Изучение антигенной активности рекомбинантных ДНК omp31, p39, sp41 B.melitensis на модельных животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед

• Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед

СПИСОК ТАБЛИЦ

СПИСОК РИСУНКОВ

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ

БЛАГОДАРНОСЬ

ВВЕДЕНИЕ

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткий обзор о бруцеллезной инфекции

1.2. Распространение бруцеллеза

1.3.Экономическое значение бруцеллеза

1.4. Специфическая профилактика бруцеллеза

1.5. Открытие новых вакцин и их применение

1.6. Механизм действия ДНК-вакцин

1.7. Иммунный ответ, вызванный ДНК-вакцинами

1.8. Методы трансфекции ДНК-вакцины и ее совершенствование

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

2.1.1. Получение антигена

2.1.2.Выделение ДНК и ПЦР-анализ

2.1.3. Экстракция ДНК из агарозного геля

2.1.4. Секвенирование

2.1.5. Клонирования

2.1.5.1. Расщепление рестриктазой

2.1.5.2. Лигирование вектора со вставкой

2.1.5.3.Трансформации E.coli

2.1.5.3.1. Приготовление чашек Петри с LB-агаром и канамицином

2.1.5.3.2. Подготовка компетентных клеток

2.1.5.3.3. Пересев бактерий после трансформации на чашки Петри

2.1.5.4. Анализ клонов методом ПЦР

2.1.5.5. Выделение плазмидной ДНК

2.1.5.6. Создание бактериального музея для длительного хранения плазмид

2.1.5.7. Выделение плазмиды в препаративных количествах и измерение концентрации и чистоты ДНК

2.1.6. Экспериментальные испытания на морских свинках

2.1.7. Статистический анализ

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Характеристика штамма Brucella melitensis Rev-1. Культивирование и биохимическая идентификация

2.2.2. Получения антигена для молекулярно-генетических исследований

2.2.3. Выделение ДНК и ПЦР-анализ

2.2.4. Выделения ДНК из агарозного геля и секвенирования

2.2.5. Расщепление рестриктазой и Лигирование вектора со вставкой

2.2.6. Трансформации в Е.соН ХЬ1

2.2.7. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2.8. Антигенная и иммуногенная активности рекомбинантной ДНК отр31, р39, Бр41

2.2.9. Влияние на пролиферативную активность и иммунокопетентных клеток у лабораторных животных

2.2.10. Определения фагоцитарной активности лейкоцитов

3.ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

6. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ТАБЛИЦ

Таблица 1: Биохимические свойства штамма Br.melitensis

Таблица 2: Праймеры использованы на ПЦР-анализе 3 генов

Таблица 3: Праймеры использованы для ПЦР-анализа колоний

Таблица 4: Первый раз выделение и измерения плотность

Таблица 5: Второй раз выделение и измерения плотность

Таблица 6: Схема иммунизации морских свинок

Таблица 7: Антигенная активность ДНК отр31, р39, Бр41 бруцелл

Таблица 8: Результаты иммунологических исследований и ферментивной активности

Таблица 9: Результаты серологических исследований

Таблица 10: Результаты бактериологических исследований биологического материала

Таблица 11. Результаты РБТЛ у вакцинированных морских свинок

СПИСОК РИСУНОК

Рисунок 1: Рост бруцелл на среде Альбими

Рисунок 2: Окраска по граму

Рисунок 3: Результаты электрофореза полученных фрагментов ДНК в 1%

агарозе

Рисунок 4: Концентрацию фрагментов ДНК в 1% агарозе

Рисунок 5: Электрофорез в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления плазмид, содержащих гены отр31, р39 и плазмиды ЕОБРШ соответствующими рестриктазами

Рисунок 6: Электрофорез в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления плазмид, содержащих ген отр31 и плазмиды ЕОБРШ соответствующими рестриктазами

Рисунок 7: Электрофорез в агарозном геле продуктов ферментативного расщепления плазмид, содержащих гены отр31, р39 и Бр41 соответствующими рестриктазами

Рисунок 8: ПЦР-анализ бактериальных колоний на наличие плазмиды рЕОБР-р39 (колонии № 2,3,4,6 дали положительный сигнал)

Рисунок 9: ПЦР-анализ бактериальных колоний на наличие плазмиды рЕОБР-отр31 ( колонии № 2,3,4,5,6,8,9,10 дали положительные сигнал)

Рисунок 10: ПЦР-анализ бактериальных колоний на наличие плазмиды рЕОБР-Бр41( колонии № 1,4 дали положительные сигнал)

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ

OMPs - белки наружной мембраны. SP - поверхностные белки. LPS - Липополисахарид

MALDI-TOF MS - времяпролетной масс-спектрометрии с матричной лазерной десорбцией/ионизацией

РБ- Розбенгала

ИФА - иммуноферментный анализ

РА- реакция агглютинации

РСК - реакция связывания комплемента

РИД - реакция иммунодиффузии

РЛ - реакцию лейкоцитолиза

ПЦР - полимеразно- цепная реакция

СНГ - Содружестве Независимых Государств

APC - антигенпрезентирующие клетки

IFN- интерферон

Поли-А - полиаденилирования

CMV - цитомегаловируса

SC- Подкожный

ID- внутрикожная

IM- внутримышечная

EP -электропорацией

PEI-полиэтиленимин

ДК - дендритные клетки

МЭБ - Международное Эпизоотическое Бюро. КРС - крупный рогатый скот.

МНС - комплекса гистосовместимости.

ЦТЛ - Цитотоксические Т-лимфоциты.

NK - клеток естественных киллеров.

ГОА - гидрооксид алюминия.

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов.

РНГА - Реакция непрямой гемолитической агглютинации.

ПхЛУ - паховый лимфатический узел.

ПчЛУ - подчелюстной лимфатический узел.

ФИ - фагоцитарный индекс.

WHO - Всемирной организации здравоохранения.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Прежде всего, я благодарю Аллаха за то, что он дал мне возможность закончить эту работу.

Своего научного руководителя члена корреспондента РАН, профессора, доктора биологических наук, заслуженного ветеринарного врача России, заведующего кафедры иммунологии и биотехнологии Девришова Давуда Абдулсемидовича, за полученные знания, освоенные методы, помошь и консультации при выполнении работы, доброту. Я большой благодарностью буду вспоминат годы учебы и работы проведенные под руководством моим научным руководителем.

Я хотела бы выразить мою глубокую благодарность и признательность руководству академии и особую благодарность выражаю преподавателям кафедры иммунологии и биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина.

Выражаю благодарность научному коллективу и специалистам ООО «Агровет», за помощь в проведение экспериментальных работ. Отдельно хочу выразить признательность доктору биологических наук Бедоевой Залине Михайловне, начальнику ОБТК Магомедовой Светлане Алисултановне

Моя огромная благодарность и любовь моему дорогому мужу Эмад Эльшахед, моим детям Ахмед, Эяд и Амгед за их поддержку, усилия, поддержку и бесконечную помощь на протяжении всей работы.

Я посвящаю этот диссертация духу моего отца, кто хотел увидеть меня в этот день.

Огромное спасибо и любовь моей маме и моим сестрам Асмаа и Доаа за постоянную поддержку.

ВВЕДЕНИЕ

Бруцеллез, известный как «волнистая лихорадка», «средиземноморская лихорадка» или «мальтийская лихорадка», является зоонозом, почти всегда передается прямым или косвенным контактом с инфицированными животными или их продуктами. Несмотря на большой прогресс в борьбе с этим заболеванием во многих странах, все еще остаются регионы, где инфекция сохраняется у домашних животных и, следовательно, часто происходит инфицирование населения. Эта опасная инфекция для человека и животных встречается во многих частях мира, особенно в средиземноморских странах Европы, Северной и Восточной Африке, на Ближнем Востоке, в Южной и Центральной Азии, в Центральной и Южной Америке. Часто в ряде стран в официальной статистике не отражается все выявленные случаи. Есть только несколько стран в мире, которые официально свободны от этой болезни, хотя случаи все еще происходят у людей, возвращающихся из эндемичных стран [69].

Продолжительность инкубационного периода бруцеллезной инфекции у человека составляет несколько месяцев до нескольких лет, протекая часто пожизненно приводя к инвалидности. Ранняя диагностика и лечение антибиотиками значительно сокращают время, в течение которого пациент может быть недееспособным. Тем не менее, существует множество регионов, где эффективная диагностика или лечение недоступны, или где программы по обнаружению и профилактике инфекции у людей и животных не проводятся должным образом [117].

Хотя гуморальные антитела играют определенную роль в устойчивости к инфекции, основным механизмом защиты бруцеллеза является клеточно-опосредованный иммунитет. Клеточный иммунитет включает в себя запуск

специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и активацию макрофагов, усиливающих их бактерицидную активность, посредством выделения цитокинов (например, гамма-интерферона и фактора некроза опухоли) из специально выделенных хелперных Т-лимфоцитов [176].

Использование живых вакцин также опасно, поскольку штаммы, такие как B. abortus S19 и B. melitensis Rev-1, не являются полностью авирулентными для людей. Вакцинный штамм B. abortus RB-51, имеет низкую патогенность, но все же представляет потенциальную опасность при случайной инъекции и устойчив к рифампицину [86].

Вакцинация является чрезвычайно важным и эффективным аспектом большинства стратегий борьбы с бруцеллезом, но имеет тот недостаток, что результаты диагностики не в полной мере бывают достоверными, т.к. вакцинные штаммы длительное время персистируют в организме вакцинированных животных стимулируя производство гиперчувствительности и антителопродукцию, обнаруживаемых серологическими и аллегрическими реакциями, скрывающие истинное эпизоотологическое состояние поголовья и мешающая оздоровлению хозяйств. Это обстоятельство явилось основной вакцинация крупного рогатого скота в возрасте до шести месяцев и перед осеменением. Однако двукратная иммунизация не улучщило защиту взрослого скота от заболевания бруцеллезом, что выразилось в значительном росте количества неблагополучных пунктов и больного скота. В тоже время использование живых вакцин потенциально опасно, поскольку штаммы, такие как B. abortus S19 и B. melitensis Rev 1, не являются полностью авирулентными для людей. Широко используемы в последнее время вакцина из штамма B. abortus RB 51, не индуцирующий гуморальный иммунитет, являясь живой имеет те же недостатки как и вакцины из штаммов B. abortus S19 и B. melitensis Rev

В настоящее время нет широко распространенного теста, который способен отличить вакцинированные от инфицированных животных, хотя некоторые тесты находятся под оценкой [107].

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение антигенной активности рекомбинантных ДНК omp31, p39, sp41 B.melitensis на модельных животных»

Актуальность работы.

Профилактика бруцеллеза остается одной из проблем ветеринарии и создание эффективных и безопасных вакцин сохраняет актуальность.

Бруцеллы являются факультативными внутриклеточными патогенами, которые могут выживать и размножаться внутри фагоцитарных клеток хозяина таким образом ускользают от бактерицидных факторов гуморального иммунитета и фагоцитоза, приводя тем самым к хронической инфекции.. Механизмы, с помощью которых бруцелла уклоняется от внутриклеточного убийства, не полностью поняты. Тем не менее, Brucella в конечном итоге становятся секвестрированными в моноцитах и макрофагах ретикулоэндотелиальной системы, таких как лимфатические узлы, печень, селезенка и костный мозг [14].

На питательных средах бруцеллы образуют как гладкие, так и грубые колонии, соответственно экспрессирующие гладкий липополисахарид (S-LPS) или грубый LPS (R-LPS) в качестве основного поверхностного антигена. S-LPS является сильнейшим АГ по сравнению с другими антигенными молекулами, участвующими в иммунном ответе против бруцеллеза [24 ].

В настоящее время для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота используется живые вакцины из штаммов Brucella abortus 19 и Br. melitensis Rev 1.

Профилактики бруцеллеза животных, с использованием живых вакцин в

течение более 60 лет не обеспечила благополучие и по настоящее время

12

основным эффективным методом является диагностика и выбраковка положительно реагирующих, и это продолжается на фоне применения живых вакцин, немотря на проблемы биобезопасности их применении и специфических недостатков, включая аборт у животных и аллергические реакции и ограничении использования продукции в течение 20 дней после вакцинации. [7, 8, 127 ].

По этим причинам разрабатываются различные стратегии производства безопасных, нереплицирующихся вакцин, которые легко воспроизводятся с постоянным качеством [1]. В последнее время белки наружной мембраны (OMPs), поверхностные белки (SP) и периплазматически связывающий белок (p39) идентифицированные у бруцелл рассматриваются как группа иммуногенов для вакцин, отличных от ЛПС.

Основные белки наружной мембраны (OMPs) у бруцелл были идентифицированы в начале 1980-х годов и охарактеризованы как потенциальные иммуногенные и защитные антигены. OMP АГ, также известны как факторы, которые влияют на вирулентность Brucella. Роль одного из основных OMP, Omp31, в защитном иммунитете против бруцеллезной инфекции изучается в настоящее несколькими группами ученых. Несмотря на важную роль в иммуногенности и вирулентности OMP АГ использование их в создании вакцин не изучены [67]. Не менее интересными в качестве иммуногена периплазматически связывающий белок Brucella melitensis (p39), который действует в качестве Т-клеточного иммунодоминантного антигена бруцелл и вызывает сильную реакцию гиперчувствительности замедленного типа и поверхностный белок (SP) с молекулярной массой 41 кДа (SP41), который связан с бактериальной адгезией и инвазией клеток. [53, 66]

Развитие биологической науки позволяет разработать вакцины, на молекулярном уровне и одним из направлений является создание ДНК вакцины

на основе рекомбинантных ДНК отр31, р39, sp41. и изучения их антигенных и иммуногенных свойств на модели морских свинок.

Выбранная тема представляет интерес для науки и практики, а методические подходы, соответствуют современному уровню научных достижений молекулярной биологии и иммунологии.

Степень разработанности темы исследования.

В доступных литературных источниках приводятся результаты многих исследований по ДНК-вакцинам, но нет сведений по данному направлению для бруцеллезной инфекции. Кроме того, в научной литературе нет материалов по исследованию данного напрвления в Египте или Россия.

Цель и задачи.

Целью исследования было изучение антигенной активности рекомбинантных ДНК отр31, sp41 и р39 штамма В. melitensis Яеу-1 на модельных животных.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение и подготовка бактериальной культуры штамма В. теШет1з Яеу-1 для молекулярно-генетических исследований.

2. Выделения ДНК и клонирование генов отр31, sp41 и р39 штамма В. теШет1з Яеу-1 в эукариотическом векторе.

3. Трансфармация плазмиды в Е.евИ ХЬ1 для получения рекомбинантных ДНК отр31, sp41 и р39.

4. Иммунизация рекомбнантными ДНК отр31, sp41 и р39 модельных животных и тестирование антигенной активности.

5. Иммуногенная активность рекомбинантных ДНК отр31, р39, sp41 и диссеминация заражающего штамма в органах морских свинок.

6. Изучение механизмов активации клеточного иммунитета.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые:

1. Усовершенствована методика инактивации Br. mlitensis Rev-1 для ДНК технологий дробным нагреванием при температуре 45 и 80 ° С и с последующим охлаждением до 2 ° С.

2. Впервые получены гены omp31, sp41 и p39 из штамма Brucella melitensis Rev-1.

3. Впервые проведено клонирование omp31, sp41 и p39 в векторе pEGFP-N1 и трансформации в компетентных E.coli XL1 и получены рекомбинантные ДНК для иммунологических исследований.

4. Впервые уставлена иммуногенная активность рекомбинантных ДНК omp31, sp41 и p39 депонированных на ГОА и PEI с активацией Т- и В- клеточного иммунитета на модельных животных.

5. Рекомбинантные отр31, sp41 и p39 могут быть использованы для создания иммунобиологических препаратов (вакцин и диагностикумов).

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Используемые в настоящее время живые вакцины представляют потенциальную опасность применения, а также имеют специфические недостатки связанные с абортом у беременных животных, аллергическими реакциями и длительной персистенцией вакцинных штаммов что затрудняет диагностику. По этим причинам исследования по разработке безопасных, нереплицирующихся вакцин против бруцеллеза имеет важное научно-практические значение. Проведенные исследования по изучению антигенной активности белков наружной мембраны omp31 и sp41 и периплазматического p39 штамма Brucella melitensis Rev-1, представляет теоретический и

практический интерес для ветеринарии и медицины при создании новых вакцинных препаратов и средств контроля бруцеллезной инфекцией.

Практическая значимость работы заключается в перспектитвности создания биобезопасных ДНК вакцины с использованием иммуногенно активных пептидов бруцелл.

Личный вклад автора.

Проведен глубокий анализ научной литературы по теме диссертации, изучены методические подходы и выбраны молекулярно-генерические и информативные иммунологически методы исследований, проведены поисковые и экспериментальные работы, полученные результаты последовательно описаны и обобщены. По результатам исследований сделаны выводы о перспективности создания и возможности применения в ветеринарии молекулярно-генетических вакцины против бруцеллеза (ДНК вакцины).

Степень достоверности.

В работе использованы современные микробиологические, молекулярно-генетические и иммунологические методы исследований, полученные результаты теоретически обосновано проанализированы, цифровой материал в статистически обработан данных подтверждающих достоверность полученных результатов.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертации были представлены на различных научных конференциях:

1. XII Международной Научно-практической конференции «Современные технологии: Актуальные вопросы, достижения и инновации», Е.ЫЬгагу, (23 Декабря 2017)

2. XVIII Научная конференция молодых ученых «Биотехнология в

растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Россиский акадимика наук, Москва, (19-20 апреля 2018г ).

3. IX International scientific conference # SCIENCE4HEALTH, РУДН, Москва, (24-

27 апреля 2018г)

4. Национальной научно-практической конференции «Актуальные вопросы

биологии, биотехнологии, ветеринарии, зоотехнии, товароведения ипереработки сырья животного и растительного происхождения», МВА имени К.И. Скрябина(06-07 февраля 2019) Москва-2019.

Публикации. По теме диссертации и материалам исследований опубликованы 7 печатных работ, в том числе 3- в изданиях ведущих научных журналов, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту:

- получение бруцеллезного антигена вакцинного штамма Br.melitensis Rev-1 для молеклярно-генетических исследований.

- выделения ДНК и получения продуктов ПЦР omp31, sp41 и p39 антигена бруцелл.

- клонирования генов в векторе pEGFP-N1 и трансформации этой плазмиды в E.coli XL1.

- изучения антигенной активности рекомпинантные ДНК отр31, р39, sp41 на модельных животных

- Результаты бактериологических исследований биологического материала.

- Изучение механизмов активации клеточного иммунитета.

Объем и структуры диссертации. Диссертация изложена на 122 печатных листах, в т.ч. 7 страницах приложений. Структура диссертационной работы представлена введением, обзором литературы, результатами собственных исследований, обсуждением полученных результатов, выводами, рекомендациями по использованию научных выводов, списком использованной литературы. Материалы иллюстрированы 11 таблицами и 10 рисунками. Список использованной литературы включает 201 источников, в том числе 47 россиийских и 154 иностранных авторов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Краткий обзор о бруцеллезной инфекции.

Болезнь, которую мы теперь знаем как бруцеллез, была впервые обнаружена в 1850-х годах на Мальте. Это стало известно британским медицинским работникам, работавшим на острове после Крымской войны [194].

Бруцеллез — хронически протекающая инфекционная болезнь всех видов животных и человека, проявляющаяся часто абортами, задержанием последа, эндометритами, артритами, орхитом, расстройством воспроизводительной функцией и другими органными и системными нарушениями и имеет тенденцию к широкому распространению при скоплении животных [174], вызванный бруцеллой, родом грамотрицательных бактерий. [109], Бруцелла неподвижна, не образует спор при определенных условиях, принимает различные формы и размеры, а также способна образовывать капсулы [37]. Род Brucella включает девять различных видов, которые вызывают заболевания у

различных видов животных и людей: B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae, B. ovis, B. canis, B. ceti, B. pinnipedialis и B. microti [42].

B. melitensis ^овцы и козы) является наиболее важным зоонозным агентом; за ним следуют B. ovis (овцы), B. abortus (крупный рогатый скот), B. suis (свиньи) и B. canis (собаки) [93]. Бруцеллы рассматриваются как объект угрозы биологического террора категории B, который вызывает вывод из строя воинского контингента и поражение гражданского населения [113].

Это заболевание протекает в нескольких клинических формах (острый, подострый, первично и вторично хронический) [5]. Занос бруцеллеза в благополучные хозяйства чаще всего происходит с больными животными или переболевшими - бруцеллоносителями при несоблюдении правил карантинирования [46]. Передача заболевания часто происходит при обращении с домашним скотом, а также при приеме непастеризованного молока и сыра, имеют повышенную инфекционность при аэрозолизации [182] или через прямой контакт с тканями больных животных и плода [56]. Виды бруцелл используют уреазу для выживания в тяжелых желудочных условиях при желудочно-кишечной инфекции [48].

Понимание биологии и молекулярных механизмов бруцеллезных инфекций имеет первостепенное значение при осуществлении любой программы борьбы с бруцеллезом или ее ликвидации у животных и может способствовать поиску новых подходов к созданию эффективных инструментов для профилактики бруцеллеза [95, 24].

Бруцеллы являются факультативными внутриклеточными патогенами, которые способены выживать и размножаться в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках, таких как трофобластные и эпителиальные клетки

[84]. Установлено, что бруцеллы могут локализоваться и сохранять жизнеспособность в лимфатических узлах (9 %), печени (22 %), сердце (18 %), селезёнке (28%) и половых органах (23 %) [10] и изучение свойств бруцелл показало, что существует связь между его вирулентностью, иммуногенностью и морфологией, S-форма более иммуногенна, чем R-форма [1]. Липополисахарид (LPS) бруцелл является важным фактором вирулентности и может вызывать выработку защитных антител [60]. Вирулентность бруцелл зависит от его способности проникать и колонизировать клетки, в которых он размножается, и генетическая основа этого аспекта плохо изучена [201]. Бруцеллы демонстрируют сильный тканевый тропизм для лимфо-ретикулярной и репродуктивной систем с внутриклеточным образом жизни, который ограничивает воздействие врожденных и адаптивных иммунных реакций и воздействия антибиотиков [156].

Диагностика бруцеллёза является сложной задачей из-за того, что точная идентификация вида невозможна ни с одним из доступных в настоящее время серологических методов диагностикии и иммунологические реакции у заражённых особей и устойчивость к инфекции одинаковы [190, 6, 50].

В серологических тестах для диагностики бруцеллеза, например, наиболее широко используемым является тест Розбенгала (РБ), реакция агглютинации (РА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА) котороые рекомендованы МЭБ [12, 4, 39], в которых в качестве диагностического антигена обычно используют гладкие липополисахариды (S-LPS), который может давать ложноположительные рузельтаты на вакцинные антитела [108] и реакцию лейкоцитолиза (РЛ) для выявления сенсибилизации лейкоцитов крови и слюны при бруцеллезе [36] .Также существует диагностика методом

полимеразной цепной реакции (ПЦР) [25] и новый метод выявления специфических маркеров возбудителя бруцеллеза в крови пациентов с клиническим диагнозом острого бруцеллеза методом MALDI-TOF MS, который подтвержден данными масс-спектрометрии белковых экстрактов культур для целей межвидовая дифференциация штаммов возбудителей бруцеллеза, имеющих клиническое значение [ 40].

Поэтому необходимо разработать более современные методы исследования, позволяющие дифференцировать поствакцинальный иммунитет от малосимптомного течения хронического бруцеллеза [ 31].

Бруцелла обладает множеством механизмов вирулентности, которые предотвращают обнаружение [137].

1.2. Распространение бруцеллеза

Виды бруцелл являются патогенами, имеющие широкий спектре клинических проявлений и распространение во всем мире [181, 21, 124, 200]

Бруцеллез эндемичен во многих странах, наибольшее распространение имеет в странах Ближнего Востока, Африки, Латинской Америки, Центральной и Средней Азии и странах Средиземноморского бассейна. К факторам, влияющим на распространенность, относятся технологии ведения животноводства и контакты с дикой природой [197, 87, 22], активность эпидемического процесса при зоонозных инфекциях оказывают влияние как биологические факторы (особенности возбудителя и иммунологическая реактивность животных и человека), так и социальные (система организации эпидемиологического и эпизоотологического надзора на территории) [29].

Кроме того, бруцеллез по-прежнему представляет угрозу для здоровья населения в Египте, особенно в сельских районах [103]. Бруцеллез вызывает заметные экономические потери в животноводстве. Экспертиза молока и тканей животных в Египте для Brucella spp. показали повышенную распространенность серологически реактивных животных [167]. Эпидемиологическая ситуация с бруцеллезом в Египте не решена и нуждается в уточнение [189].

Бруцеллез был впервые зарегистрирован в Египте в 1939 году. Программы борьбы с бруцеллезом в Египте использовали 2 метода: вакцинация всех животных и убой инфицированных животных с положительными серологическими результатами. Трудность точного обнаружения всех инфицированных животных, особенно носителей, является основным ограничением этих программ. Для повышения эффективности бруцеллезной специфической профилактики необходимо раннее выявление бруцеллеза с помощью высокочувствительных и специфических методов. Египет имеет смешанные популяции овец, коз, крупного рогатого скота и буйволов. Количество буйволов в Египте выше, чем в любой другой стране. В дополнение к высоким показателям распространенности инфекций B. melitensis у овец и коз, в Египте увеличились инфекции крупного рогатого скота и буйволов B. Melitensis [162]. Несмотря на усилия египетских ветеринарных служб по преодолению бруцеллеза, эта болезнь все еще широко распространена как у животных, так и у людей и представляет собой одну из наиболее серьезных угроз для общественного здравоохранения в Египте [106]. Бруцеллез эндемичен среди скота в Египте, и его случаи отмечались среди КРС, буйволов, овец, коз и верблюдов.Превалирующими видами бруцелл являются B. melitensis biovar (bv) 3, B. abortus bv 1 и B. suis bv 1 и согласно статистике Министерства

здравоохранения за 2015 год в Египте, общее количество зарегистрированных случаев бруцеллеза у людей достигло 4065 человек [ 35 ].

Российская Федерация охватывает обширную территорию, охватывающую всю Европу и Азию и включающую разнообразные природные условия и широко варьирующиеся климатические условия. Они неизбежно содержат множество природных очагов зоонозных и экологических патогенов, включая бруцеллез [83].

На территории России циркулируют B.melitensis, В.аЬойш, B.suis и б.оу1б. [23]. Наиболее вирулентны для человека B.melitensis, которые нередко вызывают эпидемические вспышки заболеваний, протекающих в тяжелой форме. однако Россия обладает обширным опытом борьбы с бруцеллезом у крупных и мелких животных на основе систематических мер по охране здоровья животных и борьбы с болезнями в сочетании с использованием специальной профилактики [73, 43]. Шестьдесят процентов эпизоотических вспышек бруцеллеза, выявленных в Содружестве Независимых Государств (СНГ), произошли в Казахстане в последние годы [136]. Наибольшее количество больных животных было обнаружено в 2006, 2007 и 2011 годах [33]. Наряду с Российской Федерацией напряженная эпидемическая ситуация с бруцеллезом за 2010-2014 гг сохраняется в республиках Кыргызстан, Казахстан, Азербайджан, Таджикистан и Армения, что связано с высокой заболеваемостью среди животных эпидемически значимых видов - крупного и мелкого рогатого скота [27 ].

По данным Пономаренко и др. эпидемиологическая ситуация по бруцеллезу в Российской Федерации в 2016 г. была неблагоприятной в Ставропольском крае, Самарской ,Ленинградской и в Амурской областях, а в

2017 г. также считалась нестабильной, поскольку показатели заболеваемости среди населения колеблются в пределах 340-370 случаев [34, 26 ].

Бруцеллез верблюда можно встретить во всех странах выращивания верблюдов, за исключением Австралии [177].

Бруцеллы малоустойчивы к высокой температуре. В жидкой среде при +60°С они погибают через 30 минут, при +80-85°С - через 5 минут, при кипячении моментально. Под действием прямых солнечных лучей бруцеллы гибнут через 4-5 часов, в почве сохраняют жизнеспособность до 100 дней, в воде - до 114 дней. Длительно сохраняются в пищевых продуктах. Обладают большой устойчивостью к воздействиям низких температур [11].

Эпидемическое значение пищевых продуктов и сырья животного происхождения определяется массивностью обсеменения, видом бруцелл, их вирулентностью, длительностью их сохранения. Так, в молоке бруцеллы сохраняются до 10 и более дней, брынзе - до 45 дней, во внутренних органах, костях, мышцах и лимфатических узлах инфицированных туш - более одного месяца, в шерсти - до 3 месяцев [9].

1.3. Экономическое значение бруцеллеза.

Существует несколько хорошо документированных исследований по экономическому воздействию бруцеллеза, которые учитывают все аспекты заболевания. Потери зависят от распространенности, видов животных, а также от управления, социально-политических решений и маркетинга. Дополнительным фактором является воздействие болезни человека, но недооценка является общей, а данные жесткие [72, 79].

Бруцеллез является заболеванием, которое вызывает экономические трудности в развитых, а также развивающихся и слаборазвитых странах [172]. Экономические потери от бруцеллеза связаны с абортами, мертворождениями,

24

рождением нежизнеспособного приплода, снижением молочной продуктивности и использования животных в качестве рабочей силы. Наряду со значительным экономическим ущербом болезнь представляет и социальную угрозу [2].

Из-за всех вышеперечисленных обстоятельств болезнь представляет серьезные экономические, диагностические, терапевтические и профилактические проблемы для селекционеров, ветеринаров, врачей и органов общественного здравоохранения. Его социально-экономическое воздействие, необходимость подхода «Одно здоровье» и разнообразие участвующих участников, включая дикую жизнь, делают бруцеллез сложным заболеванием. Эта сложность возрастает из-за того, что, хотя у некоторых бруцелл есть предпочтительный хозяин, барьеры не являются строгими, а перекрестные инфекции могут быть значительными в системах смешанного земледелия или в интерфейсе внутренней дикой жизни, два условия, часто налагаемые условиями окружающей среды или связанных с культурными традициями. Таким образом, контроль и искоренение трудны [61]. Общая стоимость программ по ликвидации бруцеллеза с учетом инфляции до 1 января 2016 года оценивалась примерно в 6 миллионов евро [64].

Бруцеллез продолжает оставаться основной зоонозной угрозой для людей

и распространенной причиной болезней животных, особенно в развивающихся

странах. Во многих промышленно развитых странах политика убой была

эффективной для искоренения болезни, в то время как вакцины, хотя и

обеспечивают довольно высокий уровень защиты, также индуцируют антитела,

которые вмешиваются в последующие программы эпиднадзора.

Многочисленные попытки создать защитную убитую вакцину до сих пор

вызывают разочарование, и наиболее успешными вакцинами против

бруцеллеза были те, которыеиспользуютживую аттенуированнуювиды

25

бруцелли использование оптимальной системы контроля эпизоотического процесса бруцеллеза , обеспечит увеличение эффективности борьбы с этим заболеванием. [169, 3 ]

1.4. Специфическая профилактика бруцеллеза.

Вакцины Brucella abortus 19 (впервые описанные в 1930 г.) и вакцины Brucella melitensis Rev-1 (впервые описанные в 1957г) широко использовались соответственно для крупного рогатого скота и мелких жвачных животных. Вакцины S19 и Rev-1, однако, далеки от совершенства, поскольку абсолютная защита не достигается, что позволяет использовать субклинических животных-носителей, и оба штамма сохранили некоторую вирулентность и могут вызывать аборты с переменной частотой. Кроме того, обе эти вакцины являются инфекционными для человека (Rev.1 также устойчив к стрептомицину), они способны в больших дозах вызывать генерализованная инфекция у морских свинок и людей [28] , и они будут индуцировать антитела против гладкого липополисахарида, что делает их несовместимыми с процедурами испытаний и убоя в странах, в которых действует программа ликвидации. Совсем недавно вакцина на основе стабильного спонтанного устойчивого к рифампину грубого мутанта B. abortus, названная RB-51, заменила S19 во многих странах, включая Соединенные Штаты [140].

Условия, которые должны соблюдаться идеальной вакциной против

бруцеллеза, не изменились с тех пор, как они были перечислены пятнадцать лет

назад (Всемирная организация здравоохранения, 1999 г.): у животных обоих

полов и в любом возрасте такая вакцина должна быть безвредной и

предотвращать инфекцию единичная доза, не стимулировать антитела,

препятствующие серодиагностике, не передаваться людям или другим

животным (включая не загрязнять мясо, пищевые органы, молоко и молочные

продукты), быть стабильными как в пробирке, так и в естественных условиях,

26

легко обрабатываются в условиях крупномасштабного ферментации и наделены маркерами для легкого дифференцирования от полевых изолятов. Никакая действующая вакцина не отвечает все требованиям [61].

Идеальная вакцина должна иметь следующие характеристики, чтобы считаться эффективной: она не должна вызывать заболевания у привитых животных, она должна предотвращать аборты, однократная доза должна обеспечивать долгосрочную защиту, она должна обеспечивать защиту животных, и это должно быть подходящим для животных всех возрастных групп. Биологическая стабильность также должна быть главным фактором, чтобы избежать риска реверсии вирулентности. Более того, вакцина не должна быть патогенной для человека [152].

В отношении бруцеллеза использование малоэффективных вакцин может способствовать «ложному чувству безопасности», которое применяется и работает на выбор бруцелл с более высокой вирулентностью и потенциалом передачи [143].

Бруцеллы являются факультативными внутриклеточными патогенами, которые противостоят уничтожению нейтрофилов, реплицируются внутри макрофагов и в «непрофессиональных» фагоцитах и поддерживают длительное взаимодействие с клетками-хозяевами [76]. Как внутриклеточные организмы, защита от инфекции бруцелл требует клеточного иммунитета, который включает СЭ4 + и СЭ8 + Т-лимфоциты, цитокины типа ТЫ, такие как ШИ- уи ТИБ-а, и активированные макрофаги и дендритные клетки (ЭС) [30, 96].

Таким образом, контроль инфекции хозяина требует набора клеток и

факторов, которые вместе способствуют комплексному ответу против бруцелл

и критически важно понять, что контроль и возможное искоренение бруцеллеза

зависит не только от вакцинации, но также от создания условий,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед, 2019 год

материала

Иммунизация ДНК антигенами Количе ство животн ых Бактериологические исследования (определение КОЕ) Всего КОЕ

Автаназия на 30 день после заражения

ПхЛУ ПчЛУ печень селезенка кровь

Omp31 + ГОА 5 5 0 2 11 2 20

Sp41 + ГОА 5 9 2 3 13 2 29

P39 + ГОА 5 7 2 4 14 1 28

оmp31+р39+sp41 по 100 мкг+ ГОА 5 2 0 2 7 0 7

Вакцина Rev-1 (живая) 5 0 0 1 2 0 3

контрольная группа 5 19 7 34 54 16 130

Примечание: ПхЛУ - паховый лимфатический узел; ПчЛУ -подчелюстной л/у.

Полученные результаты свидетельствуют о формировании защитного иммунитета. Более высокими защитными свойствами обладала вакцина из штамма Br.melitensis (3 КОЕ выделено из региональных тканей), иммунизация комплексом рекомбинатных белков оmp31+р39+sp41, также предохраняет от генерализованной формы. Иммунными в обеих группах оказались 97 и 93% морских свинок. В целом по моно рекомбинантным антигенам иммунитет составил 74,4%. В контрольной группе отмечали генерализованную форму инфекции.

Таким образом, можно заключить, что живая вакцина против бруцеллеза формирует стерильный иммунитет. Иммунизация оmp31+р39+sp41 сорбированные на ГОА, также формирует достатлочно высокий уровень защиты. У вакцинированных моно ДНК антигенами вакциной иммунитет был нестерильным.

2.2.9. Влияние на пролиферативную активность и иммунокопетентных

клеток у лабораторных животных

При бруцеллезеной инфекции важную роль в защитных механизмах играют клеточный иммунный ответ. Нами проводилось изчение индекса пролиферации (ИП) спленоцитов в реакции бласттрансформации (РБТЛ).

При постановке РБТЛ спленоциты культивировали в С02-инкубаторе в присутствии специфического антигена в течение 7 суток. В качестве специфического антигена использовали клетки Br. abortus штамм 19,

о -5

инактивированные прогреванием, в концентрации 1x10 КОЕ/см . В контрольные пробы вносили равный объем физиологического раствора.

Результаты учитывали, подсчитывая количество клеток в пробах в камере Горяева. ИП рассчитывали через семь суток после постановки РБТЛ как отношение количества клеток в опыте (при культивировании в присутствии брецеллезного антигена) к количеству клеток в контроле (при культивировании клеток этой же пробы без брецеллезного антигена). Результаты РБТЛ представлены в таблице 11.

Таблица 11. -Результаты РБТЛ у вакцинированных морских свинок

Клетки селезенки иммунизированные антигенами Индекс пролиферации в присутствии антигена в РБТЛ

Omp31 + ГОА 0,71 ±0,21

Sp41 + ГОА 0,65+0,11

P39 + ГОА 0,95±0,36

оmp31+р39+sp41 по 100 мкг+ ГОА 1,48+0,15

Вакцина Rev-1 (живая) 1,82+0,21

контрольная группа 0,85+0,32

Из представленных данных видно, что достоверных различий между экспериментальными и контрольными группами также не выявлены. Тем не менее, более высокий уровень пролиферации спленоцитов в присутствии бактериального антигена отмечен в группах, получивших средние и максимальные дозы исследуемых адъювантов.

Таким образом, при иммунизация ДНК антигенами и живой бруцеллезной вакциной у животных активируются клеточные механизмы иммунной защиты, и активируется пролиферативная активность, что свидетельствует об активации антителообразовании.

2.2.10. Определения фагоцитарной активности лейкоцитов.

Из свежей периферической крови выделяли моноциты и нейтрофилы на градиенте плотности фиколпак, затем трехкратно промывали в среде 199, содержащая гепарин и антибиотики. Полученную суспензию клеток ресуспендировали в среде 199, содержащую фетальную сыворотку и глютамин, и помещали на лед на 40-30 минут для предотвращения адгезии фагоцитов на стекле.

В чашку Петри с помещенными в них покровными стеклами вносили по

1 см суспензию моноцитов в охлажденной среде 199 (концентрация моноцитов

3 О

5х103), тщательно перемешивали и инкубировали при 37 С в течение 60 мин. По окончании инкубации на покровные стекла вносили 200 мкл суспензии

9 3

инактивированных прогреванием S. aureus в концентрации 109 КОЕ/см3, чтобы соотношение моноцитов и микробных клеток составляло не менее 1:50. Инкубировали при 37 0С в течение 40 мин. По окончании инкубации стекла с прикрепившимися к ним моноцитами трижды промывали теплым физиологическим раствором, высушивали в течение 15-20 мин, фиксировали в этаноле и вновь высушивали. Стекла с фиксированными клетками окрашивали разведенным в 10 раз дистиллированной водой азур-эозином в течение 30-40 минут, трижды промывали дистиллированной водой от остатков краски и подсушивали. Микроскопию мазков проводили с использованием бинокулярного микроскопа Lenovo с иммерсионным объективом x100 и окуляром х10.

В мазках подсчитывали не менее 100 фагоцитов. Фагоцитарную активность клеток оценивают по двум показателям:

активности фагоцитоза (ФА) - отображает процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их количества, вычисляли по формуле:

а

ФА = — x 100 % , в

где а - количество клеток, вступивших в фагоцитоз;

в - общее количество всех подсчитанных фагоцитов

фагоцитарный индекс (ФИ) - среднее количество поглощенных бактерий в отдельном фагоците, вычисляли по формуле:

С

ФИ = — , Е

где С - общее количество микробных клеток, поглощенных фагоцитами;

Е - количество клеток, вступивших в фагоцитоз.

Динамика изменения показателей фагоцитоза после иммунизации и заражения достоверно возрастало количества фагоцитирующих клеток крови в 2-3 раза, по сравнению с исходными данными. Динамика изменения ФИ была аналогична таковой для ФА. При этом характер их изменений у иммунизированных и контрольных животных после заражения существенно достоверно отличались высокой активации фагоцитирующих клеток у иммунизированных животных.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об усилении фагоцитарной активности клеток крови иммунизированных животных как ДНК антигенами, так и живой вакциной.

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вакцинация - одна из наиболее эффективных стратегий профилактики инфекционных заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения (WHO), вакцинация спасает 5 жизней каждую минуту и спасет более 25 миллионов жизней в период с 2011 по 2020 годы [54].

Анализ литературных данных, проведенный в период формулирования цели и определения целей исследования для диссертационной работы, показал, что бруцеллез продолжает оставаться заболеванием во всем мире, которое приводит к серьезным экономическим потерям, кроме того, оно по-прежнему поражает животных и людей всех возрастных групп и обоих полов [197, 87, 32].

Наиболее эффективной стратегией предотвращения распространения бруцеллеза у людей, помимо пастеризации молочных продуктов, является борьба с крупным рогатым скотом посредством вакцинации. Хотя существуют эффективные вакцины для борьбы с бруцеллезом, эта болезнь не была ликвидирована в большинстве стран мира [ 132].

Конроль бруцеллеза у животных и его профилактика в значительной степени основаны на вакцинации. Поэтому в последние десятилетия интенсивно проводились исследования по разработке более безопасных и более эффективных вакцин против бруцеллеза [65].

Инактивация патогенных микроорганизмов в пробах микроорганизмов является одним из основных необходимых способов защиты исследователей, однако сообщалось также о том, что некоторые методы инактивации вызывают повреждение ДНК и содержания белка в клетках [126]. Высокий риск некоторых агентов биологической угрозы должен найти быстрый, простой и применимый метод инактивации при сохранении его нуклеиновой кислоты [166].

Одной из этих бактерий является бруцелла, которая является важной зоонозной бактерией для людей и животных [150], а также лабораторно приобретенная инфекция [184], особенно В. теШеш1в, поскольку она является наиболее патогенным видом, за которым следует в.бшб, тогда как В.аЪогшБ считается как самый легкий тип бруцеллеза [90, 141, 184].

Это исследование сравнивалось просто между двумя методами инактивации для достижения применимого, быстрого и более дешевого метода. Преимущество метода инактивации формалином заключается в продолжительности процесса инактивации. Однако есть данные, что формалин влияет на иммуногенность лекарств, что косвенно указывает на возможное изменение антигенной структуры клетки.

Формальдегид главным образом индуцирует N

гидроксиметилмоноаддукты на поперечных связях гуанина, аденина и цитозина и К-метилена между соседними пуринами в ДНК. Эти перекрестные связи являются типами повреждений ДНК, которые потенциально фатальны для выживания клеток, если они не удаляются путем сокращения эксцизии нуклеотидов [116].

Поэтому мы считаем, что метод нагрева является наиболее приемлемым методом. Также это доступный, безопасный и недорогой метод.

Несмотря на значительный прогресс в борьбе с этой болезнью во многих странах, все еще остаются регионы, в которых инфекция сохраняется у домашних животных, и, следовательно, часто происходит передача инфекции населению [193, 151].

Аттенуированный B.melitensis Rev-1, используемый в качестве вакцины против бруцеллеза овец и козла, вызванного В. melitensis, считается лучшей

вакциной, доступной для профилактики инфекции В. ovis, но его использование для этой цели имеет серьезные недостатки [ 168].

Разработка эффективной вакцины для контроля бруцеллеза была сложной задачей для ученых на протяжении многих лет. Несмотря на огромный прогресс и разработку применимых вакцин, поиск улучшенных вакцин никогда не заканчивается. Хотя доступные вакцины эффективны в борьбе с бруцеллезом, они имеют многочисленные недостатки, такие как вмешательство в диагностические тесты, патогенность для людей, возможность вызывать аборт у беременных животных [78].

Несмотря на успех, достигнутый благодаря вакцинации B. melitensis Rev-1 1 во многих регионах мира, недостатки, связанные с ее использованием, побудили к изучению альтернативных вакцин против В. melitensis: ДНК-вакцин, субъединичных вакцин, везикул наружных мембран, гладких мутантов B. Melitensis [158].

Врожденный иммунитет - это быстрый и неспецифический иммунный ответ, возникающий на ранних стадиях инвазии бруцелл. Физические барьеры, такие как эпителиальные клетки и желудочный сок, образуют первую линию защиты. Гуморальные компоненты, такие как комплемент и лизоцим, могут удалять микроорганизмы путем опсонизации и бактерицидного действия. Клеточные компоненты иммунной системы, включая макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы и врожденные Т-клетки, играют главную роль в врожденном иммунитете [ 179].

Было показано, что ДНК-вакцинация плазмидой, кодирующей бактериальные, вирусные и паразитарные иммуногены, является привлекательным методом индукции эффективных иммунных реакций [186].

Чтобы получить более безопасную вакцину против бруцеллеза, была проведена иммунизация ДНК-векторами благодаря их способности вызывать генерацию иммунного ответа типа Т1 [98] , и антитела, продуцируемые у животных, вакцинированных живыми аттенуированными вакцинами против бруцелл, неразличимы с использованием современных общепринятых серологических тестов от тестов, полученных у инфицированных животных [130].

Одним из возможных подходов является разработка маркерных вакцин, в которых определенные гены были удалены из родительских вакцинных штаммов, которые демонстрируют хорошую иммуногенность и эффективность вакцин.

Поэтому решили в этом исследовании попытаться подготовить рекомбенантный ДНК путем клонирования специфические фрагменты генов отр31, sp41 и р39 В. теШет1з в вектор EGFP-N1 путем оптимизации кодонов на сайтах рестрикции.

Мы выбрали три белка отр31, sp41 и р39, которые могут оказывать сильное действие на защиту и иммунный ответ бактерий.

Белки, расположенные на поверхности бактерий, традиционно использовались в качестве полезных антигенов для диагностического и вакцинного компонента [142] как белок наружной мембраны 31 (Отр31) является иммунодоминантным и защитным антигеном, консервативным среди возбудителя бруцелл [97, 147]. Поверхностные белки (БР) бруцелл играют важную роль в бактериальной адгезии и инвазии и, таким образом, представляют собой мишени для иммунной системы хозяина в виде поверхностного белка с кажущейся молекулярной массой 41 кДа (Бр41), который избирательно взаимодействует с клетками [52] и предполагаемый

82

периплазматически связывающий белок р39 был описан как Т-клеточные иммунодоминантные антигены бруцелл [51].

В результате выделения ДНК и ПЦР-анализа с электрофоретическим методом детекции были получены специфические фрагменты ДНК соответствующие полосы вырезали из геля и продукт ПЦР очищали от геля.

Секвенирование было выполнено для трех генов, полученный результат был проверен с использованием компьютерной программы BLAST search BLAST ®, и результаты были положительными.

Продукты амплификации гены omp31, sp41 и p39 обрабатывались эндонуклеазой рестрикции XbaI и XhoI и плазмиду EGFPN1 обрабатывали рестриктазами NheI и XhoI. Компетентные клетки E.coli XL1 использоваи для трансформации и результаты трансформации появился на чашках Петри LB-агара в виде колоний, которые анализировали на наличие плазмиды с помощью ПЦР-анализа. Затем провели гель-электрофорез продуктов ПЦР.

Все колонии, которые дали положительный сигнал, были использованы для инокуляции в среды LB бульон с канамицином. Затем амплифицировали в колбах с 500 мл среды и инкубировали в течение суток в шейкере-инкубаторе, кроме культур с omp31 требовалось больше времени для выращивания в LB-бульоне. Это из-за эндотоксинов, которые были в культурах, произведенных из экспрессии гена в культуре.

Mamat U. и др. описали что, липополисахарид (ЛПС), также называемый эндотоксином, является основным компонентом наружной мембраны практически всех грамотрицательных бактерий, а рекомбинантные белки, обычно производимые в E.coli, обычно содержат эндотоксины. Удаление бактериального эндотоксина из рекомбинантных терапевтических белков

является сложным и дорогостоящим процессом, который необходим для обеспечения безопасности конечного продукта [135].

Тем не менее, обычные методы удаления эндотоксина, такие как ультрафильтрация, разделение фаз Triton X, являются низкоэффективными и неудовлетворительными [159].

Хотя ЛПС от гладких и грубых деформаций может рассеиваться поверхностно-активные вещества, такие как TritonX-100 [134].

Поэтому решили извлечь и очистить плазмиду , используя TritonX-100 и фенол-хлороформ [139].

После этого оптическую плотность трех амплифицирующих плазмид измеряли с помощью спектрофотометра.

Для определения антигенной и иммуногенной активности рекомбинантного ДНК, полученного в качестве иммуногена использовали морских свинок. Получены плазмиды omp31, p39, sp41 с добавлением адъюванта 3% ГОА в конечной концентрации 18%.

По литературным данным лекарственные средства, содержащие адъювант ГОА имеют низкую вязкость, что обеспечивает более легкий проход через шприц [18].

В наших исследованиях рекомбинантные гены сорбированные на адъюванте ГОА формируют достаточно высокий уровень защиты.

При бруцеллезе реакцию РНГА использовали многие авторы, которые установили специфичность и более высокую чувствительность, по сравнению с РА, РСК, РДСК, роз бенгал пробой (РБП) и РИД с О-ПС антигеном [47].

При иммунизации ДНК-вакцин в организм вводят не белок-антиген, а нуклеиновую кислоту (ДНК), в которой закодирована информация о белке . Это вакцины на основе плазмидных ДНК, кодирующих протективные антигены возбудителей инфекционных заболеваний [19]. В отношении некоторых новых препаратов существуют сомнения, они требуют совершенствования и доработок, однако, несмотря на трудности на этапах создания или применения, являются перспективными профилактическими средствами для современного здравоохранения [20 ].

Вакцинация считается наиболее эффективным и экономически эффективным средством предотвращения различных инфекционных патогенных микроорганизмов, в то время как стимулирование сильного иммунного ответа для обеспечения долгосрочной защиты все еще остается главной проблемой. Чтобы преодолеть эту проблему, было бы полезно использовать соответствующий адъювант с вакцинами [198]

Максимальные титры антител в сыворотке животных иммунизированных моно антигенами оmp31, р39, sp41 составлял 1:160-1:640. При введении смеси трех антигенов отмечали более высокий титр 1:1280-2560, соответственно с адъювантами ГОА и PEI. Иммунизация живой вакциной из штамма Rev-1 вызывало наиболее высокий уровень прироста антител. Эти результаты чувствительности согласуются с Mohan A. et al [144].

Официально признанный диагностический комплекс в нашей стране при бруцеллезе у животных наблюдается реакция агглютинации (РА) и реакция связывания комплемента (РСК) [13], но на основе большого количества фактического материала было установлено, что РНГА с разработанным новым антигеном эритроцитов по диагностической эффективности значительно превосходит другие методы диагностики бруцеллеза (РА, РСК, РДСК, РБП, МПОГ с антигеном O-PS и др.) используется в ветеринарной практике, взятых

вместе, выявляет пациентов с бруцеллезом у животных в более раннее время после заболевания и может заменить все эти реакции [47].

Для оценки антигенной активности рекомбинантных ДНК генов, иммунизировли морских свинок и через 21 день после иммунизации заражали живой агаровой культурой второй генерации вакцинного штамма Br.melitensis

С -5 -5

Rev-1 в дозе 1 х 10 КОЕ/см внутрибрюшинно в объеме 1 см .

Штамм B. melitensis Rev-1 обеспечивает достаточно высокий уровень защиты, однако он имеет два недостатка: длительная сенсибилизация животных, приводящая к вмешательству в последующие аллергические тесты и формирование анти-Rev-! антитела, которые исчезают с различной скоростью у отдельных животных [119 ].

Несколько ДНК-вакцин, включая рекомбинантные P39, Omp31, были оценены с центральной целью вызывания ТЫ-ответа, но основным недостатком этих вакцин является их относительно низкая защита и необходимость в нескольких бустерных дозах или первичном повышении, и для оценки требуются дополнительные исследования. Эффективность этих кандидатов антигенов в животноводстве [196].

Начальным этапом фагоцитоза микроорганизмов является их распознавание специфическими рецепторами на поверхности мембраны фагоцитарных клеток. моноциты /макрофаги не только имеют рецепторы для опсонинов, полученных из сыворотки, таких как иммуноглобулин G, Fc и комплемент, но также экспрессируют рецепторы, которые непосредственно связывают бактерии, распознавая молекулы, такие как LPS, липид A, белки наружной мембраны, липопротеины и маннозилированные структуры, которые экспонируются на поверхность микроорганизма [ 85].

Существует прямая связь между снижением фагоцитарной и функциональной активности нейтрофилов крови, степенью выраженности инфекционной аллергии при бруцеллезе [ 38].

Экспериментальное изучение антигенной и протективной активности ДНК антигенов свидетелствовало об активации клеточных и гуморальных механизмов иммунитета.

Установлен достоверный рост пролиферативной активности антителпродуцирующих спленоцитов на фоне применения ДНК оmp31+р39+sp41 с адъювантом ГОА, по сравнению с их раздельным применением, но этот показатель был ниже, чем при введении вакцины из штамма Rev-1.

Таким образом, при иммунизация ДНК антигенами и живой бруцеллезной вакциной у животных активируются клеточные механизмы иммунной защиты, и активируется пролиферативная активность, что свидетельствует об активации антителообразовании.

Динамика изменения показателей клеточной активности фагоцитоза после иммунизации также свидетельствовало о достоверном увеличении, количество фагоцитирующих клеток крови увеличилось в 2-3 раза, по сравнению с исходными данными.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют наличии об достаточно выраженнойц иммуногенности полученных ДНК отр31, р39, sp41 депонированных на ГОА и протективной активности выраженной в защите от диссеминации заражающего вакцинного штамма в организме модельных животных, и перспективности разработки вакцинного препарата против бруцеллеза животных с использованием ДНК отр31, р39, sp41 антигенов.

4. ВЫВОДЫ

1. Метод дробного прогревания в водяной бане при температуре 45°С в течение 20 мин, с охлаждением до +2 оС в течение 2 часов и повторное прогревание при температуре 80°С в течение 15 минут обеспечивает полноту инактивации и наиболее приемлим для молеклярно-генетических исследований штаммов Brucella.

2. Впервые получены гены omp31, sp41 и p39 B. melitensis и рекомбинантные плазмиды для конструирования ДНК иммунного препарата.

3. Проведена трансформация рекомбинантных плазмид в компетентных клетках E.coli XL1 и получены геномные белки omp31, sp41 и p39, которых подтверждена ПЦР-анализом и секвенированием.

4. Геномные белки omp31, sp41 и p39 и их ассоциация при введении морским свинкам безвредны, не вызывает аллергических реакций.

5. После иммунизации антигенами omp31, sp41 и p39 депонированных на ГОА и PEI у морских свинок активируется клеточные и гуморальные механизмы иммунитета. Динамика показателей фагоцитоза после иммунизации достоверно возрастало в 2-3 раза, по сравнению с исходными данными.

6. Установлен достоверный рост пролиферативной активности антителпродуцирующих спленоцитов и выработки специфических антител на фоне применения ДНК оmp31+р39+sp41 с адъювантом ГОА, уровень которых был несущественно ниже, чем при введении живой вакцины из штамма Rev-1.

7. Введение ассоциации антигенов omp31, sp41 и p39 оказывают более выраженную активацию антителогенеза по сравнению с моно антигенами.

8. ДНК оmp31+р39+sp41 с адъювантом обеспечивали защиту от диссеминации заражающего вакцинного штамма в организме модельных животных.

9. Полученные результаты позволяют рекомендовать рекомбинантные omp31, sp41 и p39 для клонирования и экспрессии специфических белков для иммунологических целей - создание вакцинных и диагностических препаратов.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ

ВЫВОДОВ

1. Разработанные методические подходы молекулярно-генетические исследований могут быть использованы в научной работе аспирантов, магистрантов при работе с геномом бактерий.

2. Результаты исследований рекомендуется использовать в учебном процессе при преподавании микробиологии, иммунологии и битехнологии в высших учебных заведениях.

6. ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Дальнейшие исследования, связанные с темой диссертации могут быть использованы для разработки ДНК вакцин против инфекциооных болезней, в том числе поливалентных и ассоциированных инфекций.

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Альбертян М.П. Вакцины против бруцеллеза: прошлое, настоящее и будущее / Альбертян М.П., Федоров А.И., Искандаров М.И. // Проблемы , касающиеся разных видов животных, 2006 - С.8-11.

2. Анагону С.И.Н. Особенности проявления бруцеллеза животных и борьбы с ним в странах африканского континента /Анагону С.И.Н., Скляров О.Д., Ватников Ю.А.// Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство - 2013 - № 2 - С. 55-60.

3. Аракелян П.К.Оптимизация противобруцеллезных мероприятий мелкого рогатого скота в современных условиях/ Аракелян П.К., Бондарева О.В.,Барабанова Е.Б., Димов С.К., Димова А.С. //Достижения науки и техники АПК - 2011 - №09-С.27-75.

4. Аскерова С.А. Модифицированные методы диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных животных / Аскерова С.А., Гулюкин М.И., Гулюкин

A.М., Искандаров М.И., Лайшев К.А., Слепцов Е.С., Винокуров Н.В., Федоров В.И., Захарова О.И., Павлова А.И.// Монография. - Новосибирск: Изд. АНС «СибАК», 2019. - 264с.

5. Атаходжаева Д.Р. Подострый бруцеллез и его клиникоиммунологическая характеристика / Атаходжаева Д.Р. // Вестник здоровье и образование в XXI веке - 2013 - № 10 - С. 1-9.

6. Бронников В.С. Спектрофотометрические профили поглощения сыворотки крови вакцинированных и заражённых бруцеллёзом животных / Бронников

B.С., Савицкий С.В. // достижения науки и техники АПК. - 2015 - Т.29. №4.

C. 53-55.

7. Веселовский С.Ю. Результаты испытания сплит-конъюгированной вакцины против бруцеллеза животных в комбинации с различными

иммуномодуляторами./ Веселовский С.Ю., Агольцов В.А., Попова О. М., Анников В. В., Девришов Д. А. // Научная жизнь. 2018. № 10. С. 153-163.

8. Веселовский С.Ю. Экспериментальное применение сплит-конъюгированной вакцины против бруцеллеза животных с использованием иммуномодулятора полиоксидония./ Веселовский С.Ю., Агольцов В.А., Попова О.М., Девришов Д.А., Козлов С.В. // Научная жизнь. 2018. №2. С. 89-100.

9. Генджиева О.Б. Эпизоотология и эпидемиология бруцеллеза в республике Калмыкия / Генджиева О.Б., Руденко А.В. // Вестник Калмыцкого университета - 2013 - Т. 1, № 17- С. 10-17.

10.Гордиенко Л.Н. Приживаемость типичных форм и l-вариантов бруцелл в органах и тканях северных оленей на территории очагов инфекции / Гордиенко Л.Н. //Достижения науки и техники АПК - 2010 - №12- С. 70-72.

11. Девришов Д.А. Сравнительная оценка ростовых свойств производственных культур бруцелл на различных питательных сред./ Девришов Д.А., Шведов В.В., Шведов Д.В., Бедоева З.М. //Ветеринарная медицина - 2014- № 1, С. 19-34.

12. Дегтяренко Л.В. Применениероз-бенгал пробы при дифференциальной поствакцинальной диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота / Дегтяренко Л.В., Скляров О.Д., Каликин И.Н. // Достижения науки и техники АПК. - 2015. - Т. 29, № 4- С.67-69.

13.Димов С.К. Экспресс-диагностика бруцеллеза животных с использованием ИФА / Димов С.К., Димова А.С., Сизов А.А., Стеблева Г.М., Куренская Н.И., Мельников Д.П., Сизов Д.А., Аракелян П.К.// Метод. Пособие / ИЭВСиДВ, ВНИИБТЖ, ООО НПФ «Сиббиотест», ООО «Сибитек» -Новосибирск.- 2014. - 21 с.

14. Дубровина В.И. Механизмы клеточного иммунного ответапри бруцеллезе / Дубровина В.И., Коновалова Ж.А., Ястремская К.Ю., Баранникова Н.Л., Токарева Л.Е., Балахонов С.В. //Эпидемиология и Вакцинопрофилактика -

2016 - № 6 ,Т. 91- С. 80-87

15.Ельшазли М.А Персептивы создания ДНК вакцин против бруцеллеза животных. / Ельшазли М.А., Девришов Д.А. // Современные технологии: актуальные вопросы, достижения и инновации Сборник статей XII Международной научно-практической конференции, Состоявшейся 23 декабря 2017г. в г. Пенза ЧАСТЬ 1 Пенза МЦНС «НАУКА и просвещение»

2017 С.268-270 Пенза 2018.

16.Ельшазли М.А. О конструировании ДНК вакцин против бруцеллеза животных. / Ельшазли М.А., Девришов Д.А. // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. Материалы XVII Всероссийской конференции молодых ученых. ВНИИСХБ. 10-20, 04.2018, С.194-195, Москва 2018.

17.Ельшазли М.А. Приготовление культур бруцелл и выделение ДНК для иммунобиотехнологических целей / Ельшазли М.А., Девришов Д. А., Бедоева З.М., Марзанова С.Н., Малюченко О.П. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. - 2019- №1. С. 22-28.

18.Жугунисов К.Д. Сравнительная оценка эффективности различных адъювантов при изготовлении инактивированной вакцины против блутанга / Жугунисов К.Д., Таранов Д.С., Ершебулов З.Д., Жунушов А.Т., Абдураимов Е.О.// Актуальные вопросы ветеринарной биологии - 2017 - Т. 3 , № 35- С.31-37.

19.Зверев, В. Вакцины: от Дженнера и Пастера до наших дней / Зверев В. // Наука и жизнь. - 2006. - № 3. - С. 27-32.

20.Исаенко Е.Ю. Вакцины нового поколения /Исаенко Е.Ю., Бабич Е.М., Елисеева И.В., Ждамарова Л.А., Белозерский В.И., Колпак С.А // Вестник Смоленской государственной медицинской академии - 2015 - Т. 14, № 2 - С. 50-57/

21.Искандаров М.И. Бруцеллез животных в России. / Искандаров М.И., Гулюкин М.И., Гулюкин А.М., Искандарова С.С., Альбертян М.П., Федоров А.И., Слепцов Е.С., Винокуров Н.В., Федоров В.И. // Монография. -Новосибирск: Изд. АНС «СибАК», 2017. - 286 с.

22.Искандаров М.И. Бруцеллез животных в России: эпизоотологические особенности и совершенствование специфической профилактики./ Искандаров М.И. // Автореферат дассертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук - 2011.

23.Кузнецова И.В. Изучение генетического разнообразия штаммов бруцелл, выделенных в северо-кавказском федеральном округе / Кузнецова И.В., Ковалев Д.А., Евченко Ю.М., Шакирова Л.И., Швецова Н.М., Пономаренко Д.Г., Писаренко С.В., Жиров А.М., Лукина А.А., Куличенко А.Н. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2017- №3- С. 58-62.

24. Кулаков Ю.К..Молекулярные аспекты персистенции бруцелл / Кулаков Ю.К.// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология - 2016 - №1 -С. 3-8

25.Кушалиев К.Ж. Диагностика бруцеллёза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) / Кушалиев К.Ж., Зулхарнаева Р.Г., Сивожелезова Н.А. // Ветеринарные науки - 2012 - С. 109-110.

26.Литвинова З.А. Обеспечение эпизоотического и ветеринарно-санитарного благополучия животноводческих отраслей амурской области / Литвинова З.А. // Дальневосточный аграрный вестник. - 2018 - №2(46) - С.77- 84.

27. Лямкин Г. И. Эпидемическая ситуация по бруцеллезу в Российской федерации и государствах — участниках содружества независимых государств/ Лямкин Г. И., Пономаренко Д.Г., Худолеев А.А., Вилинская С.В., Зайцев А.А., Куличенко А.Н.// Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение - 2016 - №1 - С. 68-74

28.Михайлов Л.М. Изучение иммуногенных свойств термоэкстрактов из бруцелл в Б- и 1-формах на морских свинках / Михайлов Л.М., Баранникова Н.Л., Токарева Л.Е., Витязева С.А., Старовойтова Т.П., Дубровина В.И., Балахонов С.В.// Эпидемиология и Вакцинопрофилактика - 2016 - № 4 (89)-С. 82-86.

29.Нафеев А.А. Эпидемические проявления бруцеллеза на благополучной территории/Нафеев А. А., Буртаева Н. Т., Никулкина Н. П., Безик В. В.// Эпидемиология и инфекционные болезни - 2012 - № 4 - С. 40-42.

30.Нурпейсова А.Х. Перспективы изучения полиморфизма генов гамма-интерферонапри хроническом бруцеллезе / Нурпейсова А. X., Коломеец А. Н. // Клиническая лабораторная диагностика - 2016 - Т. 61, № 2 - С. 110113.

31. Нурпейсова А.Х. Серомониторинг за лицами профессиональной группы риска по бруцеллезу/Нурпейсова А.Х., Берёзкина Г.В., Штрек С.В., Зеликман С.Ю., Кузьменко Н.А.// Национальные приоритеты России -2017- Т. 4, № 26 - С. 137-139.

32.Охапкина В.Ю. Эпидемическая опасность бруцеллеза в современных условиях / Охапкина В.Ю., Пяткова Н.В., Павлов Д.Л., Суслопаров А.А.// Эпидемиология и Вакцинопрофилактика - 2016 - № 3 (88) - С. 15-22.

33.Поляков М.А. Эпизоотическая ситуация по бруцеллёзу крупного рогатого скота в Оренбургской области и некоторые аспекты её мониторинга /

Поляков М.А., Савина И.В., Нургалиева Р.М., Селин С.В., Шишкин А.П. //ВЕТЕРИНАРИЯ - 2014- С. 82-85.

34.Пономаренко Д.Г, Русанова Д.В., Куличенко А.Н. ОБ эпизоотолого-эпидемиологической Ситуации по Бруцеллезу в российской федерации в 2016 г. и Прогноз на 2017 г / Пономаренко Д.Г, Русанова Д.В., Куличенко А.Н. // Пробл. особо опасных инф. - 2017- Т. 2 - С. 23-27.

35.Россельхознадзор Информационно - Аналитический Центр, Эпизоотическая ситуация в странах мира - 29 апреля 2016 г - № 90.

36.Саидова Б. М. Аллергодиагностика бруцеллеза / Саидова Б. М., Ахмедов Д. Р., Саидов M. C.// Клиническая лабораторная диагностика - 2013 - № 3 - С. 16-17.

37.Сансызбай А.Р. Изучение морфологических свойств изолятов бруцелл в S- и R-формах электронно-микроскопическим методом, ветеринарная медицина / Сансызбай А.Р., Еспембетов Б.А., Зайцев В.Л., Зинина Н.Н., Сырым Н.С., Султанкулова К.Т., Сармыкова М.К., Нисанова Р.К. // Вестник Алтайского государственного аграрного университета . - 2013 - V.12, № 110- С. 74-79.

38. Саркисян Н.С. Интенсивность специфической сенсибилизации и иммунный статус у больных бруцеллезом / Саркисян Н.С., Д.Г. Пономаренко, О.В. Логвиненко, Е.Л. Ракитина, М.В. Костюченко, А.Н. Куличенко // Медицинская иммунология - 2016 - Т. 18, № 4. С. 365-372.

39. Слепцов Е.С. Усовершенствование средств и методов диагностики бруцеллеза северных оленей в условиях якутии/ Слепцов Е. С., Винокуров Н. В., Федоров В. И., Григорьев И. И., Захарова О. И.//Аграрный вестник Урала - 2018 - № 05 (172) - С. 54-58.

40. Ульшина Д.В. Применение времяпролетной масс-спектрометрии для диагностики бруцеллеза и межвидовой дифференциации штаммов brucella

Брр/ Ульшина Д.В., Ковалев Д.А., Бобрышева О.В., Пономаренко Д.Г., Русанова Д.В., Ковалева Н.И., Куличенко А.Н. // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение.-2018 - Т. 7, № 4 - С. 15-24.

41. ФГБНУ (Научно-исследовательский институт- республиканский исследовательский научно- консультационный центр экспертизы), Вакцинология: современные проблемы, вызовы и перспективные направления. Аналитический обзор, Москва 2015.

42. Хаммадов Н. И. Маркерные локусыгенома бруцеллдля дифференциальной пцр индикации патогенных штаммов / Хаммадов Н.И., ОсянинК.А., Усольцев К.В., Фаизов Т.Х., Хаммадова А.В., Шуралев Э.А.// Проблемы о собоопасных инфекций. - 2018 -№ 3 - С.88-93

43.Цирельсон Л.Е. К эпидемиологической и иммунологической оценке очагов бруцеллеза в России /Цирельсон Л.Е., Желудков М.М. , Кулаков Ю.К. , Хадарцев О.С., Скляров О.Д.//Эпидемиология и Вакцинопрофилактика -2012 - № 5 (66) - С. 24- 29

44.Цирельсон Л.Е. Обзор проблем вакцинопрофилактики бруцеллеза / Цирельсон Л.Е., Желудков М.М., Кулаков Ю.К.// Эпидемиология и Вакцинопрофилактика - 2013 - № 3 (70) - С. 77-81.

45.Юсупов О.Ю. Вакцина из штамма В. теШеш1вКеу-1 для профилактики бруцеллеза овец и коз / Юсупов О.Ю., Кабардиев С.Ш.,Газимагомедов М.Г., Халиков А.А.,Девришов Д.А.,Скляров О.Д.,Климанов А.И. // Ветеринария.-2016.- № 11.-С. 21-24.-Рез. англ.-Библиогр.: с.24.

46.Юсупов О.Ю. Способ изготовления вакцины против бруцеллеза мелкого рогатого скота./ Юсупов О.Ю., Кабардиев С.Ш., Девришов Д.А. // патент , 2642316, 2018.

47. Яникова Э.А. Изыскание метода получения бруцеллезного эритроцитарного антигена для РНГА/ Яникова Э.А.; Хаиров С.Г.; Юсупов О.Ю.; Алиев

А.Ю.//Журнал: Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана - 2015 - №1, Т.221- С. 269-273.

48.Abkar M. Subcutaneous immunization with a novel immunogenic candidate (urease) confers protection against Brucella abortus and Brucella melitensis infections./ Abkar M., Amani J., Sahebghadam L. A., Nikbakht B. G., Alamian S., Kamali M.// APMIS - 2015 - V. 123- P. 667-675.

49. Adone R. Epidemiosurveillance of brucellosis / Adone R., Pasquali P. // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 2013- V. 32, № 1- P. 199-205.

50. Alisha W. B. R. Molecular cloning, expression and purification of Brucella abortus 544 phosphoglycerate kinase in a pMAL vector / Alisha W. B. R., Hannah L. T. S., HuynhT. H., Lauren T. A., Wongi M., Hu J. L., Hong H. Ch., Suk K. // J. Prev. Vet. Med. - 2014 - V. 38, № 4 - P. 75-78.

51. Al-Mariri A. A DNA vaccine encoding p39 and sp41 of Brucella melitensis induces protective immunity in BALB/c mice / Al-Mariri A., Akel R., Abbady A.Q. // Arch. Med. Vet. - 2014 - V. 46 - P. 53-62.

52. Al-Mariri A. Evaluation of the immunogenicity and the protective efficacy in mice of a DNA vaccine encoding SP41 from Brucella melitensis / Al-Mariri A., Abbady A.Q // J. Infect. Dev. Ctries - 2013- V. 7, № 4 - P. 329-337.

53. Al-Mariri A. Induction of immune response in BALB/c mice with a DNA vaccine encoding bacterioferritin or P39 of Brucella spp. / Al-Mariri A., Tibor A., Mertens P., De Bolle X., Michel P., Godfroid J., Walravens K., Letesson J.J. // Infection and immunity - 2001- V. 69, №. 10 - P. 6264-6270.

54. Apostólico J.dS. Adjuvants: classification, modus operandi, and licensing. /Apostólico J.dS., Lunardelli V.A.S., Coirada F.C., Boscardin S.B., Rosa D.S. // Journal of Immunology Research - 2016 - Volume 2016 - 16 pages.

55.Apostolico J. dS. Dendritic cell targeting effectively boosts T cell responses

elicited by an HIV multiepitope DNA vaccine / Apostolico J. dS., Lunardelli

97

V.A., Yamamoto M.M., Souza H.F., Cunha-Neto E., Boscardin S.B., et al.// Front Immunol.- 2017- V. 8, № 101 .

56.Azam S. Genetic Characterization and Comparative Genome Analysis of Brucella melitensis Isolates from India. / Azam S., Rao S. B., Jakka P., Rao V. N., Bhargavi B., Gupta V. K., and Radhakrishnan G. // Hindawi Publishing Corporation International Journal of Genomics . - 2016 - V. 2016 - Ps. 13.

57. Babiuk L.A. Induction of immune responses by DNA vaccines in large animals / Babiuk L.A., Pontarollo R., Babiuk S., Loehr B., van Drunen Littel-van den Hurk S. // Vaccine - 2003 - V. 21 - P. 649-658.

58. Babiuk S. A single HBsAg DNA vaccination in combination with electroporation elicits long-term antibody responses in sheep / Babiuk S., Tsang C., van Drunen Littel-van den Hurk, S., Babiuk L.A. Griebel P.J. // Bioelectrochemistry - 2007-V. 70 - P. 269-274.

59. Bai H. Cytoplasmic transport and nuclear import of plasmid DNA / Bai H., Lester G.M.S., Petishnok L.C., Dean D.A. // . Biosci. Rep. - 2017- V. 37.

60. Beninati C. Immunogenic mimics of Brucella lipopolysaccharide epitopes / Beninati C., Garibaldi M., Carla Lo Passo, Mancuso G., Papasergi S., Garufi G., Pernice I., Teti G., Felici F. // Peptides - 2009 - V. 30 - P. 1936-1939.

61. Blasco J. M. Brucellosis vaccines and vaccine candidates. / Blasco J. M., Moreno E., Moriyond I. // Veterinary Vaccines for Developing Countries. Chapter 5f. S. -FAO (Rome) - 2016.

62. Blasco J. M. Control and eradication of Brucella melitensis infection in sheep and goats / Blasco J. M., Molina-Flores B. // Vet. Clin. North Am.Food Anim. Pract. -2011- V.27- P. 95-104.

63. Brandsma J.L. DNA vaccine design / Brandsma J.L. // Methods in Molecular Medicine - 2006 - V. 127 - P. 3-10.

64.Caminiti A. Tuberculosis, Brucellosis and Leucosis in Cattle: A Cost Description of Eradication Programmes in the Region of Lazio, Italy / Caminiti A., Pelone F., Battisti S., Gamberale F., Colafrancesco R., Sala M., La Torre G., Della Marta U., Scaramozzino P., et al. // Transbound Emerg. Dis. - 2016.

65. Carvalho T.F. Meta-Analysis and Advancement of Brucellosis Vaccinology./ Carvalho T.F., Haddad J.P.A., Paixao T.A., Santos R.L. // PLoS ONE - 2016 -V.11, No.11- P. 1-28.

66.Castañeda-Roldán E. I. Characterization of SP41, a surface protein of Brucella associated with adherence and invasion of host epithelial cells /Castañeda-Roldán E. I., Ouahrani-Bettache S., Saldaña Z., Avelino F., Rendón M. A., Dornand J. and Girón J. A.// Cellular Microbiology - 2006 - V. 8, №. 12 - P. 1877-1887

67.Cloeckaert A. Major outer membrane proteins of Brucella spp. : past, present and future /Cloeckaert A., Vizcaino N., Paquet J-Y., Bowden R.A., Elzer P.H.//Veterinary Microbiology - 2002 - V. 90 - P. 229-247.

68.Coban C. DNA vaccines: A simple DNA sensing matter / Coban C., Kobiyama K., Jounai N., Tozuka M., Ishii K. J. // Human Vaccines & Immunotherapeutics -2013 - V. 9, № 10 - P. 2216-2221.

69. Corbel M.J. Brucellosis in humans and animals /Produced by the World Health Organization in collaboration with the Food and Agriculture Organizationof the United Nations and World Organisation for Animal Health// 2006.

70.Corner L. A. Persistence of Brucella abortus strain 19 infection in adult cattle vaccinated with reduced doses / Corner L. A., Alton G. G. // Res Vet Sci - 1981-V. 31- P. 342-344.

71. Dhama K. DNA vaccines and their applications in veterinary practice: current perspectives / Dhama K., Mahendran M., Gupta P. K., Rai A. // Vet. Res. Commun. - 2008 - V. 32 - P. 341-356.

72. Dean A. S. Global burden of human brucellosis: A systematic review of disease frequency. / Dean A. S., Crump L., Greter H., Schelling E., Zinsstag, J. // Plos. Negl. Trop. Dis. - 2012 - V.6 -P. 1865.

73. Denisov A.A. The Russian experience in brucellosis veterinary public health / Denisov A.A., Sclyarov O.D., Salmakov K.M. , Shumilov K.V. // Rev. sci. tech.Off. int. Epiz. - 2013- V. 32, № 1 - P. 229-237.

74. Dhama K., Mahendran M., Gupta P. K., Rai A. DNA vaccines and their applications in veterinary practice: current perspectives / Dhama K., Mahendran M., Gupta P. K., Rai A. // Vet Res Commun - 2008- V. 32 - P. 341-356.

75. Ding X. In ovo vaccination with the Eimeria tenella EtMIC2 gene induces protective immunity against coccidiosis / Ding X., Lillehoj H.S., Dalloul R.A., Min W., Sato T., Yasuda A., Lillehoj E.P. // Vaccine - 2005 - V. 23 - P. 37333740.

76. Dornand J. The innate immune response against Brucella in humans / Dornand J., Gross A., Lafont V., et al. // Vet. Microbiol. - 2002 - V. 90, № 3 - P. 83-94.

77. Dorneles E. M. Genetic stability of Brucella abortus isolates from an outbreak by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA16) / Dorneles E. M., Santana J. A., Alves T. M., Pauletti R.B., Mol J.P., Heinemann M.B., Lage A.P. // BMC Microbiol - 2014- V. 14- P. 186.

78. Dorneles E. M. Recent advances in Brucella abortus vaccines / Dorneles E. M., Sriranganathan N. , Lage A. P. // Veterinary Research - 2015 - V. 46 , № 76.

79. Ducrotoy M. J. Brucellosis as an emerging threat in developing economies: lessons from Nigeria. / Ducrotoy M. J., Bertu W. J., Ocholi R. A., Gusi A. M., Bryssinckx W., Welburn S., Moriyon I. // Plos. Negl. Trop. Dis. - 2014 - V. 8 - P. 3008.

80. Dunham S.P. The application of nucleic acid vaccines in veterinary medicine / Dunham S.P. // Research in Veterinary Science - 2002 - V. 73 - P. 9-16.

81. Faurez F. Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection / Faurez F., Dory D., Le Moigne V., Gravier R., Jestin A. // Vaccine - 2010 - V. 28, № 23- P. 3888-3895.

82.Felber B.K. HIV DNA Vaccine: Stepwise improvements make adifference / Felber B.K., Valentin A., Rosati M., Bergamaschi C., Pavlakis G.N. // Vaccines -2014- V. 2 - P. 354-379.

83. Feodorova V. A. Russian vaccines against especially dangerous bacterial pathogens / Feodorova V. A., Sayapina L. V. , Corbel M. J., Motin V. L. // Emerging Microbes and Infections - 2014- V. 3, № 86.

84. Fernández L. V. Omp31 plays an important role on outer membrane properties and intracellular survival of Brucella melitensis in murine macrophages and HeLa cells / Fernández L. V., • Navarro R. O., Alcántara- F.J. B., Ramírez A. C., Rodríguez A. V. // Arch Microbiol, 2017.

85. Fernandez-Prada C. M. Interactions between Brucella melitensis and Human Phagocytes: Bacterial Surface O-Polysaccharide Inhibits Phagocytosis, Bacterial Killing, and Subsequent Host Cell Apoptosis / Fernandez-Prada C. M., Zelazowska E. B., Nikolich M., Hadfield T. L., Roop R. M. II, Robertson G. L. and Hoover D.L// Infection and immunity- 2003 - V. 71, No. 4 - P. 2110-2119.

86.Ficht T. A. Brucellosis: The Case for Live, Attenuated Vaccines / Ficht T. A., Kahl-McDonagh M. M., Arenas-Gamboa A. M., and Rice-Ficht A. C.// Vaccine. Author manuscript; available in PMC - 2010 - 9 pages.

87.Figueiredo de P. Pathogenesis and immunobiology of brucellosis: review of Brucella-host interactions / Figueiredo de P., Ficht T.A., Rice-Ficht A., Rossetti C.A., Adams L.G. // Am. J. Pathol. - 2015- V. 185 - P. 1505-1517.

88. Finco O. and Rappuoli R. Designing Vaccines for the Twenty-First Century Society / Finco O. and Rappuoli R // Front Immunol. 2014. №5. Article 12.

89.Fluegel A.M. Abortion and premature birth in cattle following vaccination with Brucella abortus strain RB51 / Fluegel A.M., Cornish T.E., O'Toole D., Boerger-Fields A.M., Henderson O.L., Mills K. W. // J. Vet. Diagnostic Invest. - 2013- V. 25- P. 630-635.

90. Galinska E. M. Brucellosis in humans - etiology, diagnostics, clinical forms / Galinska E. M., Zagorski J. // Annals of Agricultural and Environmental Medicine - 2013 - V. 20, № 2 .

91. Garg R. Alum adjuvanted rabies DNA vaccine confers 80% protection against lethal 50 LD50 rabies challenge virus standard strain / Garg R., Kaur M., Saxena A., Prasad R., Bhatnagar R. // Mol. Immunol. - 2017 - V. 85, 166-173.

92. Garin-Bastuji B. Brucella melitensis infection in sheep: present and future / Garin-Bastuji B., Blasco J. M., Grayon M., Verger J. M. // Vet. Res. - 1998- V. 29 - P. 255-274.

93. Godfroid J. From the discovery of the Malta fever's agent to the discovery of marine mammal reservoir brucellosis has continuously been a re-emerging zoonosis. / Godfroid J., Cloeckaert A., Liautard J.P., Kohler S., Fretin D. Walravens K. // Vet. Res. - 2005 - V. 36 - P. 313-326.

94. Godfroid J. Brucellosis at the animal/ecosystem/human interface at the beginning of the 21st century / Godfroid J., Scholz H.C., Barbier T., Nicolas C., Wattiau P., Fretin D., et al. // Prev. Vet. Med. - 2011- V. 102 - P. 118-131.

95.Godfroid J. Brucellosis in livestock and wildlife: zoonotic diseases without pandemic potential in need of innovative one health approaches / GodfroidJ. // Arch Public Health. - 2017- V. 75, № 34.

96. Golding B. Immunity and protection against Brucella abortus / Golding B., Scott D.E., Scharf O., et al. // Microbes Infect - 2001- V. 3 - P. 43-48.

97. Golshani M. Improved immunogenicity and protective efficacy of a divalent DNA vaccine encoding Brucella L7/L12-truncated Omp31 fusion protein by a

DNA priming and protein boosting regimen / Golshani M., Rafati S., Siadat S.D., Moheimani M. N., Shahcheraghi F., Arsang A., Bouzari S. // Molecular Immunology - 2015- V. 66 - P. 384-391.

98. Gómez L. Multivalent Fusion DNA Vaccine against Brucella abortus / Gómez L., Llanos J., Escalona E., Sáez D., Alvarez F., Molina R., Flores M., Oñate A. //HindawiBioMed Research International - 2017 - V. 2017 - 8 pages.

99. Grant E.V. Enhancement of plasmid DNA immunogenicity with linear polyethylenimine / Grant E.V. , Thomas M., Fortune J., Klibanov A. M., Letvin N. L., // Eur. J. Immunol. - 2012 - V. 42 - P. 2937-2948.

100. Gupta P.K. A DNA vaccine that encodes rabies virus glycoprotein lacking transmembrane domain enhances antibody response but not protection / Gupta P.K., Sharma S., Walunj S.S., Patil A.A., Rai A., Saini M. // Acta Virologica -2006 - V. 50 - P. 87-92.

101. Gurunathan S. DNA vaccines: immunology, application, and optimization / Gurunathan S., Klinman D.M., Seder R.A. // Annual Reviews in Immunology -2000 - V. 18 - P. 927-974.

102. Haidari G. Combined skin and muscle vaccination differentially impact the quality of effector T cell functions: The CUTHIVAC-001 randomized trial / Haidari G., Cope A., Miller A., Venables S., Yan C., Ridgers H., Reijonen K., Hannaman D., Spentzou A., Hayes P., et al. // Sci. Rep. - 2017 - V. 7 - P. 13011.

103. Hassanain N.A. Sero-prevalence of brucellosis in Egypt with emphasis on potential risk factors / Hassanain N.A. and Ahmed M.W. // World Journal of Medical Sciences - 2012- V. 7, № 2 - P. 81-86.

104. Hobernik D. Review DNA Vaccines—How Far From Clinical Use? / Hobernik D., Bros M. // Int. J. Mol. Sci. -2018 - V. 19 - P. 3605.

105. Hornstein B.D. Effects of circular DNA length on transfection efficiency by electroporation into HeLa Cells / Hornstein B.D., Roman D., Arevalo-Soliz L.M., Engevik M.A., Zechiedrich L.// PLoS One - 2016.

106. Hosein H.I. Evaluation of the General Organization of Veterinary Services control program of animal brucellosis in Egypt: An outbreak investigation of brucellosis in buffalo / Hosein H.I., Zaki H.M., Safwat N.M., Menshawy A.M.S., Rouby S., Mahrous A., Madkour B.E. // Veterinary World - 2018- V. 11, № 6 -P. 748-757.

107. Hull N. C. and Schumaker B. A. Comparisons of brucellosis between human and veterinary medicine / Hull N. C. and Schumaker B. A.// Infection ecology & Epidemiology - 2018 - V. 8 - 12 pages.

108. Ihsan M. A. Serological diagnostic potential ofrecombinant outer membrane proteins (rOMPs) from Brucella melitensis in mouse model using indirect enzyme-linked immunosorbent assay / Ihsan M. A., Siti K. B., Latiffah H., Abdul Rani B. , Abdul Rahman O. // BMC Veterinary Research - 2015- V. 11 - P. 275.

109. Im Y.B. Evaluation of Th1/Th2-Related Immune Response against Recombinant Proteins of Brucella abortus Infection in Mice / Im Y. B., Park W. B., Jung M., Kim S.,Yoo H.S. // J. Microbiol. Biotechnol. - 2016 - V. 26, № 6 -P.1132-1139.

110. Ivanov A.V. A live vaccine from Brucella abortus strain 82 for control of cattle brucellosis in the Russian Federation / Ivanov A.V., Salmakov K. M., Olsen S.C., Plumb G.E. // Anim. Health. Res. Rev. - 2011- V. 12 - P. 113-121.

111. Jiang L. Novel chitosan derivative nanoparticles enhance the immunogenicity of a DNA vaccine encoding hepatitis B virus core antigen in mice / Jiang L., Qian F., He X., Wang F., Ren D., He Y., Li K., Sun S., Yin C. // Journal of Gene and Medicine - 2007 - V. 9 - P. 253-264.

112. Jorritsma S.H.T. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines / Jorritsma S.H.T., Gowans E.J., Grubor-Bauk B., Wijesundara D.K. // Vaccine - 2016- V. 34 -P. 5488-5494.

113. Kaur G. Cloning, Expression and Characterisation of Recombinant Outer Membrane Protein 16 from Brucella spp. / Kaur G.,Verma R., Kumar B. V. S., Deka D., Agrawal R. K. // Proc. Natl. Acad. Sci., India, Sect. B Biol. Sci. - 2015-V. 85, № 3 - P. 853-858.

114. Khan K. H. DNA vaccines: roles against diseases / Khan K. H. // GERMS -2013 - V. 3, № 1 - P. 26.

115. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects / Krieg

A.M. // Annual Reviews Immunology - 2002 - V. 20 - P. 709-760.

116. Kawanishi M. Genotoxicity of formaldehyde: molecular basis of DNA damage and mutation/ Kawanishi M., Matsuda T. and Yagi T.// Frontiers in environmental science - 2014 - V. 2 - article 36.

117. Khan M. Z. and Zahoor M. An Overview of Brucellosis in Cattle and Humans, and its Serological and Molecular Diagnosis in Control Strategies / Khan M. Z. and Zahoor M.// Trop. Med. Infect. Dis. - 2018 - V. 3, No.65 - 14 pages.

118. Kutzler M. A. DNA vaccines: ready for prime time? / Kutzler M. A., Weiner D.

B. // Nat. Rev. Genet. - 2008 - V. 9, № 10 - P. 776-788.

119. Lalsiamthara J. Development and trial of vaccines against Brucella / Lalsiamthara J., Lee J. H. // J. Vet. Sci. - 2017- V. 18, №1 - P. 281-290.

120. Lamolinara A. Intradermal DNA Electroporation Induces Cellular and Humoral Immune Response and Confers Protection against HER2/neu Tumor / Lamolinara A., Stramucci L., Hysi A., Iezzi M., Marchini C., Mariotti M., Amici A., Curcio C. // J. Immunol. Res - 2015 - P. 145-159

121. Lee S.H. DNA vaccines, electroporation and their applications in cancer treatment / Lee S.H., Danishmalik S.N., Sin J.I. // Human Vaccines & Immunotherapeutics - 2015- V. 11, № 8 - P. 1889—1900.

122. Leifert J.A., Whitton J. L. Immune Responses to DNA Vaccines: Induction of CD8 T Cells, Austin (TX): Landes Bioscience; 2000-2013. Chapters taken from the Madame Curie Bioscience Database [internet].

123. Li L. Molecular mechanisms for enhanced DNA vaccine immunogenicity / Li L., Petrovsky N. // Expert. Rev. Vaccines - 2016 - V. 15 - P. 313-329.

124. Li M.T. Model-Based Evaluation of Strategies to Control Brucellosis in China / Li M.T., Sun G.Q., Zhang W.Y., Jin Z. // International Journal Environmental Research and Public Health. 2017. V.14, No. 3 - C. 295.

125. Lim J.J. Protective effects of recombinant Brucella abortus Omp28 against infection with a virulent strain of Brucella abortus 544 in mice / Lim J.J., Kim D.H., Lee J.J., Kim D.G., Min W., Lee H.J., Rhee M.H., Kim S. // J. Vet. Sci. -2012 - V. 13, № 3 - P. 287-292.

126. Lin A. Effects of bacterial inactivation methods on downstream proteomic analysis / Lin A., Merkley E. D., Clowers B. H., Hutchison J. R., Kreuzer H. W. // Journal of Microbiological Methods - 2015 - No. of Pages 8.

127. Lin G.Z. Immunogenicity of adenovirus and DNA vaccines co-expressing P39 and lumazine synthase proteins of Brucella abortus in BALB/c mice / Lin G.-Z., Yang Ju-T., Wei Suo-Ch., Chen Shi-En, Huo Sh.-D., Ma Z.-R. // Tropical Animal Health and Production - 2018 - V. 50 - C. 957-963.

128. Liu M.A. DNA vaccines: an historical perspective and view to the future, / Liu M.A. // Immunological Reviews - 2011- V. 239- P. 62-84.

129. Liu M.A. DNA vaccines: a review / Liu M.A. // Journal of Internal Medicine -2003- V. 253 - P. 402-410.

130. Liu Wen-xing. Expression, purification, and improved antigenic specificity of a truncated recombinant bp26 protein of Brucella melitensis M5-90: apotential antigen for differential serodiagnosis of brucellosis in sheep and goats/ Liu Wen-xing, Hu Sen, Qiao Zu-jian, Chen Wei-ye, Liu Lin-tao, Wang Fang-kun, Hua Rong-hong, Bu ZHi-gao, and Li Xiang-rui // Biotechnology and Applied Biochemistry - 2011 - V. 58, № 1 - P. 32-38.

131. Loehr B.I. Suppository-mediated DNA immunization induces mucosal immunity against bovine herpesvirus-1 in cattle / Loehr B.I., Rankin R., Pontarollo R., King T., Willson P., Babiuk L.A., van Drunen Littel-van den Hurk, S.// Virology - 2001- V. 289 - P. 327-333.

132. Lopez-Santiago R. Immune Response to Mucosal Brucella Infection. /Lopez-Santiago R, Sanchez-Argaez AB, De Alba-Nünez LG, Baltierra-Uribe SL and Moreno-Lafont MC// Front. Immunol. - 2019- V.10- Article 1759.

133. Luo D. Protective immunity elicited by a divalent DNA vaccine encoding both the L7/L12 and Omp16 genes of Brucella abortus in BALB/c mice / Luo D., Ni B., Li P., Shi W., Zhang S., Han Y., Mao L., He Y., Wu Y., Wang X. // Infect Immun. - 2006- V. 74 - P. 2734-2741.

134. Magalhaes P. O. Methods of Endotoxin Removal from Biological Preparations: a Review / Magalhaes P. O., Lopes A. M., Mazzola P. G., C. R. Yagui, Penna T.C. V., A. Pessoa Jr. // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. (www. cspsCanada.org) -2007 - V. 10, № 3- P. 388-404.

135. Mamat U. Detoxifying Escherichia coli for endotoxin-free production of recombinant proteins / Mamat U., Wilke K., Bramhill D., Schromm A.B., Lindner

B., Kohl T. A., Corchero J. L., Villaverde A., Schaffer L., Head S. R., Souvignier

C., Meredith T. C. , Woodard R.W. // Microbial Cell Factories - 2015 - V. 14,№ 57.

136. Manat Y. Expression, purification and immunochemical characterization of recombinant OMP28 protein of Brucella species / Manat Y., Shustov A.V., Evtehoval E., Eskendirova S.Z. // Open Veterinary Journal - 2016 - V. 6, № 2 -P. 71-77.

137. Mansoori N. Vaccines and Vaccine Candidates against Brucellosis / Mansoori N., Pourmand M. R. // Infect Epidemiol Med. - 2016 - V. 2, № 4 - P. 32-36.

138. Mark Saltzman W. DNA vaccines: methods and protocols / edited by Mark Saltzman W., Hong Shen, Janet L. Brandsma.// 2nd ed. 2006.

139. McKiernan H.E., Danielson P.B. InMolecular Diagnostics (Third Edition) / McKiernan H.E., //2017.

140. Meeusen Els N. T. Current Status of Veterinary Vaccines / Meeusen Els N. T., Walker J., Peters A., Paul-Pierre Pastoret, Jungersen G. // Clinical Microbiology Reviews - 2007 - V. 20, № 3- P. 489-510.

141. Mesureur J. A Simple and Safe Protocol for Preparing Brucella Samples for Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Analysis / Mesureur J.,Ranaldi S.,Monnin V.,Girard V.,Arend S.,Welker M.,O'Callaghan D., Lavigne J.Ph.,Keriel A. // Journal of Clinical Microbiology -2016 - V. 54 - p. 449 -452.

142. Mirkalantari S. Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector / Mirkalantari S., Amirmozafari N., Kazemi B., Irajian G.// Asian Pacific Journal of Tropical Medicine - 2012 - P. 511-513.

143. Moreno, E. Retrospective and prospective perspectives on zoonotic brucellosis / Moreno, E. // Front Microbiol- 2014 - V. 5 - P. 213.

144. Mohan A A comparison of titers of anti-Brucella antibodies of naturally infected and healthy vaccinated cattle by standard tube agglutination test, microtiter plate agglutination test, indirect hemagglutination assay, and indirect

enzyme-linked immunosorbent assay/ Mohan A, Saxena HM, Malhotra P //Veterinary World - 2016- V. 9, No. 7- P. 717-722.

145. Moriyón I. Rough vaccines in animal brucellosis: structural and genetic basis and present status / Moriyón I., Grilló M. J., Monreal D., González D., Marín C., López-Goñi I., Mainar-Jaime R. C., Moreno E., Blasco J. M. // Vet. Res. -2004 -V. 35 - P. 1-38.

146. Myhr A.I. DNA Vaccines: Regulatory Considerations and Safety Aspects / Myhr A.I. // Curr. Issues Mol. Biol. - 2017 - V. 22 - P. 79-88.

147. Naghavi M. Design and Production of a Novel Recombinant Chimeric IL2-Omp31 Antigen against Brucella Infection / Naghavi M., Sekhavati M.H., Tahmoorespur M., Nassiri M.R. // Archives of Razi Institute - 2018 - V. 73, № 3 - P. 199-206.

148. Nicoletti P. Vaccination / Nicoletti P. // In Animal Brucellosis, P. 283-299. Edited by K. H. Nielsen & J. R. Duncan. Boca Raton: CRC Press, 1990.

149. OIE. Bovine brucellosis / In Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals - 2012- P. 616-50.

150. OIE, cfsph, USDA, 2003-2018, "Brucellosis", www.cfsph.iastate.edu - P. 1-14. (online).

151. OIE 2016. Chapter 2.1.4.: Brucellosis (Brucella abortus, B. melitensis and Brucella suis / OIE // 2016

152. Oliveira S.C. Recent advances in understanding immunity against brucellosis: application for vaccine development / Oliveira S.C., Macedo G.C., de Almeida L.A., de Oliveira F.S., Oñate A., Cassataro J., Giambartolomei G.H. // Open Vet. Sci. J. - 2010 - V. 4- P. 102-108.

153. Olsen S.C. Essential role of vaccines in brucellosis control and eradication programs for livestock / Olsen S.C., Stoffregen W.S. // Expert Rev Vaccines -2005- V. 4 - P. 915-928.

154. Oshop G.L. DNA vaccination in avian / Oshop G.L., Elankumaran S., Heckert R.A. // Veterinary Immunology and Immunopathology - 2002 - V. 89 - P. 1-12.

155. Patial S. Virus neutralizing antibody response in mice and dogs with a bicistronic DNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein and canine parvovirus VP2 / Patial S., Chaturvedi V.K., Rai A., Saini M., Chandra R., Saini Y., Gupta P.K.// Vaccine - 2007 - V. 25 - P. 4020-4028.

156. Paul de Figueiredo. Pathogenesis and Immunobiology of Brucellosis Review of Brucellae Host Interactions / Paul de Figueiredo, Ficht T. A., Rice-Ficht A., Rossetti C. A., Adams L. G. // The American Journal of Pathology - 2015 - V. 185, № 6.

157. Pereiro P. Transcriptome profiles associated toVHSV infection or DNA vaccination in turbot(Scophthalmus maximus) / Pereiro P., Dios S., Boltana S., Coll J., Estepa A., Mackenzie S., Novoa B., Figueras A.// PlosOne - 2014 - V. 9.

158. Pérez-Sancho M. Control of Animal Brucellosis — The Most Effective Tool to Prevent Human Brucellosis / Pérez-Sancho M., García-Seco T., Domínguez L. and Álvarez J.// INTECH - 2015 - Chapter 13 - P. 201-246.

159. Petsch D. Endotoxin removal from protein solutions / Petsch D., Anspach F.B. // J. Biotechnol. - 2000 - V. 76 - P. 97-119.

160. Prazeres D.M.F. Plasmid Biopharmaceuticals / Prazeres D.M.F.; Monteiro G.A. // Microbiol. Spectrum - 2014 - V. 2.

161. Raska M. DNA Vaccines for the Induction of Immune Responses in Mucosal Tissues / Raska M., Turanek J. // Chapter | 67 - 2015.

162. Refai M. Incidence and control of brucellosis in the Near East region / Refai M. // Vet. Microbiol. - 2002 - V.90, № 81- P. 110.

163. Saez J. L. Comparison of depopulation and S19-RB51 vaccination strategies for control of bovine brucellosis in high prevalence areas / Saez J. L., Sanz C.,

Durán M., García P., Fernandez F., Minguez O., Carbajo L., Mardones F., Perez A., Gonzalez S., Domínguez L., Alvarez J. // Veterinary Record - 2014

164. Sales N.S. In vivo electroporation enhances vaccine-mediated therapeutic control of human papilloma virus-associated tumors by the activation of multifunctional and effector memory CD8(+) T cells / Sales N.S., Silva J.R., Aps L., Silva M.O., Porchia B., Ferreira L.C.S., et al. // Vaccine - 2017.

165. Salmakov K. M. Comparative study of the immunobiological properties of live brucellosis vaccines / Salmakov K. M., Fomin A.M., Plotnikova E.M., Safina G.M., Galimova G.M., Salmakova A.V., Ivanov A.V., Panin A.N., Sklyarov O.D., Shumilov K.V., Klimanov A.I. // Vaccine - 2010- V. 28, № 5 - P. 35-40.

166. Sagripanti J.L. Microbial Inactivation for Safe and Rapid Diagnostics of Infectious Sample / Sagripanti J.L., Hulseweh B., Grote G., VoB L., Bohling K., Marschall H.J. // Journal of applied and environmental microbiology - 2011 - P. 7289-7295.

167. Samaha H. Multicenter Study of Brucellosis in Egypt / SamahaH., Al-RowailyM., KhoudairR. M. , AshourH. M. // Emerg .Infect . Dis. - 2008 - V.14, № 12.

168. Sancho P., Tejedor C., Sidhu-Muñoz R. S., Fernández-Lago L., Vizcaíno N. Evaluation in mice of Brucella ovis attenuated mutants for use as live vaccines against B. ovis infection / Sancho P., Tejedor C., Sidhu-Muñoz R. S., Fernández-Lago L., Vizcaíno N. // Veterinary Research - 2014 - V. 45, № 61.

169. Schurig, G. G. Brucellosis vaccines: past, present and future / Schurig, G. G., Sriranganathan N., Corbel M. J. // Vet. Microbiol. - 2002- V. 90 - P. 479-496.

170. Shams H. Recent developments in veterinary vaccinology / Shams H. // Veterinary Journal - 2005- V. 170 - P. 289-299.

171. Sharma A.K. DNA vaccines: future strategies and relevance to intracellular pathogens / Sharma A.K., Khuller G.K. // Immunology and Cell Biology - 2001-V. 79 - P. 537-546.

172. Siadat S. D. Brucellosis Vaccines: An Overview, Zoonosis / Siadat S. D., Salmani A. Sh., Aghasadeghi M. R. // Dr. Jacob Lorenzo-Morales (Ed.), InTech -2012 -Available from: http://www.intechopen.com/books/zoonosis/brucellosis-vaccines.

173. Simborio H.L.T. Strategies for the development of an effective vaccine against Brucellosis / Simborio H.L.T., Reyes A.W.B., Hop H.T., Arayan L.T., Min W., Lee H.J., Chang H.H, Kim S. // J. Prev. Vet. Med. - 2014- V. 38, № 2- P. 53-60.

174. Singh A. 16S rRNA and Omp31 Gene Based Molecular Characterization of Field Strains of B. melitensis from Aborted Fetus of Goats in India / Singh A., Gupta V. K., Kumar A., Singh V. K., Nayakwadi Sh. // The Scientific World Journal - 2013 - V. 2013, Ps. 7.

175. Sislema-Egas F. Evaluation of protective effect of DNA vaccines encoding the BAB1_0263 and BAB1_0278 open reading frames of Brucella abortus in BALB/c mice / Sislema-Egas F., Cespedes S., Fernandez P., Retamal-Diaz A., Saez D., Onate A. // Vaccine - 2012- V. 30 - P. 7286-7291.

176. Skendros P. and Boura P. Immunity to brucellosis / Skendros P. and Boura P. // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. - 2013 - V. 32 , No. 1- P.137-147.

177. Sprague L. D. A review on camel brucellosis: a zoonosis sustained by ignorance and indifference / Sprague L. D., Al-Dahouk S., Neubauer H. // Pathog. Glob. Health. - 2012 - V. 106 - P. 144-149.

178. Stachyra A. DNA vaccines against influenza / Stachyra A., Gora-Sochacka A., Sirko A. // Acta Biochimica Polonica - 2014 - V. 61, № 3 - P. 515-522.

179. Sung K. Y. and Yoo H. S. Host immune responses during Brucella infection: A brief review / Sung K. Y. and Yoo H. S. // J. Prev. Vet. Med. - 2014 - V. 38, No. 1 - P. 26-34.

180. Suschak J.J. Advancements in DNA vaccine vectors, non-mechanical delivery methods, and molecular adjuvants to increase immunogenicity / Suschak J.J., Williams J.A., Schmaljohn C.S. // Hum. Vacc. Immunother. - 2017- V.13 - P. 2837-2848.

181. Tadepalli G. Brucella spp Asa Zoonotic Pathogen: A Review / Tadepalli G., Balakrishna K., Sripathy Murali H.C., Batra H.V. // J. Vet. Med. Res. -2016- V. 3, № 4- P. 1058.

182. Teske S. S. Animal and Human Dose-Response Models for Brucella Species / Teske S. S., Huang Y., Tamrakar S. B., Bartrand T. A., Weir M.H. , Haas C. N. // Risk Analysis - 2011- V. 31, № 10.

183. Tolmachov, O. Designing Plasmid Vectors. / Tolmachov, O. // Methods in Molecular Biology - 2009 - C. 117-129.

184. Traxler R. M. A Literature Review of Laboratory-Acquired Brucellosis / Traxler R. M., Lehman M.W., Bosserman E. A., Guerra M. A., Smith T. L. // Journal of Clinical Microbiology - 2013 - V. 51, № 9 - P. 3055-3062.

185. Trumpfheller C. The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine / Trumpfheller C., Caskey M., Nchinda G., Longhi M.P., Mizenina O., Huang Y., et al. // Proc Natl Acad Sci USA - 2008.

186. Vahedi F. Construction of an expression plasmid (vector) encoding Brucella melitensis outer membrane protein, a candidate for DNA vaccine / Vahedi F., Ghorbani E., Falsafi T. // Reports of Biochemistry & Molecular Biology - 2013 -V. 1, № 2.

187. Velikovsky C. A DNA vaccine encoding lumazine synthase from Brucella abortus induces protective immunity in BALB/c mice / Velikovsky C. A., Cassataro J., Giambartolomei G.H., Goldbaum F.A., Estein S., Bowden R.A., Bruno L., Fossati C.A., Spitz M.// Infect. Immun. - 2002 -V.70 - P. 2507-2511.

188. Vemulapalli R. Brucella abortus RB51: enhancing vaccine efficacy and developing multivalent vaccines / Vemulapalli R., He Y., Sriranganathan N., Boyle S.M. Schurig G.G. // Vet Microbiol.- 2002- V. 90, №1-4- P. 521-532.

189. Wareth G.Animal brucellosis in Egypt / Wareth G., Hikal A., Refai M., Melzer F., Roesler U., Neubauer H. // J. Infect. Dev. Ctries - 2014 - V. 8, №11 - P. 1365-1373.

190. Wareth G. Comprehensive Identification of Immunodominant Proteins of Brucella abortus and Brucella melitensis Using Antibodies in the Sera from Naturally Infected Hosts / Wareth G., Eravci M., Weise C., Roesler U., Melzer F., Sprague L. D. , Neubauer H. , Murugaiyan J. // Int. J. Mol. Sci. - 2016 - V. 17-P. 659.

191. Williams J.A. Improving DNA vaccine performance through vector design / Williams J.A. // Curr. Gene Ther. - 2014 - V. 14 - P. 170-89.

192. Wolff J. A. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo / Wolff J. A., Malone R.W., WilliamsP., Chong W., Acsadi G., Jani A., et al. // Science - 1990 -V. 247- P. 1465-1468.

193. World Health Organization 2006/Brucellosis in humans and animals.

194. Wyatt H.V. Lessons from the history of brucellosis / Wyatt H.V. // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.- 2013- V. 32, №1.- P.17-25.

195. Xu Y. Intranasal DNA vaccine for protection against respiratory infectious diseases: the delivery perspectives / Xu Y., Yuen P.W., Lam J.K. // Pharmaceutics - 2014 - V. 6 - P. 378-415.

196. Yang X. Progress in Brucella vaccine development / Yang X., Skyberg J. A., Cao L., Clapp B., Thornburg T., Pascual D.W. // Front Biol. (Beijing) - 2013- V. 8, № 1- P. 60-77.

197. Yang X. Selection of Protective Epitopes for Brucella melitensis by DNA Vaccination. / Yang X., Hudson M., Walters N., Bargatze R. F., Pascual D. W. // infection and immunity - 2005 - , V. 73, № 11- P. 7297-7303.

198. Yousefi S. Nanoparticle or conventional adjuvants: which one improves immune response against Brucellosis / Yousefi S., Abbassi-Daloii T., Tahmoorespur M., Sekhavati M.H. // Iran J. Basic Med. Sci. - 2019 - V. 22 - P. 360-366.

199. Zaneti A.B. Dendritic Cell Targeting Using a DNA Vaccine Induces Specific Antibodies and CD4+ T Cells to the Dengue Virus Envelope Protein Domain III / Zaneti A.B., Yamamoto M.M., Sulczewski F.B., Almeida B. S., Souza H.F.S., Ferreira N.S., Maeda D.L.N.F., Sales N.S., Rosa D.S., Ferreira L.C.dS. , Boscardin S.B. // Front. Immunol. - 2019 - V. 10, № 59.

200. Zheng R. A Systematic Review and Meta-Analysis of Epidemiology and Clinical Manifestations of Human Brucellosis in China / Zheng R., Xie S., Lu X., Sun L., Zhou Y., Zhang Y. and Wang K. // BioMed Research International V. 2018, 10 pages.

201. Zygmunt M. S. Identification of Brucella melitensis 16M genes required for bacterial survival in the caprine host / Zygmunt M. S., Hagius S. D., Walker J. V. , Elzer P. H. // Microbes and Infection - 2006 - V. 8 - P. 2849-2854.

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ - МВА ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА» ОГРН 1037739216790 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д.23. тел. [phone], факс: [phone] e-mail: [e-mail], сайт: www.mgavm.ru от

На № от

СПРАВКА

об использовании научных результатов диссертационной работы

Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед

на тему «Изучение антигенной активности рекомбинантных ДНК отрЗ 1, р39, эр41

В.теШегшэ на модельных животных»

Результаты научных исследований Ельшазли Маха Ахмед Эльсайед используются в учебной процессе на кафедре иммунологии и биотехнологии при изучении курса иммунология (в разделе вакцинологии) и биотехнология лекарственных средств ветеринарного применения (конструирование ДНК вакцин).

Методы подготовки и получения бактериальных культур, выделения антигенно-активных генов ДНК, конструирования рекомбинантных ДНК и изучения протективной активности на модельных животных используются в научной работе кафедры, а также при выполнений диссертационных работ аспирантами и магистрантами.

Лгровет

ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ

«АГРОВЕТ»

109472 Москва, ул. Ташкентская д.Э4, корп.5 Тел 377-69-87,т/факс [phone]. email: agrovet® asrovet.ru ИНН 7721138777 КПП 772101001 ОГРН 102773967161« _

/д. W

№ /V

СПРАВКА

об использовании научных результатов диссертационной работы Елыпазли Маха Ахмед Эльсайед

на тему «Изучение антигенной активности рекомбинантных ДНК отрЗ 1, р39, Бр41

В.теШег^Б на модельных животных»

Елыпазли Маха Ахмед Эльсайед на научно-производственной базе ООО «Агровет» проводила исследования по получению бактериальных антигенов и субклеточных культур бруцелл для ДНК-технологий и экспериментальное изучение протективной активности на морских свинках.

Молекулярно-генетические методы с бактериальными культурами используются в опытах по разработке новых биобезопасных вакцинных и диагностические препаратов.

Заместитель генерального директора по научной работе и контролю качества биологичес| доктор биологиче^ З.М.Бедоева

XVIII научная конференция молодых ученых

«Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии»

00

0

CM

1

H

<

ш

X

*

ш

U

z

ш

G

1Л

#