Изменение метаболома бактерий класса молликут под воздействием внешних факторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Ванюшкина, Анна Алексеевна

• Ванюшкина, Анна Алексеевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Ванюшкина, Анна Алексеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Актуальность работы

Цель работы

Научная новизна и практическая значимость работы

Апробация работы

Личный вклад автора

Объем работы

Публикации

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Особенности метаболизма молликут

2.2 Реконструкции карт метаболизма исследуемых организмов

2.3 Основные методы, используемые для анализа метаболитов бактерий

2.3.1 Тушение метаболизма и экстракция метаболитов

2.3.2 Методы разделения и анализа метаболитов

2.3.2.1 Газовая хроматография

2.3.2.2 Капиллярный электрофорез

2.3.2.3 Жидкостная хроматография

2.3.2.4 Выбор оптимальных условий проведения хроматографического разделения метаболитов

2.3.3 Детектирование и идентификация метаболитов

2.4 Обработка данных и интерпретация результатов анализа метаболитов

2.4.1 Обработка полученных данных

2.4.2 Способы интерпретации полученных результатов

2.5 Оценка адаптационных возможностей бактерий с применением

метаболомного анализа

2.5.1 Применение качественного анализа метаболитов

2.5.2 Применение количественного анализа метаболитов

2.6 Перспективы метаболомики

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Штамм бактерий и условия культивирования

3.2 Определение устойчивости культуры к кислотному и осмотическому воздействию

3.2.1 Определение устойчивости культуры к кислотному воздействию

3.2.2 Определение устойчивости культуры к осмотическому воздействию

3.3 Химические реактивы

3.4 Экстракция метаболитов

3.5 Инструменты и ВЭЖХ-МС параметры

3.6 Идентификация метаболитов и программное обеспечение

3.7 Сравнительный анализ метаболомов & теШ/егит, М. ^аШьерИсит и А. 1тс11ами

3.8 Выравнивание аминокислотных последовательностей

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Анализ метаболома бактерий А. \aidlawu, & теШ/егит и М. gallisepticum

4.2 Реконструкция метаболизма & теШ/егит, М. gallisepticum и А.ЫсИамИ

4.2.1 Удаление реакций из первичной схемы метаболизма

4.2.2 Реакции, приводящие к образованию «мертвых концов» в схеме метаболизма

4.2.3 Заполнение пробелов в схеме метаболизма

4.2.4 Выявленные особенности метаболизма молликут

4.3 Пентозофосфатный путь в клетках молликут

4.4 Составление списков возможных внутриклеточных метаболитов исследуемых видов молликут

4.5 Детектирование метаболитов трех видов молликут с помощью метода ВЭЖХ-МС/МС

4.6 Идентификация метаболитов бактерий А. ШсИами, & теШ/егит и М. gallisepíicum

4.7 Сравнительный количественный анализ метаболомов трех видов М.

^аШьерИсит, А. \aidlawii и & теШ/егит

4.8 Накопление метаболитов относительно компонентов отдельных метаболических путей Б. теШ/егит, М. %аШ$ерИсит и А. ЫШстп

4.9 Влияние аминокислотных замен на активность ферментов

4.10 Исследование адаптации молликут к кислотному воздействию

4.11 Исследование адаптации молликут к осмотическому воздействию

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Выравнивание аминокислотных последовательностей ферментов

Список сокращений

МС - масс-спектрометрия ГХ- газовая хроматография

HILIC - жидкостная хроматография на основе гидрофильного взаимодействия

ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография

УВЭЖХ - ультра высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-МС/МС - комплекс высокоэффективной жидкостной хроматографии и

тандемной масс-спектрометрии

RMS - комбинационная микроспектроскопия

SIMS - масс-спектрометрия вторичных ионов

Q/ QQQ - квадрупольный масс-спектрометр/ тройной квадрупольный масс-спектрометр

i-TRAP- масс-спектрометр типа ионная ловушка

TOF - времяпролетный масс-спектрометр

Q-TOF - квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр

FTICR- масс-анализатор ионно-циклотронного резонанса с Фурье-

преобразованием

ЯМР- ядерный магнитный резонанс ЕС - классификация ферментов ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота ЦТК - цикл трикарбоновых кислот ФАД - флавинадениндинуклеотид ФМН - флавинмононуклеотид

НАДФ/НАДФН - никотинамидадениндинуклсотидфосфат/восстановленная форма никотинамидадениндинуклеотидфосфата

НАД/НАДН - никотинамидадениндинуклеотид/ восстановленная форма

никотинамидадениндинуклеотида

АМФ - аденозинмонофосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат

ГМФ - гуанозинмонофосфат

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

УМФ - уридинмонофосфат

дУТФ - дезоксиуридинмонофосфат

дУДФ - дезоксиуридиндифосфат

ЦМФ - цитидинмонофосфат

дТДФ - дезокситимидиндифосфат

дТТФ - дезокситимидинтрифосфат

Актуальность работы

Термин «системная биология» подразумевает комплексное исследование сложных биологических систем на различных уровнях их организации. Системная биология, как относительно новая дисциплина, призвана интерпретировать уже накопленные и вновь получаемые экспериментальные данные для понимания принципов организации живого и способности организмов к адаптации при изменении условий окружающей среды. Метаболомика, являющаяся частью системной биологии, предоставляет новые возможности для достижения этой цели [1]. Развитие методов, позволяющих идентифицировать и количественно оценивать метаболиты клетки, позволяет расширить наши представления о биологических процессах в клетке. Исследования метаболического профиля организма позволяют получить мгновенный «снимок» клеточной активности и выявить новые взаимосвязи между закономерностями репликации, транскрипции и трансляции функционально сложных мультиферментных систем.

Одним из направлений системной биологии, использующих метаболомный анализ, является исследование принципов организации биологических объектов, характеризующихся ограниченной генетической информацией (малым размером генома) и, следовательно, небольшими ресурсами регуляции. Проведение метаболомных исследований организмов с наиболее просто устроенным метаболизмом позволяет не только дополнять существующие данные, но и моделировать различные условия жизнедеятельности бактерии с целью определения механизмов адаптации. В качестве модельного объекта в данной работе были выбраны три вида бактерии класса молликут- Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum, Mycoplasma gallisepticum. Ключевым моментом в использовании молликут в качестве модельного объекта стала простота их устройства. Бактерии класса молликут (также называемые микоплазмами) представляют собой виды одноклеточных организмов, способные автономно реплицироваться на искусственных питательных средах. Молликуты ведут

паразитический образ жизни и имеют в естественной среде обитания одного или нескольких хозяев [2]. Эти микроорганизмы являются основными возбудителями ряда респираторных и урогенитальных инфекционных заболеваний человека и животных, в том числе пневмонии и уретрита. Для молликут характерны: значительно редуцированный геном, размеры которого варьируются от 580 тыс. до 1.4 млн. пар оснований, низкое содержание Г-Ц оснований (31 % для М. gallisepticum), отсутствие клеточной стенки и большинства ферментов, ответственных за биосинтез метаболитов. Между тем, ограниченный метаболизм молликут не является препятствием для их адаптации и выживания в разных условиях. Накопленные данные об отсутствии у молликут некоторых систем ферментативной регуляции наряду со способностью клеток адаптироваться к различным условиям роста, делают их удобным модельным объектом для изучения принципов организации и механизмов адаптации минимальной живой системы на метаболическом уровне.

Исследования метаболома простейших бактерий позволяют выявить соединения и метаболические пути, которые необходимы для их жизнедеятельности. Так, метаболомные исследования, проведенные для бактерий Mycoplasma pneumoniae, позволили не только построить точную модель метаболизма этих организмов, прогнозирующую поведение клетки в различных условиях, но и определить минимальный состав искусственной питательной среды, необходимой для культивирования этих бактерий [3]. Идентификация основных метаболитов и анализ изменения их внутриклеточной концентрации при различных воздействиях предоставляет исследователям возможность выявлять механизмы регуляции биохимических процессов в клетке. Результаты анализа внутриклеточных метаболитов, взятые вместе с данными протеомного анализа и данными аннотирования генов, позволили нам выявить потенциальные механизмы адаптации A. laidlcnvii, S. melliferum, М. gallisepticum к внешним воздействиям и определить особенности метаболизма каждого вида бактерий.

Цель работы

Исследовать метаболом трех видов молликут - М. ^аШзерйсит, & теШ/егит, и А. \aid\a\vii при культивировании клеток в оптимальных лабораторных условиях, а также при адаптации к кислотному и осмотическому внешним воздействиям.

Задачи работы:

1. Реконструировать метаболические карты А. \aidla\vu, & теШ/егит, М.

g^аШверНсит и составить базы данных внутриклеточных метаболитов для каждого вида.

2. Выбрать и отработать оптимальные условия для проведения анализа метаболитов в клетках молликут с использованием ВЭЖХ-МС/МС метода и провести анализ метаболома бактерий А. \aidlawni, М. ^аШБерИсит, & теШ/егит, культивируемых в оптимальных условиях.

3. Сопоставить между собой данные метаболомного анализа для 5". теШ/егит, A.laidlawii и А/. ^сйНьерИсит и выявить особенности метаболизма каждого вида.

4. Провести сравнительный анализ относительных концентраций метаболитов в клетках М. %аШ$ерйсит, А. \aidla\vii и теШ/егит.

5. Сопоставить данные о накоплении метаболитов с аминокислотными заменами в активных центрах ферментов & теШ/егит, М. gallisepticum, А. \aidla\m, катализирующих реакции с участием накапливающихся метаболитов для анализа влияния таких замен на активность ферментов.

6. Провести анализ изменения метаболома бактерий 6". теШ/егит, А. laidla\\,ii и М %аШ$ерйсит в условиях кислотного и осмотического воздействий для выяснения способов адаптации бактерий к осмотическому и кислотному воздействиям.

Научная новизна и практическая значимость работы

Настоящая работа направлена на изучение принципов организации минимальной живой системы на метаболическом уровне при исследовании бактерий класса молликут. Молликуты являются возбудителями инфекционных заболеваний человека, сельскохозяйственных животных и растений, поэтому исследование принципов регуляции их метаболизма имеет не только фундаментальную, но и практическую значимость для здравоохранения и сельского хозяйства. Демонстрация активации уникальных метаболических путей в клетках микоплазм позволит использовать их в качестве мишеней при разработке новых лекарственных средств.

С помощью метода гидрофильной хроматографии, совмещенной с времяпролетной масс-спектрометрией, в работе был впервые проведен анализ метаболома бактерий класса молликут и реконструированы карты метаболизма трех исследуемых видов. Кроме того, впервые был охарактеризован метаболом клеток А. 1тс11а\т, Б. теШ/егит, М. gallisepticum в нормальных условиях и в условиях кислотного и осмотического воздействия.

Благодаря полученным данным удалось определить различия в механизмах регуляции трех видов молликут на метаболомном уровне и предложить механизмы биохимической адаптации молликут к внешним воздействиям. Показаны отличия в механизмах приспособления к внешним воздействиям между теШ/егит, А. 1акИамп1 и М. %а1ШерНсит. Определены особенности метаболизма каждого вида. Полученные данные могут быть использованы для создания новых противомикробных препаратов, с учетом специфики организации метаболизма клеток разных видов молликут.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых НИИ Физико-химической медицины (Москва, 23-24 мая 2012 г.); на конференции Европейской молекулярно-биологической организации (Хайдельберг, 17-20 ноября 2012 г.); конференции молодых ученых НИИ физико-химической медицины (Москва, 28-29 мая 2013 г.); 9-ой ежегодной конференции метаболомного сообщества (Глазго, 1-4 Июля 2013 г.); 380м конгрессе федерации европейских биохимических обществ (Санкт-Петербург, 6-11 ноября 2013 г.

Личный вклад автора

Все экспериментальные научные результаты, изложенные в диссертации, их анализ, обобщение литературных данных и оценка результатов выполнены лично автором под руководством Камашева Д.Э.

Объем работы

Диссертация содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты и дискуссия, заключение, выводы, благодарности, список литературы и приложение. Работа изложена на 163 страницах, содержит 8 таблиц и 17 рисунков.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ, из которых 3 статьи в международных рецензируемых изданиях и 5 публикаций в трудах конференций.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение метаболома бактерий класса молликут под воздействием внешних факторов»

1. ВВЕДЕНИЕ

Системная биология призвана интерпретировать уже накопленные и вновь получаемые экспериментальные данные геномного, транскриптомного, протеомного и метаболомного анализа для понимания принципов организации организма и его способности к адаптации при изменении условий окружающей среды. В настоящий момент полностью расшифрованы и аннотированы более четырех тысяч геномов различных микроорганизмов. Для большинства видов бактерий уже получены данные протеомного и транскриптомного анализа. Однако данные о транскрипции мРНК, расшифровка ДНК-последовательностей и данные протеомного анализа не раскрывают полностью всех процессов, происходящих в клетках. Метаболомика, как часть системной биологии, предоставляет новые возможности для исследования принципов организации живой системы. Анализ метаболома является трудоемкой задачей и требует индивидуального подхода при изучении каждого конкретного микроорганизма, поэтому наиболее полные метаболомные данные, на сегодняшний день, получены лишь для хорошо изученных видов. Однако именно метаболический профиль организма представляет собой тот конечный результат клеточной активности на всех остальных уровнях регуляции, который позволяет объединить все накопленные многоуровневые «омные» данные для получения целостного представления об организме.

Несмотря на аннотирование полных геномов множества микроорганизмов, функции многих генов остаются неизвестны и многие преобразования в клетке катализируются неопределенными ферментами. Наиболее простой подход для решения задачи функциональной аннотации гена разработан на основании метаболомного анализа. Такой метод заключается в анализе изменений концентраций метаболитов в «нокаутных» штаммах (то есть штаммах с делецией определенного гена) [4, 5]. Для такого штамма ожидаемым изменением в метаболоме является накопление субстратов реакций, катализируемых соответствующим удаленному гену ферментом. Детектирование накоплений

метаболитов в клетках при делеции гена позволяют точно функционально аннотировать ген [6-8]. Исследование метаболитов позволяет также охарактеризовать важнейшие пути метаболизма на уровне взаимосвязей между низкомолекулярными компонентами клетки и выявить новые пути протекания превращений метаболитов в клетке [9]. Так, группа ученых под руководством профессора Пейрауда в 2009 году продемонстрировала наличие каждого из метаболитов предполагаемого пути биосинтеза глиоксилата в клетках организма Methylobacteriiim extorquens [10]. Кроме того, выявление компонентов уже изученных метаболических путей является доказательством наличия активности соответствующего пути в клетках [11]. Например, в перспективном, с точки зрения биоэнергетики, организме Clostridium acetobutylicum, наличие цитрата в клетках послужило доказательством существования функционального цикла трикарбоновых кислот, несмотря на недостаток аннотированных ферментов [12]. Метаболомика является мощным инструментом количественной оценки динамики изменения содержания метаболитов. Такие данные могут расширить наше понимание механизмов адаптации организмов к различным условиям окружающей среды и выявить принципы взаимодействия патогенных микроорганизмов с хозяином [13-15]. Данные метаболомного анализа, взятые в совокупности с протеомными, транскриптомными и геномными данными позволяют реконструировать максимально приближенные к реальным объектам модели метаболизма. Построение точных моделей метаболизма является необходимым условием для прогнозирования поведения микроорганизма в различных условиях [16].

Для получения представления о механизмах регуляции фундаментальных биохимических процессов в клетке объектом исследования часто выбирают простейшие микроорганизмы, поскольку моделирование их метаболизма и интерпретация полученных результатов представляет собой более простую задачу, чем в случае использования в качестве модели клеток эукариот. Метаболизм бактерий устроен значительно проще, чем метаболизм эукариот, так как в состав их метаболома входит значительно меньше компонентов. На

сегодняшний день расшифрованы последовательности генома нескольких тысяч видов бактерий. Прямые связи между метаболитами, катализируемые ферментативными преобразованиями, подробно отображены в существующих базах данных метаболических путей, что упрощает задачу реконструкции единой схемы метаболизма выбранного организма и интерпретации полученных результатов. В качестве объектов исследований в данной работе были выбраны три вида бактерии класса молликут- А. \aidla\vu, теШ/егит, М. §аШзерИсит. Молликуты являются удобными модельными объектами для исследования минимальной живой системы, так как им свойственны предельная простота устройства клеток, отсутствие большинства путей биосинтеза, но в тоже время, способность адаптироваться к различным условиям культивирования. Для исследования принципов организации минимальной живой системы на примере молликут в работе были поставлены следующие вопросы: какие особенности метаболизма бактерий позволяют им адаптироваться к изменению условий окружающей среды, какие регуляторные механизмы приводят к оптимизации состояния клетки в различных условиях, в чем отличие механизмов адаптации в организмах близкородственных видов, проявляющих строгую специфичность к организму-хозяину? Метаболомика, как область системной биологии, направлена на решение этих вопросов благодаря возможности объяснить физиологические процессы с точки зрения согласованных взаимодействий многочисленных биохимических реакций. Поэтому исследование метаболизма микроорганизмов в настоящее время является одной из самых актуальных областей развития системной биологии, позволяющей выяснить фундаментальные закономерности, возможно, действующие и в более сложных живых системах.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 2.1 Особенности метаболизма молликут

Ключевым моментом в выборе молликут в качестве модельных объектов стала простота устройства их клеток и способность бактерий этого класса адаптироваться к различным условиям роста. Класс молликут представляет собой гетерогенную группу микроорганизмов, объединяющую микоплазмы, ахолеплазмы, спироплазмы, уреаплазмы, анаэроплазмы и термоплазмы. Представителей класса молликут характеризует ряд особенностей, уникальных для прокариот: отсутствие клеточной стенки и ее предшественников; наименьший среди прокариот размер генома (0,5-1,2 млн. п.н.); самое низкое относительно других микроорганизмов соотношение Г-Ц пар оснований в ДНК; чрезвычайно простая организация клетки, имеющей минимальное количество органелл: цитоплазматическую мембрану, более похожую на мембрану клеток эукариот, прокариотический нуклеоид и рибосомы; присутствие холестерина и его эфиров в плазматической мембране [17-19]. Проведение метаболомных исследований организмов с наиболее просто устроенным метаболизмом позволит не только дополнить существующие данные, но и моделировать различные условия их жизнедеятельности с целью определения механизмов адаптации к ним.

Объектами исследований были выбраны три вида бактерий класса молликут - Spiroplasma melliferum, Mycoplasma gallisepticum, и Acholeplasma laidlawii, являющиеся близкими родственниками, но имеющие отличия в специфичности по отношению к организму-хозяину и в некоторых метаболических путях.

Представители класса молликут очень широко распространены в природе как паразиты человека и других млекопитающих, птиц, рыб, моллюсков, насекомых, растений [20]. Их метаболизм зависит от клетки-хозяина, с которой они тесно связаны [19]. Микоплазмы проявляют строгую специфичность к организму-хозяину, нередко и тканеспецифичность. Однако существуют многочисленные примеры обнаружения Микоплазм в организмах и тканях,

отличающихся от обычных мест обитания бактерий [20]. Основные места обитания Микоплазм в человеке и животных - слизистые поверхности дыхательных путей и урогенитального тракта, глаза, желудочно-кишечный тракт, молочные железы, и суставы. М. gallisepticum - возбудитель хронических респираторных заболеваний кур и индеек. Я. теШ/етт является патогеном насекомых и инфицирует медоносных пчел [21]. Спироплазмы и фитоплазмы широко распространены в кишечнике, гландах и слюнных железах членистоногих. А. ШсИами способна заражать клеточные культуры и имеет широкий спектр хозяев, в том числе крупный рогатый скот, человек, птицы и растения, а первоначально этот вид бактерий был выделен из сточных вод [22-26]. Генетически редуцированные организмы имеют ограниченную приспособляемость к внешним факторам, однако за счет паразитического образа жизни молликуты обладают мощными адаптивными способностями [27]. Сравнение между собой метаболомов разных видов молликут может помочь выявить минимальные адаптивные функции простейших бактерий.

Метаболическая активность молликут, по всей видимости, направлена в первую очередь на производство энергии и выживание в изменяющихся условиях окружающей среды, а не на накопление субстратов для внутриклеточного биосинтеза. У микоплазм отсутствует большинство биосинтетических систем, взамен они используют метаболический аппарат организма-хозяина. Так, М. %епИаНит (близкий родственник исследуемых видов) имеет только один ген, ответственный за ферменты биосинтеза аминокислот, и несколько генов, ответственных за ферменты синтеза предшественников витаминов и нуклеиновых кислот [28]. У молликут отсутствуют гены, кодирующие ферменты биосинтеза жирных кислот, что ведет к зависимости микоплазм от внешнего источника этих веществ и дает возможность в эксперименте манипулировать составом жирных кислот в плазматической мембране [19].

В метаболизме микоплазм отсутствует цикл трикарбоновых кислот, синтез многих аминокислот, а также синтез пуринов и пиримидинов [29]. Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК или цикл Кребса), возможно, самый важный

центральный метаболический путь в живых клетках. Этот путь играет основную роль в производстве энергии и в биосинтезе ключевых промежуточных соединений для анаболических реакций. Несмотря на значимость этого цикла, многие бактерии, особенно патогенные микроорганизмы, имеют неполный ЦТК (например Pyrococcus horikoshii, Synechocystis, Rickettsia prowazekii), а у некоторых организмов (например, у исследуемых нами микоплазм), геномная аннотация ферментов этого цикла полностью отсутствует. Кроме исследуемых нами бактерий класса молликут, полное отсутствие аннотированных ферментов ЦТК показано также для Mycobacterium genitalium и Treponema pallidum [30].

В геноме всех видов молликут отсутствуют ферменты, катализирующие de novo синтез пуриновых и пиримидиновых оснований. В клетках молликут имеются ферменты синтеза нуклеотидов с использованием готовых азотистых оснований в качестве субстратов. Поэтому для нормального роста молликутам необходимо присутствие во внешней среде, по меньшей мере, одного пиримидинового нуклеозида и двух пуриновых оснований [3]. Нуклеозиды, имеющиеся в питательной среде, сначала преобразуется в соответствующие азотистые основания и затем используются для синтеза нуклеотидов. Для синтеза пиримидиновых нуклеотидов в клетках молликут необходимым и достаточным является наличие в питательной среде цитидина. Цитидин - нуклеозид, который может быть преобразован в уридин с помощью имеющегося у молликут фермента цитидиндэаминазы. Синтез пиридиновых нуклеотидов в молликутах осуществляется за счет фосфорилирующих ферментов уридин-, тимидилат- и цитидилат-киназы. Пуриновые мононуклеотиды синтезируются в молликутах путем переноса группы фосфорибозила к соответствующему основанию с помощью фермента фосфорибозилтрансферазы [2]. Например, реакция преобразования адешша в AMP в клетках молликут катализируется ферментом аденин-фосфорибозилтрансферазой. Фосфорибозилпирофосфат синтезируется в клетке с помощью реакций пентозофосфатного пути. Преобразование пурин-монофосфатов в трифосфаты осуществляется ферментами аденилат- или гуанилат-киназой [21].

Молликуты также не способны синтезировать аминокислоты и в основном получают их извне благодаря действию специальных ферментов - пермеаз. Исключением являются бактерии вида А. laidlawii, в геноме которых, в отличие от остальных молликут, аннотированы ферменты частичного биосинтеза аминокислот фенилаланина и тирозина из фосфоенолпирувата [23]. Также в клетках ахолеплазм имеется несколько ферментов, участвующих в биосинтезе такой аминокислоты как триптофан. В свою очередь, ферменты метаболизма аминокислот представлены во всех видах молликут.

Геному микоплазм свойственен минимальный набор генов синтеза АТФ, необходимый для жизнедеятельности и паразитирования клеток. Практически все молликуты лишены эффективной дыхательной системы. В их протеоме отсутствуют цитохромы, что исключает механизм генерации АТФ с помощью окислительного фосфорилирования [2, 31, 32]. Таким образом, метаболические пути молликут энергетически не производительны и сопряжены с постоянным импортом необходимых соединений для протекания внутриклеточных реакций из окружающей среды и в некоторых случаях приводят к истощению тканн хозяина по специфическим субстратам.

На основе способности молликут к метаболизму углеводов, их делят на ферментирующие и неферментирующие. В зависимости от типа молликут -пируват, генерирующийся в процессе гликолиза в клетках, может быть переработан до лактата лактатдегидрогеназой в клетках ферментирующих молликут или до ацетил-КоА по пируватдегидрогеназному пути в клетках неферментирующих молликут [33, 34]. Некоторые микоплазмы, такие как М. agalactiae, М. genitalium, и М. bovis, способны окислять органические кислоты (лактат, пируват) с образованием уксусной кислоты и СОг [31, 35]. Гены такого метаболизма пирувата были определены в некоторых микоплазмах, например, М. capricolum [36] и М. genitalium [34]. Члены ферментирующей группы молликут вырабатывают молочную кислоту (лактат) в процессе усвоения углеводов и снижают pH в среде культивирования в процессе роста. Определение нуклеотидных последовательностей генома и их аннотация показали, что S.

melliferum, M. gallisepticum и A. laidlawii относятся к ферментирующему типу и имеют все ферменты гликолиза - главного пути метаболизма глюкозы.

Важной особенностью углеводного метаболизма молликут является неполная представленность ферментов пентозофосфатного пути - в аннотации генома молликут отсутствует один из двух основных ферментов - трансальдолаза.

Способом выработки АТФ в условиях недостатка источников энергии в клетках молликут является путь дезаминирования аргинина. Большинство неферментирующих молликут и некоторые ферментирующие виды имеют гены ферментов пути дезаминирования аргинина (орнитиновый цикл). Это путь гидролиза аминокислоты аргинина, протекающий с образованием орнитина, АТФ, С02 и аммиака, повышающего значение pH бактерии [2]. В цикле используются три фермента: аргинин-деаминаза, орнитин-карбамоил-трансфераза, и карба*маткиназа [37]. Деградация аргинина соединена с эквимолярным производством АТФ и субстратным фосфорилированием. Орнитиновый цикл найден в разнообразных филогенетических бактериальных группах, например, Pseudomonas, Bacillus, и молочнокислых бактериях [37]. Роль этого пути в качестве единственного источника АТФ у неферментирующих молликут продемонстрирована только для некоторых видов [2, 33, 38]. Некоторые виды, например М. hominis, М. arthritidis, М. gallinarum, используют орнитиновый цикл в качестве альтернативного способа выработки энергии и благодаря этому способны выживать в условиях отсутствия углеводов в среде [39].

Еще один потенциальный механизм производства энергии в клетках молликут основан на получении АТФ из ацетилфосфата и АДФ с помощью ацетаткиназы, в сочетании с образованием ацетилфосфата из ацетил-коэнзима А под действием ацетил-фосфат-трансферазы. Оба фермента встречаются как у ферментирующих, так и у неферментирующих молликут. А ацетил-коэнзим А может быть получен в микоплазмах путем окислительного фосфорилирования пирувата [2].

У многих видов молликут в процессе формирования специфичности к организму-хозяину появились индивидуальные пути поизводства АТФ.

Например, уникальный энергетический обмен уреаплазм, представляющий собой особый результат адаптации этих бактерий к среде обитания - слизистым половых органов и мочевым путям человека. Для выживания и деления клеткам уреаплазм необходимо наличие мочевины в среде [2]. В геноме этих организмов не было обнаружено ферментов, ответственных за реакции гликолиза, орнитинового цикла или ацетат-киназного АТФ-генерирующего путей. Экспериментально показано, что синтез АТФ в клетках уреаплазм происходит при генерации трансмембранного потенциала за счет действия фермента АТФ-азы типа FOF1 [40]. При значении рН внешней среды 6,0 (оптимальный рН уреаплазменного роста) в процессе гидролиза мочевины генерируется химический потенциал аммиака и, одновременно, увеличивается протонный электрохимический потенциал, что запускает процесс синтеза АТФ [41].

Благодаря паразитическому образу жизни геном молликут значительно редуцирован. Однако кажущиеся ферментативные пробелы в метаболических путях являются заполненными за счет универсальности ферментов. Многофункциональные ферменты представляют собой одно из решений для экономии генетической информации в организмах с минимальными геномами. В протеогеномных аннотациях молликут можно обнаружить множество неполных метаболических путей или ферментативных «пробелов» в метаболических путях. Кроме того, часто аннотированные гены не транскрибируются, поэтому было бы ошибочно в описании метаболизма этих бактерий опираться только на результаты аннотирования генома. Отсутствие корреляции между данными аннотации и результатами метаболомных экспериментов также можно объяснить ошибочным определением функции гена или посттрансляционной модификацией, инактивирующей транслируемый белок. Например, в клетках М. genitalium и многих других молликут обнаружена малатдегидрогеназая активность, однако, рамок считывания этого белка в геноме М. genitalium и М. pneumoniae не было обнаружено [34, 42]. Оказалось, что продукт гена отнесен к лактатдегидрогеназе в М. genitalium и М. hyopneumoniae, но выполняет также функции малатдегидрогеназы [43]. Накопленные данные о наличии и отсутствии у

молликут систем ферментативной регуляции наряду со способностью клеток быстро адаптироваться к различным условиям роста делают их удобными модельными объектами для изучения принципов организации минимальной живой системы на метаболическом уровне.

2.2 Реконструкции карт метаболизма исследуемых организмов

Важным этапом системного анализа микроорганизма является реконструкция его метаболической карты, то есть сбор и визуализация всех потенциальных биохимических процессов клетки. Процесс моделирования метаболических карт может приводить к важным результатам уже на этапе разработки. Например, в работе группы JI. Серрано при реконструкции метаболической карты М. pneumoniae наблюдались несоответствия между моделью, составленной согласно аннотации генома, и экспериментальными результатами, полученными ранее. Такие несоответствия были разрешены с помощью сопоставления последовательности аминокислот ферментов, анализа литературы и уточнения полученной модели [16]. В работе автора было экспериментально показано, что нуклеозид цитидин является необходимым и достаточным компонентом питательной среды, для того, чтобы синтезировать все пиримидиновые нуклеотиды в клетке (ЦТФ, УТФ, ТТФ) [3]. Данные о метаболизме других видов микоплазм и первоначальные расчеты предполагали, что урацил может также служить предшественником для синтеза всех пиримидиновых нуклеотидов за счет реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой [44]. Проведенные эксперименты показали, что наличие урацила в качестве единственного пиримидинового нуклеозида в питательной среде является не достаточным для культивирования молликут [3]. Поиск в геноме М. pneumoniae гена, кодирующего гомолог фермента ЦТФ-синтазы в других микоплазмах, в Е. coli и Lactococcus lactis, не дал никаких результатов. Тогда с помощью проведения реконструкции метаболизма, авторам удалось определить, что пиримидиновый метаболизм М. pneumoniae уникально

отличается от других микоплазм отсутствием реакции перехода УТФ в ЦТФ, катализируемой ЦТФ-синтазой, и что цитидин является необходимым субстратом для культивирования этого организма [16].

Кроме возможности получить важные сведения о метаболизме организма на этапе разработки схемы метаболизма, реконструкция служит для сортировки отдельных белков в группы (относящиеся к одному метаболическому пути или белковому комплексу) и позволяет улучшить функциональную аннотацию генов [45]. Кроме того, реконструкция метаболизма обеспечивает платформу для визуализации и анализа любых «омиксных» данных.

Существует два основных подхода к реконструкции карт метаболизма. Один из двух основных алгоритмов реконструкции направлен на составление схемы метаболизма исходя из первоначальных данных аннотирования генома и последующее уточнение наличия ферментативных реакций. Второй алгоритм, который наиболее часто используются исследователями, состоит из первоначального уточнения функций ферментов и последующей реконструкции метаболических путей.

Наиболее информативным является первый алгоритм, заключающийся в построении схемы на основе первичной аннотации, так как он включает все возможные реакции, катализируемые ферментами [45]. Такой алгоритм состоит из следующих шагов: 1) создание метаболической схемы на основе автоматической аннотации; 2) проверка назначенных согласно аннотации реакций, включающая поиск ферментативных «пробелов» в метаболических путях; поиск аннотированных ферментов, способных катализировать реакции, соответствующие «пробелам» в схеме; проверку возможности утилизации или выведения всех конечных продуктов; описание транспортной системы, ответственной за импорт необходимых субстратов.

Начальный этап построения единой схемы метаболических реакций в первом алгоритме реконструкций проводится на основании аннотации генов организма. Почти все доступные последовательности генома в настоящее время систематически обработаны с помощью автоматизированных программ, которые

идентифицируют кодирующие последовательности и функционально аннотируют гены. Исходя из данных функциональной аннотации генов, предполагаемым ферментам присваивают соответствующие катализируемые ими реакции. Интернет ресурсы, содержащие различные варианты биохимических данных, способствуют упрощению процедуры первичной реконструкции метаболизма. Существует два типа баз данных, (БД) содержащих необходимую информацию. Первый тип - фермент - ориентированные БД, которые предоставляют информацию о функциях ферментов, например В1ШЧГОА [46], 8\у15зРго1 [47]. С помощью информации, предоставленной такими базами выявляются данные о дополнительных активностях аннотированных ферментов и их способности катализировать различные биохимические превращения в метаболическом пути. Другой тип БД - базы метаболических путей, содержащие описание биохимии метаболических процессов, например ЕсоСус, описывающая метаболизм кишечной палочки [48] или иМ-ВОБ база данных, описывающая пути катаболизма у разных видов бактерий [49]. Такие базы данных позволяют выяснить все биохимические реакции, в которых участвует тот или иной метаболит и определить взаимосвязь между реакциями. Реконструкцию схемы метаболизма также можно проводить, используя уже имеющиеся реконструкции родственных организмов. Часто реакции группируются в метаболические пути или модули, которые сохраняются в нескольких организмах. Однако, несмотря на секвенирование и аннотацию геномов многочисленных микроорганизмов, функции многих генов остаются неизвестными и, наоборот, многие преобразования катализируются неизвестными ферментами. Кроме того, не всегда идентифицируются гены, соответствующие экспериментально охарактеризованным ферментам. Все это представляет собой значительное препятствие для создания точных моделей метаболизма, основанных на данных протеогеномной аннотации.

Второй этап реконструкции, заключающийся в уточнении полученной первичной реконструкции, является наиболее трудоемким. Существуют

несколько минимальных требований к детализации, необходимой для реконструкции полной модели метаболизма бактерий.

Во-первых, метаболические пути должны быть представлены в соответствии с особенностями физиологии исследуемого организма. Например, первоначальная реконструкция метаболизма ЪаМоЪассШт р1аШаптг предполагала, что сукцинил-КоА является субстратом для биосинтеза метионина в реакции, катализируемой сукцинилтрансферазой [50]. Экспериментально было показано, что клетки Ь. р\ап1агит способны синтезировать метионин. Однако сукцинил-КоА не может быть синтезирован в клетках этого организма из-за неполной представленности ферментов цикла Кребса (цикла биохимических реакций, в процессе которых образуются основные предшественники биосинтеза). Это указывало на наличие противоречия между экспериментальными данными и данными первичной реконструкции, проведенной для этого организма при проведении аннотации генома. Анализ субстратной специфичности фермента сукцинилтрансферазы и его ортологов у других организмов показал, что ацетил-КоА может также выступать в роли субстрата для синтеза метионина [50]. Клетки Ь. р1аШагит способны синтезировать ацетил-КоА. Выявление подобных несоответствий, которые могут быть идентифицированы во всей метаболической сети, требует хороших знаний физиологии микроорганизма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ванюшкина, Анна Алексеевна, 2014 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rogers F.B. Medical subject headings // Bull Med Libr Assoc. 1963. Vol. 51, № P. 114-6.

2. Razin S. The mycoplasmas // Microbiol Rev. 1978. Vol. 42, № 2. P. 414-70.

3. Yus E., Maier T., Michalodimitrakis K., et al. Impact of genome reduction on bacterial metabolism and its regulation // Science. 2009. Vol. 326, № 5957. P. 1263-8.

4. Saghatelian A., Cravatt B.F. Discovery metabolite profiling—forging functional connections between the proteome and metabolome // Life Sci. 2005. Vol. 77, № 14. P. 1759-66.

5. Smith C.A., Want E.J., O'Maille G., et al. XCMS: processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 3. P. 779-87.

6. Allen J., Davey H.M., Broadhurst D., et al. High-throughput classification of yeast mutants for functional genomics using metabolic footprinting // Nat Biotechnol. 2003. Vol. 21, № 6. P. 692-6.

7. Saito N., Robert M., Kitamura S., et al. Metabolomics approach for enzyme discovery // J Proteome Res. 2006. Vol. 5, № 8. P. 1979-87.

8. Heinemann M., Sauer U. Systems biology of microbial metabolism // Curr Opin Microbiol. Vol. 13, № 3. P. 337-43.

9. Loh K.D., Gyaneshwar P., Markenscoff Papadimitriou E., et al. A previously undescribed pathway for pyrimidine catabolism // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. Vol. 103, № 13. P. 5114-9.

10. Peyraud R., Kiefer P., Christen P., et al. Demonstration of the ethylmalonyl-CoA pathway by using 13C metabolomics // Proc Natl Acad Sci USA. 2009. Vol. 106, № 12. P. 4846-51.

11. Olszewski K.L., Mather M.W., Morrisey J.M., et al. Branched tricarboxylic acid metabolism in Plasmodium falciparum // Nature. Vol. 466, № 7307. P. 774-8.

12. Amador-Noguez D., Feng X.J., Fan J., et al. Systems-level metabolic flux profiling elucidates a complete, bifurcated tricarboxylic acid cycle in Clostridium acetobutylicum // J Bacteriol. Vol. 192, № 17. P. 4452-61.

13. Kresnowati M.T., van Winden W.A., Almering M.J., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation // Mol Syst Biol. 2006. Vol. 2, № P. 49.

14. Wu L., van Dam J., Schipper D., et al. Short-term metabolome dynamics and carbon, electron, and ATP balances in chemostat-grown Saccharomyces

cerevisiae CEN.PK 113-7D following a glucose pulse // Appl Environ Microbiol. 2006. Vol. 72, № 5. P. 3566-77.

15. Reitzer L. Nitrogen assimilation and global regulation in Escherichia coli // Annu Rev Microbiol. 2003. Vol. 57, № P. 155-76.

16. Wodke J.A., Puchalka J., Lluch-Senar M., et al. Dissecting the energy metabolism in Mycoplasma pneumoniae through genome-scale metabolic modeling // Mol Syst Biol. Vol. 9, № P. 1-19.

17. Baseman J.B., Tully J.G. Mycoplasmas: sophisticated, reemerging, and burdened by their notoriety // Emerg Infect Dis. 1997. Vol. 3, № 1. P. 21-32.

18. Bove J.M. Spiroplasmas: infectious agents of plants, arthropods and vertebrates // Wien Klin Wochenschr. 1997. Vol. 109, № 14-15. P. 604-12.

19. Razin S., Yogev D., Naot Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas//Microbiol Mol Biol Rev. 1998. Vol. 62, № 4. P. 1094-156.

20. Robison K., Gilbert W., Church G.M. More haemophilus and Mycoplasma genes // Science. 1996. Vol. 271, № 5253. P. 1302b-3b.

21. Razin S. Physiology of mycoplasmas // Adv Microb Physiol. 1973. Vol. 10, № P. 1-80.

22. Razin S., Michmann J., Shimshoni Z. The Occurrence of Mycoplasma (Pleuropneumonia-Like Organisms, Pplo) in the Oral Cavity of Dentulous and Edentulous Subjects // J Dent Res. 1964. Vol. 43, № P. 402-5.

23. Lazarev V.N., Levitskii S.A., Basovskii Y.I., et al. Complete genome and proteome of Acholeplasma laidlawii // J Bacteriol. 2011. Vol. 193, № 18. P. 4943-53..

24. Laidlaw P.P., Elford,W J. A new group of filterable organisms // B Biol. Sci. 1936. Vol. № 120. P. 292-303.

25. Leach R.H. Comparative studies of mycoplasma of bovine origin // Ann N Y Acad Sci. 1967. Vol. 143, № 1. P. 305-16.

26. Stipkovits L. The pathogenicity of avian mycoplasmas // Zentralbl Bakteriol Orig A. 1979. Vol. 245, № 1-2. P. 171-83.

27. Cocaign-Bousquet M., Even S., Lindley N.D., et al. Anaerobic sugar catabolism in Lactococcus lactis: genetic regulation and enzyme control over pathway flux // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. Vol. 60, № 1-2. P. 24-32.

28. Zhang W., Baseman J.B. Transcriptional response of Mycoplasma genitalium to osmotic stress // Microbiology. Vol. 157, № Pt 2. P. 548-56.

29. Pollack J.D., Tryon V.V., Beaman K.D. The metabolic pathways of Acholeplasma and Mycoplasma: an overview// Yale J Biol Med. 1983. Vol. 56, № 5-6. P. 709-16.

30. Huynen M.A., Dandekar T., Bork P. Variation and evolution of the citric-acid cycle: a genomic perspective // Trends Microbiol. 1999. Vol. 7, № 7. P. 281-91.

31. Miles R.J. Catabolism in mollicutes // J Gen Microbiol. 1992. Vol. 138, № 9. P. 1773-83.

32. Pollack J.D., Williams M.V., McElhaney R.N. The comparative metabolism of the mollicutes (Mycoplasmas): the utility for taxonomic classification and the relationship of putative gene annotation and phylogeny to enzymatic function in the smallest free-living cells // Crit Rev Microbiol. 1997. Vol. 23, № 4. P. 269354.

33. Kenri T., Horino A., Matsui M., et al. Complete genome sequence of Mycoplasma pneumoniae type 2a strain 309, isolated in Japan // J Bacteriol. 2012. Vol. 194, № 5. P. 1253-4.

34. Fräser C.M., Gocayne J.D., White O., et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium // Science. 1995. Vol. 270, № 5235. P. 397-403.

35. Taylor R.R., Varsani H., Miles R.J. Alternatives to arginine as energy sources for the non-fermentative Mycoplasma gallinarum // FEMS Microbiol Lett. 1994. Vol. 115, № 2-3. P. 163-7.

36. Zhu P.P., Peterkofsky A. Sequence and organization of genes encoding enzymes involved in pyruvate metabolism in Mycoplasma capricolum // Protein Sei. 1996. Vol. 5, № 8. P. 1719-36.

37. Ruepp A., Soppa J. Fermentative arginine degradation in Halobacterium salinarium (formerly Halobacterium halobium): genes, gene products, and transcripts of the arcRACB gene cluster // J Bacteriol. 1996. Vol. 178, № 16. P. 4942-7.

38. Himmelreich R., Plagens H., Hilbert H., et al. Comparative analysis of the genomes of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium // Nucleic Acids Res. 1997. Vol. 25, № 4. P. 701-12.

39. Pereyre S., Sirand-Pugnet P., Beven L., et al. Life on arginine for Mycoplasma hominis: clues from its minimal genome and comparison with other human urogenital mycoplasmas // PLoS Genet. 2009. Vol. 5, № 10., el000677. P. 1-13

40. Romano N., Tolone G., Ajello F., et al. Adenosine 5'-triphosphate synthesis induced by urea hydrolysis in Ureaplasma urealyticum // J Bacteriol. 1980. Vol. 144, № 2. P. 830-2.

41. Smith D.G., Russell W.C., Ingledew W.J., et al. Hydrolysis of urea by Ureaplasma urealyticum generates a transmembrane potential with resultant ATP synthesis//J Bacteriol. 1993. Vol. 175, № 11. P. 3253-8.

42. Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., et al. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae // Nucleic Acids Res. 1996. Vol. 24, № 22. P. 4420-49.

43. Cordwell S.J., Basseal D.J., Pollack J.D., et al. Malate/lactate dehydrogenase in mollicutes: evidence for a multienzyme protein// Gene. 1997. Vol. 195, № 2. P. 113-20.

44. Pachkov M., Dandekar T., Korbel J., et al. Use of pathway analysis and genome context methods for functional genomics of Mycoplasma pneumoniae nucleotide metabolism // Gene. 2007. Vol. 396, № 2. P. 215-25.

45. Francke C., Siezen R.J., Teusink B. Reconstructing the metabolic network of a bacterium from its genome // Trends Microbiol. 2005. Vol. 13, № 11. P. 550-8.

46. Barthelmes J., Ebeling C., Chang A., et al. BRENDA, AMENDA and FRENDA: the enzyme information system in 2007 // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № Database issue. P. D511-4.

47. Boutet E., Lieberherr D., Tognolli M., et al. UniProtKB/Swiss-Prot // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 406, № P. 89-112.

48. Karp P.D., Paley S., Romero P. The Pathway Tools software // Bioinformatics. 2002. Vol. 18 Suppl 1, № P. S225-32.

49. Ellis L.B., Roe D., Wackett L.P. The University of Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database: the first decade // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34, № Database issue. P. D517-21.

50. Teusink B., van Enckevort F.H., Francke C., et al. In silico reconstruction of the metabolic pathways of Lactobacillus plantarum: comparing predictions of nutrient requirements with those from growth experiments // Appl Environ Microbiol. 2005. Vol. 71, № 11. P. 7253-62.

51. Osterman A., Overbeek R. Missing genes in metabolic pathways: a comparative genomics approach//Curr OpinChemBiol. 2003. Vol. 7, № 2. P. 238-51.

52. Ma H., Zeng A.P. Reconstruction of metabolic networks from genome data and analysis of their global structure for various organisms // Bioinformatics. 2003. Vol. 19, № 2. P. 270-7.

53. Kummel A., Panke S., Heinemann M. Systematic assignment of thermodynamic constraints in metabolic network models // BMC Bioinformatics. 2006. Vol. 7, № 512 P. 312-20.

54. Ren Q., Kang K.H., Paulsen I.T. TransportDB: a relational database of cellular membrane transport systems // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № Database issue. P. D284-8.

55. Feist A.M., Henry C.S., Reed J.L., et al. A genome-scale metabolic reconstruction for Escherichia coli K-12 MG1655 that accounts for 1260 ORFs and thermodynamic information // Mol Syst Biol. 2007. Vol. 3, № 121 P. 1-12.

56. Gates S.C., Sweeley C.C. Quantitative metabolic profiling based on gas chromatography // Clin Chem. 1978. Vol. 24, № 10. P. 1663-73.

57

58

59

60

61

62

63,

64.

65

66.

67.

68.

69.

70.

Horning E.C., Horning, M. G. Human metabolic profiles obtained by GC and GC/MS //J. Chromatogr. Sei. 1971. Vol. 9, № 129. P. 1-18.

Tweeddale H., Notley-McRobb L., Ferenci T. Effect of slow growth on metabolism of Escherichia coli, as revealed by global metabolite pool ("metabolome") analysis // J Bacteriol. 1998. Vol. 180, № 19. P. 5109-16.

Maharjan R.P., Ferenci T. Global metabolite analysis: the influence of extraction methodology on metabolome profiles of Escherichia coli // Anal Biochem. 2003. Vol. 313, № 1. P. 145-54.

Sauer U., Lasko D.R., Fiaux J., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism // J Bacteriol. 1999. Vol. 181, № 21. P. 6679-88.

Villas-Boas S.G., Hojer-Pedersen J., Akesson M., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods // Yeast. 2005. Vol. 22, № 14. P. 1155-69.

Lange H.C., Eman M., van Zuijlen G., et al. Improved rapid sampling for in vivo kinetics of intracellular metabolites in Saccharomyces cerevisiae // Biotechnol Bioeng. 2001. Vol. 75, № 4. p. 406-15.

Jozefczuk S., Klie S., Catchpole G., et al. Metabolomic and transcriptomic stress response of Escherichia coli // Mol Syst Biol. Vol. 6, № 364 P. 1-18

Ikeda T.P., Shauger A.E., Kustu S. Salmonella typhimurium apparently perceives external nitrogen limitation as internal glutamine limitation // J Mol Biol. 1996. Vol. 259, № 4. P. 589-607.

Szymanski J., Jozefczuk S., Nikoloski Z., et al. Stability of metabolic correlations under changing environmental conditions in Escherichia coli—a systems approach // PLoS One. 2009. Vol. 4, № 10. P. 1-15

Faijes M., Mars A.E., Smid E.J. Comparison of quenching and extraction methodologies for metabolome analysis of Lactobacillus plantarum // Microb Cell Fact. 2007. Vol. 6, № 27. P 1-8

Link H., Anselment B., Weuster-Botz D. Leakage of adenylates during cold methanol/glycerol quenching of Escherichia coli //2008. Vol. 4 № 3 P. 240-7

Winder C.L., Dunn W.B., Schuler S., et al. Global metabolic profiling of Escherichia coli cultures: an evaluation of methods for quenching and extraction of intracellular metabolites // Anal Chem. 2008. Vol. 80, № 8. P. 2939-48.

Mashego M.R., Wu L., Van Dam J.C., et al. MIRACLE: mass isotopomer ratio analysis of U-13C-labeled extracts. A new method for accurate quantification of changes in concentrations of intracellular metabolites // Biotechnol Bioeng. 2004. Vol. 85, № 6. P. 620-8.

Ohashi Y., Hirayama A., Ishikawa T., et al. Depiction of metabolome changes in histidine-starved Escherichia coli by CE-TOFMS // Mol Biosyst. 2008. Vol. 4, № 2. P. 135-47.

71. Wittmann C., Kromer J.O., Kiefer P., et al. Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria // Anal Biochem. 2004. Vol. 327, № 1. P. 135-9.

72. Bolten C.J., Wittmann C. Appropriate sampling for intracellular amino acid analysis in five phylogenetically different yeasts // Biotechnol Lett. 2008. Vol. 30, № 11. P. 1993-2000.

73. Taymaz-Nikerel H., de Mey M., Ras C., et al. Development and application of a differential method for reliable metabolome analysis in Escherichia coli // Anal Biochem. 2009. Vol. 386, № 1. P. 9-19.

74. Wu X., Li N., Li H., et al. An optimized method for NMR-based plant seed metabolomic analysis with maximized polar metabolite extraction efficiency, signal-to-noise ratio, and chemical shift consistency // Analyst. Vol. 139, № 7. P. 1769-78.

75. Rabinowitz J.D., Kimball E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli // Anal Chem. 2007. Vol. 79, № 16. P. 6167-73.

76. Hollywood K., Brison D.R., Goodacre R. Metabolomics: current technologies and future trends // Proteomics. 2006. Vol. 6, № 17. P. 4716-23.

77. Canelas A.B., ten Pierick A., Ras C., et al. Quantitative evaluation of intracellular metabolite extraction techniques for yeast metabolomics // Anal Chem. 2009. Vol. 81, № 17. P. 7379-89".

78. Ortmayr K., Stanetty,C., Kosma, P., Hann, S., Koellensperger G. Quantitative determination of NADP+ and NADPH using LC-MS: Workflow evaluation is crucial in metabolomics//Journal. 2013, P. 1-5

79. Monton M.R., Soga T. Metabolome analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1168, № i_2. P. 237-46.

80. Timischl B., Dettmer K., Kaspar H., et al. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics// Electrophoresis. 2008. Vol. 29, № 10. P. 2203-14.

81. Yang S., Hoggard J.C., Lidstrom M.E., et al. Comprehensive discovery of C labeled metabolites in the bacterium Methylobacterium extorquens AMI using gas chromatography-mass spectrometry // J Chromatogr A. Vol. 1317, № 22 P. 175-85.

82. Azizan K.A., Baharum S.N., Mohd Noor N. Metabolic profiling of Lactococcus lactis under different culture conditions // Molecules. Vol. 17, № 7. P. 8022-36.

83. Munger J., Bajad S.U., Coller H.A., et al. Dynamics of the cellular metabolome during human cytomegalovirus infection // PLoS Pathog. 2006. Vol. 2, № 12. P. 132-5.

84. van der Kloet F.M., Hendriks M., Hankemeier T., et al. A new approach to untargeted integration of high resolution liquid chromatography-mass spectrometry data // Anal Chim Acta. Vol. 801, № P. 34-42.

85. Bajad S., Shulaev V. LC-MS-based metabolomics // Methods Mol Biol. Vol. 708, № P. 213-28.

86. Guillarme D., Nguyen D.T., Rudaz S., et al. Recent developments in liquid chromatography—impact on qualitative and quantitative performance // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1149, № l.P. 20-9.

87. Wilson I.D., Nicholson J.K., Castro-Perez J., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies // J Proteome Res. 2005. Vol. 4, № 2. P. 591-8.

88. Nguyen D.T., Guillarme D., Rudaz S., et al. Fast analysis in liquid chromatography using small particle size and high pressure // J Sep Sci. 2006. Vol. 29, № 12. P. 1836-48.

89. Walles M., Gauvin C., Morin P.E., et al. Comparison of sub-2-microm particle columns for fast metabolite ID // J Sep Sci. 2007. Vol. 30, № 8. P. 1191-9.

90. Colebatch G., Desbrosses G., Ott T., et al. Global changes in transcription orchestrate metabolic differentiation during symbiotic nitrogen Fixation in Lotus japonicus // Plant J. 2004. Vol. 39, № 4. P. 487-512.

91. Jonsson P., Gullberg J., Nordstrom A., et al. A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS // Anal Chem. 2004. Vol. 76, № 6. P. 1738-45.

92. Koek M.M., Muilwijk B., van der Werf M.J., et al. Microbial metabolomics with gas chromatography/mass spectrometry // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 4. P. 1272-81.

93. Soga T., Ohashi Y., Ueno Y., et al. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry // J Proteome Res. 2003. Vol. 2, № 5. P. 488-94.

94. Soga T., Ueno Y., Naraoka H., et al. Simultaneous determination of anionic intermediates for Bacillus subtilis metabolic pathways by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry // Anal Chem. 2002. Vol. 74, № 10. P. 2233-9.

95. Edwards J.L., Chisolm C.N., Shackman J.G., et al. Negative mode sheathless capillary electrophoresis electrospray ionization-mass spectrometry for metabolite analysis of prokaryotes // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1106, № 1-2. P. 80-8.

96. Harada K., Fukusaki E., Kobayashi A. Pressure-assisted capillary electrophoresis mass spectrometry using combination of polarity reversion and electroosmotic

flow for metabolomics anion analysis // J Biosci Bioeng. 2006. Vol. 101, № 5. P. 403-9.

97. Wunschel D., Fox K.F., Fox A., et al. Quantitative analysis of neutral and acidic sugars in whole bacterial cell hydrolysates using high-performance anion-exchange liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry // J Chromatogr A. 1997. Vol. 776, № 2. P. 205-19.

98. Villas-Boas S.G., Mas S., Akesson M., et al. Mass spectrometry in metabolome analysis // Mass Spectrom Rev. 2005. Vol. 24, № 5. P. 613-46.

99. Shi G. Application of co-eluting structural analog internal standards for expanded linear dynamic range in liquid chromatography/electrospray mass spectrometry // Rapid Commun Mass Spectrom. 2003. Vol. 17, № 3. P. 202-6.

100. Fernie A.R., Trethewey R.N., Krotzky A.J., et al. Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology // Nat Rev Mol Cell Biol. 2004. Vol. 5, № 9. P. 763-9.

101. Шатц В.Д., Сахартова, О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии // Рига: Зинатне. 1988. С. 390-9.

102. Wilson I D., Plumb R., Granger J., et al. HPLC-MS-based methods for the study of metabonomics // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2005. Vol. 817, № 1. P. 67-76.

103. Jandera P. Stationary and mobile phases in hydrophilic interaction chromatography: a review// Anal Chim Acta. 2011. Vol. 692, № 1-2. P. 1-25.

104. Vo Duy S., Besteiro S., Berry L., et al. A quantitative liquid chromatography tandem mass spectrometry method for metabolomic analysis of Plasmodium falciparum lipid related metabolites // Anal Chim Acta. Vol. 739, № P. 47-55.

105. Bajad S., Shulaev V. LC-MS-based metabolomics // Methods Mol Biol. 2011. Vol. 708, № P. 213-28.

106. Harder U., Koletzko В., Peissner W. Quantification of 22 plasma amino acids combining derivatization and ion-pair LC-MS/MS // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. Vol. 879, № 7-8. P. 495-504.

107. Орлов В.И. А.А.А. Жидкостная хроматография. Теоретические основы: / ed. Научно-технологическая компания// Дзержинск: Синтенко. 1997. С. 37-9.

108. dos Santos Pereira A., David F., Vanhoenacker G., et al. The acetonitrile shortage: is reversed HILIC with water an alternative for the analysis of highly polar ionizable solutes? // J Sep Sci. 2009. Vol. 32, № 12. P. 2001-7.

109. Coulier L., Bas R., Jespersen S., et al. Simultaneous quantitative analysis of metabolites using ion-pair liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 18. P. 6573-82.

110. Tolstikov V.V., Fiehn О. Analysis of highly polar compounds of plant origin: combination of hydrophilic interaction chromatography and electrospray ion trap mass spectrometry // Anal Biochem. 2002. Vol. 301, № 2. P. 298-307.

111. Tolstikov V.V., Fiehn O., Tanaka N. Application of liquid chromatography-mass spectrometry analysis in metabolomics: reversed-phase monolithic capillary chromatography and hydrophilic chromatography coupled to electrospray ionization-mass spectrometry // Methods Mol Biol. 2007. Vol. 358, № P. 141-55.

112. Olsen B.A. Hydrophilic interaction chromatography using amino and silica columns for the determination of polar pharmaceuticals and impurities // J ChromatogrA. 2001. Vol. 913, № 1-2. P. 113-22.

113. Guo Y., Gaiki S. Retention behavior of small polar compounds on polar stationary phases in hydrophilic interaction chromatography // J Chromatogr A. 2005. Vol. 1074, № 1-2. P. 71-80.

114. Naidong W. Bioanalytical liquid chromatography tandem mass spectrometry methods on underivatized silica columns with aqueous/organic mobile phases // J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2003. Vol. 796, № 2. P. 209-24.

115. Spagou K., Tsoukali H., Raikos N., et al. Hydrophilic interaction chromatography coupled to MS for metabonomic/metabolomic studies // J Sep Sci. Vol. 33, № 67. P. 716-27.

116. Cubbon S., Antonio C., Wilson J., et al. Metabolomic applications of HILIC-LC-MS // Mass Spectrom Rev. Vol. 29, № 5. P. 671-84.

117. Bajad S.U., Lu W., Kimball E.H., et al. Separation and quantitation of water soluble cellular metabolites by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1125, № 1. P. 76-88.

118. Chauve В., Guillarme D., Cleon P., et al. Evaluation of various HILIC materials for the fast separation of polar compounds // J Sep Sci. 2010. Vol. 33, № 6-7. P. 752-64.

119. Fu Q., Liang Т., Li Z., et al. Separation of carbohydrates using hydrophilic interaction liquid chromatography // Carbohydr Res. 2013. Vol. 379, № P. 13-7.

120. Naidong W., Chen Y.L., Shou W., et al. Importance of injection solution composition for LC-MS-MS methods // J Pharm Biomed Anal. 2001. Vol. 26, № 5-6. P. 753-67.

121. Гюхнер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР: Пер. с англ. // Москва: Мир. 1984. С. 365-9.

122. Воловенко Ю.М. К.В.Г., Комаров И.В., Туров А.В., Хиля В.П. Спектроскопия ядерного магнитьного резонанса для химиков // Москва: Научное партнерство, МБФНП. 2011. С. 568-96.

123. Coen М., Holmes Е., Lindon J.C., et al. NMR-based metabolic profiling and metabonomic approaches to problems in molecular toxicology // Chem Res Toxicol. 2008. Vol. 21, № 1. P. 9-27.

124. Fiehn О. Extending the breadth of metabolite profiling by gas chromatography coupled to mass spectrometry // Trends Analyt Chem. 2008. Vol. 27, № 3. P. 261-269.

125. Putri S.P., Nakayama Y., Matsuda F., et al. Current metabolomics: practical applications //J Biosci Bioeng. Vol. 115, № 6. P. 579-89.

126. Lewis I.A., Schommer S.C., Hodis В., et al. Method for determining molar concentrations of metabolites in complex solutions from two-dimensional III-13C NMR spectra // Anal Chem. 2007. Vol. 79, № 24. P. 9385-90.

127. Лебедев A.T. Масс-спектрометрия в органической химии: Методы в химии // Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний. 2010. С. 100-76.

128. Lacorte S., Fernandez-Alba A.R. Time of flight mass spectrometry applied to the liquid chromatographic analysis of pesticides in water and food // Mass Spectrom Rev. 2006. Vol. 25, № 6. P. 866-80.

129. Hu Q., Noll R.J., Li H., et al. The Orbitrap: a new mass spectrometer // J Mass Spectrom. 2005. Vol. 40, № 4. P. 430-43.

130. Glish G.L., Burinsky D.J. Hybrid mass spectrometers for tandem mass spectrometry //J Am Soc Mass Spectrom. 2008. Vol. 19, № 2. P. 161-72.

131. Liebeke M., Dorries K., Meyer H., et al. Metabolome analysis of gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus by GC-MS and LC-MS // Methods Mol Biol. Vol. 815, № P. 377-98.

132. Soo E.C., Hui J.P. Metabolomics in glycomics // Methods Mol Biol. Vol. 600, № P. 175-86.

133. Kimball E., Rabinowitz J.D. Identifying decomposition products in extracts of cellular metabolites // Anal Biochem. 2006. Vol. 358, № 2. P. 273-80.

134. Want E.J., Nordstrom A., Morita H., et al. From exogenous to endogenous: the inevitable imprint of mass spectrometry in metabolomics // J Proteome Res. 2007. Vol. 6, № 2. P. 459-68.

135. Buescher J.M., Moco S., Sauer U., et al. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites // Anal Chem. Vol. 82, № 11. P. 4403-12.

136. Luo В., Groenke K., Takors R., et al. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1147, № 2. P. 153-64.

137. Cai S.S., Short L.C., Syage J.A., et al. Liquid chromatography-atmospheric pressure photoionization-mass spectrometry analysis of triacylglycerol lipids— effects of mobile phases on sensitivity // J Chromatogr A. 2007. Vol. 1173, № 12. P. 88-97.

138. Hilario M., Kalousis A., Pellegrini C., et al. Processing and classification of protein mass spectra// Mass Spectrom Rev. 2006. Vol. 25, № 3. P. 409-49.

139. Pedrioli P.G., Eng J.K., Hubley R., et al. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research // Nat Biotechnol.

2004. Vol. 22, № 11. P. 1459-66.

140. Sugimoto M., Kawakami M., Robert M., et al. Bioinformatics Tools for Mass Spectroscopy-Based Metabolomic Data Processing and Analysis // Curr Bioinform. Vol. 7, № 1. P. 96-108.

141. van Nederkassel A.M., Daszykowski M., Eilers P.H., et al. A comparison of three algorithms for chromatograms alignment // J Chromatogr A. 2006. Vol. 1118, № 2. P. 199-210.

142. Nordstrom A., O'Maille G., Qin C., et al. Nonlinear data alignment for UPLC-MS and HPLC-MS based metabolomics: quantitative analysis of endogenous and exogenous metabolites in human serum // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 10. P. 3289-95.

143. Nevedomskaya E., Derks R., Deelder A.M., et al. Alignment of capillary electrophoresis-mass spectrometry datasets using accurate mass information // Anal Bioanal Chem. 2009. Vol. 395, № 8. P. 2527-33.

144. Eilers P.H. Parametric time warping // Anal Chem. 2004. Vol. 76, № 2. P. 40411.

145. Robinson M.D., De Souza D.P., Keen W.W., et al. A dynamic programming approach for the alignment of signal peaks in multiple gas chromatography-mass spectrometry experiments // BMC Bioinformatics. 2007. Vol. 8, № P. 419.

146. Diaz R., Ibanez M., Sancho J.V., et al. Building an empirical mass spectra library for screening of organic pollutants by ultra-high-pressure liquid chromatography/hybrid quadrupole time-of-flight mass spectrometry // Rapid Commun Mass Spectrom. Vol. 25, № 2. P. 355-69.

147. Sysi-Aho M., Katajamaa M., Yetukuri L., et al. Normalization method for metabolomics data using optimal selection of multiple internal standards // BMC Bioinformatics. 2007. Vol. 8, № 93. P. 1-17.

148. Jonsson P., Bruce S.J., Moritz T., et al. Extraction, interpretation and validation of information for comparing samples in metabolic LC/MS data sets // Analyst.

2005. Vol. 130, № 5. P. 701-7.

149. Katz J.E., Dumlao D.S., Clarke S., et al. A new technique (COMSPARI) to facilitate the identification of minor compounds in complex mixtures by GC/MS and LC/MS: tools for the visualization of matched datasets // J Am Soc Mass Spectrom. 2004. Vol. 15, № 4. P. 580-4.

150. Broeckling C.D., Reddy I.R., Duran A.L., et al. MET-IDEA: data extraction tool for mass spectrometry-based metabolomics // Anal Chem. 2006. Vol. 78, № 13. P. 4334-41.

151. Katajamaa M., Miettinen J., Oresic M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data // Bioinformatics. 2006. Vol. 22, № 5. P. 634-6.

152. Caspi R., Foerster H., Fulcher C.A., et al. The MetaCyc Database of metabolic pathways and enzymes and the BioCyc collection of Pathway/Genome Databases //Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36, № Database issue. P. D623-31.

153. Ibanez M., Sancho J.V., Pozo O.J., et al. Use of quadrupole time-of-flight mass spectrometry in the elucidation of unknown compounds present in environmental water // Rapid Commun Mass Spectrom. 2005. Vol. 19, № 2. P. 169-78.

154. Kopka J., Schaucr N., Krueger S., et al. [e-mail]: the Golm Metabolome Database//Bioinformatics. 2005. Vol. 21, № 8. P. 1635-8.

155. Smith C.A., O'Maille G., Want E.J., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database // Ther Drug Monit. 2005. Vol. 27, № 6. P. 747-51.

156. Lu W., Clasquin M.F., Melamud E., et al. Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer//Anal Chem. Vol. 82, № 8. P. 3212-21.

157. Ewald J.C., Heux S., Zamboni N. High-throughput quantitative metabolomics: workflow for cultivation, quenching, and analysis of yeast in a multiwell format // Anal Chem. 2009. Vol. 81, № 9. P. 3623-9.

158. Sheldon M.T., Mistrik R., Croley T.R. Determination of ion structures in structurally related compounds using precursor ion fingerprinting // J Am Soc Mass Spectrom. 2009. Vol. 20, № 3. p. 37O-6.

159. Kim K.S., Pelton J.G., Inwood W.B., et al. The Rut pathway for pyrimidine degradation: novel chemistry and toxicity problems // J Bacteriol. Vol. 192, № 16. P. 4089-102.

160. Ala-Korpela M., Kangas A.J., Soininen P. Quantitative high-throughput metabolomics: a new era in epidemiology and genetics // Genome Med. Vol. 4, № 36. P. 1-4.

161. Nakahigashi K., Toya Y., Ishii N., et al. Systematic phenome analysis of Escherichia coli multiple-knockout mutants reveals hidden reactions in central carbon metabolism // Mol Syst Biol. 2009. Vol. 5, № P. 306.

162. Jozefczuk S., Klie S., Catchpole G., et al. Metabolomic and transcriptomic stress response of Escherichia coli // Mol Syst Biol. 2010. Vol. 6, № 364. P. 15-9.

163. Boer V.M., Crutchfield C.A., Bradley P.H., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations // Mol Biol Cell. 2010. Vol. 21, № l.P. 198-211.

164. Kastenmuller G., Schenk M.E., Gasteiger J., et al. Uncovering metabolic pathways relevant to phenotypic traits of microbial genomes // Genome Biol. 2009. Vol. 10, № 3. P. R28.

165. Zamboni N, Sauer U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis // Curr Opin Microbiol. 2009. Vol. 12, № 5. P. 553-8.

166. Fehr M., Frommer W.B., Lalonde S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors // Proc Natl Acad Sci USA. 2002. Vol. 99, № 15. P. 9846-51.

167. Paul Lee W.N., Wahjudi P.N., Xu J., et al. Tracer-based metabolomics: concepts and practices // Clin Biochem. Vol. 43, № 16-17. P. 1269-77.

168. Maier T., Marcos J., Wodke J.A., et al. Large-scale metabolome analysis and quantitative integration with genomics and proteomics data in Mycoplasma pneumoniae // Mol Biosyst. Vol. 9, № 7. P. 1743-55.

169. Wagner M. Single-cell ecophysiology of microbes as revealed by Raman microspectroscopy or secondary ion mass spectrometry imaging // Annu Rev Microbiol. 2009. Vol. 63, № P. 411-29.

170. Wagner H., Dunker S., Liu Z., et al. Subcommunity FTIR-spectroscopy to determine physiological cell states // Curr Opin Biotechnol. Vol. 24, № 1. P. 8894.

171. Ornatsky O., Bandura D., Baranov V., et al. Highly multiparametric analysis by mass cytometry // J Immunol Methods. Vol. 361, № 1-2. P. 1-20.

172. Bendall S.C., Simonds E.F., Qiu P., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum // Science. Vol. 332, № 6030. P. 687-96.

173. Rubakhin S.S., Lanni E.J., Sweedler J.V. Progress toward single cell metabolomics // Curr Opin Biotechnol. Vol. 24, № l.P. 95-104.

174. Alexeev D., Kostrjukova E., Aliper A., et al. Application of Spiroplasma melliferum proteogenomic profiling for the discovery of virulence factors and pathogenicity mechanisms in host-associated spiroplasmas // J Proteome Res. Vol. 11, № l.P. 224-36.

175. Alexeev D., Kostrjukova E., Aliper A., et al. Application of Spiroplasma melliferum proteogenomic profiling for the discovery of virulence factors and pathogenicity mechanisms in host-associated spiroplasmas // J Proteome Res. 2012. Vol. 11, № l.P. 224-36.

176. Tautenhahn R., Cho K., Uritboonthai W., et al. An accelerated workflow for untargeted metabolomics using the METLIN database // Nat Biotechnol. 2012. Vol. 30, № 9. P. 826-8.

177. Melamud E., Vastag L., Rabinowitz J.D. Metabolomic analysis and visualization engine for LC-MS data//Anal Chem. Vol. 82, № 23. P. 9818-26.

178. Veselova O.A., Kondratov, I.G., Galyamina, M.A., Demina, I.A., Ladygina, V.G., Serebryakov, M.V., Levitskii, S.A., Lazarev, V.N., Chukin, M.M., Larin, A.K., Akopian, T.A., Kostryukova, E.S., Tyakht, A.V., Alekseev, D.G., Govorun,

V.M. Genome of Mycoplasma gallisepticum S6 //Journal. 2013. Vol. 177. № 1. P. 259-63.

179. Tredwell G.D., Edwards-Jones B., Leak DJ., et al. The development of metabolomic sampling procedures for Pichia pastoris, and baseline metabolome data // PLoS One. Vol. 6,№ 1. P. 1-16.

180. Kanehisa M., Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes // Nucleic Acids Res. 2000. Vol. 28, № 1. P. 27-30.

181. Moat A., Foster J., Spector M. Microbial Physiology. / Wiley-Liss, Inc. 2002. P. 425-7.

182. Papazisi L., Gorton T.S., Kutish G., et al. The complete genome sequence of the avian pathogen Mycoplasma gallisepticum strain R(low) // Microbiology. 2003. Vol. 149, № Pt 9. P. 2307-16.

183. Simmons W.L., Daubenspeck J.M., Osborne J.D., et al. Type 1 and type 2 strains of Mycoplasma pneumoniae form different biofilms // Microbiology. Vol. 159, № Pt 4. P. 737-47.

184. Rottem S., Razin S. Sugar transport in Mycoplasma gallisepticum // J Bacteriol. 1969. Vol. 97, № 2. P. 787-92.

185. Kornberg H.L., Lambourne L.T. Role of the phosphoenolpyruvate-dependent fructose phosphotransferase system in the utilization of mannose by Escherichia coli // Proc Biol Sei. 1992. Vol. 250, № 1327. P. 51-5.

186. Falke D., Labenz J., Brauer D., et al. Adenosine diphosphate: thymidine 5'-phosphotransferase, a new enzyme activity, associated with the Herpes simplex virus-induced deoxypyrimidine kinase // Biochim Biophys Acta. 1982. Vol. 708, № 1. P. 99-103.

187. Molin M., Norbeck J., Blomberg A. Dihydroxyacetone kinases in Saccharomyces cerevisiae are involved in detoxification of dihydroxyacetone // J Biol Chem. 2003. Vol. 278, № 3. P. 1415-23.

188. Lehninger A. Princioals of biology // ed. Nelson D. University of Wisconsin-Madison. 2008. C. 1000-340.

189. Karadsheh N.S., Tejwani G.A., Ramaiah A. SedoheptuIose-7-phosphate kinase activity of phosphofructokinase from the different tissues of rabbit // Biochim Biophys Acta. 1973. Vol. 327, № 1. P. 66-81.

190. Pontremoli S., Traniello S., Luppis B., et al. Fructose diphosphatase from rabbit liver. I. Purification and properties // J Biol Chem. 1965. Vol. 240, № 9. P. 345963.

191. Gorbachev A.Y., Fisunov G.Y., Izraelson M., et al. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum // BMC Genomics. Vol. 14, № 1. P. 726-9.

192. Zaldivar J., Borges A., Johansson B., et al. Fermentation performance and intracellular metabolite patterns in laboratory and industrial xylose-fermenting

Saccharomyces cerevisiae // Appl Microbiol Biotechnol. 2002. Vol. 59, № 4-5. P. 436-42.

193. Vogl G., Plaickner A., Szathmary S., et al. Mycoplasma gallisepticum invades chicken erythrocytes during infection // Infect Immun. 2008. Vol. 76, № 1. P. 717.

194. Terry T.M., Zupnik J.S. Weak association of glucosamine-containing polymer with the Acholeplasma laidlawii membrane // Biochim Biophys Acta. 1973. Vol. 291, № l.P. 144-8.

195. Cole R.M., Tully J.G., Popkin T.J., et al. Morphology, ultrastructure, and bacteriophage infection of the helical mycoplasma-like organism (Spiroplasma citri gen. nov., sp. nov.) cultured from "stubborn" disease of citrus // J Bacteriol. 1973. Vol. 115, № l.P. 367-84.

196. Robertson J., Smook E. Cytochemical evidence of extramembranous carbohydrates on Ureaplasma urealyticum (T-strain Mycoplasma) // J Bacteriol. 1976. Vol. 128, № 2. P. 658-60.

197. Schiefer H.G., Gerhardt U., Brunner II, et al. Studies with lectins on the surface carbohydrate structures of mycoplasma membranes // J Bacteriol. 1974. Vol. 120, № l.P. 81-8.

198. Vikstrom S., Li L., Karlsson O.P., et al. Key role of the diglucosyldiacylglycerol synthase for the nonbilayer-bilayer lipid balance of Acholeplasma laidlawii membranes//Biochemistry. 1999. Vol. 38, № 17. P. 5511-20.

199. McElhaney R.N. The structure and function of the Acholeplasma laidlawii plasma membrane // Biochim Biophys Acta. 1984. Vol. 779, № l.P. 1-42.

200. Lichtenthaler ILK. The l-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis in Plants // Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 1999. Vol. 50, № P. 47-65.

201. Rohdich F., Hecht S., Gartner K., et al. Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein // Proc Natl Acad Sei USA. 2002. Vol. 99, № 3. P. 1158-63.

202. Ley D. Mycoplasma gallisepticum infection: Diseases of poultry // S.Y. M. Ames.: Iowa State Press. 2003. P. 135-86.

203. Ananias K.R., de Melo A.A., de Moura C.J. Analysis of moisture content, acidity and contamination by yeast and molds in Apis mellifera L. honey from central Brazil // Braz J Microbiol. Vol. 44, № 3. P. 679-83.

204. Scripal I.G., Bilay V.l. Microorganisms - agents of the plant diseases // Naukova Dumka. 1988. Vol. № P. 1-6.

205. Chernov V.M., Mukhametshina N.E., Gogolev Y.V., et al. Mycoplasma adaptation to adverse growth conditions: nanotransformation and phytopathogenicity of Acholeplasma laidlawii PG8 // Dokl Biochem Biophys. 2007. Vol. 413, № P. 57-60.

206. David S.A., Volokhov D.V., Ye Z., et al. Evaluation of Mycoplasma inactivation during production of biologies: egg-based viral vaccines as a model // Appl Environ Microbiol. 2010. Vol. 76, № 9. P. 2718-28.

207. Folmsbee M., Howard G., McAlister M. Nutritional effects of culture media on mycoplasma cell size and removal by filtration // Biologicals. 2010. Vol. 38, № 2. P. 214-7.

208. Castanie-Cornet M.P., Foster J.W. Escherichia coli acid resistance: cAMP receptor protein and a 20 bp cis-acting sequence control pH and stationary phase expression of the gadA and gadBC glutamate decarboxylase genes // Microbiology. 2001. Vol. 147, № Pt 3. P. 709-15.

209. Ajello F., Romano N., Massenti M.F. L-histidine ammonia-lyase from a T-strain Mycoplasma (Ureaplasma urealyticum) // Boll 1st Sieroter Milan. 1977. Vol. 56, № 4. P. 343-50.

210. Hahn R.G., Kenny G.E. Differences in arginine requirement for growth among arginine-utilizing Mycoplasma species // J Bacteriol. 1974. Vol. 117, № 2. P. 611-8.

211. Booth I.R., Louis P. Managing hypoosmotic stress: aquaporins and mechanosensitive channels in Escherichia coli // Curr Opin Microbiol. 1999. Vol. 2, № 2. P. 166-9.

212. Botsford J.L., Alvarez M., Hernandez R., et al. Accumulation of glutamate by Salmonella typhimurium in response to osmotic stress // Appl Environ Microbiol. 1994. Vol. 60, № 7. P. 2568-74.

213. Imfoff J.F. Osmoregulation and compatible solutes in eubacteria // FEMS Microbiol. 1986. V. 39. P. 57-66.

214. Gowrishankar J. Identification of osmoresponsive genes in Escherichia coli: evidence for participation of potassium and proline transport systems in osmoregulation//J Bacteriol. 1985. Vol. 164, № 1. P. 434-45.

215. Bremer E., Kramer R. Coping with osmotic challenges: osmoregulation through accumulation and release of compatible solutes in bacteria: Bacterial Stress Responses / ed. G. Storz, Hengge-Aronis, R. Washington, DC: American Society for Microbiology Press. 2000. P.79-97.