Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Летаров, Андрей Викторович

• Летаров, Андрей Викторович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Летаров, Андрей Викторович

Список сокращений.

Оглавление.

I Введение.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Цель и задачи работы.

1.3 Научная новизна и практическая ценность работы.

II Обзор литературы.

II. 1 Фолдинг белка как вторая половина генетического кода.

11.2 Основные закономерности фолдинга.

II.2.1 Две гипотезы механизма сворачивания.

11.2.1.1 Гипотеза нуклеации и роста.

11.2.1.2 Сворачивание с образованием кинетических интермедиатов.

11.3 Молекулярные шапероны.

11.3.

DnaK/DnaJ.

11.3.2 GroEL/GroES.

11.4 Фолдинг белка и сборка бактериофагов.

11.4.1 Бактериофаги и молекулярные шапероны.

11.4.2 Фибриллярные белки бактериофагов и их сборка.

11.4.3 Фибриллярные белки фага Т4.

11.5 Структурные особенности coiled coil.

11.5.1 Основные принципы структуры coiled coil.

11.5.2 Олигомерность coiled coil.

11.5.3 Ориентация цепей в структуре coiled coil.

11.5.4 Нарушения периодичности.

11.6 Механизмы фолдинга и олигомеризации coiled coil.

11.7 Фибритин бактериофага Т4.

III. Материалы и методы.

III. 1 Штаммы бактерий и бактериофага.

III.2. Среды для выращивания бактерий.

III.3 Выращивание бактериофагов и выделение фаговой ДНК.

111.4. Плазмиды и белковые препараты.

111.5. Конструирование рекомбинантных плазмид.

111.6. Полимеразная цепная реакция.

111.7. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация плазмидной ДНК.

111.8. Экспрессия белков и анализ на растворимость.

111.9. Электрофорез белков и иммуноблот.

III. 10. Выделение и очистка белков.

III. 1.1. Определение концентрации белка.

III.1.2. Ограниченный протеолиз.

III. 13. Спектроскопия кругового дихроизма.

III. 14 Определение нуклеотидной последовательности.

III. 15. Изучение криорефолдинга.

III. 16. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

III. 17 Солюбилизация тел включения и рефолдинг белка in vitro.

IV Результаты исследования.

IV. 1 Исходные предпосылки.

IV.2 Неспособность последовательности coiled coil участка фибритина инициировать тримеризацию и фолдинг.

IV.2.1 Получение делеционного мутанта фибритина В, лишённого Сконцевого домена.

IV.2.2 Свойства белка NB 1.

IV.2.2.1 Экспрессия, растворимость и очистка.

IV.2.2.2 Электрофоретическая подвижность.

IV.2.2.3 Чувствительность к трипсинолизу.

IV.2.2.4 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое олигомерное состояние.

TV.2.2.5 Неспособность ингибировать рефолдинг фибритина В.

IV.3 Доказательство роли С-концевого домена в инициации тримеризации и фолдинга фибритина.

IV. 3.1 Получение химерного белка W31, содержащего фолдон фибритина.■.

IV.3.2 Свойства белка W31.

IV.3.2.2 Электрофоретическая подвижность.

IV.3.2.3 Свойства олигомеров W31.

IV.3.2.4 Ингибирование ренатурации фибритина В.

IV.4 Демонстрация посттрансляционной тримеризации in vivo делеционных мутантов фибритина.

IV.4.1 Совместная экспрессия фибритинов В и Е.

IV.5 Поиск мутаций, стабилизирующих мономерный интермедиат фолдинга.

IV.5.1. Получение и скрининг библиотеки случайных мутантов фибритина В1 по пяти аминокислотным остаткам в последовательности С-концевого домена.

IV.5.1.1 Растворимость мутантных белков с нарушенным

С-концевым доменом.

IV.5.1.2. Общий фенотип мутантов фибритина с нарушенным

С-концевым доменом.

IV.5.2 Свойства мутантов фибритина с нарушенной тримеризацией и фолдингом.

IV.5.2.1 Нуклеотидные последовательности мутантов.

IV.5.2.2. Экспрессия при различных температурах.

IV.5.2.3 Получение и очистка мутантных белков.

IV.5.2.4 Способность образовывать микроагрегаты в растворе.

IV.5.2.5 Спектры кругового дихроизма мутантных белков.

IV.5.2.6 Неспособность восстанавливать ДСН-устойчивое тримерное состояние.

IV.5.2.7. Чувствительность к расщеплению трипсином.

IV.5.2.8 Дифференциальная сканирующая калориметрия

ДСК) мутантных белков.

IV.5.2.9. Неспособность мутантов с нарушенным фрлдоном ингибировать рефолдинг интактного фибритина.

IV.5.3. Свойства точечных мутантов фибритина с заменами остатка Тгр476 и делеционного мутанта С1.

IV.6 Изучение возможности альтернативных путей фолдинга фибритина.

IV.6.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым фрагментом пг9.

IV.6.1.1 Создание химерного белка WB9C.

IV.6.1.2 Свойства химерного белка WB9C.

IV.6.2. Получение и свойства делеционного мутанта WacXN полноразмерного фибритина с удалённым С-концевым доменом.

IV.6.2.1 Создание делеционного мутанта Wae XN.

IV.6.2.2 Свойства белка Wae XN.

IV.6.3 Рефолдинг фибритина XN и свойства ренатурированного белка.

IV.6.3.1 Рефолдинг.

IV.6.3.2 Свойства ренатурированного белка Wae XN.

V Обсуждение результатов.

V. 1 Доказательство роли С-концевого домена в инициации фолдинга фибритина.

V.1.2 Способность С-концевого домена фибритина к автономной тримеризации.

IV. 2 Поспрансляционное сворачивание делеционных мутантов in vivo и существование моно мерно го интермедиата.

V.3 Свойства мутантных белков с нарушенным фолдоном.

V.4 Возможны ли альтернативные пути фолдинга фибритина ?.

V.4.1 Замещение фолдона фибритина С-концевым фрагментом белка пг9.

У.4.2 Роль 1Ч-концевого домена в фолдинге фибритина.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение пути фолдинга фибритина бактериофага Т4»

1.1 Актуальность проблемы.

Проблема формирования пространственной структуры белковой молекулы на основе её первичной структуры (фолдинг белка) - одна из наиболее активно исследуемых в современной молекулярной биологии и биохимии. Понимание закономерностей фолдинга является одной из предпосылок для успешного решения ряда биотехнологических и медицинских проблем, таких как создание рекомбинантных вакцин, эффективных противовирусных препаратов, лечение ряда наследственных заболеваний [1,2], а также дизайна белковых молекул de novo.

Структура фибритина бактериофага Т4 - белка, формирующего воротничёк и бакенбарды (воротничковые нити) вирусной частицы подробно исследована в лаборатории молекулярной генетики НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского. В структурном отношении фибритин представляет собой сегментированный, параллельный тройной а-спиральный coiled coil, белок, то есть суперспираль из трёх а-спиралей.

Белки, содержащие структуру coiled coil - широко распространены в природе. К ним относятся такие функционально важные белки как миозин, тропомиозин, промежуточные филаменты, ядерные ламинины, некоторые вирусные адгезины и другие [83].

Фибритин бактериофага Т4 является удобным модельным объектом для исследования закономерностей фолдинга фибриллярных белков. Ряд его свойств, такие как растворимость, возможность получения больших количеств рекомбинантного белка в клетках Е. coli, простота очистки, возможность получения нормально собирающихся делеционных мутантов, а также устойчивость олигомерного состояния к действию ДСН позволяют значительно методически упростить работу с данным белком.

К настоящему времени выяснено, что N-домен молекулы ответственней за присоединение белка к вирусной частице и, очевидно, участвует в формировании воротничка фага. С-концевой домен находится в дистальной части фибриллы. Установленно, что карбоксиконцевой домен играет существенную роль в фолдинге белка [125,126]. Известна рентгеновскай структура С-концевого фрагмента фибритина [129]. Однако, последовательность событий в процессе фолдинга фибритина и конкретные функции С-концевого домена к началу данной работы оставались невыяснены.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Летаров, Андрей Викторович

Выводы

1. Доказано, что фолдинг фибритина В in vitro инициируется тримеризацией С-концевого домена (фолдона), за которой следует формирование суперспиральной структуры.

2. С-концевой участок последовательности фибритина (фолдон) является независимо собирающейся единицей, способной служить ядром, инициирующим фолдинг всей молекулы белка. Фолдон фибритина с помощью генетических методов может быть получен в виде отдельной молекулы с сохранением способности к тримеризации и сборке в структуру типа Р - пропеллер.

3.Различные мутации, функционально инактивирующие фолдон, блокируют фолдинг фибритина как in vivo, так и in vitro и, вероятно, стабилизируют мономерный интермедиат фолдинга.

4. Показано, что фолдинг in vivo делеционных мутантов фибритина, фибригинов В и Е, протекает постгрансляционно, с образованием мономерных интермедиатов.

5.Показано, что в условиях рефолдинга in vitro возможно формирование нативной структуры фибритина в отсутствии С-концевого домена, происходящее, однако, с низкой эффективностью. Предположительно, этот процесс направляется N- концевым глобулярным доменом фибритина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Летаров, Андрей Викторович, 1999 год

1. Курочкина Л.П., Месянжинов В.В. (1996), Фолдинг белка в клетке. Успехи биол. Химии, 36, 49-86

2. В. В. Месянжинов, (1997), Фибриллярные белки бактериофага Т4 как модель для изучения фолдинга. Мол. Биол. 31, 389-397

3. Erlanson D.A., Verdine G.L., (1994), Falling out of the fold: tumorigenic mutations andp53. Chem. Biol. 1, 79-84;

4. Lilie H, Schwarz E, Rudolph R (1998) Advances in refolding of proteins produced in E. coli Curr Opin Biotechnol.;9 :497-501;

5. Ramachandran G.N., Sasisekharan V., (1968), Conformation of polypeptides and proteins Adv. Prot. Chem. 23, 283-291

6. Jaenicke R. (1991), Protein folding: local structures, domains, subunits, and assemblies. Biochemistry, 30, 3147-3161

7. Matouschek A., Serrano L., Ferscht A. (1994), Mechanisms of protein folding (Ed. Pain R.H.) Oxford: Oxford Univ. Press, 137-159

8. Anfinsen C.B., Haber M., Sela M., White F.H., (1961), ??? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 47, 1309-1314

9. Creighton Т.Е. (1994), , Mechanisms of protein folding (Ed. Pain R.H.) Oxford: Oxford Univ. Press, 1-54

10. Tsong T.Y., Baldwin, R.L. and McPhie P. (1972), A sequential model of nucleation-dependent protein folding: kinetic studies of ribonuclease A. J.Mol.Biol. 63, 453-469.

11. Птицын О.Б. (1973), Стадии и механизм самоорганизации белковых молекул Докл. АН СССР, 210, 1213-1215

12. Ptitsyn О.В., Lim V.I., Finkelstein A.V. (1972), Analysis and simulation of biochemical systems (Eds. Hess B. and Hemker H.C.), North Holland. Publ. Сотр., Amsterdam, 421-431.

13. Птицын О.Б. (1998), Сворачивание белков и компактные интермедиаты. Биохимия, 63, 435-443.

14. Dolgikh D.A., Glimanshin R.I., Brazhnikov E.V., Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov S.Yu., Ptitsyn, O.B. (1981), Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure?FEBS Lett. 136, 311-315.

15. Dolgikh D.A., Kolomiets A.P. Bolotina I.A., Ptitsyn O.B. (1984), Alpha-Lactalbumin: compact st^te with fluctuating tertiary structure? FEB S Lett. 165, 88-92.

16. Abkhevich V.I., Gutin, A.M. Shakhnovich E.I. (1991), Specific nucleus as the transition state for protein folding: evidence from the lattice model. Biochemistry, 33, 10026-10036

17. Jackson S.E., ElMasry N., Fersht, A. (1993), Structure of the hydrophobic core in the transition state for folding of chymotrypsin inhibitor 2: a critical test of the protein engineering method of analysis. Biochemistry, 32, 11270-11278

18. Shakhnovich E.I., Abkhevich V., Ptitsyn O.B. (1996), Conserved residues and the mechanism of protein folding Nature, 379, 96-98

19. Ptitsyn O.B. (1998), Protein folding and protein evolution: common folding nucleus in different subfamilies of c-type cytochromes? J Mol Biol. 278, 655666

20. Бычкова B.E.(1997), О фушсциональной роли ненативиых белков. Успехи биологической химии, 37, 49-100

21. OhgushiM., Wada А. (1983), 'Molten-globule state': a compact form of globular proteins with mobile side-chains. FEBS Lett. 164, 21-24.

22. Бычкова B.E., Птицын О.Б., (1993),Состояние расплавленной глобулы для белковых молекул становиться скорее правилом, чем исключением. Биофизика, 38, 58-66.

23. Ptitsyn O.B. (1995), Structures of folding intermediates. Curr.Opin.Str.Biol. 5, 74-78

24. Christensen H, Pain R.H. (1991), Molten globule intermediates and protein folding. Eur. Biophys. J. 19, 221-229.

25. Родионова H.A., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина H.A. Бычкова В.Е. Птицын О.Б. (1989), Внутримолекулярная подвижность белка в состоянии "расплавленной глобулы"

26. Молек.биология, 23, 808-815.

27. Ptitsyn О.В., Uversky V.N. (1996), All-or-none solvent-induced transitions between native, molten globule and unfolded states in globular proteins. Folding & Design, 1, 117-122.

28. Sosnick T.R., Mayane, L„ Hiller,R. Englander S.W. (1994) The barriers in protein folding., Nature Struct. Biol., 1, 149-156.

29. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. (1996), Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carbonic J.Mol.Biol., 255, 215-228.

30. Radford S.E., Dobson C.M., Evans P.A. (1992), The folding of hen lysozyme involves partially structured intermediates and multiple pathways. Nature (London), 358, 302-307

31. Sternberg N., (1973) Properties of a mutant of Escherichia coli defective in bacteriophage lambdahead formation (groE). I. Initial characterization. J. Mol. Biol. 67, 1-23.

32. Georgopoulos C., Hendrix R.W., Casjen S.R., Kaiser A.D. (1973), Host participation in bacteriophage lambda head assembly. J. Mol. Biol. 76, 45-60.

33. Мартин Й.(1998), Фолдинг белка, протекающий с участием шаперониновой системы GroEL/GroES. Биохимия, 63, 444-452.

34. Mathew А, et al. (1998), Role of the heat-shock response in the life and death of proteins. Ann N Y Acad Sei. 851,99-11;

35. Sato N, et al. (1998), The molecular chaperones in cell cycle control. Ann N Y Acad Sei. 851,61-66;

36. Richardson A, et al. (1998), The ins and outs of a molecular chaperone machine. Trends Biochem Sei. 23, 138-43;/37