Определение биомаркеров сепсиса - фенилкарбоновых кислот - в сыворотке крови методом газовой хроматомасс-спектрометрии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат наук Паутова, Алиса Константиновна

• Паутова, Алиса Константиновна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Паутова, Алиса Константиновна

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболомика критических состояний

1.2. Низкомолекулярные биомаркеры сепсиса

Аминокислоты и их производные

Полиолы и их производные

Жирные кислоты и их производные

Гидроксикислоты и их производные

Амины, азотсодержащие гетероциклы и их производные

Нуклеотиды и другие азотсодержащие производные нуклеиновых кислот

1.3. Происхождение фенилкарбоновых кислот

1.4. Конъюгирование фенилкарбоновых кислот

1.5. Газовая хроматография для определения ароматических микробных метаболитов

1.6. Дериватизация фенилкарбоновых кислот

1.7. Высокоэффективная жидкостная хроматография для определения ароматических микробных метаболитов

1.8. Сорбционное концентрирование фенилкарбоновых кислот

Химически модифицированные кремнезёмы

Сверхсшитый полистирол

1.9. Микросорбционное концентрирование в шприце, заполненном сорбентом (MEPS)

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Оборудование

2.3. Методика эксперимента

Приготовление рабочих растворов фенилкарбоновых кислот

Условия дериватизации фенилкарбоновых кислот в эфирах

Методика жидкость-жидкостной экстракции фенилкарбоновых кислот

Условия сорбционного концентрирования на сверхсшитом полистироле

Методика микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном сорбентом (MEPS), фенилкарбоновых кислот из модельных растворов

Методика микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном сорбентом (MEPS), фенилкарбоновых кислот из образцов сыворотки крови

Микросорбционное концентрирование в шприце с использованием в качестве сорбента сверхсшитого полистирола

Методика газохроматографического анализа фенилкарбоновых кислот

Обработка экспериментальных результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Дериватизация фенилкарбоновых кислот

3.2. Жидкость-жидкостная экстракция фенилкарбоновых кислот

3.3. Прогностические модели для реанимационных больных, основанные на определении содержания фенилкарбоновых кислот в образцах сыворотки крови

3.4. Сорбционное концентрирование фенилкарбоновых кислот на концентрирующих патронах со сверхсшитым полистиролом

3.5. Микросорбционное концентрирование в шприце, заполненном сорбентом (MEPS)

Матрица: модельные растворы

Матрица: сыворотка крови здорового донора

Матрица: сыворотка крови реанимационных больных

Сорбент: сверхсшитый полистирол

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1

Приложение 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БК - бензойная кислота

БСТФА - N,O-бwc(триметилсилил)трифторацетамид

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГВК - 3-метокси-4-гидроксифенилуксусная (гомованилиновая) кислота

ГХ/МС - газовая хроматомасс-спектрометрия

ГХ/ПИД - газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором

ДЭЭ - диэтиловый эфир

ЖЖЭ - жидкость-жидкостная экстракция

МТБЭ - метил-дареда-бутиловый эфир

и-ГБК - 4-гидроксибензойная кислота

и-ГФМК - 3-(4-гидроксифенил)молочная кислота

и-ГФПК - 3-(4-гидроксифенил)пропановая кислота

и-ГФУК - 2-(4-гидроксифенил)уксусная кислота

ТМС - триметилсилильные производные

ФКК - фенилкарбоновые кислоты

ФМК - 3-фенилмолочная кислота

ФПК - 3-фенилпропановая кислота

ФУК - 2-фенилуксусная кислота

D5-БК - 2,3,4,5,6-D5-бензойная кислота

MEPS - микросорбционное концентрирование в шприце, заполненном сорбентом (MicroExtraction by Packed Sorbent)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение биомаркеров сепсиса - фенилкарбоновых кислот - в сыворотке крови методом газовой хроматомасс-спектрометрии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Метаболомные исследования являются востребованным направлением в настоящее время: начиная с 2009 года число публикаций по теме «метаболомика» выросло в 4,5 раза. Новые решения в области качественного и количественного химического анализа, а также статистические методы анализа многомерных данных активно используются для реализации данного подхода в области диагностики различных заболеваний. Разнообразие метаболического профиля наиболее наглядно представлено в таких биологических жидкостях как моча и кровь. Для больных в критических состояниях (сепсис, септический шок, полиорганная недостаточность и др.) унифицировать отбор мочи зачастую невозможно, поэтому поиск биомаркеров перечисленных осложнений проводится в крови (в т.ч. цельной, плазме и сыворотке).

В НИИ общей реаниматологии им. В.А. Неговского Федерального научно-клинического центра реаниматологии и реабилитологии разработана методика определения трех наиболее клинически значимых низкомолекулярных биомаркеров, являющихся продуктами жизнедеятельности бактерий, вызывающих сепсис. Этими соединениями являются фенилкарбоновые кислоты (ФКК): 2-гидрокси-3-фенилпропановая кислота (фенилмолочная кислота, ФМК), 4-гидроксифенилуксусная кислота (п-ГФУК) и 3-(4-гидроксифенил)-2-гидроксипропановая кислота (4-гидроксифенилмолочная кислота, п-ГФМК), чье микробное происхождение и прогностическая значимость установлены при проведении микробиологических и клинических исследований. Для их качественного и количественного определения используют жидкость-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ) с последующим газохроматографическим определением с универсальным пламенно-ионизационным детектированием (ГХ/ПИД). Проведение ЖЖЭ предусматривает использование большого объема органических растворителей, значительных временных затрат, связанных с необходимостью двукратной экстракции и упаривания органического элюата, а также затрудняет автоматизацию.

Актуальность работы определяется необходимостью разработки экспрессных высокочувствительных способов определения низкомолекулярных биомаркеров сепсиса в сыворотке крови.

Цель работы заключалась в разработке способов определения ФКК (бензойная, фенилуксусная, фенилпропановая, коричная, фенилмолочная, п-гидроксибензойная, п-гидроксифенилуксусная, и-гидроксифенилпропановая, гомованилиновая и п-гидроксифенилмолочная кислоты), включающих ЖЖЭ, сорбционное и микросорбционное концентрирование из сыворотки крови с последующей дериватизацией определяемых веществ и ГХ/МС анализом полученных производных.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• разработать способ определения ФКК с использованием ЖЖЭ из модельных растворов и из сыворотки крови здоровых доноров и реанимационных больных с последующей дериватизацией и анализом методом ГХ/МС;

• изучить возможность использования неполярных сорбентов на основе модифицированного силикагеля (С2, С8, С18) для извлечения ФКК с применением микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном сорбентом (microextraction by packed sorbent, MEPS), из модельных водных растворов и из сыворотки крови здоровых доноров и реанимационных больных разной степени тяжести с последующей дериватизацией и анализом методом ГХ/МС;

• изучить возможность использования сверхсшитого полистирола в качестве сорбента для сорбционного и микросорбционного извлечения ФКК из модельных растворов и образцов сыворотки крови с последующей дериватизацией и анализом методом ГХ/МС.

Научная новизна работы. Предложены способы определения ФКК в модельных растворах и образцах сыворотки крови, основанные на их извлечении методами ЖЖЭ, сорбционного (сорбент - сверхсшитый полистирол) и микросорбционного концентрирования в шприце (сорбенты - силикагель с привитыми фазами С8 и С18 или сверхсшитый полистирол) с последующей дериватизацией и ГХ/МС анализом.

При разработке способов сорбционного и микросорбционного концентрирования в шприце изучены особенности извлечения аналитов из модельных растворов и образцов сыворотки крови при разном рН (2-7), с применением различных видов элюентов, промывочных и кондиционирующих растворов. Выявлены особенности газохроматорафического определения ФКК с применением различных способов дериватизации (в сухом остатке или в объеме элюата). В выбранных условиях сорбционного и микросорбционного концентрирования в шприце, а также при извлечении аналитов методом ЖЖЭ, установлены степени извлечения, построены градуировочные зависимости в наиболее клинически значимом диапазоне концентраций (94-2250 мкг/л) и установлены пределы определения в модельных растворах и в сыворотке крови.

Практическая значимость. Благодаря использованию метода ГХ/МС кроме клинически значимых ФКК (ФМК, и-ГФУК, и-ГФМК) предложен способ определения других потенциально значимых ФКК (БК, ФПК, и-ГБК, и-ГФПК, ГВК и коричная кислота) с использованием ЖЖЭ; установлены характеристики определения (степени извлечения, пределы определения, градуировочные зависимости); определено содержание ФКК в сыворотке крови у здоровых доноров.

Предложен способ получения триметилсилильных производных ФКК при дериватизации в объеме растворителя (диэтиловый (ДЭЭ) и метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ)).

Разработаны способы воспроизводимого хроматомасс-спектрометрического определения низкомолекулярных биомаркеров сепсиса в образцах сыворотки крови здоровых доноров и реанимационных больных с использованием микросорбционного концентрирования в шприце (МБРБ) с применением неполярного (силикагель с привитой фазой С18) и полимерного (сверхсшитый полистирол) сорбентов, что позволяет рекомендовать его для внедрения в клиническую практику.

Разработанные подходы и статистический анализ накопленного массива данных (анализы 196 образцов сыворотки крови реанимационных больных и здоровых доноров) позволили построить математические модели для предсказания выживаемости реанимационных больных, а также для предсказания появления почечной или сердечно-сосудистой недостаточностей.

На защиту выносятся:

• способ определения ряда ФКК в модельных растворах и образцах сыворотки крови, основанный на ЖЖЭ, дериватизации и ГХ/МС анализе;

• условия дериватизации ряда ФКК в объеме ДЭЭ и МТБЭ с получением триметилсилильных производных для дальнейшего газохроматографического разделения;

• условия извлечения ряда ФКК из модельных растворов с применением метода микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном неполярным сорбентом (силикагель с привитой фазой С2, С8 или С18);

• способ определения ряда ФКК с применением метода микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18, в образцах сыворотки крови здоровых доноров и реанимационных больных;

• условия извлечения ряда ФКК из модельных растворов с использованием сорбционного концентрирования на концентрирующих патронах со сверхсшитым полистиролом;

• условия извлечения ряда ФКК из модельных растворов и образцов сыворотки крови в варианте микросорбционного концентрирования в шприце с применением в качестве сорбента сверхсшитого полистирола.

Апробация работы. VI Всероссийская конференция с международным участием «Масс-

спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2013), Второй Всероссийский симпозиум

с участием иностранных ученых «Кинетика и динамика обменных процессов» (с.

Дивноморское, Краснодарский край, 2013), XXI Международная научная конференция

студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014» (Москва, 2014), Третий

Всероссийский симпозиум «Кинетика и динамика обменных процессов» (Воронеж, 2014),

Всероссийская конференция «Теория и практика хроматографии» с международным участием,

7

посвященная памяти проф. М.С. Вигдергауза (Самара, 2015), VII Всероссийская конференция с международным участием «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2015), IV Всероссийский симпозиум с международным участием «Кинетика и динамика обменных процессов» (Сочи, 2015), V Всероссийский симпозиум с международным участием «Кинетика и динамика обменных процессов» (Сочи, 2016), XIII Всероссийская ежегодная конференция с международным участием «Проблема инфекции при критических состояниях» (Москва, 2017), VI Всероссийский симпозиум с международным участием «Кинетика и динамика обменных процессов» (Сочи, 2017).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 31 печатных работах: в 7 статьях, включенных в список ВАК, 23 тезисах докладов, 1 патенте на изобретение.

Личный вклад автора. Личный вклад автора заключается в анализе научной литературы, постановке задач исследования, планировании и выполнении экспериментов, обработке, анализе, структурировании и обобщении полученных результатов, написании статей, тезисов докладов, заявки на патент, подготовке докладов и выступлении на конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Материал изложен на 100 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 14 таблиц, в списке цитируемой литературы 117 наименований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболомика критических состояний

Достижения в области молекулярной и клеточной биологии за последние два десятилетия, в первую очередь секвенирование генома человека, несомненно, определили успехи в понимании патогенеза заболеваний, а также позволили более точно определять группы риска при определенных условиях. Тем не менее, при использовании геномного подхода многие вопросы остаются без ответа. Исследование метаболома более точно отражает деятельность клетки на уровне генома, транскриптома и протеома, поскольку метаболом представляет собой совокупность всех метаболитов и промежуточных продуктов метаболизма в биологическом организме.

Метаболомика - наука о метаболическом отклике живых систем на патофизиологические раздражители или генетическую модификацию. Транскриптомика, протеомика и метаболомика охватывают то, что называется системной биологией (рис. 1) [1]. Интерес к изучению метаболомики проявляется в очень широком круге областей, начиная с биотехнологии, сельского хозяйства, медицины, пищевого производства и заканчивая химией окружающей среды и токсикологией [2].

О

о

АО

1=> Фенотип

* о

ДНК Ген м-РНК Протеины Метаболиты

$ ф О о

Геном ика Транскриптомика Протеомика Метаболомика Рис. 1. Схематичное изображение многомерной биологии [1].

Метаболомика изучает обмен веществ на глобальном уровне. Концепция, лежащая в основе метаболомики, заключается в том, что метаболическое состояние определяется общим физиологическим состоянием организма. Исследование метаболома включает в себя анализ тысяч малых молекул в клетках, тканях, органах и биологических жидкостях с последующим применением статистических методов обработки данных и выявлением закономерностей [3].

Критические заболевания характеризуются тяжелыми нарушениями метаболического

гомеостаза и путей передачи сигнала. Метаболомика позволяет определять фенотипы

конкретных заболеваний и их патогенез, проводить раннюю диагностику, выявлять группы

больных с риском и тяжесть их заболевания, а также спрогнозировать реакцию организма на

9

лечение. Таким образом, для критических заболеваниях метаболомика может изменить концепцию биомаркеров [1].

Биомаркеры - это характеристики, являющиеся индикаторами нормальных или патогенных процессов, а также определяющие ответ организма на терапевтическое вмешательство. Аномалии, возникающие при заболевании, могут быть связаны с изменением клеточного метаболизма, ведущим к измеримым различиям в составе и уровнях метаболитов. Изучение этих биохимических изменений может быть очень полезно для идентификации биомаркеров [3], а оценка этих изменений может служить основой для диагностики соответствующего заболевания.

Сепсис представляет собой клинико-патогенетическую форму инфекционного заболевания, характеризующуюся разнообразием клинических проявлений, вызванных нарушенной резистентностью макроорганизма. Возбудителями сепсиса чаще всего являются стрептококки и стафилококки, реже — пневмококки, кишечная палочка и др. Без активного подавления возбудителя и коррекции иммунологических нарушений сепсис может привести к летальному исходу. В последние годы многочисленные исследования существенно дополнили представления о механизмах развития сепсиса, методах диагностики и комплексного лечения, но летальность при сепсисе продолжает оставаться высокой [4].

Традиционным методом определения возбудителя инфекционного процесса и сепсиса является культуральный метод - выделение из крови больного возбудителей инфекции [5]. Для этого образец крови помещают в жидкую питательную среду, находящуюся в специальном флаконе и инкубируют в бактериологическом анализаторе для регистрации бактериального роста. Если регистрируется рост, производится высев на твёрдые питательные среды для получения чистой культуры возбудителя и проводится идентификация микроорганизма ручными или автоматизированными биохимическими тестами. Ручные тесты выполняются быстро, но способны идентифицировать не все типы микроорганизмов; автоматизированные системы идентифицируют более широкий круг организмов, но требуют дорогостоящих расходных материалов и большего времени [6]. Одним из основных недостатков данного метода является продолжительность бактериологического исследования (до 96 часов), что приводит к поздней идентификации микроорганизма и постановке диагноза, что в свою очередь часто является причиной высокой летальности.

В последнее время возрос интерес к применению MALDI-TOF масс-спектрометрии (матричная лазерная десорбционная ионизация в сочетании с времяпролётным масс-анализатором) для идентификации микроорганизмов. В основе данного метода лежит получение масс-спектра рибосомальных белков исследуемого микроорганизма, который является видоспецифическим, и сравнение его с масс-спектрами, содержащимися в базе

10

данных. По определённому расчётному критерию делается вывод о принадлежности микроорганизма к тому или иному виду и роду. В качестве объекта исследования может выступать чистая культура микроорганизма, выращенная на питательной среде, а также биологические жидкости. Данный метод может за несколько минут определить в одном образце любой микроорганизм из более 4500 видов, которые содержатся в базах данных. Для одного анализа достаточно 1 мкл образца; нет необходимости в использовании больших количеств токсичных органических растворителей как в большинстве методов молекулярной диагностики. Использование мишени с 96 лунками и более позволяет проводить анализ сразу нескольких образцов. Однако существует проблема идентификации вида микроорганизма в присутствии другого (или других) из-за частичного совпадения спектров. В перспективе при дальнейшем совершенствовании программного обеспечения данная проблема, вероятно, будет решена [5].

1.2. Низкомолекулярные биомаркеры сепсиса

В зависимости от цели исследования, к потенциальным биомаркерам сепсиса могут предъявляться принципиально разные требования (рис. 2), что отражается на процессе поиска и его результатах. Так, достаточно долго в качестве основного критерия к потенциальному биомаркеру выдвигалось требование его исключительной принадлежности к микроорганизмам. Альтернативная точка зрения: биомаркеры сепсиса следует искать среди соединений, которые участвуют в метаболизме как человека, так и бактерий. Теоретически, количественные изменения таких «общих» метаболитов могут отражать глубину нарушений при сепсисе, или другими словами - дезинтеграцию метаболизма человека и его микробиоты.

молекулы «хозяина» молекулы бактерий

(производятся (производятся

эукариотическими клетками) ^ прокариотическими клетками)

«общие» метаболиты

Рис. 2. Три варианта принадлежности (происхождения) молекул - потенциальных биомаркеров сепсиса

В настоящее время для определения продуктов метаболизма в биологических объектах наиболее часто используются две группы методов: спектроскопия ЯМР 1Н [7-9] и различные варианты газовой или жидкостной хроматографии, газовой или жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ГХ/МС и ЖХ/МС) [9-11]. На основе полученных таким образом первичных данных о наличии и количественном содержании тех или иных веществ в поиске сепсис-

ассоциированных метаболитов исследователи используют подходы, основанные на метаболическом профилировании, распознавании образов, аналогичным отпечаткам пальцев.

В настоящее время сформирована база данных нормального человеческого метаболизма -Human Metabolon Data Base (HMDB) [12] в которой содержится информация о более чем 40 000 низкомолекулярных соединений - метаболитов и 400 метаболических путях. База регулярно обновляется и пополняется. В процессе поиска клинически-значимых метаболитов и потенциальных биомаркеров исследователи документируют те или иные отклонения в их качественно-количественном содержании в биологическом образце материала больных по сравнению со здоровыми людьми.

При многих заболеваниях для поиска метаболитов чаще используют доступные биологические образцы, получаемые неинвазивными способами, например, мочу, конденсат выдыхаемого воздуха и др. При сепсисе в условиях разной степени дисфункции органов выделения результаты исследования таких образцов невозможно унифицировать и оценивать, поэтому у больных с сепсисом для метаболомного анализа исследуются преимущественно образцы крови (цельная кровь, сыворотка, плазма). Кровь - это сложная многокомпонентная биологическая среда, которая требует особых условий пробоподготовки. Применяются разные методы пробоподготовки крови, что может отражаться на воспроизводимости результатов в руках разных исследователей, поэтому большинство исследователей создают собственные группы контроля (здоровых людей или экспериментальных животных) и приводят эти данные в своих статьях для объективного сравнения.

В исследования по метаболомике сепсиса включаются, как правило, небольшие группы больных. Составить однородные группы среди критических больных с сепсисом крайне сложно, так как больные всегда различаются по характеру и продолжительности основного заболевания, причине развития сепсиса, выраженности симптомов, тяжести состояния и др. Кроме того, все больные с сепсисом получают интенсивное лечение, которое в клинике невозможно унифицировать, так как такие тяжелые больные нуждаются в индивидуальном подходе. Также нельзя исключить, что некоторые лекарственные препараты оказывают влияние на метаболический профиль соответствующих соединений. Авторы, как правило, выделяют группы больных, используя шкалы оценки тяжести состояния (APACHE II), органных нарушений (SOFA) и др [13].

Еще одна важная особенность состоит в том, что сепсис неизбежно связан с микробным фактором. Геном микробиоты, населяющей организм человека (микробиом), содержит в 100 раз больше генов, чем геном организма хозяина. Метаболическая активность бактерий при сепсисе мало изучена, но бесспорно она подвержена значительным изменениям, что неизбежно

приводит к нарушению естественной интеграции метаболических путей человека и его микробиоты [14].

В организме человека исходные высокомолекулярные вещества (например, белки, полисахариды, жиры, полифенолы, стероиды) подвергаются химической трансформации по основным метаболическим путям с образованием низкомолекулярных метаболитов, представляющих собой разные классы химических соединений. В литературе накопились данные о десятках метаболитов, ассоциированных с сепсисом [15-35]. Молекулы, выявленные исследователями и отмеченные как клинически-значимые, сгруппированы далее в шести группах по принадлежности к следующим классам соединений: аминокислоты, полиолы, жирные кислоты, гидроксикислоты, амины и азотсодержащие гетероциклы, нуклеотиды.

Аминокислоты и их производные

Значимые различия в уровне аминокислот и их производных зафиксированы у септических больных: уровни аланина, гистидина, фенилаланина и креатина значительно повышены в сыворотке септических больных (или крыс) в различных клинических (или экспериментальных) исследованиях (Прил. 1. Табл. 1). В большинстве работ для определения данных соединений использовали метод 1Н-ЯМР. Некоторые авторы обнаруживают высокое содержание этих соединений не только в крови, но и в тканях легких и бронхоальвеолярном лаваже, что подтверждает нарушение метаболизма белков при сепсисе: избыток аминокислот является следствием катаболизма белков и отражает нарушения в синтезе белков и ферментов, необходимых организму в критическом состоянии. Увеличение 3-нитротирозина в плазме вследствие его нитрования авторы [15] расценивают как маркер окислительного повреждения пероксинитритом (ООКО-) при эндотоксемии или сепсисе.

Концентрации только двух аминокислот значительно снижены: глицина при эндотоксемии в моче инфицированных новорожденных [16] и глутатиона в крови тяжелых септических крыс [17]. Обе эти аминокислоты участвуют в детоксикации организма путем образования конъюгатов, и их снижение можно объяснить повышенным потреблением в условиях интоксикации. Кроме того, снижение уровней глицина и глутатиона при сепсисе может отражать несостоятельность барьерной функции печени на фоне повышенной проницаемости кишечной стенки, что сопровождается избыточным поступлением в кровь бактерий и микробных метаболитов.

Полиолы и их производные

При сепсисе уровни глюкозы в крови повышены [18-19]. В то же время, наличие кетоновых тел (группа продуктов обмена веществ, которые образуются в печени из ацетил-

13

КоА) указывает на активацию окисления жирных кислот вследствие нарушения энергетического обмена и дефицита АТФ. Авторы [19] объясняют измененный метаболический профиль у детей с сепсисом через изменение метаболизма глюкозы. Этот факт можно рассматривать как следствие снижения глюкозы по причине перераспределения ее расхода с митохондриального окислительного фосфорилирования на другие альтернативные метаболические пути, такие как продукция лактата и пентозо-фосфатный путь. Подтверждением являются более высокие уровни глюкозы и лактата в крови, а в моче достоверно более низкие концентрации промежуточных метаболитов пентозофосфатного пути окисления глюкозы (рибит, рибоновая и 2,3,4-гидроксимасляная кислоты) по сравнению с группой новорожденных без инфекции (Прил. 1. Табл. 2).

Высокие уровни глюконовой и глюкуроновых кислот также относят к продуктам окисления глюкозы в условиях окислительного стресса [15]. Также глюконовая и 2-кетоглюконовая кислоты могут быть метаболитами неферментирующих грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas spp. и накапливаться в крови больных с грамотрицательной инфекцией. Так, при исследовании 17 штаммов Pseudomonas spp показана их способность метаболизировать глюкозу в глюконовую и 2-кетоглюконовую кислоты [20]. В большинстве работ для определения данных соединений также использовали метод 1Н-ЯМР, а также ГХ/МС и УВЭЖХ/Q-TOF.

Жирные кислоты и их производные

Метаболомные исследования профиля жирных кислот свидетельствуют о выраженных нарушениях липидного обмена. Так, у экспериментальных крыс с сепсисом уровни длинноцепочечных жирных кислот (линоленовая, олеиновая и стеариновая кислоты), определенные методом ВЭЖХ/МС, снижены, особенно у невыживших (Прил. 1. Табл. 3) [21]. Эти жирные кислоты в свободном состоянии вовлечены в энергетический обмен. При сепсисе особенно важно, чтобы их уровень в сыворотке крови был достаточно высоким, так как в условиях нарушения обмена глюкозы именно расщепление жиров восполняет энергетические потребности больного организма. Однако результаты указывают на дисбаланс между потребностью в этих жирных кислотах и их содержанием в крови.

Уровни других метаболитов - полиненасыщенных жирных кислот (линолевой, докозапентаеновой и докозагексаеновой кислот) - повышены у септических крыс. Наиболее высокие концентрации этих жирных кислот отмечены в плазме животных с неблагоприятным исходом. Полиненасыщенные жирные кислоты связаны с антиокислительными и антивоспалительными процессами [22]; в то же время их высокие уровни зарегистрированы на пике бактериальной нагрузки и воспаления. Исследователи [21] объясняют повышение

14

концентраций этих метаболитов при сепсисе как ответ на выброс провоспалительных медиаторов.

Обращают на себя внимание выраженные изменения профиля ароматических метаболитов. В крови больных сепсисом концентрации ФУК и ФПК, определенные методом ГХ/МС, значительно снижены [23-24]. Эти метаболиты являются конечными продуктами микробной биодеградации фенилаланина [25]. Группой профессора Белобородовой Н.В. установлено, что их всегда можно обнаружить в крови здоровых людей в стабильных концентрациях [26]. Для сепсиса характерно полное отсутствие ФПК в крови [14], что можно расценить как подавление метаболической активности некоторых анаэробных бактерий микробиоты человека [27].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Паутова, Алиса Константиновна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Nin N., Izquerdo-Garcia J.L., Lorente J.A. The metabolomic approach to the diagnosis of critical illness. // Annual update in Intensive Care and Emergency Medicine. 2012. P. 43-54.

2. Kuehnbaum N.L., Britz-McKibbin P. New advances in separation science for metabolomics: resolving chemical diversity in a post-genomic era. // Chem. Rev. 2013. V.113. P. 2437.

3. Kaddurah-Daouk R., Soares J.C., Quinones M.P. Metabolomics: a global biochemical approach to the discovery of biomarkers for psychiatric disorders. // Biomarkers for Psychiatric Disorders. 2009. P. 129-130.

4. Singer M.,Deutschman C., Seymour C., Shankar-Hari M., Annane D., Bauer M., Bellomo R., Bernard G., Chiche J.-D., Coopersmith C., Hotchkiss R., Levy M., Marshall J., Martin G., Opal S., Rubenfeld G., Poll T., Vincent J.-L., Angus D. // The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 2016. V. 315. № 8. P.801-810.

5. Ломинадзе Г.Г., Семенова Е.А., Мотузова О.В., Калакуцкая А.Н., Лазарева А.В. Использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для ускорения идентификации микроорганизмов в гемокультурах пациентов с подозрением на сепсис. // Лаб. Диагн. 2014. № 4. С. 17-20.

6. Патель Р. MALDI-TOF-масс-спектрометрия: трансформативная протеомика для клинической микробиологии. // Клин. Лаб. Диагн. 2014. № 11. С. 8-10.

7. Mickiewicz B., Duggan G.,Winston B., Doig C., Kubes P., Vogel H. Metabolic profiling of serum samples by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy as a potential diagnostic approach for septic shock. // Crit. Care Med. 2014 V. 42. P.1140-1149.

8. Wishart D. Advances in metabolite identification. // Bioanalysis. 2011. V.3. P.1769-1782.

9. Dunn W., Broadhurst D., Atherton H., Goodacre R., Griffin J. Systems level studies of mammalian metabolomes: the roles of mass spectrometry and nuclear magnetic resonance spectroscopy. // Chem. Soc. Rev. 2011. V. 40. P. 387-426.

10. Nicholson J., Lindon J. Systems biology: metabonomics. // Nature. 2008. V. 455 P. 1054-1056.

11. Buzatto A., Sousa A., Guedes S., Cieslarova Z., Simionato A. Metabolomic investigation of human diseases biomarkers by CE and LC coupled to MS. // Electrophoresis. 2014. V. 35. P. 12851307.

12. Wishart D., Jewison T., Guo A., Wilson M., Knox C., Liu Y. HMDB 3.0—the human metabolome database in 2013. // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41 P. 801-807.

13. Мороз В.В., Белобородова Н.В., Осипов А.А., Власенко А.В., Бедова А.Ю., Паутова А.К. Фенилкарбоновые кислоты в оценке тяжести состояния и эффективности интенсивного лечения больных в реаниматологии. // Общая реаниматология. 2016. Т. 12. № 4. С. 37-48.

14. Белобородова Н.В. Интеграция метаболизма человека и его микробиома при критических состояниях. // Общая Рениматология. 2012. Т.4. №4. С. 42-54.

15. Liu X., Zheng X., Ji S., Lv Y., Zheng D., Xia Z. Metabolomic analysis of thermally injured and/or septic rats. // Burns. 2010. V. 36. P. 992-998.

16. Fanos V., Locci E., Noto A., Lazzarotto T., Manzoni P., Atzori L. Urinary metabolomics in newborns infected by cytomegalovirus: a preliminary investigation. // Earl. Hum. Develop. 2013. V. 89(Suppl. 4). S58-9.

17. Recknagel P., Gonnert F.,Westermann M., Lambeck S., Lupp A., Rudiger A. Liver dysfunction and phosphatidylinositol-3-kinase signalling in early sepsis: experimental studies in rodent models of peritonitis. // PLoS Med. 2012. V. 9. e1001338.

18. Mickiewicz B., Vogel H., Wong H., Winston B. Metabolomics as a novel approach for early diagnosis of pediatric septic shock and its mortality. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2013. V. 187 P. 967-976.

19. Fanos V., Caboni P., Corsello G., Stronati M., Gazzolo D., Noto A. Urinary 1H-NMR and GC-MS metabolomics predicts early and late onset neonatal sepsis. // Early Hum. Dev. 2014. V. 90.S.1. S.78-83.

20. Lockwood L., Tabenkin B., Ward G. The production of gluconic acid and 2-ketogluconic acid from glucose by species of Pseudomonas and Phytomonas. // J. Bacteriol. 1941. V. 42 P. 51-61.

21. Xu P., Lin Z., Meng H., Yan S., Yang Y., Liu X. A metabonomic approach to early prognostic evaluation of experimental sepsis. // J. Infect. 2008. V. 56. P. 474-481.

22. Calder P. n-3 fatty acids, inflammation and immunity: relevance to postsurgical and critically ill patients. // Lipids. 2004. V. 39. P.1147-1161.

23. Белобородова Н.В., Архипова А.С., Белобородов Д.М., Оленин А.Ю., Бойко Н.Б., Мелько А.И. Хромато-масс-спектрометрическое определение низкомолекулярных ароматических соединений микробного происхождения в сыворотке крови больных сепсисом. // Клин. Лаб. Диаг. 2006. №2. С. 3-6.

24. Белобородова Н.В., Оленин А.Ю., Ходакова А.С., Черневская Е.А., Хабиб О.Н. Происхождение и клиническое значение низкомолекулярных фенольных метаболитов в сыворотке крови человека. // Анест. Реаним. 2012. № 5. С. 65-72.

25. Белобородова Н.В., Ходакова А.С., Байрамов И.Т., Оленин А.Ю. Микробный путь образования фенилкарбоновых кислот в организме человека. // Биохимия. 2009. Т. 74. № 12. С. 1657-1663.

26. Белобородова Н.В., Мороз В.В., Осипов А.А., Бедова А.Ю., Оленин А.Ю., Гецина М.Л., Карпова О.В., Оленина Е.Г. Нормальный уровень сепсис-ассоциированных фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови. // Биохимия. 2015. Т. 80. № 3. С. 449-455.

79

27. Beloborodova N., Bairamov I., Olenin A., Khabib O., Fedotcheva N. Anaerobic Microorganisms from human microbiota produce species-specific exometabolites important in health and disease. //Glob. J. Pathol. Microbiol. 2013. V. 1. P. 43-53.

28. Beloborodova N.V., Sarshor Yu. N., Bedova A.Yu., Chernevskaya E.A., Pautova A.K. Involvement of aromatic metabolites in the pathogenesis of septic shock. Shock. 2018. DOI : 10.1097/SHK.0000000000001064

29. Martin M., Gibello A., Fernández J., Ferrer E., Garrido-Pertierra A. Catabolism of 3- and 4-hydroxyphenylacetic acid by Klebsiella pneumoniae. // J. Gen. Microbiol. 1991. V. 137. P. 621-628.

30. Seymour C., Yende S., Scott M., Pribis J., Mohney R., Bell L. Metabolomics in pneumonia and sepsis: an analysis of the GenIMS cohort study. // Intensive Care Med. 2013. V. 39. P. 1423-1434.

31. Beier К., Eppanapully S., Bazick H., Chang D., Mahadevappa K., Gibbons F. Elevation of blood urea nitrogen is predictive of long-term mortality in critically ill patients independent of "normal" creatinine. // Crit. Care Med. 2011. V. 39. P. 305-313.

32. Rogers A., McGeachie M., Baron R., Gazourian L., Haspel J., Nakahira K. Metabolomic derangements are associated with mortality in critically ill adult patients. // PLoS One. 2014. V. 9. e87538.

33. Tokushige K., Hashimoto E., Kodama K., Tobari M., Matsushita N., Kogiso T., Taniai M., Torii N., Shiratori K., Nishizaki Y., Ohga T., Ohashi Y., Sato T. Serum metabolomic profile and potential biomarkers for severity of fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease. // J. Gastroenterol. 2013. V. 48. P.1392-1400.

34. Izquierdo-García J.L., Nin N., Ruíz-Cabello J., Rojas Y., de Paula M, López-Cuenca S., Morales L., Martínez-Caro L., Fernández-Segoviano P., Esteban A., Lorente J.A. A metabolomic approach for diagnosis of experimental sepsis. // Intens. Care Med. 2011. V. 37. P. 2023-2032.

35. Beloborodova N.V., Olenin A.Y., Khodakova A.S. Phenylcarboxylic acids as potential markers for diagnosis of sepsis in cardiac surgery patients. // Archiv. Euromed. 2011. V 1-2. P. 20-26.

36. Beloborodova N.V., Olenin A.Yu., Pautova A.K. Metabolomic findings in sepsis as a damage of host-microbial metabolism integration. // J. Crit. Care 2018. V. 43. P. 246-255.

37. Singh C., Rai R., Azim A., Sinha N., Ahmed A., Singh K. Metabolic profiling of human lung injury by 1H high-resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of blood serum. // Metabolomics. 2015. V. 11. P. 166-174.

38. Биохимия. Учебник для вузов под ред. Е.С. Северина. 2007. М.: Гэотар-Медиа. С. 616626.

39. Jones M., Kopple J., Swendseid M. Phenylalanine metabolism in uremic and normal man. // Kidney Intern. 1978. V. 14. P. 169-179.

40. Nardini M., Natella F., Scaccini C., Ghiselli A. Phenolic acids from beer are absorbed and extensively metabolized in humans. // J. Nutr. Biochem. 2006. V. 17. № 1. Р. 14-22.

41. Peters S., Kaal E., Horsting I., Janssen H.-G. An automated method for the analysis of phenolic acids in plasma based on ion-pairing micro-extraction coupled on-line to gas chromatography/mass spectrometry with in-liner derivatisation. // J. Chromatogr. A. 2012. V. 1226. P. 71-76.

42. Bustamante L., Cardenas D., von Baer D., Pasrene E., Duran-Sandoval D., Vergara C., Mardones C. Evaluation of microextraction by packed sorbent, liquid-liquid microextraction and derivatization pretreatment of diet-derived phenolic acids in plasma by gas ch romatography with triple quadrupole mass spectrometry // J. Sep. Sci. 2017. P. 1-13

43. Лохов П.Г., Арчаков А.И. Масс-спектрометрические методы в метаболомике. // Биомед. Химия. 2008. Т. 54. № 5. С. 497-511.

44. Мороз В.В., Белобородова Н.В., Бедова А.Ю., Ревельский А.И., Гецина М.Л., Осипов А.А., Саршор Ю.Н., Бучинская А.А., Оленин А.Ю. Разработка и адаптация к условиям клинической лаборатории методик газохроматографического определения фенилкарбоновых кислот в сыворотке крови // Журн. аналит. химии. 2015. Т. 70. № 4. С. 418-425.

45. Свидетельство № 01.00225/205-38-15 об аттестации методики измерения выдано ФГУП «Всероссийский научно-исследовательский институт метрологической службы» от 07 августа 2015 г.

46. Патент №2423704 от 8 октября 2001 г. Белобородова Н.В., Ходакова А.С., Оленин А.Ю. Способ лабораторной диагностики сепсиса.

47. Kopple J.D. Phenylalanine and Tyrosine Metabolism in Chronic Kidney Failure. // J. Nutr. 2007. V. 137. №6. P. 1586S-1590S

48. Leibich H.M., Pickert A. Gas chromatographic profiling of phenolic acids in urine of patients with cirrhosis of the liver. // J.Chromatogr. 1985. V. 338. №1. P. 25-32.

49. Вахрушев М.К., Ревельский А.И., Оленин А.Ю., Белобородова Н.В. Разработка условий дериватизации фенилкарбоновых кислот, выделенных из сыворотки крови, и использованием метода газовой хроматографии/масс-спектрометрии. // Масс-спектрометрия. 2012. Т. 9. № 1. С. 36-42.

50. Segura J., Ventura R., Jurado C. Derivatization procedures for gas chromatographic-mass spectrometric determination of xenobiotics in biological samples, with special attention to drugs of abuse and doping agents. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 61-90.

51. Qiu Y., Su M., Liu Y., Chen M., Gu J., Zhang J., Jia W. Application of ethyl chloroformate derivatization for gas chromatography-mass spectrometry based metabonomic profiling. // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 583. P. 277-283.

52. Deutsch J.C. Determination of p-hydroxyphenylpyruvate, p-hydroxyphenyllactate and tyrosine in normal human plasma by gas chromatography-mass spectrometry isotope-dilution assay.// J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 1-6.

53. Davis B.A., Durden D.A., Pun-Li P., Boulton A.A. Gas chromatographic procedure for the determination of meta- and para-hudroxyphenylacetic acids. // J. Chromatogr. 1977. V. 142. P. 517522.

54. Davis B.A., Yu P.H., Carlson K., O'Sullivan K., Boulton A.A. Plasma levels of phenylacetic acid, m- and p-hydroxyphenylacetic acid, and platelet monoamine oxidase activity in schizophrenic and other patients. // Psychiatry Research. 1982. V. 6. P. 97-105.

55. Ohie T., Fu X., Iga M., Kimura M., Yamaguchi S. Gas chromatography-mass spectrometry with tert.-butyldimethylsilyl derivatization: use of the simplified sample preparations and the automated data system to screen for organic acidemias. // J. Chromatogr. B. 2000. V. 746. P. 63-73.

56. Paik M.-J., Kim K.-R. Sequential ethoxycarbonylation, methoximation and tert-butyldimethylsilylation for simultaneous determination of amino acids and carboxylic acids by dual-column gas chromatography. // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1034. P. 13-23.

57. Davis B.A., Durden D.A., Boulton A.A. Simultaneous analysis of twelve biogenic amine metabolites in plasma, cerebrospinal fluid and urine by capillary column gas-chromatography - highresolution mass spectrometry with selected-ion monitoring. // J. Chromatogr. 1986. V. 374. P. 227238.

58. Loo Y.H., Scotto L., Horning M.G. Gas chromatographic determination of aromatic acid metabolites of phenylalanine in brain. // Anal. Biochem. 1976. V.76. P. 111-118.

59. Wang C., Zuo Y. Ultrasound-assisted hydrolysis and gas chromatography-mass spectrometric determination of phenolic compounds in cranberry products. // Food Chem. 2011. V. 128. P. 562-568.

60. Jurkova M., Wurst M. Chromatography of microbial metabolites of aromatic amino acids. // J. Chromatogr. 1988. V. 446. P. 117-130.

61. Wurst M., Jurkova M., Zouchova Z. Gas chromatographic determination of aromatic carboxylic acids in the fungus oudemansiella mucida. // J. Chromatogr. 1984. V. 291. P. 145-153.

62. Blau K. Aromatic acid excretion in phenylketonuria analysis of the unconjugated aromatic acids derived from phelynalanine. // Clin. Chim. Acta. 1970. V. 27. P. 5-18.

63. Meineke I., Desel H., Kahl R., Kahl G.F., Gundert-Remy U. Determination of 2-hydroxyphenylacetic acid (2HPAA) in urine after oral and parenteral administration of coumarin by gas-liquid chromatography with flame-ionization detection. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1998. V. 17. P. 487-492.

64. Bengtsson I.M., Lehotay D.C. Sample preparation with an automated robotic workstation for organic acid analysis by gas chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 685. P. 1-7.

65. Liu A., Kushnir M., Roberts W., Pasquali M. Solid phase extraction procedure for urinary organic acid analysis by gas chromatography mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 2004. V. 806. P. 283-287.

66. Toshimitsu N., Ohki T., Maeda K., Saito A., Ohta K., Kobayashi K. A gas chromatographic-mass spectrometric assay for nine hydroxyphenolic acids in uremic serum. // Clin. Chim. Acta. 1979. V. 96. P. 247-254.

67. Curtius H.Ch., Mettler M., Ettlinger L. Study of the intestinal tyrosine metabolism using stable isotopes and gas chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. 1976. V. 126. P. 569-580.

68. Macek J. Correlation of the chromatographic retention of some phenylacetic and phenylpropionic acid derivatives with molecular structure. // J. Chromatogr. 1985. V. 333. P. 309-317.

69. Kim K.R., Hahn M.K., Zlatkis A., Horning E.C., Middleditch B.S. Simultaneous gas chromatography of volatile and nonvolatile carboxylic acids as tert.-butyldimethylsilyl derivatives ./ J. Chromatograph. 1989. V. 468. P. 289-301.

70. Kim K.R., Park H.G., Paik M.N., Ryu H.S., Oh K.S., Myung S.W., Leibich H.M. Gas chromatographic profiling and pattern recognition analysis of urinary organic acids from uterine myoma patients and cervical cancer patients. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 712. P. 11-22.

71. Gusovsky F., Sabelli H., Fawcett J., Edwards J., Javaid J.I. Gas-liquid chromatographic determination of total phenylacetic acid in urine. // Anal. Anal. Biochem. 1984. V.136. P. 202-207.

72. Markham G., Lichty D.G. Wightman F. Comparative study of derivatisation procedures for the quantitative determination of the auxin, phenylacetic acid, by gas chromatography. // J. Chromatogr. 1980. V. 192. P. 429-433.

73. Wong J.T.F., Baker G.B., Coutts R.T. Rapid and simple procedure for the determination of urinary phenylacetic acid using derivatization in aqueous medium followed by electron-capture gas chromatography. // J. Chromatogr. 1988. V. 428. P. 140-146.

74. Gao X., Pujos-Guillot E., Martin J.-F., Galan P., Juste C. Metabolite analysis of human fecal water by gas chromatography/mass spectrometry with ethyl chloroformate derivatization. // Anal. Biochem. 2009. V.393. P. 163-175.

75. Husek P., Liebich H.M. Organic acid profiling by direct treatment of deproteinized plasma with ethyl chloroformate. // J. Chromatogr. B. 1994. V. 656. P. 37-43.

76. Yamaguchi M., Matsunaga R., Fukuda K., Nakamura M. Determination of free and total phenylacetic and p- and m-hydroxyphenylacetic acids in human urine by liquid chromatography with fluorimetric detection. // J. Chromatogr. 1987. V. 414. P. 275-284.

83

77. Chen X.B., Pagella J.H., Bakker M.L., Parra O. Determination of aromatic metabolites in reminant urine by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1996. V. 682. P. 201208.

78. Shariati Sh., Yamini Y., Darabi M., Amini M. Three phase liquid phase microextraction of phenylacetic acid and phenylpropionic acid from biological fluids. // J. Chromatogr. B. 2007. V. 855. P. 228-235.

79. Suarez M., Romero M.-P., Macia A., Valls R., Fernandez S. Improved method for identifying and quantifying olive oil phenolic compounds and their metabolites in human plasma by microelution solid-phase extraction plate and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // J. Chromatogr.

B. 2009. V. 877. P. 4097-4106.

80. Rubio L., Serra A., Macia A., Borras X., Romero M.-P., Motilva M.-J. Validation of determination of plasma metabolites derived from thyme bioactive compounds by improved liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. // J. Chromatogr. B. 2012. V. 905. P. 75-84.

81. Amin R.M., Tomita Y., Onodera R. Rapid determination of phenylalanine and its related compounds in rumen fluid by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1995. V. 663. P. 201-207.

82. Khan R.I., Amin R.M., Mohammed N., Onodera R. Quantitative determination of aromatic amino acids and related compounds in rumen fluid by high-performance liquid chromatography. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 710. P. 17-25.

83. Paepe D. De et al. An improved mass spectrometric method for identification and quantification of phenolic compounds in apple fruits. // Food Chemistry. 2013. V. 136. P. 368-375.

84. Kivrak I., Kivrak S., Harmandar M., Cetintas Y. Phenolic compounds of Pinus brutia ten.: chemical investigation and quantitative analysis using an ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry with electrospray ionization source. // Rec. Nat. Prod. 2013. P.312-319.

85. Matamoros V., Calderon-Preciado D., Dominguez C., Bayona J. Analytical procedures for the determination of emerging organic contaminants in plant material: a review. // Analytica Chimica Acta. 2012. V. 722. P. 8-20.

86. Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Объедкова Е.В. Использование сверхсшитого полистирола как сорбента для трердофазной экстракции при анализе лекарств в биологических объектах методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т. 10. № 1. С. 5-13.

87. Методы разделения и концентрирования. Методическое пособие (Под ред. Дмитриенко

C.Г.) М.: Изд-во МГУ, 2008. С. 70-72.

88. Buchberger W. Novel analytical procedures for screening of drug residues in water, waste water, sediment and sludge. // Anal. Chim. Acta. 2007. V. 593. P. 129-139.

84

89. Kim K.R., Kim J.H., Jeong D.J., Paek D.J., Leibich H.M. Gas chromatographic profiling analysis of urinary organic acids from nonsmokers and smokers. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 701. P.1

90. Zhang D., Li W., Zhang J., Tang W., Qian C., Feng M., Chu Q., Ye J. Study on urinary metabolic profile of phenylketonuria by micellar electrokinetic capillary chromatography with dual electrochemical detection - potential clinical application in fast diagnosis of phenylketonuria. // Analytica Chimica Acta. 2011. V. 694. P. 61-66.

91. Deutsh J.C. Determination of p-hydroxyphenylpyruvate, p-hydroxyphenyllactate and tyrosine in normal human plasma by gas chromatography-mass spectrometry isotope-dilution assay. // J. Chromatogr. B. 1997. V. 690. P. 1-6.

92. Hennion M.-C. Solid-phase extraction: method development, sorbents, and coupling with liquid chromatography. // J. Chromatogr. A. 1999. V. 856. P. 3-54.

93. Goncalves J., Silva C.L., Castilho P.C., Camara J.S. An attractive, sensitive and high-throughput strategy based on microextraction by packed sorbent followed by UHPLC-PDA analysis for quantification of hydroxybenzoic and hydroxycinnamic acids in wines. // Microchem. J. 2013. V. 106. P.129-138.

94. Tsyurupa M.P., Davankov V.A. Porous structure of hypercresslinked polystyrene: state-of-the-art mini-review. // Reactive & Functional Polymers. 2006. V. 66. P. 768-779.

95. Цюрупа М.П., Блинникова З.К., Проскурнина Н.А., Пастухов А.В., Павлова Л.А., Даванков В.А. Сверхсшитый полистирол - первый нанопористый полимерный материал. Российские нанотехнологии. 2009. Т. 4. № 9. С. 109-117.

96. Long C., Li Y., Yu W., Li A. Adsorption characteristics of water vapor on the hypercrosslinked polymeric adsorbent. // Chem. Engineering J. 2012. V. 180. P.106-112.

97. Liu Q.-Q., Wang L., Xiao A.-G., Yu H.-J., Tan Q.-H. A hyper-cross-linked polystyrene with nano-pore structure. // European Polymer J. 2008. V. 44. P. 2516-2522.

98. Oh C.-G., Ahn J.-H., Ihm S.-K. Adsorptive removal of phenolic compounds by using hypercrosslinked polystyrenic beads with bimodal pore size distribution. // European Polymer J. 2008. V. 44. P. 2516-2522.

99. Hu H., Wang X., Li S., Huang J., Deng S. Bisphenol-A modified hyper-cross-linked polystyrene resin for salicylic acid removal from aqueous solution: adsorption equilibrium, kinetics and breakthrough studies. // J. Colloid & Interface Science. 2012. V. 372. P. 108-112.

100. Pan B.C., Xiong Y., Li A.M., Chen J.L., Zhang Q.X., Jin X.Y. Adsorption of aromatic acids on an aminated hypercrosslinked macroporous polymer. // Reactive & Functional Polymers. 2002. V. 53. P. 63-72.

101. Rosenberg G.I., Shabaeva A.S., Moryakov V.S., Tsyurupa M.P., Davankov V.A. Sorption properties of hypercrosslinked polystyrene sorbents. // Reactive Polymers. 1983. V. 1. P. 175-182.

85

102. Руденко А.О., Карцова Л.А., Краснов К.А. Новые возможности сверхсшитого полистирольного сорбента при определении эрготамина в крови крыс методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. // Вестник СПбГУ. 2011. Т. 2. № 4. С. 142-147.

103. Руденко А.О., Карцова Л.А. Выявление возможностей сорбента Purosep-200 на основе сверхсшитого полистирола при анализе водо- и жирорастворимых витаминов. // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. № 6. С. 766-772.

104. Fontanals N., Galia M., Cormack P., Marce R.M., Sherrington D., Borrull F. Evaluation of a new hypercrosslinled polymer as a sorbent for solid-phase extraction of a polar compounds. // J. Chromatogr. A. 2005. V. 1075. P. 51-56.

105. Li A., Zhang Q., Zhqng G., Chen J., Fei Z., Liu F. Adsorption of phenolic compounds from aqueous solutions by a water-compatible hypercrosslinked polymeric adsorbent. // Chemosphere. 2002. V. 47. P. 981-989.

106. Abdel-Rehim M. Microextraction by packed sorbent (MEPS): A tutorial. // Anal. Chem. Acta. 2011. V. 701. P. 119-238.

107. Abdel-Rehim M. Recent advances in microextraction by packed sorbent for bioanalysis. // J. Chromatogr. A. 2010. V. 1217. P. 2569-2580.

108. Pereira J., Gonsalves J., Alves V., Camara J.S. Microextraction using packed sorbent as an effective and high-throughput sample extraction technique: Recent applications and future trends. // Sam. Pre. 2013. P. 38-53.

109. Шурек Я., Пулкрабова Я., Хайцлова Я., Назафарин Л., Ковальчук Т. Возможности метода микроэкстракции шприцем, заполненным сорбентом (MEPS), в паре с системой газовой хроматографии/времяпролётной масс-спектрометрии в анализе бромированных антипиренов в сточных водах // Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7. № 2. С. 150-153.

110. Paredes R.M.G., Pinto C.G., Pavon J.L.P., Cordero B.M. In situ derivatization combined to automated microextraction by packed sorbents for the determination of chlorophenols in soil samples by gas chromatography mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2014. Vol. 1359. P. 52-59

111. Szultka M., Krzeminski R., Szeliga J., Jackowski M., Buszewski B. A new approach for antibiotic drugs determination in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry. // J. Chromatogr. A. 2013. V. 1272. P. 41-49.

112. Altun Z., Abdel-Rehim M. Study of the factors affecting the performance of microextraction by packed sorbent (MEPS) using liquid scintillation counter and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. // Anal. Chim. Acta. 2008. V. 630. P. 116-123.

113. Pautova A.K., Revelsky A.I. Optimization of the conditions for preparation of silyl derivatives of phenylcarboxylic acids in diethyl and methyl-tert-butyl ethers. // Protect. Metals Physical Chem. Surfaces. 2015. V. 51. № 6. P. 1076-1079.

114. Паутова А.К., Бедова А.Ю., Саршор Ю.Н., Белобородова Н.В. Определение ароматических микробных метаболитов в сыворотке крови методом газовой хромато-масс-спектрометрии. // Журн. Аналит. Химии. 2018. Т. 73. № 2. Р. 121-128.

115. Pomerantsev A.L., Rodionova O.Y. Concept and role of extreme objects in PCA/SIMCA. // J. Chemometrics. 2013. V. 28. №5. Р. 429-438.

116. Паутова А.К., Ревельский А.И. Сорбционное концентрирование фенилкарбоновых кислот (биомаркеров сепсиса) из модельных растворов на сверхсшитом полистироле. // Физикохимия Поверх. Защита Мат. 2014. Т. 50. № 6. С. 640-644.

117. Соболев П.Д., Паутова А.К., Ревельский А.И. Извлечение ароматических микробных метаболитов из водных растворов методом микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном сорбентом (MEPS), с последующим хроматомасс-спектрометрическим определением их силильных производных. // Масс-спектрометрия. 2017. Т. 14. № 2. С. 103-110.