции журнала ТМФ, за редактирование текстов диссертации и автореферата.

Заключение

В данной части работы

• Показана возможность формирования комплексов ВО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования ДНП. Показано, что укладка белка в ДНП не соответствует структуре оболочки нативиого вируса.

• Показано, что при использовании ВО другого потексвируса ВМАльт ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты ВО, не содержащие ДНК.

• Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования.

Глава V

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Протопопова, Анна Дмитриевна, 2012 год

1. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология в 3-х томах, под ред. Р. Сопера, М. Мир 1996.

2. Терентьев А.Л., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия, Усп. биол. хим., т. 49, 2009, с. 429-480.

3. Binning G., Quate С., Atomic force microscope, Phys.Rev. Lett., v. 56, p. 577-579 (1986).

4. Weisenhorn A.L., Hansma P.K., Albrecht T.R., Quate C.F., Forces in atomic force microscopy in air and water, Appl. Phys. Lett. v. 54, p. 2651-2653 (1989).

5. Butt H.J., Siedle P., Seifert K., Fendler K., Seeger Т., Bamberg E., Weisenhorn A.L., Goldie K., Engel A. Scan speed limit in atomic force microscopy, J. Microsc., v. 169, p. 75 84 (1993).

6. Neumeister J.M., Ducker W.A. Lateral, normal, and longitudinal spring constants of atomic force microscopy cantilevers, Rev. Sci. Instrum., v. 65, p. 2527-2531 (1994).

7. Sader J.E. Parallel beam approximation for V-shaped atomic force microscope cantilevers, Rev. Sci. Instrum., v. 66, p. 4583 4587 (1995).

8. Khan A., Philip J., Hess P. Young's modulus of silicon nitride used in scanning force microscope cantilevers, J. Appl. Phys., v. 95, p. 1667-1672 (2004).

9. Senden T.A., Ducker W.A. Experimental Determination of Spring Constants in Atomic Force Microscopy, Langmuir, v. 10, p. 1003-1004 (1994).

10. Maeda N., Senden T.J. A Method for the Calibration of Force Microscopy Cantilevers via Hydrodynamic Drag, Langmuir, v. 16, p. 9282-9286 (2000).

11. Notley S.M., Biggs S., Craig V.S.J. Calibration of colloid probe cantilevers using the dynamic viscous response of a confined liquid, Rev. Sci. Instrum., v. 74, p. 4026-4032 (2003).

12. Degertekin F.L., Hadimioglu B., Sulchek T., Quate C.F. Actuation and characterization of atomic force microscope cantilevers in fluids by acoustic radiation pressure , Appl. Phys. Lett., v. 78, p. 1628-1630 (2001).

13. Holbery J.D., Eden V.L., Sarikaya M., Fisher R.M. Experimental determination of scanning probe microscope cantilever spring constants utilizing a nanoindentation apparatus , Rev. Sci. Instrum., v. 71, p. 3769-3776 (2000).

14. Cleveland J.P., Manne S., Bocek D., Hansma P.K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy, Rev. Sci. Instrum., v. 64, p. 403-405 (1993).

15. Bonaccurso E., Butt H.J. Microdrops on Atomic Force Microscope Cantilevers: Evaporation of Water and Spring Constant Calibration, J. Phys. Chem. B, v. 109, p. 253-263 (2005).

16. Hutter J.L., Bechhoefer J. Calibration of atomic force microscope tips, Rev. Sci. Instrum., v. 64, p. 1868-1873 (1993).

17. Butt H. J., Cappella B., Kappl M. Force measurements with atomic force microscope: technique, interpretetion and applications, Surf. Sci. Rep., v. 59, p. 1-152 (2005).

18. Hudlet S., Saint Jean M., Guthmann C., Berger J. Evaluation of the capacitive force between an atomic force microscopy tip and a metallic surface, Eur. Phys. J. B, v. 2, p. 5-10 (1998).

19. Law B.M., Rieutord F. Electrostatic forces in atomic force microscopy, Phys. Rev. B, v. 66, 035402 (2002).

20. Colchero J., Gil A., Baro A.M. Resolution enhancement and improved data interpretation in electrostatic force microscopy, Phys. Rev. B, v. 64, 245403 (2001).

21. Hao H.W., Baro A.M., Saenz J.J. Electrostatic and contact forces in force microscopy , J. Vac. Sci. Technol. B, v. 9, p. 1323-1328 (1991).

22. Sacha G.M., Verdaguer A., Mart?nez J., Saenz J.J., Ogletree D.F., Salmeron M. Effective tip radius in electrostatic force microscopy, Appl. Phys. Lett., v. 86, 123101 (2005).

23. Israelachvili J.N. Intermolecular and surface forces, Third edition, Elsevier 2011, p. 312.

24. Hogg R., Healy T.W., Fuerstenay D.W. Mutual Coagulation of Colloidal Dispersions, Trans. Faraday Soc., v. 62, p. 1632-1637 (1966).

25. Butt H.J. Electrostatic interaction in scanning probe microscopy when imaging in electrolyte solutions, Nanotechnology, v. 3 p. 60-68 (1992).

26. Israelachvili J.N., Adams G.E. Direct measurement of long range forces between two mica surfaces in aqueous KN03 solutions, Nature, v. 262, p. 774-776 (1976).

27. Hawn C.Z., Porter K.R., The fine structure of clots formed from purified bovine fibrinogen and thrombin: a study with the electron microscope, J Exp. Med., v. 86, p. 285-297 (1947).

28. Edsall J.T., Foster J.F., Scheinberg H., Studies on double refraction of flow. III. Human fibrinogen and fraction I of human plasma, J. Am. Chem. Soc., v.69, 2731-2738 (1947).

29. Porter K.R., Hawn C. Z., Sequences in the formation of clots from purified bovine fibrinogen and thrombin: a study with the electron microscope, J Exp. Med., v. 90, p. 225-237 (1949).

30. Hall C. E., Electron microscopy of fibrinogen and fibrin, J. Biol. Chem, v.179, p. 857865 (1949).

31. Hall C. E., Visualization of individual macromolecules with the electron microscope, Proc. N.A.S., v.42, p. 801-806 (1956).

32. Hall C. E., Slayter H.S., The fibrinogen molecule: its size, shape, and Mode of polymerization, J. Biophysic. And Biochem. Cytol., v. 5, № 1, p. 11-17 (1959).

33. Ehrlich P., Shulman S., Ferry J. D., The conversion of fibrinogen to fibrin. VIII. Sedimentation and viscosity studies on clotting systems inhibited by urea and on solutions of fibrin in urea, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 2258-2265 (1952).

34. Katz S., Gutfreund K., Shulman S., Ferry J. D. The conversion of fibrinogen to fibrin. X. Light scattering studies of bovine fibrinogen, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 5706-5709 (1952).

35. Fostern J. F., Samsa E. G., Shulman S., Ferry J. D., The conversion of fibrinogen to fibrin. VI. Flow birefringence studies on clotting systems inhibited by hexamethylene glycol, Arch. Biochem. Biophys., v. 34, 417-423 (1951).

36. Scheraga H.A., Backus J.K., Flow birefringence in arrested clotting systems, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 1979-1983 (1952).

37. Casassa E.F., Light scattering from very long rod-like particles and an application to polymerized fibrinogen, J. Chem. Phys., v. 23, p. 596-597 (1955).

38. Ferry J.D., The mechanism of polymerization of fibrinogen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 38, p. 566-569 (1952).

39. Hantagan R. R., Hermans J., Assembly of Fibrin, J. Biol. Chem., v. 254, № 22, p. 11272-11281 (1979).

40. Hogg D. G., Blomback B., The mechanism of the fibrinogen-thrombin reaction, Thromb. Res., v. 12, № 6, p. 953-964 (1978).

41. Krakow W., Endres G.F., Siegel B.M., Scheraga H.A., An electron microscopy investigation of the polymerization of bovine fibrin monomer, J. Mol. Biol., v. 71, p. 95-103 (1972).

42. Slayter H.S., Heigh-resolution metal replication of macromolecules, Ultramicroscopy, v. 1, p. 341-357 (1976).

43. Flower W.E, Hantagan R.R., Hermans J., Erickson H.P., Structure of the fibrin protofibril, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 78, pp.4872-4876 (1981).

44. Mosesson M. W., DiOrio J. P., Siebenlist K. R., Wall J. S., Heinfeld J.F., Evidence for a second type of fibril branch point in fibrin polymer networks, the trimolecular junction, Blood, v. 82, № 5, p. 1517-1521 (1993).

45. Wigren R., Elwing H., Erlandsson R., Welin S., Lundstrom I., Structure of adsorbed fibrinogen obtained by scanning force microscopy, FEBS, v. 280, №2, p. 225-228 (1991).

46. Ortega-Vinuesa J. L., Tengvall P., Lundstrom I., Molecular packing of HSA, IgG, and fibrinogen adsorbed on silicon by AFM imaging, Thin Solid Films, v. 324, p. 257-273 (1998).

47. Taatjes D. J., Quinn A. S., Jenny R. J., Hale P., Bovill E. G., McDonagli J., Tertiary structure of the hepatic cell protein fibrinogenin fluid revealed atomic force microscopy, Cell Biol. Int., v. 21, № 11, p. 715-726 (1997).

48. Cacciafesta P., Humphris A. D. L., Jandt K. D., Miles M. J., Human plasma fibrinogen adsorption on ultrafiat titanium oxide surfaces studied with atomic force microscopy, Langmuir, v. 16, p. 8167-8175 (2000).

49. Marchant R. E., Barb M. D., Shainoff J. R., Eppell S. J., Wilson D. L., Siedlecki C.A., Three dimensional structure of human fibrinogen under aqueous conditions visualized by atomic force microscopy, Thromb. Haemost., v. 77, p. 1048-1051 (1997).

50. Sit P. S., Marchant R. E., Surface-dependent conformations of human fibrinogen observed by atomic force microscopy under aqueous conditions, Thromb. Haemost., v.82, p. 1053-1060 (1999).

51. Agnihotri A., Siedlecki C. A., Time-dependent conformational changes in fibrinogen measured by atomic force microscopy, Langmuir, v. 20, p. 8846-8852 (2004).

52. Jandt K.D., Finke M., Cacciafesta P., Aspects of the physical chemistry of polymers, biomaterials and mineralised tissues investigated with atomic force microscopy (AFM), Coll. Surf. B: Biointerfaces, v. 19, № 4, p. 301-314 (2000).

53. Marchin K.L., Berrie C.L., Conformational changes in the plasma protein fibrinogen upon adsorption to graphite and mica investigated by atomic force microscopy, Langmuir, v. 19, p. 9883-9888 (2003).

54. Ohta R., Saito N., Ishizaki T., Takai, Visualization of human plasma fibrinogen adsorbed on highly oriented pyrolytic graphite by scanning probe microscopy, Surface Science, v. 600, p. 1674-1678 (2006).

55. Gorkun O. V., Litvinov R. I., Veklich Yu. I., Weisel J.W., Interactions Mediated by the N-Terminus of Fibrinogen's B/3 Chain, Biochemistry, v. 45 (49), p. 14843-14852 (2006).

56. Litvinov R.I., Yakovlev S., Tsurupa G., Gorkun O. V., Medved L., Weisel J.W., Direct evidence for specific interactions of the fibrinogen aCdomains with the central E region and with each other, Biochemistry, v. 46(31), p. 9133-9142 (2007).

57. Weisel J.W., Medved L., The structure and function of the a-C domains of fibrinogen, Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 936, p. 312-27 (2001).

58. Liu W., Carlisle C. R., Sparks E. A., Guthold M., The mechanical properties of single fibrin fibers, J. Thromb. Haemost., v. 8, p.1030-1036 (2010).

59. Collet J. P., Shuman H., Ledger R. E., Lee S., Weisel J. W., The elasticity of an individual fibrin fiber in a clot, PNAS, v. 102, № 26, p. 9133-9137 (2005).

60. Lim B., Lee E.H., Sotomaypr H., Schulten K., Molecular basis of fibrin clot elasticity, Structure, v. 16, p. 449-459 (2008).

61. Lee E. H., Hsin J., Sotomayor M., Cornelias G., Schulten K., Discovery through the computational microscope, Structure, v. 17(10), p. 1295 1306 (2009).

62. Zenhausen F., Adrian M., Emch R., Taborelli M., Jobin M., Descouts P. Scanning force microscopy and cryo-electron microscopy of tobacco mosaic virus as a test specimen, Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1168-1172 (1992).

63. Zhong Q., Innis D., Kjoller K., Elings V.B. Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy, Surface Science Letters, v.290, Nsl-2, p. L688-L692 (1993).

64. Kolbe W.F., Ogletree D.F., Salmeron M.B. Atomic force microscopy imaging of T4 bacteriophages on silicon substrates, Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1113-1117 (1992).

65. Imai K., Yoshimura K., Tomitori M., Nishikawa O., Kokawa R., Yamamoto M., Kobayashi M., Ikai A. Scanning Tunneling and Atomic Force Microscopy of T4

66. Bacteriophage and Tobacco Mosaic Virus, Jpn. J. Appl. Phys. v. 32, p. 2962-2964 (1993).

67. Droz E., Taborelli M., Wells T. N. C., Descouts P. Preparation of Isolated Biomolecules for SFM Observations: T4 Bacteriophage as a Test Sample, Biophys. J., v.65, p.1180 1187 (1993).

68. Lyubchenko Yu.L., Oden P.I., Lampner D., LindsayS.M., DunkerK.A. Atomic force microscopy of DNA and bacteriophage in air, water and propanol: the role of adhesion forces, Nucleic Acids Res., V. 21, № 5, p. 1117-1123 (1993).

69. Karrasch S., Dolder M., Schabert F., Ramsden J., Engel A. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution, Biophys. J., v. 65, № 6, p. 2437-2446 (1993).

70. Malkin A. J., Land T. A., Kuznetsov Yu. G., McPherson A., DeYoreo J.J., Investigation of Virus Crystal Growth Mechanisms by In Situ Atomic Force Microscopy, Phys. Rev. Lett., v. 75, № 14, p. 2778-2781 (1995).

71. Lucas R. W., Kuznetsov Y. G., Larson S. B., McPherson A., Crystallization of Brome mosaic virus and T = 1 Brome mosaic virus particles following a structural transition, Virology, 286 (2), p. 290-303 (2001).

72. Dubrovin E.V., Drygin Yu.F., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy as a tool of inspection of viral infection, Nanomedicine: Nanotech., Bio., and Med. 3, p. 128-131 (2007).

73. McPerson A., Kuznetsov Yu. G., Atomic Force Microscopy Investigation of Viruses, In Atomic Force Microscopy in Biomedical Research, Methods in Molecular Biology, V. 736, Part 3, p. 171-195 (2011).

74. Falvo M. R., Washburn S., Superfine R., Finch M., Brooks F. P., Chi V., Taylor R. M., Manipulation of Individual Viruses: Friction and Mechanical Properties, Biophysical Journa,l V. 72, p. 1396-1403 (1997).

75. Drygin Yu. F., Bordunova O. A., Gallyamov M. O., Yaminsky I. V. Atomic force microscopy examination of tobacco mosaic virus and virion RNA, FEBS Letters, 425, p. 217-221 (1998).

76. Kuznetsov Yu. G., McPherson A. Atomic force microscopy investigation of Turnip Yellow Mosaic Virus capsid disruption and RNA extrusion, Virology, v. 352, p. 329-337 (2006).

77. Kiselyova O.I., Yaminskyl. V., Karpova О. V., Rodionova N. P., Kozlovsky S. V., Arkhipenko M. V., Atabekov J. G. AFM Study of Potato Virus X Disassembly Induced by Movement Protein, J. Mol. Biol., v. 332, p. 321-325 (2003).

78. Hewat E.A., Neumann E., Blaas D. The Concerted Conformational Changes during Human Rhinovirus 2 Uncoating, Molecular Cell, V. 10., № 2, p. 317-326 (2002).

79. Сушко А.Д., Яминский И.В., Гаврюшина Е.С., Дрыгин Ю.Ф. Высвобождение РНК из вируса обыкновенной простуды человека HRV 2 в кислой среде, Коллоидный журнал т. 72, № 4, стр. 549-554 (2010).

80. Kienberger F., Zhu R., Moser R., Blaas D., Hinterdorfer P. Monitoring RNA release from human rhinovirus by dynamic force microscopy, J. Virology, v. 78, p. 3203-3209 (2004).

81. Kuznetsov Yu. G., Datta S., Kothari N. H., Greenwood A., Fan H., McPherson A. Atomic force microscopy investigation of fibroblasts infected with wild-type and mutant murine leukemia virus (MuLV), Biophys. J. 83, p. 3665-3674 (2002).

82. MalkinA. J., McPherson A., Gershon P. D. Structure of Intracellular Mature Vaccinia Virus Visualized by In Situ Atomic Force Microscopy, J. Virology, v.77, №11, p.6332-0340 (2003).

83. Kuznetsov Yu., Gershon P. D., McPherson A. Atomic Force Microscopy Investigation of Vaccinia Virus Structure, J. of Virology, Vol. 82, № 15, p. 7551-7566 (2008).

84. Kuznetsov Yu. G., Victoria J. G., Robinson W. E., McPherson A. Atomic Force Microscopy Investigation of Human Immunodeficiency Virus (HIV) and HIV-infected Lymphocytes, J. of Virology, vol. 77, № 22, p. 11896-11909 (2003).

85. Plomp M., Rice M. K., Wagner E. K., McPherson A., Malkin A. J. Rapid Visualization at High Resolution of Pathogens by Atomic Force Microscopy, Am. J. Pathol., v. 160, p. 1959-1966 (2002).

86. Liashkovich I., Hafezi W., Kuhn J. E., Oberleithner H., Kramer A., Shahin V. Exceptional mechanical and structural stability of HSV-1 unveiled with fluid atomic force microscopy, J. Cell Sci., v. 121, p. 2287-2292 (2008).

87. Roos W. H., Radtke K., Kniesmeijer E., Geertsema H., Sodeik В., Wuite G. J. Scaffold expulsion and genome packaging trigger stabilization of herpes simplex virus capsids, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 106, p. 9673 -9678 (2009).

88. Giocondi M., Ronzon F., Nicola M.C., Dosset P., Milhiet P.E., Chevalier M., Le Grimellec K. Organization of influenza A virus envelope at neutral and low pH, J. Gen. Vir., v. 91, p. 329-338 (2010).

89. Liu C.H., Horng J.Т., Chang J.S., Hsieh C.F., Tseng Y.C., Lin S. Localization and force analysis at the single virus particle level using atomic force microscopy, Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 417, p. 109-115 (2011).

90. Атабеков PI.Г. Применение вирусных структур в качестве инструментов нанотех-нологий, Рос. нанотехнологии, 3, 1-2, стр. 132-141 (2008).

91. Frenkel-Conrat Н., Williams R.C. Reconstitution of active tobacco mosaic virus from the inactive protein and nucleic acid components, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 416, p. 690-698 (1955).

92. Bancroft J.В., Hiebert E. Formation of an infectious nucleoprotein from protein and nucleic acid isolated from a small spherical virus, Virology, v. 32., p. 354-356 (1967).

93. Новиков В.К., Кимаев В.З., Атабеков И.Г. Реконструкция нуклеопротеида X-вируса картофеля, Докл. АН СССР, № 204, с. 1259-1262 (1972).

94. Fox J.M., Wang G., Speir J.A., Olson N.H., Johnson J.E., Baker T.S., Young M.J. Comparison of the Native CCMV Virion with in Vitro Assembled CCMV Virions by Cryoelectron Microscopy and Image Reconstruction, Virology, v. 244, p. 212-218 (1998).

95. Frenkel-Conrat H., Singer B. Reconstitution of tobacco mosaic virus. IV. Inhibition by enzymes and other proteins, and use of polynucleotides, Virology, v. 23, p. 354-362 (1964).

96. Heibert E., Bancroft J.В., Bracker C.E. The assembly in vitro of some small spherical viruses, hybrid viruses and other nucleoproteins, Virology, v. 346, p. 492-508 (1968).

97. Black D.R., Connell C.J., Merigan T.C. Structure and infectivity of picornaviral RNA encapsidated by cowpea chlorotic mottle virus protein, J. of Virology, v. 12, N8 6, p. 1209-1215 (1973).

98. Santanu M., Pfeifer C. M., Johnson J. M., Liu J., Zlotnick A. Redirecting the coat protein of a spherical virus to assemble into tubular nanostructures, J. Am. Chem. Soc., v. 128, № 8, p. 2538-2539 (2006).

99. Erickson J.W., Abouhaidar M., Bancroft J.B. The specificity of papaya mosaic virus assembly, Virology, V. 90, P. 60-66 (1978)

100. Erickson J.W., Bancroft J.B. , Prog. Clin. Biol. Res. 1980, № 40, P. 293-300.

101. Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K., Atabekov J.G. Structire of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X, Virology, v. 65, p. 283-287 (1975).

102. Goodman R.M. Reconstruction of potato virus X in vitro. I Properties of the dissociated protein structural subunits, Virology, v. 76, p. 72 -78 (1975).

103. Koo J., Rafailovich M. H., Medved L., Tsurupa G., Kudryk B. J., Liu Y., Galanakis D. K., Evaluation of Fibrinogen Self-assembly: Role of its alphaC Region, Thromb Haemost., 8(12) (2010) 2727-2735.

104. Chernysh, I.N., and Weisel, J.W., Dynamic imaging of fibrin network formation correlated with other measurements of polymerezation (2008) Blood, 111, 4854-4861

105. Yermolenko I.S., Lishko V.K., Ugarova T.P., Magonov S.N. High-resolution visualization of fibrinogen molecules and fibrin fibers with atomic force microscopy, Biomacromolecules, v. 12, 2, p. 370-379 (2011).

106. Santos, N. C., Castanho, M. A. Biophys. J. 1996, 71, p. 1641-1646.

107. Santos, N. C., Ter-Ovanesyan, E., Zasadzinski, J. A., Prieto, M., Castanho, M. A. R. B. Biophys. J. 1998, 75, 1869-1873.

108. Chinn J. A., Horbett T. A., Ratner B. D. Baboon fibrinogen adsorption and platelet adhesion to polymeric materials, Thromb. Haemostasis, v. 65, p. 608-617 (1991).

109. Pizzo S. V., Schwartz M. L., Hill R. L., McKee P. A. The Effect of Plasmin on the Subunit Structure of Human Fibrin, J of Bio. Chem., v. 248, № 13, p. 4574-4583 (1973).

110. Medved L.V., Gorkun O.V., Privalov P.L. Structural organization of C-terminal parts of fibrinogen Act-chains, FEBS Letters, v. 160, № 1,2, p. 291-295 (1983).

111. J. M. Kollman, L. Pandi, M. R. Sawaya, M. Riley, R. F. Doolittle, Crystal structure of human fibrinogen, Biochem., v. 48, p. 3877 3886 (2009).

112. M.Nelson, W.Humphrey, A.Gursoy, A.Dalke, L.Kale, R.D.Skeel, and K.Schulten. NAMD A parallel, object-oriented molecular dynamics program. Int. J. Supercomp. Appl. High Perform. Comp., 10, p. 251-268 (1996).

113. Kubiak K., Mulheran P.A.Molecular Dynamics Simulations of Hen Egg White Lysozyme Adsorption at a Charged Solid Surface, J. Phys. Chem. B, v. 113, p. 1218912200 (2009).

114. W. Humphrey, A. Dalke and K. Schulten, VMD: Visual molecular dynamics, J. Mol. Gr., 14(1), p. 33-38 (1996).

115. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen-fibrin transition in blood coagulation, Nature, v. 275, p.501-505 (1978).

116. Pechik I., Yakovlev S., Mosesson M.W., Gilliland G.L., Medved L. Structural basis for sequential cleavage of fibrinopeptides upon fibrin assembly, Biochemistry, v. 45, № 11, p. 3588-3597 (2006).

117. Baulcombe D.C., Chapman S., Santa Cruz S. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections, Plant J., V. 7., P. 1045-1053 (1995).

118. Bustamante C., Vesenka J., Tang C.L., Rees W., Guthod M., Keller R., Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy, Biochemistry, 31, 22-26 (1992).

119. Vesenka J., Guthod M., Tang C.L., Keller R., Delaine E., Bustamante C., Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope, Ultramicroscopy, 42-44, 1243-1249 (1992).

120. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. // J. Gen. Virol. 1978. V. 38. P. 329.

121. Rodionova N. R, Karpova O. V., Kozlovsky S. V., Zayakina O. V., Arkhipenko M. V., Atabekov J. G. // Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J Mol Biol 2003, № 333, p. 565 572.