Механизмы формирования кальциевого ответа тромбоцита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Балабин Федор Андреевич

• Балабин Федор Андреевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Балабин Федор Андреевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Роль положительной и отрицательной обратных связей в математической модели кальциевого ответа тромбоцита

Глава 4. Экспериментальное исследованию динамики концентрации кальция в одиночных тромбоцитах при помощи флуоресцентной микроскопии

Глава 5. Минимальная модель активации тромбоцита

Глава 6. Диагностический метод, позволяющий выявлять особенности

тромбоцитарного гемостаза у пациентов

Заключение

Основные результаты и выводы

Список использованных источников

Публикации автора по теме диссертации, опубликованные в журналах из

перечня Web of Science и SCOPUS

Список конференций, на которых были доложены результаты

исследования

Приложение

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Каждый многоклеточный организм, обладающий замкнутой кровеносной системой, постоянно сталкивается с проблемой поддержания её целостности. В процессе эволюции система остановки кровотечений -гемостаза - развилась в сложную многокомпонентную структуру, постоянно балансирующую на границе между тромбозом (образование тромбов в здоровых сосудах) и геморрагией (неостанавливающееся кровотечение) [1]. По данным ВОЗ, более половины человеческих смертей в мире так или иначе связаны с нарушениями работы системы гемостаза. Тромбоциты - часть этой системы, их задача - «распознать» повреждения кровеносных сосудов и «закрыть» их агрегатами из своих «тел». Для этого они должны обладать способностью к мгновенному реагированию на изменения окружающей их среды, т.е. к активации, которая обеспечивается в первую очередь системой кальциевой сигнализации. А именно, при контакте с агонистами тромбоцитарных рецепторов, такими, как АДФ и тромбин, концентрация ионов кальция в цитозоле тромбоцитов за секунды повышается в несколько десятков раз [2-4].

Ионы кальция играют решающую роль в активации тромбоцитов, поскольку являются кофакторами многих белков внутриклеточной сигнализации, регулирующих такие процессы как изменение формы клетки, выброс гранул и образование прокоагулянтной поверхности [4]. Как показали недавние исследования, при активации тромбоцита не происходит стабильное повышение концентрации кальция в цитозоле, а наблюдается последовательность стохастических «пиков» или «спайков» [3; 5-7].

Известно, что промежуточным посредником между рецепторами

плазматической мембраны и первичным повышением концентрации кальция

выступает инозитолтрифосфат (1Р3)[8]. Это вещество появляется в результате

расщепления мембранных фосфоинозитидов фосфолипазами группы С,

3

активируемыми рецепторами, ассоциированными с G-белками или с тирозинкиназами. Далее №3 связывается с рецептором к №3 на

поверхности эндоплазматического ретикулума, что приводит к выходу ионов кальция в цитозоль [9]. При этом активность всех изоформ фосфолипазы С регулируется по принципу положительной обратной связи концентрацией ионов кальция в цитозоле [10]. С другой стороны, ионы кальция выступают регуляторами для инозитолтрифосфат-3-киназы, утилизирующей №3 [11].

Динамика концентрации ионов кальция в тромбоцитах исследуется экспериментально с конца восьмидесятых годов прошлого века, когда стали доступными флуоресцентные метки, позволяющие измерять концентрацию кальция в живых клетках методами флуоресцентной микроскопии [12]. Известно, что тромбоциты отвечают на активацию последовательностями кальциевых пиков, и в зависимости от типа и концентрации активаторов количество, частота и амплитуда кальциевых пиков могут меняться [2; 3; 5-7]. При больших концентрациях активаторов кальциевые пики могут сливаться друг с другом, образуя при этом своеобразные кластеры, в пределе стремясь к стабильно высокому уровню концентрации кальция в цитозоле [3].

Как и в других клетках, в тромбоцитах ответ на активацию последовательностями кальциевых пиков обусловлен кооперативным открытием выпускающих ионы кальция из эндоплазматического

ретикулума в цитозоль, и наличием противодействующих им сарко-эндоплазматических кальциевых АТФаз (SERCA), переносящих ионы кальция в обратном направлении [13]. представляет собой тетрамер, каждый из мономеров которого имеет два сайта связывания для ионов кальция: высокоафинный и низкоафинный [9]. Высокоафинный сайт отвечает за открытие рецептора, а низкоафинный - за его закрытие [14]. Активность SERCA также зависит от концентрации кальция в цитозоле [9]. Для корректного описания динамики концентрации ионов кальция в цитозоле тромбоцита необходимо знать соотношение потоков ионов кальция через

мембрану эндоплазматического ретикулума, а также учитывать то, что в тромбоцитах существенное число белков выступает буферами для ионов кальция, тем самым замедляя процессы переноса. Здесь может помочь математическое моделирование процесса. Существует множество компьютерных моделей кальциевой сигнализации в разных клетках, в том числе в тромбоцитах. Например, в девяностые годы прошлого века была разработана первая минимальная биофизическая модель осцилляций концентрации кальция в ооцитах лягушек рода Хвпврш [9]. В редуцированной версии этой модели концентрация 1Р3 фиксируется и выступает бифуркационным параметром, а сама система описывается тремя обыкновенными дифференциальными уравнениями [15]. Два из этих уравнений описывают открытое и закрытое состояния 1Р3Я, а третье -концентрацию кальция в цитозоле. До недавнего времени отсутствовала минимальная модель, которая бы описывала кальциевый ответ тромбоцита без существенных отклонений числа кальциевых пиков в единицу времени и их формы от данных, наблюдаемых экспериментально.

Наконец, особый интерес представляет исследование динамики концентрации кальция в тромбоцитах пациентов с мутациями, приводящими к существенным отклонениям в свертывании крови. Например, для тромбоцитов пациентов с синдромом Вискотта-Олдрича характерны малые размеры и повышенные концентрации кальция [16], а для тромбоцитов пациентов с МТН-9-опосредованной тромбоцитопенией - наоборот. С одной стороны, такие исследования дают возможность понять роль того или иного белка в активации тромбоцита, если у пациента вследствие мутации этот белок не работает. С другой стороны, понимание особенностей активации тромбоцитов у таких пациентов помогает в индивидуальном подборе терапии. В этой связи важной задачей видится разработка диагностического метода, позволяющего количественно сравнивать кальциевые ответы тромбоцитов у пациентов и у здоровых доноров. Для этого может быть использована

интегральная концентрация кальция [17], однако такой подход связан с трудоемким и неточным пересчетом концентрации кальция из интенсивности флуоресценции кальциевого зонда. В данной работе предлагается подход, позволяющий оценивать силу кальциевого ответа, основываясь на временных особенностях кальциевых профилей.

Степень разработанности темы исследования

Исследования динамики концентрации кальция в одиночных тромбоцитах являются актуальными, что демонстрирует значительное число публикаций по этой теме, преимущественно биологической иди медицинской направленности. Это связано с тем, что ионы кальция регулируют большинство процессов, связанных с активацией тромбоцита, и оценку изменения концентрации кальция в тромбоцитах приводят как индикатор того, что тромбоциты в том или ином эксперименте претерпели активацию. Вместе с тем недостает как изложения фундаментальных закономерностей, лежащих в основе наблюдаемых явлений, так и простых методов оценки кальциевой динамики в одиночных тромбоцитах, пригодных к использованию в клинике. Эти задачи частично решаются данной работой.

Цель работы - определение молекулярных механизмов формирования кальциевого ответа в тромбоцитах человека.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. В рамках компьютерного моделирования определить роль положительной и отрицательной обратных связей в формировании кальциевого ответа тромбоцита;

2. Экспериментально определить временные характеристики кальциевого ответа тромбоцита на активацию;

3. Разработать минимальную математическую модель кальциевого ответа тромбоцита на активацию, описывающую наблюдаемые экспериментальные закономерности;

4. Сформулировать критерий оценки гетерогенности кальциевых ответов одиночных тромбоцитов человека, подходящий как для здоровых доноров, так и для пациентов с нарушениями тромбоцитарного гемостаза.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования является динамика концентрации кальция в цитозоле одиночного тромбоцита при его активации. Предмет исследования - временные и амплитудные характеристики кальциевых ответов одиночных тромбоцитов, полученные теоретически и экспериментально.

Научная новизна работы

Впервые было обнаружено, что влияние ионов кальция на активность фосфолипазы С-Р2 и инозитолтрифосфата обусловливает положительную и отрицательную обратные связи соответственно; показано, что физиологичный кальциевый ответ тромбоцита на активацию возможен лишь при одновременном присутствии этих обратных связей.

Было произведено детальное описание формы тромбоцитарного кальциевого «пика» и оценено приращение количества пиков в единицу времени по сравнению с базовой активацией в ответ на добавление основных активаторов. Впервые было теоретически обосновано минимальное расстояние между кальциевыми пиками, соствавляющее 1.6 ± 0.4 с.

В работе впервые построена минимальная математическая модель кальциевого ответа тромбоцита, учитывающая основные пути кальциевой сигнализации в клетке и описывающая форму типичного кальциевого пика, наблюдаемую в эксперименте. В рамках модели предсказано наличие трех

характерных режимов поведения концентрации кальция в клетке: стабильно низкий уровень кальция, колебательный режим и стабильно высокий уровень кальция. Степень активации тромбоцита и, как следствие, состояние системы зависит от текущей концентрации №3. В исходном состоянии при низкой концентрации №3 тромбоцит покоится. При увеличении концентрации №3 модельная система в определенный момент претерпевает бифуркацию Андронова-Хопфа: рождается предельный цикл, который и обеспечивает колебательный ответ. При дальнейшем увеличении концентрации №3 клетка вновь претерпевает бифуркацию Андронова-Хопфа, после которого клетка приходит в состояние со стабильно высокой концентрацией кальция.

В рамках работы была предложена экспериментальная методика количественной оценки «силы» кальциевого ответа по особенностям кальциевых профилей одиночных тромбоцитов, полученных при помощи флуоресцентного микроскопа. В проточной системе имитировались условия, аналогичные кровеносному сосуду. Каждый тромбоцит относился к одной из четырех групп активации на основании подсчета числа кальциевых пиков в минуту, доли кластеров из слившихся пиков и доли высокого уровня кальция. Каждая из этих групп соответствовала типу кальциевого ответа нарастающей силы. Эксперименты с кровью здоровых доноров позволили найти доверительные интервалы для долей популяций тромбоцитов в вышеуказанных группах. На основании попадания или непопадания в доверительный интервал можно было сделать вывод о том, имел ли пациент отклонения от нормы в тромбоцитарном гемостазе или же не имел.

Положения, выносимые на защиту

1. Уникальной особенностью кальциевого ответа тромбоцита на активацию является «зубцеобразная» форма пика и квазиосцилляторный ответ с независящим от типа активации минимальным межпиковым расстоянием и пуассоновской природой возникновения;

2. Разработана минимальная математическая модель, описывающая обмен ионами кальция между эндоплазматическим ретикулумом и цитозолем, предсказывающая характерные межпиковые времена и форму кальциевых пиков, наблюдаемые в эксперименте;

3. Из экспериментальных и теоретических исследований следует, что механизмом формирования кальциевого ответа тромбоцита является кооперативное открытие рецепторов к №3, сопряженное с буферизацией ионов кальция в цитозоле и одновременным присутствием положительной и отрицательной обратных связей.

Теоретическая значимость работы

Достоверная минимальная модель кальциевой динамики в тромбоците позволяет предсказывать силу активации той или иной клетки с минимальными затратами вычислительных ресурсов, что может быть полезным при моделировании поведения большого количества тромбоцитов одновременно, например, при симуляции роста тромба в потоке.

Простота и лаконичность модели делает ее удобным инструментом в исследовании нижележащих сигнальных каскадов, таких, как перестройка системы цитоскелета или секреция гранул. Компьютерная модель активации тромбоцита позволяет предсказывать возможные исходы экспериментов с клетками и позволяет оценивать количество реактивов, необходимых для экспериментального восстановления того или иного процесса внутриклеточной сигнализации. Наконец, анализ чувствительности кинетической модели позволяет находить в исследуемом сигнальном каскаде новые потенциальные мишени для разработчиков лекарственных препаратов.

Практическая значимость работы

Практическая значимость методики оценки интенсивности кальциевых

ответов одиночных тромбоцитов на основании динамики интенсивности

флюоресценции кальциевых зондов в одиночных тромбоцитах заключается в

9

том, что с ее помощью можно выявлять отклонения тромбоцитарного гемостаза от нормы у пациентов. Повышенные доли популяции тромбоцитов среди клеток с сильными и особо сильными кальциевыми ответами могут служить индикатором повышенной вероятности тромбоза, а повышенные доли популяции в группах для слабой активации - индикатором рефрактерности тромбоцитов и повышенной вероятности кровотечений.

Методология исследования

Методологическую основу работы составляют работы отечественных и зарубежных исследователей в области регистрации интенсивности флуоресценции одиночных клеток, изучения системы свертывания и математического моделирования сложных систем.

Методы исследования

В рамках данной работы модели интегрировались при помощи методов LSODA и Гиллеспи с использованием тау-скачков, проводилось исследование чувствительности модели к малым изменениям ее параметров. Для исследования влияния концентрации ионов кальция на производство инозитолтрифосфата использовалась кинетическая модель, построенная в среде COPASI на основании закона действующих масс, уравнения Михаэлиса-Ментен и уравнения Хилла.

Экспериментальные данные о динамике концентрации кальция в одиночных тромбоцитах были получены путем использования проточных камер. В работе использовалась флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения - современный метод, позволяющий возбуждать флуоресценцию не во всей толще раствора, а лишь в тонком (порядка 100 нм) слое цитозоля тромбоцита, прилегающего к подложке. Это дает возможность регистрировать флуоресценцию без выгорания много дольше по сравнению с эпифлуоресцентными методами.

Для построения и исследования поведения минимальной модели использовалась бибилотека Python 3.7 PyDSTool, позволяющая интегрировать системы обыкновенных дифференциальных уравнений, проводить анализ их устойчивости, находить в них точки бифуркации и получать свойства предельных циклов.

Достоверность результатов

Достоверность полученных результатов, обоснованность научных положений и выводов диссертации обеспечена использованием современных методов анализа кальциевых ответов тромбоцитов, применением оригинальной установки для регистрации интенсивности флуоресценции кальций-чувствительного зонда, а также использованием распространенных методов математического моделирования и статистической обработки данных, реализованных в общедоступных программных пакетах.

Личный вклад автора заключается в анализе научной литературы, планировании и проведении экспериментов, разработке и анализе математических моделей, статистической обработке результатов, анализе полученных результатов, представлении результатов на научных мероприятиях и подготовке публикаций в научных журналах.

Публикации

Всего опубликовано 12 статей. По теме диссертационной работы опубликовано 6 статей, из них в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах Web of Science, Scopus, RSCI

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы формирования кальциевого ответа тромбоцита»

Апробация работы

Результаты работы представлены на 13 международных и всероссийских конференциях.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структура и функции тромбоцитов человека

Тромбоциты - безъядерные дископодобные клетки диаметром до четырех микрометров и толщиной до одного микрометра, циркулирующие в кровотоке человека в количествах порядка 200-300 тысяч клеток на микролитр [18]. Основные функции тромбоцитов - предотвращение кровотечений путем формирования тромбоцитрарных агрегатов и предоставление своей поверхности для протекания реакций плазменного звена свертывания крови. Для выполнения этих функций тромбоциты способны к активации. При активации тромбоциты изменяют свою форму, приобретают способность к адгезии друг к другу, секретируют гранулы и, в случае сверхактивации, изменяют состав внешнего слоя клеточной мембраны [1; 18; 19]. Срок жизни тромбоцита доходит до десяти дней в случае, если он не претерпел активацию. Строго говоря, тромбоцит правильнее называть клеточным остатком, поскольку он отшнуровывается от клетки-предшественника мегакариоцита и не имеет собственного ядра [18]. Есть сведения о том, что в тромбоцитах есть рибосомы, в которых идет синтез белка [20], но это явление не является предметом данной работы. Прежде чем рассматривать физические механизмы, благодаря которым тромбоцит может выполнять свои функции, рассмотрим элементы его структуры.

В пространственной структуре артериального тромба выделяют два участка: стабильное плотноупакованное ядро из сильноактивированных тромбцоцитов, покрытое нестабильной оболочкой слабоактивированных периферических тромбоцитов, причем такая структура остается неизменной в артериях мышей не менее часа [21]. Структура тромба отражает градиенты концентраций агонистов, вызывающих активацию тромбоцитов: тромбин и образование фибриновых сгустков наблюдаются в первую очередь в ядре тромба, а в процессе роста периферической части наибольшее влияние имеют АДФ и тромбоксан А2. Последние данные показывают, что прокоагулянтные

тромбоциты выдавливаются из ядра тромба на периферию под давлением ретрактирующих тромбоцитов [22].

Рисунок 1.1. Структура растущего тромба. Адаптировано из [23]. Различными оттенками красного отражена концентрация кальция, концентрические кольца указывают на кальциевые осцилляции. Использованы обозначения: «core plt» - находящийся в окружении тромбина (показан как «IIa») дегранулированный сильноактивированный тромбоцит из ядра тромба - части, наиболее близко прилегающей к месту повреждения. «shell plt» - слабоактивированный тромбоит, имеющий дискообразную форму, адгезировавший к периферической части тромба. «procoagulant plt» -прокоагулянтный тромбоцит, выдавливающийся на периферию тромба под действием контракции. Предоставляет свою поверхность для мембранно-зависимых реакций плазменного звена свертывания.

Тромбоцит окружен плазматической мембраной, покрытой гликокаликсом. Объем тромбоцита лежит в пределах от 9.4 до 12.3 фл. Отрицательный заряд гликокаликса создает отталкивающую силу, которая не позволяет тромбоцитам формировать агрегаты с другими клетками в кровотоке [24]. К структурообразующим липидам, входящим в мембрану тромбоцита, относятся фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, сфигномиелин и холестерин [25]. Фосфолипиды

13

распределены асимметрично: в покоящихся тромбоцитах фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин расположены на внутреннем листке мембраны за счет АТФ-зависимой работы ферментов флиппазы и флоппазы [26]. Им противодействует скрамблаза TMEM16F, переносящая фосфатидилсерин в обратном направлении [27]. Экспонирование фосфатидилсерина на внешний листок мембраны приводит в конечном итоге к ускорению генерации тромбина [28], поэтому такой механизм должен быть отложен до той поры, пока тромбоцит не претерпит сверхактивацию, о которой будет сказано позднее.

Цитоскелет тромбоцита состоит из актина, спектрина и тубулина. Он выполняет две важные функции. Во-первых, он поддерживает целостность и дископодобную структуру в условиях циркуляции клеток в кровотоке. Во-вторых, благодаря способности цитоскелета быстро перестраиваться при активации тромбоцит может своевременно реагировать на повреждения кровеносных сосудов. Спектрин отвечает за целостность мембраны усиливая ее внутреннюю поверхность единой сетью тяжей при мембране. Нарушение целостности спектринового цитоскелета в тромбоцитах мышей привело к нестабильности клеточной мембраны и ее набуханию [29], что говорит о важности спектрина для поддержания формы покоящегося тромбоцита постоянной.

Было показано, что в покоящихся тромбоцитах присутствует кольцо из 324 микротрубочек, располагающееся глубже спектринового цитоскелета и не находящееся в непосредственном контакте с плазматической мембраной [30]. Функция этого кольца заключается в поддержании формы клетки постоянной: в экспериментах, где кольцо микротрубочек разрушалось охлаждением клеток до 4оС или при помощи химических агентов, тромбоциты приобретали сферическую форму [31]. Похожие нарушения наблюдаются у пациентов с мутациями в гене, кодирующем р1-тубулин [32].

Актиновые микрофиламенты суть полимеры из мономеров актина,

наиболее распространенного белка в тромбоцитах. Они образуют

14

сложнопереплетенную сеть тяжей, пронизывающих цитозоль клетки. Основная роль актинового цитосклета заключается в поддержании целостности тромбоцита в условиях циркуляции в кровотоке, где он подвергается сдвиговым напряжениям различной силы, а также при его резкой остановке, которая происходит при его активации на повреждении кровеносного сосуда [18]. Это обусловлено тем, что к актиновому цитоскелету через адаптерные молекулы крепятся многие цитозольные и мембранные объекты, в частности - комплекс GPIb-IX-V, обеспечивающий быструю остановку в месте повреждения путем связывания с эндотелием [33].

Тромбоциты содержат ряд органелл, необходимых для обеспечения свертывания крови. Эндоплазматический ретикулум (ЭПР) является главным хранилищем ионов кальция в клетке: концентрация кальция в нем достигает 200 - 400 мкМ, в то время как в цитозоле покоящегося тромбоцита - лишь десятки нМ [3]. Он представляет собой систему цистерн, испещряющих цитозоль тромбоцита, доля которых в объеме тромбоцита оценивается от 1 до 10% [34]. Важной особенностью ЭПР является механизм депо-зависимого восполнения запасов кальция: при падении концентрации кальция в ЭПР ниже 50 мкМ сигнальная молекула STIM1 связывается с ионным каналом ORAI на мембране, что приводит ко входу кальция в цитозоль извне и к последующей загрузке ЭПР [35]. Тромбоциты содержат три вида гранул: альфа-гранулы, плотные гранулы и лизосомы, из которых первые два вида гранул секретируются при активации тромбоцита [18]. Так, P-селектин служит биомаркером активации тромбоцитов за счет того, что в покоящейся клетке он заключен в альфа-гранулах, а при активации он экспонируется на внешний листок клеточной мембраны. В тромбоцитах присутствуют митохондрии, в покоящихся клетках они выполняют энергетическую функцию, однако при активации они особенно важны как триггер сверхактивации тромбоцита. При повышении концентрации кальция в цитозоле митохондрии начинают загружать его в себя, однако этому противодействует натрий-кальций-

литиевый обменник, переносящий ионы кальция обратно в цитозоль.

15

Согласно модели А.Н. Свешниковой, при активации тромбоцитов высокими концентрациями тромбина происходит активация митохондриального унипортера, что в части клеток приводит к загрузке митохондрий кальцием и падению митоходриального потенциала[36].

1.2. Общие принципы внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах.

У тромбоцита отсутствует ядро и, хотя согласно данным некоторых исследователей протеом тромбоцита может меняться при активации [37], в настоящей работе механизмы, которые могли бы индуцировать синтез белка в тромбоцитах, не рассматриваются. Большинство исследователей считает выход ионов кальция в цитоплазму центральным событием в процессе активации тромбоцита[4; 38]. Ионы кальция являются кофакторами многих ферментов, принимающих участие в активации тромбоцита, влияя на сокращение актинового цитоскелета [39], адгезию тромбоцитов друг к другу [40] и секрецию гранул [41].

Для исследования кальциевой сигнализации в тромбоцитах важно понимать следующие вещи:

1. Как переносится сигнал об активации снаружи внутрь клетки;

2. Как быстро наступает активация тромбоцита;

3. Каким образом происходит повышение концентрации кальция в тромбоците;

4. Каким образом происходит понижение концентрации кальция в тромбоците;

5. Какие динамические режимы возможны в системе кальциевой сигнализации;

6. Как связана динамика концентрации кальция с функциональными ответами клетки на активацию.

Схема основных сигнальных каскадов представлена на рисунке 1.2.

Активация тромбоцитов может инициироваться различными мембранными

рецепторами, однако большинство из них являются ассоциированными либо с

G-белками, либо с тирозинкиназами [4]. Сигнальные пути от таких рецепторов

16

сходятся на ферментах из группы фосфолипаз [4]. Эти ферменты играют исключительно важную роль в активации тромбоцита, будучи ответственными за вход в цитоплазму ионов кальция из эндоплазматической сети или внеклеточного пространства за счет увеличения концентрации инозитол-1,4,5-трифосфата (№3) [14].

Рисунок 1.2. Основные пути кальциевой сигнализации в тромбоцитах. Адаптировано из работы [4]. Видно, что сигнальные пути как от рецепторов, связанных с G-белками (показаны жирной черной кривой, пронизывающей мембрану семь раз), так и от тирозин-киназных рецепторов (GPVI), сходятся на фосфолипазах типа C (обозначенных на рисунке как PLCp и PLCy2), которые опосредуют рост концентрации ионов кальция в клетке производством инозитолтрифосфата №3, вызывающего открытие рецепторов к инозитолтрифосфату (IPзR). Ряд путей, таких как натрий-кальциевый обменник NCX и ионные помпы SERCA и PMCA способны понижать

концентрацию кальция. Система STIM1-ORAI направлена на пополнение кальцием ЭПР при его опустошении.

1.3. Процессы, приводящие к повышению концентрации кальция в цитозоле тромбоцита.

Повышение концентрации №3 приводит к открытию рецепторов к инозитолтрифосфату Известно, что существует три типа причем

рецепторы типов I и II располагаются на мембране ЭПР, а рецепторы типа III располагаются на клеточной мембране [42]. Все имеют сходную

структуру: это - тетрамер из четырех субъединиц, у каждый из которых есть сайт связывания для №3 и два сайта связывания для ионов кальция: высокоафинный активирующий и низкоафинный ингибирующий [43]. Такая структура приводит к тому, что график зависимости вероятности

открытия от концентрации кальция имеет колоколообразную форму: есть полоса концентраций кальция, в которых проницаемость максимальна, а при прочих значениях концентрации кальция она резко стремится к нулю [43]. Данные из источника [43], полученные на одиночных изолированных каналах при помощи метода локальной фиксации потенциала, показывают, что концентрации кальция, при которых происходит открытие различных изоформ отличаются в разы. Однако из экспериментов, в которых экспрессировались в клетках ^№093 и динамика одиночных исследовалась при помощи микроскопии полного внутреннего отражения, было показано, что все три изоформы имеют практически неотличимые динамические свойства [44]. Это объясняется трехступенчатой иерархической структурой организации и особенностями динамики концентрации

кальция вблизи кластеров на временных промежутках порядка

миллисекунд. Выделяют три уровня пространственно-временной организации Ш^: события, происходящие на уровне одиночных каналов с характерными временами порядка миллисекунд и расстояниями порядка десятков нанометров, события, происходящие на уровне кластеров из 20 - 40 каналов с

характерными временами порядка десятков миллисекунд и расстояниями порядка сотен нанометров, и глобальные события, происходящие на уровне целой клетки с характерными временами порядка десятых долей секунд и расстояниями порядка микрометров [44]. При открытии ГР3Я на расстоянии нескольких десятков нанометров от него на несколько миллисекунд создается

Рисунок 1.3. Колоколообразная зависимость вероятности открытия 1Р3Я от концентрации кальция для трех изоформ рецепторов. Адаптировано из [43]. Сверху показана кинетика открытия одиночных каналов.

локальная концентрация кальция в несколько десятков мкМ, достаточная для воздействия на соседние каналы. При этом предполагается, что более сильный стимул, вызывающий активацию тромбоцита, приводит к выбросу большей концентрации №3 и большей вероятности перехода от событий на уровне одиночных каналов к глобальному кальциевому ответу во всей клетке.

Выше был описан механизм, осуществляющий наибольшее влияние на рост концентрации кальция в тромбоците при активации. Однако существуют и иные пути, вклад от которых не столь велик. Ионы кальция могут входить в тромбоцит из внеклеточного пространства через канал P2X1, активируемый АТФ [49]. Как сказано выше, ионы кальция могут входить в тромбоцит при опустошении ЭПР за счет работы системы STIM1-ORAI [46; 47]. Известно, что при активации тромбоцита кальций высвобождается из лизосомоподобных органелл [48], однако этот механизм пока что малоизучен и вклад от него в общий кальциевый ответ невелик [35]. Кальций способен проникать внутрь тромбоцитов через неспецифические каналы семейства TRPC под воздействием диацилглицерина, однако этот процесс по последним данным характерен лишь для тромбоцитов, подверженных сверхсильной активации в ядре тромба коллагеном и тромбином одновременно [49]. Наконец, средством быстрого повышения концентрации кальция является натрий-кальциевый обменник (NCX), работающий в противоположном направлении при входе в тромбоцит ионов натрия через вышеуказанные неспецифические каналы TRPC, но такая ситуация возможна лишь при активации тромбоцитов тромбином и коллагеном одновременно, что характерно для ядра тромба [49].

Характерные скорости нарастания концентрации кальция теперь хорошо известны благодаря экспериментам с регистрации интенсивности флуоресценции кальций-связывающего флуорофора в системе с быстрым перемешиванием методом остановленной струи [50]. На рисунке 1.4 показано, что при активации тромбоцитов АДФ и тромбином происходит повышение

концентрации кальция за 0.5 с как в присутствии, так и в отсутствии ионов кальция во внеклеточной среде. Это наблюдение важно, потому что оно показывает способность системы тромбоцитарной кальциевой сигнализации своевременно срабатывать в ответ на внешний стимул. За секунду тромбоцит в артерии проходит несколько своих линейных размеров [21], и лишь быстро ответив на активатор, он способен закрепиться в месте повреждения сосуда. Поэтому важно показать механизм, по которому такой быстрый ответ мог бы развиваться. Из того, что и в отсутствие ионов кальция во внеклеточной среде тромбоцит остается способным к кальциевому ответу, следует, что ключевым механизмом, ответственным по крайней мере за первоначальные события, происходящие при активации тромбоцита, является высвобождение ионов кальция из внутриклеточных хранилищ.

1.4. Процессы, приводящие к понижению концентрации кальция в тромбоците.

Понижение концентрации кальция в тромбоците со стороны плазматической мембраны реализуется АТФазой PMCA и натрий-кальциевым обменником NCX. PMCA имеет большее сродство к ионам кальция по сравнению с NCX (константа диссоциации для кальция 0.3 мкМ против 1 мкМ [51]), сопоставимое число копий по протеому [52] и в десять раз меньшую каталитическую константу [51]. Из этого следуют различные функции этих двух переносчиков ионов кальция: в то время, как PMCA поддерживает концентрацию кальция в клетке низкой в отсутствие активации клетки, NCX влияет на концентрацию кальция в клетке лишь при активации.

Концентрация кальция также понижается и за счет загрузки его во внутриклеточные органеллы: эндоплазматический ретикулум и лизосомы. Эти пути опосредованы, соответственно, АТФазами SERCA 2B и 3A [35]. Существует также малоизученный SERCA-независимый путь запасания ионов кальция в лизосомоподобных органеллах за счет работы вакуолярной протон-

АТФазы, сопряженной с кальций-протонным обменником [53].

21

Т|те (*) Ткпе (в)

Рисунок 1.4. Динамика интенсивности флуоресценции кальций-чувствительного флуорофора в системе с быстрой остановкой струи. Концентрация кальция начинает нарастать уже через 0.5 с после активации тромбоцитов как в присутствии ионов кальция во внеклеточной среде (два верхних графика), так и в их отсутствии (два нижних графика). Адаптировано из [50].

Наконец, буферизация ионов кальция белками в цитозоле тромбоцита играет решающую роль в понижении концентрации свободных ионов кальция, поскольку, по некоторым оценкам, лишь 0.01 - 0.1% из всех ионов кальция в тромбоците находятся в свободном состоянии [54]. Степень буферизации ионов кальция можно предсказывать теоретически, выделяя в протеоме белки с распространенными кальций-связывающими доменами и рассчитывая их концентрации [52]. Экспериментально ее можно исследовать при помощи

флуоресцентных зондов, которые сами по себе являются буферами для ионов кальция и могут искажать истинную картину динамики концентрации ионов кальция в тромбоцитах. Так, например, было показано, что загрузка тромбоцитов флуоресцентными зондами Fura-2 и Quin2 повышает способность тромбоцитов к агрегации [54; 55].

1.5. Режимы динамики концентрации кальция в тромбоцитах человека.

Эксперименты, в которых параллельно наблюдались динамика концентрации кальция в суспензии тромбоцитов и различные функциональные ответы на активацию, показали, что в тромбоците существует ряд порогов концентрации кальция, приводящих к все более и более сильным ответам на активацию. Так, форма тромбоцитов начинала меняться при 400-500 нМ, секреция гранул происходила при 800 нМ, а формирование тромбоцитарных агрегатов - при 2 мкМ [54; 56; 57]. Это означает, что в тромбоците должны быть механизмы, обеспечивающие различные средние концентрации кальция при внешних стимулах нарастающей силы. Эти эксперименты производились весьма грубым образом - проницаемость клеточной мембраны для кальция повышалась при помощи ионофора - иономицина, и в области приведённых значений погрешность измерений концентрации кальция использованными высокоаффинными зондами может доходить до половины наблюдаемого значения. Но так или иначе, присутствие иерархии функциональных ответов тромбоцитов, индуцированных нарастающими концентрациями кальция выгладит важным свойством.

В настоящее время известно четыре основных динамических режима

концентрации ионов кальция в тромбоцитах человека. В покоящейся клетке,

как уже было сказано выше, концентрация кальция поддерживается на

стабильно низком уровне благодаря работе ионной помпы PMCA и составляет

десятки нМ [35]. При активации тромбоцитов слабыми активаторами, такими,

как АДФ, развиваются кальциевые осцилляции, способные продолжаться

23

десятки минут при наличии активатора в среде в первую очередь за счет высвобождения ионов кальция из ЭПР [3]. Такая активация явялется обратимой: при удалении АДФ из среды осцилляции концентрации кальция прекращаются [2]. Основной механизм развития кальциевых осцилляций заключается в одновременной работе ]Р3К и ионной помпы SERCA. Повышение концентрации №3 приводит к повышению вероятности открытия ^Я, а поскольку у этого ионного канала есть высокоаффинный активирующий и низкоаффинный ингибирующий сайты, ]Р3К способен эффективно пропускать ионы кальция лишь в полосе концентраций между значениями аффинностей для этих сайтов связывания. Открытие приводит к быстрому нарастанию концентрации кальция в цитозоле, приводящему к тому, что ]Р3Я закрывается, после чего ионы кальция возвращаются в ЭПР ионной помпой SERCA и, при наличии ]Р3, процесс повторяется [15].

Еще одним известным режимом активации тромбоцитов является образование кластеров из пиков концентрации кальция, стремящихся к переходу к стабильно высокому уровню [58]. Кальциевые пики идут настолько часто, что начинают сливаться между собой. Особенностью такого режима является необратимость активации, установить механизм которой еще предстоит [17].

Наконец, при активации высокими концентрациями сильных агонистов, таких, как тромбин, концентрация кальция достигает своего максимума, что обычно сопровождается формированием прокоагулянтных тромбоцитов [22; 36].

1.6. Связь повышения концентрации кальция при активации тромбоцита и его функциональных ответов.

Центральная роль ионов кальция в активации тромбоцита заключается в их способности транслировать внеклеточные сигналы в функциональные

ответы. Система кальциевой сигнализации отвечает за запуск и координацию ряда различных процессов, необходимых для образования тромба. Для этого тромбоцитам необходимы чувствительные к ионам кальция эффекторные белки, которые могут транслировать кальциевые сигналы в соответствующие внутриклеточные ответы. Известно, что тромбоциты обладают рядом таких эффекторных белков: кальмодулин, сциндерин, гельсолин и кальпаин, участвуют в реорганизации актинового цитоскелета и изменении формы тромбоцитов; CalDAGGEFI и CIB1 участвуют в активации интегрина аПЬрЭ; PKC, Munc13-4, белки SNARE и кальпаин участвуют в секреции гранул; cPLA2 управляет выработкой тромбоксана, а TMEM16F отвечает за экспонирование фосфатидилскрина при формировании прокоагулянтынх тромбоцитов [35].

Множество путей передачи сигналов, чувствительных к концентрации кальция в одной клетке, требует присутствия механизмов, обеспечивающих скоординированную активацию этих путей в нужное время и в нужном месте, чтобы вызвать желаемый функциональный ответ на любые конкретные сигналы. Если бы все эти процессы были полностью активны в каждом тромбоците, то произошел бы самораспространяющийся лавинообразный цикл активации тромбоцитов, приводящий к образованию тромбов, секреции аутокринных активаторов и привлечению дополнительных тромбоцитов, что в конечном счете привело бы к неконтролируемому росту тромба, способному закупорить кровеносный сосуд, а это приводит к пагубным последствиям для тканей ниже по течению кровотока. Однако в действительности этого не происходит. В последнее время было показано, что в толще растущего тромба тромбоциты неоднородны по степени активации, что отчасти объясняется присутствием градинентов активаторов [21], например, тромбин медленно диффундирует из ядра тромба на периферию, однако механизмы, приводящие к появлению столь разных по фенотипу тромбоцитов, остаются неясными.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Описание экспериментальной части.

2.1.1. Использованные материалы.

Следующие материалы были получены из источников, указанных в скобках: человеческий тромбин (Hematologic Technologies, Эссекс Джанкшн, штат Вермонт, США), нефибриллярный коллаген типа I (Имтек, Москва, Россия), Fura 2-AM и CalBryte 590-AM (AAT Bioquest, Саннивейл, Калифорния, США), антитела к CD31 были предоставлены профессором А.В. Мазуровым [59]. Остальные реактивы были получены в компании Sigma-Aldrich (Сан-Диего, Калифорния, США). Пластик для изготовления предметных стекол проточных камер был предоставлен компанией ГемаКор (Москва, Россия). Трубка силиконовая ТСМ наружным диаметром 1.5 мм и внутренним 0.5 мм была получена в компании МедСил (Мытищи, Россия). Была использована клейкая лента 3M марки 467 толщиной 200 мкм.

2.1.2. Использованные буферные растворы.

Использовались три буферных раствора общего назначения:

модифицированный буфер Тирода (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 12 мМ NaHCO3, 0.36 мМ NaH2PO4, 1 мМ MgCb, 2мМ CaCb, 20 мМ HEPES, 0.36% BSA, 1 г/л глюкозы, pH 7.3) позволяет производить манипуляции с кровью в проточных камерах, а BRB-80 (80 мМ PIPES/KOH, pH 6.9, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCb) и 1% раствор Pluronic-F127 в BRB-80 использовались для адгезии антител к силанизированному стеклу и предотвращения прямого взаимодействия клеток со стеклом соответственно. Использование BRB-80 проверено многократным применением команды наших коллег для исследования динамики микротрубочек [60].

2.1.3. Силанизация покровных стекол.

Мы использовали силанизацию, чтобы сформировать гидрофобную

поверхность на обычном покровном стекле. Эта конструкция позволяет

иммобилизовать антитела на покровном стекле и использовать их в качестве

якорей, которые улавливают тромбоциты из кровотока, имитируемого в

26

проточной камере. Очищенные покровные стекла (D102450, DeltaLab, Барселона, Испания) помещали в керамические держатели (8542E40, Thomas Scientific, Суитсборо, Нью-Джерси, США), помещали в стеклянные стаканы, заполненные 250 мл изопропанола, и обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. После этого держатели извлекали из изопропанола и сушили стелка на чистом воздухе, затем очищали в плазменном очистителе PlasmaFlo (Plasma Cleaner PDC-32G, PlasmaFlo PDC-FMG (Harrick Plasma, Итака, Нью-Йорк, США)) в соответствии с его протоколом. Очищенные стекла мы помещали в плотно закрывающуюся кювету под вытяжкой,содержащую 500 мл трихлорэтилена (Компонент-Реактив, Москва, Россия) с добавленными к нему 250 мкл дихлордиметилсилана. Очищенные покровные стекла инкубировались в кювете в течение 30 минут. После инкубации мы обрабатывали ультразвуком силанизированные покровные стекла в изопропаноле в течение 5 минут, затем промывали покровные стекла три раза в изопропаноле и семь раз в дистиллированной воде. Затем высушенные покровные стекла разрезали на две равные части по длинной стороне и хранили в чашках Петри переложенными салфетками для оптических приборов в качестве промежуточного слоя.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Балабин Федор Андреевич, 2021 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Якименко А.О., Свешникова А.Н., Артеменко Е.О., Пантелеев М.А. Этот загадочный тромбоцит // Природа, № 2, 2018. - C. 33-38.

2. Heemskerk J.W., Hoyland J., Mason W.T., Sage S.O. Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets // The Biochemical Journal, 1992. Vol. 283 (Pt 2). - P. 379-383.

3. Heemskerk J.W.M., Rook M.B., Sage S.O. Ragged spiking of free calcium in ADP-stimulated human platelets: regulation of puff-like calcium signals in vitro and ex vivo // The Journal of Physiology, 2001. Vol. 535, No. 3. - P. 625-635.

4. Varga-Szabo D., Braun A., Nieswandt B. Calcium signaling in platelets // Journal of thrombosis and haemostasis: JTH, 2009. Vol. 7, No. 7. - P. 1057-1066.

5. Balabin F.A., Sveshnikova A.N. Computational biology analysis of platelet signaling reveals roles of feedbacks through phospholipase C and inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase in controlling amplitude and duration of calcium oscillations // Mathematical Biosciences, 2016. Vol. 276. - P. 67-74.

6. Balabin F.A., Morozova D.S., Mayorov A.S., Martyanov A.A., Panteleev M.A., Sveshnikova A.N. Clusterization of Inositol Trisphosphate Receptors Determines the Shape of the Calcium Oscillation Peak in Platelet Cytosol // Moscow University Physics Bulletin, 2018. Vol. 73, No. 5. - P. 526-533.

7. Shakhidzhanov S.S., Balabin F.A., Obydennyi S.I., Ataullakhanov F.I., Sveshnikova A.N. Calcium oscillations in blood platelets and their possible role in "interpreting" extracellular information by cells // Physics-Uspekhi, 2019. Vol. 62, No. 7. - P. 660-674.

8. Rittenhouse S.E., Sasson J.P. Mass changes in myoinositol trisphosphate in human platelets stimulated by thrombin. Inhibitory effects of phorbol ester // The Journal of Biological Chemistry, 1985. Vol. 260, No. 15. P. 8657-8660.

9. De Young G.W., Keizer J. A single-pool inositol 1,4,5-trisphosphate-receptor-based model for agonist-stimulated oscillations in Ca2+ concentration // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992. Vol. 89, No. 20. - P. 9895-9899.

10. Rebecchi M.J., Pentyala S.N. Structure, function, and control of phosphoinositide-specific phospholipase C // Physiological Reviews, 2000. Vol. 80, No. 4. - P. 1291-1335.

11. Xia H.J., Yang G. Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinases: functions and regulations // Cell Research, 2005. Vol. 15, No. 2. - P. 83-91.

12. Grynkiewicz G., Poenie M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties // The Journal of Biological Chemistry, 1985. Vol. 260. No 6. - P. 3440-3450.

13. Dupont G., Falcke M., Kirk V., Sneyd J. Models of Calcium Signalling : Interdisciplinary Applied Mathematics. New York: Springer International Publishing, 2016.

14. Cao Y., Gillespie D.T., Petzold L.R. Efficient step size selection for the tau-leaping simulation method // The Journal of Chemical Physics, 2006. Vol. 124, No. 4. - P. 044109.

15. Keizer J., De Young G. Simplification of a Realistic Model of IP3-induced Ca2+ Oscillations // Journal of Theoretical Biology, 1994. Vol. 166, No. 4. - P. 431-442.

16. Obydennyi S.I., Artemenko E.O., Sveshnikova A.N., Ignatova A.A., Varlamova T.V., Gambaryan S., Lomakina G.Y., Ugarova N.N., Kireev I.I., Ataullakhanov F.I., Novichkova G.A., Maschan A.A., Shcherbina A., Panteleev M. Mechanisms of increased mitochondria-dependent necrosis in Wiskott-Aldrich syndrome platelets // Haematologica, 2020. Vol. 105, No. 4. - P. 1095-1106.

17. Heemskerk J.W.M., Feijge M. a. H., Henneman L., Rosing J., Hemker H.C. The Ca2+-mobilizing potency of alpha-thrombin and thrombin-receptor-activating peptide on human platelets -- concentration and time effects of thrombin-induced Ca2+ signaling // European Journal of Biochemistry, 1997. Vol. 249, No. 2. -P. 547-555.

18. Alan Michelson, Marco Cattaneo, Andrew Frelinger, Peter Newman Platelets 4th Edition. Amsterdam: Elsevier, 2019.

19. Sveshnikova A.N., Balatskiy A.V., Demianova A.S., Shepelyuk T.O., Shakhidzhanov S.S., Balatskaya M.N., Pichugin A.V., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Systems biology insights into the meaning of the platelet's dual-receptor thrombin signaling // Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2016. Vol. 14, No. 10. - P. 2045-2057.

20. Weyrich A.S., Schwertz H., Kraiss L.W., Zimmerman G.A. Protein synthesis by platelets: historical and new perspectives // Journal of thrombosis and haemostasis: JTH, 2009. Vol. 7. No 2. - P. 241-246.

21. Stalker T.J., Traxler E.A., Wu J., Wannemacher K.M., Cermignano S.L., Voronov R., Diamond S.L., Brass L.F. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network // Blood, 2013. Vol. 121, No. 10. - P. 1875-1885.

22. Nechipurenko D.Y., Receveur N., Yakimenko A.O., Shepelyuk T.O., Yakusheva A.A., Kerimov R.R., Obydennyy S.I., Eckly A., Léon C., Gachet C.,

95

Grishchuk E.L., Ataullakhanov F.I., Mangin P.H., Panteleev M.A. Clot Contraction Drives the Translocation of Procoagulant Platelets to Thrombus Surface // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2019. Vol. 39, No. 1. - P. 3747.

23. Sveshnikova A., Stepanyan M., Panteleev M., Sveshnikova A., Stepanyan M., Panteleev M. Platelet functional responses and signalling: the molecular relationship. Part 1: responses // Systems Biology and Physiology Reports, 2021. Vol. 1, No. 1. - P. 20.

24. Coller B.S. Biochemical and electrostatic considerations in primary platelet aggregation // Annals of the New York Academy of Sciences, 1983. Vol. 416. -P. 693-708.

25. O'Donnell V.B., Murphy R.C., Watson S.P. Platelet Lipidomics // Circulation Research, 2014. Vol. 114, No. 7. - P. 1185-1203.

26. Fadeel B., Xue D. The ins and outs of phospholipid asymmetry in the plasma membrane: roles in health and disease // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2009. Vol. 44, No. 5. - P. 264-277.

27. Bricogne C., Fine M., Pereira P.M., Sung J., Tijani M., Wang Y., Henriques R., Collins M.K., Hilgemann D.W. TMEM16F activation by Ca2+ triggers plasma membrane expansion and directs PD-1 trafficking // Scientific Reports, 2019. Vol. 9, No. 1. - P. 619.

28. Reddy E.C., Rand M.L. Procoagulant Phosphatidylserine-Exposing Platelets in vitro and in vivo // Frontiers in Cardiovascular Medicine, 2020. Vol. 7. - P. 15.

29. Patel-Hett S., Wang H., Begonja A.J., Thon J.N., Alden E.C., Wandersee N.J., An X., Mohandas N., Hartwig J.H., Italiano J.E. The spectrin-based membrane skeleton stabilizes mouse megakaryocyte membrane systems and is essential for proplatelet and platelet formation // Blood, 2011. Vol. 118, No. 6. - P. 1641-1652.

30. Nachmias V.T. Cytoskeleton of human platelets at rest and after spreading // The Journal of Cell Biology, 1980. Vol. 86, No. 3. - P. 795-802.

31. White J.G., Krivit W. An Ultrastructural Basis for the Shape Changes Induced in Platelets by Chilling // Blood, 1967. Vol. 30, No. 5. - P. 625-635.

32. Kunishima S., Kobayashi R., Itoh T.J., Hamaguchi M., Saito H. Mutation of the P1-tubulin gene associated with congenital macrothrombocytopenia affecting microtubule assembly // Blood, 2009. Vol. 113, No. 2. - P. 458-461.

33. Cranmer S.L., Ashworth K.J., Yao Y., Berndt M.C., Ruggeri Z.M., Andrews R.K., Jackson S.P. High shear-dependent loss of membrane integrity and defective

platelet adhesion following disruption of the GPIba-filamin interaction // Blood, 2011. Vol. 117, No. 9. - P. 2718-2727.

34. Purvis J.E., Chatterjee M.S., Brass L.F., Diamond S.L. A molecular signaling model of platelet phosphoinositide and calcium regulation during homeostasis and P2Y1 activation // Blood, 2008. Vol. 112, No. 10. - P. 4069-4079.

35. Harper A.G.S., Sage S.O. Platelet Signalling: Calcium // Platelets in Thrombotic and Non-Thrombotic Disorders: Pathophysiology, Pharmacology and Therapeutics: an Update / Eds. P. Gresele et al. - Cham: Springer International Publishing, 2017. - P. 285-296.

36. Sveshnikova A.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Compartmentalized calcium signaling triggers subpopulation formation upon platelet activation through PAR1 // Molecular bioSystems, 2015. Vol. 11, No. 4. - P. 1052-1060.

37. Zimmerman G.A., Weyrich A.S. Signal-dependent protein synthesis by activated platelets: new pathways to altered phenotype and function // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2008. Vol. 28, No. 3. - P. 1724.

38. Rink T.J., Sage S.O. Calcium signaling in human platelets // Annual Review of Physiology, 1990. Vol. 52. - P. 431-449.

39. Hathaway D.R., Adelstein R.S. Human platelet myosin light chain kinase requires the calcium-binding protein calmodulin for activity // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1979. Vol. 76, No. 4. - P. 1653-1657.

40. Shattil S.J., Brass L.F. Induction of the fibrinogen receptor on human platelets by intracellular mediators // The Journal of Biological Chemistry, 1987. Vol. 262, No. 3. - P. 992-1000.

41. Flaumenhaft R. Molecular Basis of Platelet Granule Secretion // Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 2003. Vol. 23, No. 7. - P. 1152-1160.

42. El-Daher S.S., Patel Y., Siddiqua A., Hassock S., Edmunds S., Maddison B., Patel G., Goulding D., Lupu F., Wojcikiewicz R.J., Authi K.S. Distinct localization and function of (1,4,5)IP(3) receptor subtypes and the (1,3,4,5)IP(4) receptor GAP1(IP4BP) in highly purified human platelet membranes // Blood, 2000. Vol. 95, No. 11. - P. 3412-3422.

43. Mak D.-O.D., Foskett J.K. Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors in the endoplasmic reticulum: A single-channel point of view: SI: Organellar Channels & Transporters // Cell Calcium, 2015. Vol. 58, No. 1. - P. 67-78.

44. Lock J.T., Alzayady K.J., Yule D.I., Parker I. All three IP3 receptor isoforms generate Ca2+ puffs that display similar characteristics // Science signaling, 2018. Vol. 11, No. 561. - P. 3-44.

45. Mahaut-Smith M.P., Jones S., Evans R.J. The P2X1 receptor and platelet function // Purinergic Signalling, 2011. Vol. 7, No. 3. - P. 341-356.

46. Feske S., Gwack Y., Prakriya M., Srikanth S., Puppel S.-H., Tanasa B., Hogan P.G., Lewis R.S., Daly M., Rao A. A mutation in Orai1 causes immune deficiency by abrogating CRAC channel function // Nature, 2006. Vol. 441. - P. 179-185.

47. Gilio K., Kruchten R. van, Braun A., Berna-Erro A., Feijge M.A.H., Stegner D., Meijden P.E.J. van der, Kuijpers M.J.E., Varga-Szabo D., Heemskerk J.W.M., Nieswandt B. Roles of platelet STIM1 and Orai1 in glycoprotein VI- and thrombin-dependent procoagulant activity and thrombus formation // The Journal of biological chemistry, 2010. Vol. 285, No. 31. - P. 23629-23638.

48. Rosado J.A. Acidic Ca(2+) stores in platelets // Cell Calcium, 2011. Vol. 50, No. 2. - P. 168-174.

49. Aliotta A., Calderara D.B., Zermatten M.G., Alberio L. Sodium-Calcium Exchanger Reverse Mode Sustains Dichotomous Ion Fluxes Required for Procoagulant COAT Platelet Formation // Thrombosis and Haemostasis, 2021. Vol. 121, No. 03. - P. 309-321.

50. Sage S., Rink T. The kinetics of changes in intracellular calcium concentration in fura-2-loaded human platelets. // Journal of Biological Chemistry, 1987. Vol. 262, No. 34. - P. 16364-16369.

51. Blaustein M.P., Lederer W.J. Sodium/calcium exchange: its physiological implications // Physiological Reviews, 1999. Vol. 79, No. 3. - P. 763-854.

52. Burkhart J.M., Vaudel M., Gambaryan S., Radau S., Walter U., Martens L., Geiger J., Sickmann A., Zahedi R.P. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways // Blood, 2012. Vol. 120, No. 15. - P. e73-e82.

53. Sage S.O., Pugh N., Mason M.J., Harper A.G.S. Monitoring the intracellular store Ca2+ concentration in agonist-stimulated, intact human platelets by using Fluo-5N // Journal of thrombosis and haemostasis: JTH, 2011. Vol. 9, No. 3. -P. 540-551.

54. Sage S.O., Pugh N., Farndale R.W., Harper A.G.S. Pericellular Ca2+ recycling potentiates thrombin-evoked Ca2+ signals in human platelets // Physiological Reports, 2013. Vol. 1, No. 5. - P. e00085.

55. Lanza F., Beretz A., Kubina M., Cazenave J.P. Increased aggregation and secretion responses of human platelets when loaded with the calcium fluorescent probes quin2 and fura-2 // Thrombosis and Haemostasis, 1987. Vol. 58, No. 2. - P. 737-743.

56. Hallam T.J., Daniel J.L., Kendrick-Jones J., Rink T.J. Relationship between cytoplasmic free calcium and myosin light chain phosphorylation in intact platelets // Biochemical Journal, 1985. Vol. 232, No. 2. - P. 373-377.

57. Rink T.J., Smith S.W., Tsien R.Y. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets: Ca2+ thresholds and Ca-independent activation for shape-change and secretion // FEBS letters, 1982. Vol. 148, No. 1. - P. 21-26.

58. Poole A.W., Watson S.P. Regulation of cytosolic calcium by collagen in single human platelets // British Journal of Pharmacology, 1995. Vol. 115, No. 1. - P. 101106.

59. Mazurov A.V., Vinogradov D., Kabaeva N.V., Antonova G.N., Romanov Y., Vlasik T., Antonov A., Smirnov V. A monoclonal antibody, VM64, reacts with a 130 kDa glycoprotein common to platelets and endothelial cells: heterogeneity in antibody binding to human aortic endothelial cells. // Thrombosis and haemostasis, 1991 Vol. 66, No. 4. - P. 494-499.

60. Gudimchuk N., Vitre B., Kim Y., Kiyatkin A., Cleveland D.W., Ataullakhanov F.I., Grishchuk E.L. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips // Nature Cell Biology, 2013. Vol. 15, No. 9. -P. 1079-1088.

61. Merritt J.E., McCarthy S.A., Davies M.P.A., Moores K.E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+ // Biochemical Journal, 1990. Vol. 269, No. 2. - P. 513-519.

62. Differential Interference Contrast Microscopy and Modulation Contrast Microscopy // Fundamentals of Light Microscopy and Electronic Imaging. New York: John Wiley & Sons, Ltd, 2012. - P. 173-197.

63. Ненашева T. Как исследовать клетку на уровне отдельных биомолекул // URL: https: // biomolecula.ru/articles/kak-issledovat-kletku-na-urovne-otdelnykh-biomolekul (дата обращения: 17.09.2021).

64. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nature Methods, 2012. Vol. 9, No. 7. - P. 671-675.

65. McKinney W. Python for Data Analysis: Data Wrangling with Pandas, NumPy, and IPython. - 2nd edition. - Sebastopol: O'Reilly Media, 2017. - 885 с.

66. Hoops S., Sahle S., Gauges R., Lee C., Pahle J., Simus N., Singhal M., Xu L., Mendes P., Kummer U. COPASI - a COmplex PAthway SImulator // Bioinformatics, 2006. Vol. 22, No. 24. - P. 3067-3074.

67. Hindmarsh A.C., Petzold L.R. LSODA, Ordinary Differential Equation Solver for Stiff or Non-Stiff System. San Francisco, 2005.

68. Твердислов В.А., Сидорова А.Э., Яковенко Л.В. Биофизическая экология. М.: URSS, 2012. - 543 с.

69. E. Hairer; G. Wanner. Solving ordinary differential equations. Vol. 2. Stiff and differential algebraic problems / Springer series in computational mathematics. -Berlin, Heidelberg: Springer, 2010.

70. Clewley R. Hybrid Models and Biological Model Reduction with PyDSTool // PLOS Computational Biology, 2012. Vol. 8, No. 8. - P. e1002628.

71. Lenoci L., Duvernay M., Satchell S., DiBenedetto E., E. Hamm H. Mathematical model of PAR1-mediated activation of human platelets // Molecular BioSystems, 2011. Vol. 7, No. 4. - P. 1129-1137.

72. Woodring P.J., Garrison J.C. Expression, purification, and regulation of two isoforms of the inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase // The Journal of Biological Chemistry, 1997. Vol. 272, No. 48. - P. 30447-30454.

73. Sneyd J., Dufour J.-F. A dynamic model of the type-2 inositol trisphosphate receptor // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. Vol. 99, No. 4. - P. 2398-2403.

74. Lytton J., Westlin M., Burk S.E., Shull G.E., MacLennan D.H. Functional comparisons between isoforms of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum family of calcium pumps // The Journal of Biological Chemistry, 1992. Vol. 267, No. 20. -P. 14483-14489.

75. Lee S.B., Shin S.H., Hepler J.R., Gilman A.G., Rhee S.G. Activation of phospholipase C-beta 2 mutants by G protein alpha q and beta gamma subunits // Journal of Biological Chemistry, 1993. Vol. 268, No. 34. - P. 25952-25957.

76. Blank J.L., Ross A.H., Exton J.H. Purification and characterization of two G-proteins that activate the beta 1 isozyme of phosphoinositide-specific phospholipase C. Identification as members of the Gq class // The Journal of Biological Chemistry, 1991. Vol. 266, No. 27. - P. 18206-18216.

77. Panteleev M.A., Korin N., Reesink K.D., Bark D.L., Cosemans J.M.E.M., Gardiner E.E., Mangin P.H. Wall shear rates in human and mouse arteries: Standardization of hemodynamics for in vitro blood flow assays: Communication

from the ISTH SSC subcommittee on biorheology // Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2021. Vol. 19, No. 2. - P. 588-595.

78. Moein M., Grzyb K., Gonfalves Martins T., Komoto S., Peri F., Crawford A.D., Fouquier d'Herouel A., Skupin A. CaSiAn: a Calcium Signaling Analyzer tool // Bioinformatics, 2018. Vol. 34, No. 17. - P. 3052-3054.

79. Blumenfeld L.A., Grosberg A.Yu., Tikhonov A.N. Fluctuations and mass action law breakdown in statistical thermodynamics of small systems // The Journal of Chemical Physics, 1991. Vol. 95, No. 10. - P. 7541-7547.

80. Skupin A., Falcke M. From puffs to global Ca2+ signals: How molecular properties shape global signals // Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science, 2009. Vol. 19, No. 3. - P. 037111.

81. Bezprozvanny L., Watras J., Ehrlich B.E. Bell-shaped calcium-response curves of lns(l,4,5)P3- and calcium-gated channels from endoplasmic reticulum of cerebellum // Nature, 1991. Vol. 351. - P. 751-754.

82. Siekmann I., Cao P., Sneyd J., Crampin E.J. Data-Driven Modelling of the Inositol Trisphosphate Receptor and its Role in Calcium-Induced Calcium Release (CICR) // Computational Glioscience: Springer Series in Computational Neuroscience / Eds. M. De Pitta, H. Berry. - Cham: Springer International Publishing, 2019.

83. Wagner J., Keizer J. Effects of rapid buffers on Ca2+ diffusion and Ca2+ oscillations // Biophysical Journal, 1994. Vol. 67, No. 1. - P. 447-456.

84. Falati S., Patil S., Gross P.L., Stapleton M., Merrill-Skoloff G., Barrett N.E., Pixton K.L., Weiler H., Cooley B., Newman D.K., Newman P.J., Furie B.C., Furie B., Gibbins J.M. Platelet PECAM-1 inhibits thrombus formation in vivo // Blood, 2006. Vol. 107, No. 2. - P. 535-541.

85. Singh S., Malm C.J., Ramstrom S., Hesse C., Jeppsson A. Adrenaline enhances in vitro platelet activation and aggregation in blood samples from ticagrelor-treated patients // Research and Practice in Thrombosis and Haemostasis, 2018. Vol. 2, No. 4. - P. 718-725.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ,

ОПУБЛИКОВАННЫЕ В ЖУРНАЛАХ ИЗ ПЕРЕЧНЯ WEB OF

SCIENCE И SCOPUS:

1. Balabin F. A., Sveshnikova A. N. Computational biology analysis of platelet signaling reveals roles of feedbacks through phospholipase C and inositol 1, 4, 5-trisphosphate 3-kinase in controlling amplitude and duration of calcium oscillations // Mathematical biosciences, 2016. Vol. 276. - P. 67-74. (Scopus: 4.2, WOS: 2.144)

2. Майоров А. С., Шепелюк Т. О., Балабин Ф. А., Мартьянов А. А., Нечипуренко Д. Ю., Свешникова А.Н. Моделирование секреции гранул при активации тромбоцитов через TLR4-рецептор // Биофизика, 2018. Т. 63, № 3. - С. 475-483. (РИНЦ: 0.98)

3. Мартьянов А. А., Балабин Ф. А., Майоров А.С., Шамова Е.В., Пантелеев М.А., Свешникова А.Н. Компьютерное моделирование внутриклеточной сигнализации при активации тромбоцитов крови фукоиданом // Биологические мембраны, 2018. Т. 35, № 3. - С. 1-7. (РИНЦ: 0.949)

4. Балабин Ф. А., Морозова Д.С., Майоров А.С., Мартьянов А.А., Пантелеев М.А., Свешникова А.Н. Кластеризация рецепторов к инозитолтрифосфату определяет форму пика осцилляций кальция в цитозоле тромбоцита // Вестник Московского университета. Серия 3: Физика, астрономия. 2018. Т. 2018, № 5. - С. 63-70. (WOS: 0.672)

5. Шахиджанов С. С., Балабин Ф.А., Обыденный С.И., Свешникова А.Н., Атауллаханов Ф.И. Кальциевые осцилляции в тромбоцитах крови и их возможная роль в" интерпретации" клеткой информации из внешнего мира // Успехи физических наук, 2019. Т. 189, №. 7. - С. 703-719. (WOS: 3,361)

6. Martyanov A. A., Balabin F.A., Dunster J.L., Panteleev M.A., Gibbins

J.M., Sveshnikova A.N. Control of platelet CLEC-2-mediated activation by receptor

clustering and tyrosine kinase signaling // Biophysical journal, 2020. Vol. 118,

No. 11. - P. 2641-2655. (WOS: 4.033, Scopus: 6.3)

102

СПИСОК КОНФЕРЕНЦИЙ, НА КОТОРЫХ БЫЛИ ДОЛОЖЕНЫ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование -2014». Секция «Анализ сложных биологических систем. Модели субклеточных систем». Дубна, Россия, 3 - 8 февраля 2014 г. Доклад «Роль кальциевой регуляции активности фосфолипазы - C в активации тромбоцита».

2. Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование -2016». Секция «Анализ сложных биологических систем. Биофизика систем крови». Дубна, Россия, 25 - 30 января 2016 г. Доклад «Компьютерное моделирование интерференции внутриклеточных сигналов от PAR и P2Y рецепторов в тромбоцитах».

3. Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование -2019». Секция «Медицинская и радиационная биофизика». Пущино, Россия, 28 января - 2 февраля 2019 г. Доклад «Построение минимальной компьютерной модели динамики концентрации кальция в цитоплазме тромбоцита».

4. Международная конференция «Математика. Компьютер. Образование -2020». Секция «Медицинская и радиационная биофизика». Пущино, Россия, 27 января - 1 февраля 2020 г. Доклад «Модель кальциевого ответа тромбоцита на активацию».

5. V Съезд биофизиков России. Секция «Биофизика клетки. Мембранные процессы». Ростов-на-Дону, Россия, 4 - 10 октября 2015 г. Доклад «Теоретическое исследование роли инозитолтрифосфаткиназы и фосфолипазы-С в формировании субпопуляций тромбоцитов».

6. 3rd EUPLAN Conference. Секция «Basic and Clinical aspects of platelet research including megakaryocytes». Бад Хомбург, Германия, 21-23 сентября

2016 г. Доклад «Comprehensive systems biology modeling of platelet activation integrating signal transduction pathways via P2Y1, P2Y12, PARI and PAR4».

7. ISTH 2017 Congress. Берлин, Германия, 8 - 13 июля, 2017 г. Стендовый доклад «Four Receptor Platelet Signaling Computational Model Reveals a New Role of Protein Kinase A in the Control of Platelet Response».

8. XXIII съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова. Воронеж, Россия, 18 - 22 сентября 2017 г. Стендовый доклад «Системный анализ осцилляций концентрации кальция в тромбоцитах».

9. Международная конференция «Platelets - 2018». Тель-Авив, Израиль, 21 -25 апреля 2018 г. Стендовый доклад «First detection and interpretation of calcium waves in human platelets».

10. Международная конференция «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем - 2018». Секция «Мембранная биофизика». Минск, Беларусь, 27 - 29 июня 2018 г. Доклад «Компартментализация кальциевых флуорофоров в цитоплазме тромбоцита».

11. VI Съезд биофизиков России. Секция «Биофизика сложных систем». Сочи, Россия, 16 - 21 сентября 2019 г. Доклад «Молекулярные механизмы формирования кальциевого ответа на активацию в тромбоцитах».

12. The Week of Applied Mathematics and Mathematical Modelling. Секция «The 11th Workshop on Biomath». Владивосток, Россия, 7 - 11 октября 2019 г. Доклад «A minimal model of platelet calcium response on activation».

13. Международная конференция «Systems biology and systems physiology: regulation of biological networks». Москва, Россия, 7 - 9 декабря 2020 года. Доклад «Deciphering platelet calcium signaling».

14. ISTH 2021 Congress. Секция «Platelet Signaling». Филадельфия, США, 17 -21 июля 2021 г. Стендовый доклад «Quantitative Assessment of Heterogeneity of Single Platelet Calcium Responses to Activation».

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Таблица П1. Уравнения, присутствующие в модели.

Моду ль Имя Реакция Поток, компартмент Параметры Ссыл ка

PAR Актив ация PARI PARI + Thr ^ PARI* k[PAR1][Thr] -km[PARI*], PM к — 0.03(nM • , km 0.001s-1 [1]

PAR Дегра дация PARI * PARI* ^ k[PAR1*], PM к — 20s-1 [1]

PAR GqGTP ^ GqGDP k[GqGTP], PM к — 0.02s-1 [1]

PAR PLCGqGTP ^ PLCGqGDP k[PLCGqGTP], PM к — 15s-1 [1]

PAR PAR1*Gq + GTP ^ PAR1*GqGTP k[PAR1*Gq][GTP] -km[PAR1*GqGTP], PM к — • s)-1, km — 0.1s-1 [1]

PAR PAR1*Gq + GDP ^ PAR1*GqGDP k[PAR1*Gq][GDP] -km[PAR1*GqGDP], PM к — • , ^^ — 5s [1]

PAR PARI* + GqGDP ^ PAR1*GqGDP k[PAR1*][GqGDP] -km[PAR1*GqGDP], PM к — 100(^M • s) 1, km — 15 1 [1]

PAR PAR1*GqGTP ^ PARI* +GqGTP km[PAR1*GqGTP], PM ^m 2S [1]

PAR PLCGqGTPPIP2 ^ PLCGqGTP + IP3 V*[IP3]*\CaCttf V cyti, PM Ko.5n+[Ca2c+t\ V — 750 s-1,n — 1,K0.5 — 0.1 vM [11]

PAR PLCGqGTP ^ PLC + GqGTP k[PLCGqGTP] -km[PLC][GqGTP], PM — 5s , ^^^^ — 500(^M • s)-1 [1]

PAR PLCGqGTPPlP2 ^ PIP2 +PLCGqGTP k[PLCGqGTPPlP2] -km[PlP2][PLCGqGTP], PM к — 1s , k*^ — 1000(^M • s)-1 [1]

PAR PLCGqGDP ^ PLC +GqGDP k[PLCGqGDP] -km[PLC][GqGDP], PM к — 10 s , km — 10-4(^M • s)-1 [1]

PAR Упро щенн ый пул IP3 ^PIP2 k[IP3] - km[PIP2], PM к — 0.17s-1, km — 1.8 • 10-5s-1 [1]

инози тидов

PAR Фосф орили рован ие IP3 IP3 ^1P4 V*[lP3]*[Ca2c+t}n r \n , cytosol Ko.5n+[CaC+t\ V - 20 s-1, n -4,К0ш5 - 0.125 yM [13]

PM Утечк а кальц ия через ПМ Cae+ ^ Cacyt [Cac+] ylnr—, cytosol Y - 11.3 nM^s-1 [1]

PM PMC A Cacyt ^ Cae+ v[caC+tf 4 , ' c, cytosol KC + [caC+t\ V - 6^M ■ s-1, К -0.05fj.M [1]

DTS SERC A2b ГпС+ Гпе+ Cacyt ^ Cadts v[caC+]17 A , ---Tf, cytosol K17 + [caC+;t\ . V - 60mM ■ s-1, К - 027\iM [1]

DTS SERC A3 ГпС+ —> Гпе+ Cacyt ^ Cadts v[caZC+t]18 4 , ' 1.8, cytosol K18 + [caC+t\ V - 60mM ■ s-1, К - lAptM [1]

DTS Утечк а кальц ия из ЭПР Cad+s ^ Cacyt vln cytosol Y - 21\iM •s-1 [1]

DTS Выхо д кальц ия через IP3R Cad+s ^ Cacyt YP0[IP3R]ln[£afA], cytosol, Po - (o9UP3Ra] ( [IP3R] „ A [IP3R о]\4 + 0-1 vpm) Y-4.2■ 105s-1 [1]

DTS IP3R IP3R a ^ IP3Rо + Cad+t k1L1[IP3Ra] , r , cytosol L1 + [caC+\ J k1 - 11.94s-1 [1]

DTS IP3R IP3R о + Cad+t ^ IP3Ra (k5L5+K5)[caC+t][IP3Ro] Ls + [caC+t\ , cytosol k5 - 4(jM ■ s)-1, К5 - 4707s-1 [1]

DTS IP3R IP3R о ^ IP3Rn + IP3 (K3+km3[caC+t])L5[IP3Ro] L5 + [caC+t\ , cytosol ктз - 2.5(jiM ■ s)-1, К3 - 1.4s-1 [1]

DTS IP3R I P3Rn + IP3 ^ IP3Rо (кз1з+ксз\Са2с+})\1Р3]\1Р3Кп] Ьз + [саС+\{1+!Ц) ' cytosol k3 — 37.4(цМ ■ s) 1j ксз — 1.7(ßM • s)-1 [l]

DTS IP3R IP3Rо ^ IP3Rs k4L5\IP3Ro] 17П0/М cytosol k4 — 0.11s-1, km4 — 29.8s 1 [l]

DTS IP3R I P3Rn + Ca2+t ^ IP3Ri1 kC \CaC+t]\IP3Rn] Li + [C^t\{1+Il) km2\IP3RH], cytosol k2 — 1.78s-1, km2 — 0.84s-1 [l]

DTS IP3R IP3R a + Ca22+t ^ IP3Ri2 kC\CaC+t]\IP3Ra] Li + [caC+t] km2\IP3Ri2], cytosol [l]