Изучение фолдинга и конформационных изменений продукта гена 9 бактериофага Т4 с помощью моноклональных антител тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Жемаева, Любовь Вячеславовна

• Жемаева, Любовь Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жемаева, Любовь Вячеславовна

Список сокращений.

Глава I. Введение.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи работы.

1.3. Научная новизна.

Глава II. Обзор литературы.

II. 1. Основные закономерности фолдинга.

II.2. Домен как условная единица третичной организации белков.

Н.Э. Две гипотезы механизма сворачивания полипептидной цепи.

11.3.1. Гипотеза нуклеации и роста.

11.3.2. Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов.

И. 4. Молекулярные шапероны.

11.4.1. DnaK/DnaJ система.

11.4.2. GroEL/GroES система.

11.4.3. Молекулярные шапероны в морфогенезе бактериофага Т4.

II. 5. Применение различных физико-химических методов для изучения структуры и фолдинга белков.

II. 5.1. Адсорбционная спектроскопия.

П.5.2. Инфракрасная спектроскопия.

II.5.3. Круговой дихроизм (КД).

И.5.4. ^"С- и 15:М-ЯМР- спектроскопия.

П. 5.5. ЭПР-спектроскопия.

II.5.6. Флуоресцентная спектроскопия.

II. 5.7. Хроматография.

II.5.8. Рентгеноструктурная кристаллография и малоугловое рассеяние рентгеновского излучения.

II.6. Иммунохимические методы исследования структурной организации белков.

11.6.1. Радиоиммунологический анализ.

11.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА).

II. 6.3. Электрофоретический перенос в сочетании с иммуноферментным анализом.

II.6.4. Использование моноклональных антител в иммуноаналюе.

II.7. Белки бактериофагов как модельная система для изучения структуры и фолдинга белков.

II.7.1. Бактериофаг Т4.

II. 8. Продукт гена 9 бактериофага Т4.

Глава Ш. Материалы и методы.

Ш.1. Материалы.

Ш.2. Иммунизация животных.

Ш.З. Получение моноклональных антител.

Ш.4. Определение подкласса МКА.

Ш.5. Получение препаративных количеств МКА.

Ш.б. Очистка МКА из асцитной жидкости.

Ш.7. Иммуноферментный анализ.

Ш.7.1. Непрямой ИФА с сорбцией антигена на твердую фазу.

Ш.7.2. Конкурентный ИФА.

Ш.8. Определение константы диссоциации комплекса антиген антитело.

Ш.9. Иммуноблоттинг.

Ш.10. Штаммы бактериальных культур.

Ш. 11. Среды для выращивания бактерий и бактериофагов.

Ш.12. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

Ш. 13. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК.

Ш.14. Экспрессия генов в клетках Е. coli BL21(DE3).

Ш.15. Приготовление лизатов клеток Е. coli BL21(DE3).

IH16. Выращивание и очистка бактериофагов.

Ш.17. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Ш.18. Выделение и очистка белков.

Ш.19. Определение концентрации белка.

Ш.20. Центрифугирование клеточных экстрактов в градиенте сахарозы.

Глава IV. Результаты исследований.

IV. 1. Получение и характеристика моноклональных антител.

IV.2. Взаимодействие антител с нативной и денатурированной формами пг9.

IV.3. Исследование связывания МКА с мономерной и тримерной формами пг9.

IY.4. Анализ структурных изменений у мутантов пг9, выявляемых с помощью МКА.

IV.4.1. Структурные и информационные изменения, выявляемые у мутантных белков с делециями и точечными заменами в С-концевой области пг9.

IV.4.2. Конформационные изменения, выявляемые у мутантных белков с делециями и точечными заменами в N-концевой области пг9.

IV.4.3. Конформационные изменения, выявляемые у точечных мутантов 9*(174) и 9*(171, 174).

IV. 5. Исследование взаимодействия МКА с базальной пластинкой фага Т4.

Глава V. Обсуждение результатов.

V. 1. Роль отдельных аминокислотных остатков С-концевого домена в олигомеризации тримера пг9.

V.2. Конформационные изменения, выявляемые у точечных мутантов 9*(174) и 9*(171, 174).

V.3. Делеции N-концевой последовательности и точечные мутации в суперспирали coiled-coil приводят к нарушению правильного фолдинга пг9.

V.4. Взаимодействие МКА с пг9 в составе базальной пластинки бактериофага Т4.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение фолдинга и конформационных изменений продукта гена 9 бактериофага Т4 с помощью моноклональных антител»

1.1. Актуальность проблемы

Проблема сворачивания (фолдинга) полипептидной цепи в нативную пространственную структуру является в настоящее время одной из ключевых в молекулярной биологии и медицине. Многие наследственные болезни человека, такие, например, как наследственный эллиптоцитоз [1], расстройства зрения при мутациях в гене родопсина (ретинитный пигментоз и куриная слепота) [2, 3], синдром Марфана при мутациях в гене фибрилина-1 [4] и различные заболевания соединительной ткани [5-8] являются следствием нарушения фолдинга белка в клетке. Понимание механизмов фолдинга в клетке также важно для развития биотехнологии, в частности, для белковой инженерии при создании de novo молекул с заданными свойствами, например, при получении рекомбинантных вакцинных препаратов или биологически активных белков. Экспрессия многих генов в гетерологичных системах часто приводит к неправильному сворачиванию полипептидов и образованию нерастворимых агрегатов, называемых "телами включения" (inclusion bodies) [9, 10], что связано с нарушением фолдинга белков.

Бактериофаг Т4 - объект исследований нашей лаборатории, на модели структурных белков которого мы изучаем закономерности фолдинга и сборки сложных белковых комплексов. Продукт гена 9 (пг9) - структурный белок базальной пластинки фага Т4, к которому присоединены длинные хвостовые фибриллы (ДХФ), взаимодействующие на начальном этапе инфицирования с рецепторами на поверхности клеток Е. coli. Пг9 является триггером базальной пластинки, инициируя ее структурную реорганизацию и последующее сокращение хвостового чехла. К настоящему времени в нашей лаборатории определена нуклеотидная последовательность гена 9, разработана система экспрессии и очистки белка, с помощью рентгеноструктурной кристаллографии решена его пространственная структура с разрешением 2,3 А и сконструирована серия мутантов пг9. Эти данные стали основой для дальнейшего изучения механизмов фолдинга пг9, а также его функционирования как молекулярного триггера. Сигнал, индуцируемый при взаимодействии ДХФ с рецепторами на поверхности клеток и запускающий инфицирование Е. coli фагом, по-видимому, сопряжен со структурными изменениями пг9, которые вызывают каскад последующих конформационных перестроек белков базальной пластинки фага.

Перспективным подходом в исследовании конформационных перестроек пг9 в процессе функционирования представляется использование, с одной стороны, генноинженерных методов для получения различных мутантов пг9 и, с другой, моноклональных антител - высокоспецифичного и, как правило, чувствительного к изменениям пространственной структуры антигена экспериментального инструмента.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Жемаева, Любовь Вячеславовна

выводы

1. Получена коллекция гибридом, продуцирующих моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с продуктом гена 9 (пг9) бактериофага Т4 -триггером процесса инфицирования. Картированы участки связывания для 20 МКА к пг9. Проведена иммунохимическая характеристика шести МКА, узнающих различные домены пг9.

2. Обнаружено, что в нативном трехдоменном гомотримере пг9 неупорядоченный в кристаллографической структуре N-концевой участок молекулы (аминокислотные остатки 1-12) оказывает стабилизирующее действие на структуру аномальной coiled-coil суперспирали (аминокислотные остатки 20-43) N-концевого домена.

3. Замена остатка Lysl71/Asn в петле, соединяющей С-концевой и средний домены пг9, вызывает конформационные изменения среднего и С-концевого доменов. Замена аминокислотных остатков Phe25/Ile и Gly28/Asp, входящих в состав coiled-coil суперспирали, приводит к нарушению фолдинга как N-концевого так и среднего доменов белка.

4. Установлено, что остатки Gln282, Lys283 и 11е284, формирующие Р-15 тяж карбоксильного домена, необходимы для инициации тримеризации пг9.

5. Данные анализа мутантов пг9 с помощью МКА свидетельствуют о кооперативном характере процессов фолдинга и тримеризации пг9 с участием всех трех структурных доменов белка.

6. Показано, что все МКА, за исключением 1а4-С, взаимодействуют с пг9 в составе БП, а встраивание белка в базальную пластинку и последующее присоединение к ней длинных хвостовых фибрилл сопряжены с конформационными перестройками пг9.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Жемаева, Любовь Вячеславовна, 2001 год

1. Kaushal S., Khorana H.G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. (1994) Biochemistry, 33, 6121-6128.

2. Rao V.R., Cohen G.B., Oprian D.D. Rhodopsin mutation G90D and a molecular mechanism for congenital night blindness. (1994) Nature, 367, 639-642.

3. Aoyama Т., Tynau K., Dietz H.C., Franeke U., Furtgmayr H. Missense mutations impair intracellular processing of fibrillin and microfibril assembly in Marfan syndrome. (1993) Human. Mol. Genet., 2, 2135-2140.

4. Raghunath M., Bruckner P., Steinmann B. Delayed triple helix formation of mutant collagen from patients with osteogenesis imperfecta. (1994) J. Mol. Biol., 236, 940-949.

5. Vandenberg P. Molecular basis of heritable connective tissue disease. (1993) Biochem. Med. Metab. Biol., 49, 1-12.

6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. (1970) Nature, 227, 680-685.

7. Friguet В., Chaffotte A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. Measurements of the true affinity constant in solution of Ag-Ab complexes by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. (1985) J. Immunol. Methods, 77, 305-319.

8. Kikuchi Y., King J. Genetic control of bacteriophage T4 baseplate Morphogenesis. (1975) J. Mol. Biol., 99, 645-672.

9. Cohen C., Parry D.A. Alpha-helical coiled coils and bundles: how to design an alpha-helical protein. (1990) Proteins, 7, 1-15.

10. Watts N.R.M., Coombs D.H. Structure of the bacteriophage T4 baseplate as determined by chemical cross-linking. (1990) J. Virol., 64,143-154.

11. Watts N.R.M., Hainfeld J., Coombs D.H. Localization of the proteins gp7, gp8 and gplO in the bacteriophage T4 baseplate with colloidal gold: F(ab)2 and undecagold: Fab' conjugates. (1990) J. Mol. Biol., 216, 315-325.

12. Kells S.S. Structure and function of bacteriophage T4 gene 12 product. (1975) Ph. D. Thesis, University of Chicago.

13. Conley M.P., Wood W.B. Bacteriophage T4 whiskers: a rudimentary environment-sensing device. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 72, 3701-3705.

14. Prilipov A.G., Selivanov N.A., Efimov V.P., Marusich E.I., Mesyanzhinov V.V. Nucleotide sequences of bacteriophage T4 genes 9, 10 and 11. (1989) Nucleic Acids Res., 17, 3303.

15. Наврузбеков Г. А., Курочкина Л.П., Костюченко В.А., Зурабишвили Т.Г., Веньяминов С.Ю., Месянжинов В.В. (1999) Биохимия, 64, 1499-1506.

16. Kostyuchenko V.A., Navruzbekov G.A., Kurochkina L.P., Strelkov S.V., Mesyazhinov V.V., Rossmann M.G. The structure of bacteriophage T4 gene product 9: the trigger for tail contraction. (1999) Structure Fold. Des., 7, 1213-1222.

17. Terzaghi B.E., Terzaghi E., Coombs D. The role of the collar/whisker complex in bacteriophage T4D tail fiber attachment. (1979) J. Mol. Biol., 127, 1-14.

18. Wilson J.H., Tanyashin V.I., Murray N.E. Molecular cloning of fragments of bacteriophage T4 DNA. (1977) Mol. Gen. Genetics, 156, 203-214.

19. Studier F.W., Moffatt B.a. Use of bacteriophage T7 RNA polimerase to direct selective high-level expression of cloned genes. (1986) J. Mol. Biol., 127, 1-14.

20. Steinbacher S., Seckler R., Miller S., Steipe В., Huber R., Reinemer P. Crystal structure of P22 tailspike protein: interdigitated subunits in a thermostable trimer. (1994) Science, 265, 383-386.

21. Smith D.H., Berget P.B., King J. Temperature-sensitive mutants blocked in the folding or subunit assembly of the bacteriophage P22 tail-spike protein. I. Fine-structure mapping. (1980) Genetics, 96, 331-352.

22. Villafane R., Fleming A., Haase-Pettingell C. Isolation of suppressors of temperature-sensitive folding mutations. (1994) J. Bacteriol., 176, 137-142.

23. King J., Haase C., Yu M.-H. (1994) Protein Engineering (Eds.D.L.Oxender, C.F. Fox N.Y.: AlanR. Liss.), 109-118.

24. Friguet В., Djavadi-Ohaniance L., King J., Goldberg M.E. In vitro and ribosome-bound folding intermediates of P22 tailspike protein detected with monoclonal antibodies. (1994) J. Biol. Chem., 269, 15945-15949.

25. Betts S., King J. There's a right way and a wrong way: in vivo and in vitro folding, misfolding and subunit assembly of the P22 tailspike. (1999) Structure Fold. Des., 7, 131-139. Review.

26. Goldberg E., Grinius L., and Leteller L. (1994) in Molecular Biology of Bacteriophage T4 (Karam J.D., ed.) American Society for Microbiology, Washington, D. C., 347-356.

27. Friguet В., Djavadi-Ohaniance L., King G., Goldberg M.E. In vitro and ribosome-bound folding intermediates of P22 tailspike protein detected with monoclonal antibodies. (1994) J. Biol. Chem., 269, 15945-15949.

28. Speed M.A., Morshead Т., Wang D.I., King J. Conformation of P22 tailspike folding and aggregation intermediates probed by monoclonal antibodies. (1997) Protein Sci., 6, 99-108.

29. Braakman I., Hoover-Litty H., Wagner K.R., Helenius A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. (1991) J. Cell Biol., 114, 401411.

30. Saito Т., Taylor G., Webster R.G. Steps in maturation of influenza A virus neuraminidase. (1995) J. Virol. 69, 5011-5017.

31. Крылов B.H. (1986) Современные проблемы бактериофагии. Успехи микробиологии, 20, с. 122-153.

32. Villafane R., King J. Nature and distribution of sites of temperature-sensitive folding mutations in the gene for the P22 tailspike polypeptide chain. (1988) J. Mol. Biol., 204, 607-619.

33. Goldenberg D.P., Berget P.B., King J. Maturation of the tail spike endorhamnosidase of Salmonella phage P22. (1982) J. Biol. Chem., 257, 7864-7871.

34. Goldenberg D.P., Smith D.H., King J. Genetic analysis of the folding pathway for the tail spike protein of phage P22. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 80, 7060-7064.

35. Frison E.A. Cross-reacting and heterospecific monoclonal antibodies produced against arabis mosaic nepovirus. (1992) J. Gen. Virol., 73, 2525-2530.

36. Ghosh S, Campbell AM. Unusual cross-reactions among monoclonal antibodies to bacterial antigens: idiotypic and competitive binding analysis. (1988) FEMS Microbiol. Immunol., 1, 3-8.

37. Friguet В., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. Conformational changes induced by domain assembly within the beta 2 subunit of Escherichia coli tryptophan synthase analysed with monoclonal antibodies. (1986) Eur. J. Biochem., 160, 593597.

38. Blond S., Goldberg M.E. Partly native epitopes are already present on early intermediates in the folding of tryptophan synthase. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84, 1147-1151.

39. Murry-Brelier A., Goldberg M.E. Kinetics of appearance of an early immunoreactive species during the refolding of acid-denatured Escherichia coli tryptophan synthase beta 2 subunit. (1988) Biochemistry, 27, 7633-7640.

40. Goldberg M.E. Investigating protein conformation, dynamics and folding with monoclonal antibodies. (1991) Trends Biochem. Sci., 16, 358-362.

41. Kato A., Tanimoto S., Muraki Y., Kobayashi K., Kumagai I. Structural and functional properties of hen egg-white lysozyme deamidated by protein engineering. (1992) Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1424-1428.

42. Kato A., Shimizu Т., Saga S. Conformational changes in mutant lysozymes detected with monoclonal antibody. (1995) FEBS Lett., 371, 17-20.

43. Friguet В., Djavadi-Ohaniance L., Haase- Pettigell C.A., King G., Goldberg M.E. Properties of monoclonal antibodies selected for probing the conformation of

44. Crumpton M.J. Conformational changes in sperm-whale metmyoglobin due to combination with antibodies to apomyoglobin. (1966) Biochem. J, 100, 223-232.

45. Teale J.M., Benjamin D.C. Antibody as an immunological probe for studying the refolding of bovine serum albumin. II. Evidence for the independent refolding of the domains of the molecule. (1976) J. Biol. Chem., 251, 4609-4615.

46. Sachs D.H., Schechter A.N., Eastlake A., Anfinsen C.B. An immunologic approach to the conformational equilibria of polypeptides. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3790-3794.

47. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. (1975) Nature, 256, 495-497.

48. Sander E., Dietzgen R.G. Monoclonal antibodies against plant viruses. (1984) Adv. Vir. Res., 29, 131-168.

49. Van Ree R. Value of monoclonal antibody-based assays: advantages and drawbacks. (1994) Arb. Paul. Ehrlich Inst. Bundesamt Sera ImpfstofFe Frankf A. M., 87, 127-135, Review.

50. Baron D. Industrial production of monoclonal antibodies. (1990) Naturwissenschaften, 77, 465-471. Review. German.

51. Baquiran D.C., Dantis L, McKerrow J. Monoclonal antibodies: innovations in diagnosis and therapy. (1996) Semin. Oncol. Nurs., 12, 130-41. Review.

52. Carter M. J., Meulen V. The application of monoclonal antibodies in the study of viruses. (1984) Adv. Vir. Res., 29, 95-130.

53. Leute R.K., Ullman E.F., Goldstein A., Herzenberg L.A. Spin immunoassay technique for determination of morphine (1972) Nat. New Biol., 236, 93-94.

54. Soini E., Hemmila I. Fluoroimmunoassay: present status and key problems. (1979) Clin. Chem., 25, 353-361.

55. Simpson J.S., Campbell A.K., Ryall M.E., Woodhead J.S. A stable chemiluminescent-labelled antibody for immunological assays. (1979) Nature, 279, 646-647.

56. Rembaum A., Dreyer W.J. Immunomicrospheres: reagents for cell labeling and separation. (1980) Science, 208, 364-368.

57. Adler F., Liu C.T. Detection of morphine by hemagglutination-inhibition. (1971) J. Immunol., 106, 1684-1685.

58. Chan S.W., Tan C.T., Hsia J.C. Spin membrane immunoassay: simplicity and specificity. (1978) J. Immunol. Meth., 21, 185-195.

59. Cais M., Dani S., Eden Y., Gandolfi O., Horn M., Isaacs E.E., Josephy Y., Saar Y., Slovin E., Snarsky L. Metalloimmunoassay. (1977) Nature, 270, 534-535.

60. Wong R.C., Burd J.F., Carrico R.J., Buckler R.T., Thoma J., Boguslaski R.C. Substrate-labeled fluorescent immunoassay for phenytoin in human serum. (1979) Clin. Chem., 25, 686-691.

61. Ngo T.T., Lenhoff H.M. Enzyme modulators as tools for the development of homogeneous enzyme immunoassays. (1980) FEBS Lett., 116, 285-288.

62. Schuurs A.H., Van Weemen B.K. Enzyme-immunoassay. (1977) Clinical Chem. Acta., 81,1-40.

63. Fujio H., Takagaki Y., Ha Y.M., Doi E.M., Soebandrio A., Sokato N. Native and non-native conformation-specific antibodies directed to the loop region of hen egg-white lysozyme. (1985) J. Biochem. (Tokyo), 98, 949-962.

64. Furie В., Furie B.C. Conformation-specific antibodies as probes of the gamma-carboxyglutamic acid-rich region of bovine prothrombin. Studies of metal-induced structural changes. (1979) J. Biol. Chem., 254, 9766-9771.

65. Delmas P.D., Stenner D.D., Romberg R.W., Riggs B.L., Mann KG. Immunochemical studies of conformational alterations in bone gamma-carboxyglutamic acid containing protein. (1984) Biochemistry, 23, 4720-4725.

66. Reichlin, M. Quantitative immunological studies on single amino acid substitution in human hemoglobin: demonstration of specific antibodies to multiple sites. (1974) Immunochemistry, 11, 21-27.

67. Richards F.F., Konigsberg W.H., Rosenstein R.W., Varge J.N. On the specificity of antibodies. (1975) Science, 187, 130-133.

68. Yalow R.S., Berson S.A. Labeling of proteins: problems and practices. (1966) Trans. N. Y. Acad. Sci., 28, 1033-1044. Review.

69. Chard T. (1978) In Laboratory Technigues in Biochemistry and Molecular Biology (Work, T.S., Work, E., eds.), North Holland Publ., Amsterdam, 6, 440-445.

70. Goding J.W. Use of staphylococcal protein A as an immunological reagent. (1978) J. Immunol. Meth., 20, 241-253.

71. Haimovich J., Sela M. Protein-bacteriophage conjugates: application in detection of antibodies and antigens. (1969) Sciense, 164, 1279-1280.monoclonal human IgM antibody with anti-PR3 specificity. (1998) Clin. Immunol. Immunopathol., 89, 35-43.

72. Mihalyi E. Application of Proteolitic Enzymes to Protein Structure Study. (1972) Chem. Rubber Co., Clevelend.

73. Leontiev V.V., Uversky V.N., Gudkov A.T. Comparative stability of dihydrofolate reductase mutants in vitro and in vivo. (1993) Protein Engineering, 6, 81-84.

74. Cox J. A., Winge D.R., Stein E.A. Calcium, magnesium and the conformation of parvalbumin during muscular activity. (1979) Biochimie, 61, 601-605.

75. Fulmer C.S., Wasserman R.H., Hamilton J.W., Huang W.Y., Cohn D.V. The effect of calcium on the tryptic digestion of bovine intestinal calcium-binding protein. (1975) Biochim. Biophys. Acta, 412, 256-261.

76. Slotboom A.J., Pieterson W.A., Volwerk J.J., de Haas G.H. The mechanism of action of pancreatic phospholipase A. (1976) Monograph, pp. 99-107.

77. Perrier V., Surewicz W.K., Glaser P., Martineau L., Craescu C.T., Fabian H., Mantsch H.H., Barzu O., Gilles A.M. Zinc chelation and structural stability of adenylate kinase from Bacillus subtilis. (1994) Biochemistry, 33, 9960-9967.

78. Глинка JI., Стьюард M. (1983) Структура и функция антител. Мир, Москва.

79. Amit A.G., Mariuzza R.A., Phillips S.E.V., Polyak R.J. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 6 A resolution. (1985) Nature, 313, 156158.

80. Wilson I.A., Haft D.H., GetzofF E.D., Tainer J.A., Lerner R.A., Brenner S. Identical short peptide sequences in unrelated proteins can have different

81. Weber G., Teale F.W.J. (1966) In The Proteins, vol. 3, (Neurath, H., ed.), Academic Press, N. Y., pp. 445-452.

82. Lakowicz J.R., Weber G. Quenching of fluorescence by oxygen. A probe for structural fluctuations in macromolecules. (1973) Biochemistry, 12, 4161-4170.

83. Lakowicz J.R., Weber G. Quenching of protein fluorescence by oxygen. Detection of structural fluctuations in proteins on the nanosecond time scale. (1973) Biochemistry, 12, 4171-4179.

84. Glatter O., Kratky O. Small Angle X-Ray Scattering. (1982) Academic Press, London.

85. Feigin L.A., Svergun D.I. Structural Analysis by Small-Angle X-Ray and Neutron Scattering. (1987) Plenum Press, NY.

86. Уверский B.H. Урацил-ДНК-гликозилаза: интерпретация результатов рентгеноструктурного анализа в свете данных кинетического и термодинамического изучения фермента. (1998) Мол. биол., 32, 488-497.

87. Davis J.A., Peen Е., Williams R.C., Perkins S., Malone C.C., McCormack W.T., Csernok E., Gross W.L., Kolaskar A.S., Kulkarni-Kale U. Determination of primary amino acid sequence and unique three-dimensional structure of WGH1, a

88. Roberts G.C.K., Jardetzky О. Nuclear magnetic resonance spectroscopy of amino acids, peptides, and proteins. (1970) Adv. Protein Chem., 24, 447-545.

89. Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Птицын О.Б. Внутримолекулярная подвижность белка в состоянии "расплавленной глобулы". Исследование карбоангидразы В методом ХН-ЯМР. (1989) Мол. биол., 23, 808-815.

90. Kuwajima К., Harushima Y., Sugai S. Influence of Ca2+ binding on the structure and stability of bovine alpha-lactalbumin studied by circular dichroism and nuclear magnetic resonance spectra. (1986) Int. J. Pept. Protein Res., 27,18-27.

91. Baum J., Dobson C.M., Evans P.A., Hanley C. Characterization of a partly folded protein by NMR methods: studies on the molten globule state of guinea pig alpha-lactalbumin. (1989) Biochemistry, 28, 7-13.

92. Dobson C.M. NMR spectroscopy and protein folding: studies of lysozyme and alpha-lactalbumin. (1991) Ciba Found Symp., 161, 167-189.

93. Hamilton C.L., McDonnell H.M. (1968) In Structural Chemistry and Molecular Biology. (Rich, A., Davidson, N., and Freeman, W.H., eds), Academic Press, San Francisco, pp. 115-127.

94. Smith I.C.P. (1972) In Biology Application of Electron Spin Resonanse Spectroscopy (Swartz, H.M., Bolton, J.P., and Bong, D.C., eds) Academic Press, N.Y., pp.483-498.

95. Berliner L.H. (1976) Spin Labeling Theory and Application. Acad. Press, N.Y.

96. Болотина И.А, Лугаускас В,Ю. Определение вторичной структуры из спектров кругового дихроизма. Учет вклада ароматических аминокислотных остатков в спектры КД белков в пептидной области. (1985) Мол. биол, 19, 1409-1421.

97. Болотина И.А. Определение вторичной структуры из спектров кругового дихроизма. Вторичная структура белков в состоянии "расплавленная глобула". (1987) Мол. биол, 21, 1625-1635.

98. Manning М.С, Woody R.W. Theoretical study of the contribution of aromatic side chains to the circular dichroism of basic bovine pancreatic trypsin inhibitor. (1989) Biochemistry, 28, 8609-8613.

99. Jagannadham M.V, Balasubramanian D. The molten globular intermediate form in the folding pathway of human carbonic anhydrase B. (1985) FEBS Lett, 188, 326-330.

100. Родионова H.A, Семисотнов Г.В, Кутышенко В.П, Уверский В.Н, Болотина И.А, Бычкова В.Е, Птицын О.Б. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами. (1989) Мол. биол, 23, 683-692.

101. Uversky V.N, Semisotnov G.V, Pain R.H, Ptitsyn O.B. 'All-or-none' mechanism of the molten globule unfolding. (1992) FEBS Lett, 314, 89-92.

102. Semisotnov G.V, Uversky V.N, Sokolovsky I.V, Gutin A.M., Razgulyaev O.I, Rodionova N.A. Two slow stages in refolding of bovine carbonic anhydrase В are due to proline isomerization. (1990) J Mol Biol, 213, 561-568.

103. Bychkova V.E, Berni R, Rossi J.-L, Kutyshenko, V.P, Ptitsin O.B. Retinol-binding protein is in the molten globule state at low pH. (1992) Biochemistry, 31, 7566-7571.

104. Rahmelow К., Hubner W. Secondary structure determination of proteins in aqueous solution by infrared spectroscopy: a comparison of multivariate data analysis methods. (1996) Anal. Biochem., 241, 5-13.

105. Williams S., Causgrove T.P., Gilmanshin R., Fang K.S., Callender R.H., Woodruff W.H., Dyer R.B. Fast events in protein folding: helix melting and formation in a small peptide. (1996) Biochemistry, 35, 691-697.

106. Gilmanshin R., Williams S., Callender R.H., Woodruff W.H., Dyer R.B. Fast events in protein folding: relaxation dynamics of secondary and tertiary structure in native apomyoglobin. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3709-3713.

107. Gilmanshin R., Williams S., Callender R.H., Woodruff W.H., Dyer R.B. Fast events in protein folding: relaxation dynamics and structure of the I form of apomyoglobin. (1997) Biochemistry, 36, 15006-15012.

108. Fink A.L., Oberg K.A., Seshadri S. Discrete intermediates versus molten globule models for protein folding: characterization of partially folded intermediates of apomyoglobin. (1998) Folding Design, 3, 19-25.

109. Yang J.T., Wu C.-S.C., Martinez H.M. Calculation of protein conformation from circular dichroism. (1986) Methods Enzymol., 130, 208-269.

110. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. (1980) Мир, Москва, с. 275-349.

111. Provencher S.W., Glockner J. Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. (1981) Biochemistry, 20, 33-37.

112. Yang J.T., Wu C.-S.C., Martinez, H.M. Calculation of protein conformation from circular dichroism. (1986) Methods Enzymol., 130, 208-269.

113. Brahms S., Brahms J. Determination of protein secondary structure in solution by vacuum ultraviolet circular dichroism. (1980) J. Mol. Biol., 138, 149178.

114. Chirgadze Yu.N., Fedorov O.V., Trushina N.P. Estimation of amino acid residue side-chain absorption in the infrared spectra of protein solutions in heavy water. (1975) Biopolymers, 14, 679-694.

115. Федоров O.B. Исследование вторичной структуры белков в растворах методом инфракрасной спектроскопии. (1976) Дисс. канд. физ.-мат. наук, ИБ АН СССР, Пущино.

116. Долгих Д.А., Абатуров Л.В., Бражников Е.В., Лебедев О.Ю., Чиргадзе Ю.Н., Птицын О.Б. Кислая форма карбоангидразы: "расплавленная глобула" со вторичной структурой. (1983) Докл. АН СССР, 272, 1481-1484.

117. Lockhart D.J., Kim, P.S. Internal stark effect measurement of the electric field at the amino terminus of an alpha helix. (1992) Science, 257, 947-951.

118. Stoutland P.O., Dyer R.B., Woodruff W.H. Ultrafast infrared spectroscopy. (1992) Science, 257, 1913-1917.

119. Lockhart D.J., Kim P.S. Electrostatic screening of charge and dipole interactions with the helix backbone. (1993) Science, 260, 198-202.

120. Oberg K.A. (1994) The Application of Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectroscopy to the Study of Non-Native Conformational States of Proteins. (1994) Ph. D. Thesis, University of California, Santa Cruz.

121. Eftink M.R. Use of multiple spectroscopic methods to monitor equilibrium unfolding of proteins. (1995) Methods Enzymol., 259, 487-512.

122. Middaugh C.R., Mach H„ Ryan J.A., Sanyal G., Volkin D.B. Infrared spectroscopy. (1995) Methods Mol. Biol., 40, 137-156.

123. Phillips C.M., Mizutani Y., Hochstrasser R.H. Ultrafast thermally induced unfolding of RNase A. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7292-7296.

124. Mitchinson С, Pain RH. Effects of sulphate and urea on the stability and reversible unfolding of beta-lactamase from Staphylococcus aureus. Implications for the folding pathway of beta-lactamase. (1985) J. Mol. Biol., 184, 331-342.

125. Schmidt F.X. (1989) A Practical Approach. In Protein Structure (Creighton, Т.Е., ed.), IRL Press, Oxford, New York, Tokyo, pp. 251-285.

126. McCoy L.F., Rowe E.S., Wong K.P. Multiparameter kinetic study on the unfolding and refolding of bovine carbonic anhydrase B. (1980) Biochemistry, 19, 4738-4743.

127. Fink A.L., Calciano L.J., Goto Y., Palleros D R. (1990) In Current Research in Protein Chemistry. Academic Press, New York, pp. 417-424.

128. Goto Y., Fink A.L. Conformational states of beta-lactamase: molten-globule states at acidic and alkaline pH with high salt. (1989) Biochemistry, 28, 945-952.

129. Goto Y., Calpiano L.J., Fink A.L. Acid-induced folding of proteins. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 573-577.

130. Goto Y., Takahashi N., Fink A.L. Mechanism of acid-induced folding of proteins. (1990) Biochemistry, 29, 3480-3488.

131. Gounaris A.D., Horton H.R., Koshland D.E. The phosphoglucomutase reaction: investigation of enzyme dephosphorylation during its reaction with substrate. (1967)Biochim. Biophys. Acta., 132, 41-55.

132. Chirgadze Yu.N, Shestopalov B.V., Venyaminov S.Yu. Intensities and other spectral parameters of infrared amide bands of polypeptides in the beta- and random forms. (1973) Biopolymers, 12, 1337-1351.

133. Chirgadze Yu.N., Brazhnikov E.V. Intensities and other spectral parameters of infrared amide bands of polypeptides in the alpha-helical form. (1974) Biopolymers, 13, 1701-1712.

134. King J., Laemmli U.K. Polypeptides of the tail fibres of bacteriophage T4. (1971) J. Mol. Biol., 62, 465-477.

135. Lewis P.N., Momany F.A., Scheraga H.A. Folding of polypeptide chains in proteins: a proposed mechanism for folding. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 68, 2293-2297.

136. Tanford C., Pain R.H., Otchin N.S. Equilibrium and kinetics of the unfolding of lysozyme (muramidase) by guanidine hydrochloride. (1966) J. Mol. Biol., 15, 489-504.

137. Lumry R., Biltonen R., Brandts J.F. Validity of the "two-state" hypothesis for conformational transitions of proteins. (1966) Biopolymers, 4, 917-944.

138. Donovan J.W. Ultraviolet difference spectroscopy: new techniques and applications. (1973) Methods Enzymol., 27, 497-548.

139. Kitagishi K., Nakatani H., Hiromi K. Static and kinetic studies on the binding between pepsin and Streptomyces pepsin inhibitor with a fluorescent probe. (1980) J. Biochem. (Tokyo), 87, 573-579.

140. Mitchinson C., Pain R.H. Effects of sulphate and urea on the stability and reversible unfolding of beta-lactamase from Staphylococcus aureus. Implications for the folding pathway of beta-lactamase. (1985) J. Mol. Biol., 184, 331-342.

141. Ohnishi M., Kegai H., Hiromi K. Studies on the subsite structure of amylases. II. Difference-spectrophotometric studies on the interaction of maltotriose with liquefying alpha-amylase from Bacillus subtilis. (1975) J. Biochem. (Tokyo), 78, 247-51.

142. Kuwajima K., Ogawa Y., and Sugai S. Application of the pH-jump method to the titration of tyrosine residues in bovine alpha-lactalbumin. (1979) Biochemistry, 18, 878-882.

143. Hartl F.U., Hlodan R., Langer T. Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations. (1994) Trends Biochem Sci., 19, 20-25. Review.

144. Gething M.J., Sambrook J. Protein folding in the cell. (1992) Nature, 355, 3345. Review.

145. Мартин И. Фолдинг белка, протекающий с участием шаперониновой системы GroEL/GroES. (1998) Биохимия, 63, 444-452.

146. Braig К., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L., Sigler P.B. The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. (1994) Nature, 371, 578-86.

147. Hunt J.F., Weaver A.J., Landry S.J., Gierasch L., Deisenhofer J. The crystal structure of the GroES co-chaperonin at 2.8 A resolution. (1996) Nature, 379, 37-45.

148. Ang D, Liberek K, Skowyra D, Zylicz M, Georgopoulos C. Biological role and regulation of the universally conserved heat shock proteins. (1991) J Biol Chem., 266, 24233-24236. Review.

149. Zeilstra-Ryalls J., Fayet O., Georgopoulos C. The universally conserved GroE (Hsp60) chaperonins. (1991) Annu. Rev. Microbiol., 45,301-325. Review.

150. Van der Vies S.M., Gatenby A.A., Georgopoulos C. Bacteriophage T4 encodes a co-chaperonin that can substitute for Escherichia coli GroES in protein folding. (1994) Nature, 368, 654-656.

151. Hashemolhosseini S., Montag D., Kramer L., Henning U. Determinants of receptor specificity of coliphages of the T4 family. A chaperone alters the host range. (1994) J. Mol. Biol., 241, 524-533.

152. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. "Partly folded" state, a new equilibrium state of protein molecules: four-state guanidinium chloride-induced unfolding of beta-lactamase at low temperature. (1994) Biochemistry, 33,2782-2791.

153. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic anhydrase В at low temperature. (1996) J. Mol. Biol., 255, 215-228.

154. Уверский B.H., Птицин О.Б. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами. I. КарбоангидразаВ. (1996) Мол. Биол., 30, 1124-1134.

155. Уверский ВН., Птицин О.Б. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами. II. (З-лактамаза и общая модель. (1996) Мол. Биол., 30, 1135-1143.

156. Бычкова В.Е. О функциональной роли негативных белков. (1997) Успехи биологической химии, 37,49-100.

157. Laskey R.A., Honda В.М., Mills A.D., Finch J.T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. (1978) Nature, 275, 416-420.

158. Richardson A., Landry S.J., Georgopoulos C. The ins and outs of a molecular chaperone machine. (1998) Trends Biochem Sci., 23, 138-143. Review.

159. Saibil H. Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. (2000) Curr Opin Struct Biol., 10, 251-258. Review.

160. Feldman D.E., Frydman J. Protein folding in vivo: the importance of molecular chaperones. (2000) Curr Opin Struct Biol., 10, 26-33. Review.

161. Dolgikh DA, Gilmanshin R.I, Brazhnikov E.V, Bychkova V.E, Semisotnov G.V, Venyaminov S.Yu, Ptitsyn O.B. Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? (1981) FEBS Lett, 136, 311-315.

162. Goldenberg D, King J. Trimeric intermediate in the in vivo folding and subunit assembly of the tail spike endorhamnosidase of bacteriophage P22. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 79, 3403-3407.

163. Jackson S.E, Fersht A.R. Folding of chymotrypsin inhibitor 2. 2. Influence of proline isomerization on the folding kinetics and thermodynamic characterization of the transition state of folding. (1991) Biochemistry, 30, 10436-10443.

164. Abkevich V.I, Gutin A.M, Shakhnovich E.I. Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model. (1994) Biochemistry, 33, 10026-10036.

165. Gutin A.M, Abkevich V.I, Shakhnovich E.I. A protein engineering analysis of the transition state for protein folding: simulation in the lattice model. (1998) Fold. Des, 3, 183-194.

166. Jackson S.E, elMasry N, Fersht A.R. Structure of the hydrophobic core in the transition state for folding of chymotrypsin inhibitor 2: a critical test of the protein engineering method of analysis. (1993) Biochemistry, 32, 11270-11278.

167. Shakhnovich E, Abkevich V, Ptitsyn O. Conserved residues and the mechanism of protein folding. (1996) Nature, 379, 96-98.

168. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding. (1995) Adv. Prot. Chem, 47, 83-229.

169. Vikkula M., Ritvaniemi P., Vuorio A.F., Kaitila I., Ala-Kokko L., Peltonen L. A mutation in the amino-terminal end of the triple helix of type II collagen causing severe osteochondrodysplasia. (1993) Genomics, 16, 282-285.

170. Mitraki A., Fane В., Haase-Pettingell C., Sturtevaht J., King J. Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation. (1991) Science, 253, 54-58.

171. King J., Haase-Pettingell C., Robinson A.S., Speed M, Mitraki A. Thermolabile folding intermediates: inclusion body precursors and chaperonin substrates. (1996) FASEB J., 10, 57-66.

172. Anfinsen C.B. The formation of the tertiary structure of proteins. (1967) Harvey Lect., 61, 95-116. Review.

173. Ovchinnikov YA. Structure of rhodopsin and bacteriorhodopsin. (1987) Photochem. Photobiol., 45, 909-914. Review.

174. Курочкина Л.П., Месянжинов В.В. Фолдинг белка в клетке. (1996) Успехи биологической химии, 36, 49-86.

175. Tsong T.Y., Baldwin R.L. A sequential model of nucleation-dependent protein folding: kinetic studies of ribonuclease A. (1972) J. Mol. Biol., 63, 453-469.

176. Ptitsin O.B., Lim V.I., Finkelstein A.V. (1972) In Analysis and simulation of biochemical systems (Eds. Hess B. and Hemker H.C.), North Holland. Publ. Сотр., Amsterdam, 421-431.

177. Птицын О.Б. Стадии и механизм самоорганизации белковых молекул. (1973) Докл. АН СССР, 210, 1213-1215.