Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Буланенкова, Светлана Сергеевна

• Буланенкова, Светлана Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Буланенкова, Светлана Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6 I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Введение

2. Обзор литературы

1) Структура хроматина 10 Уровни организации хроматина

Нуклеосомный уровень организации хроматина

Хроматиновая фибрилла диаметром 30 нм

Структуры хроматина высшего порядка

Гетерогенность хроматина

Позиционирование нуклеосом

Система АТФ-зависимогоремоделирования

Модификации гистонов

Некодирующие РНК

Варианты гистонов

Негистоновые белки хроматина

Метилирование ДНК

Межвидовые различия геномов

Разные состояния хроматина

Особые структуры эукариотических хромосом

Функционирование хроматина

Дознан компенсация

Поддержание структуры хроматина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структуры хроматина млекопитающих при помощи метилазы Dam E. coli»

ПЦР на матрице первых цепей кДНК Анализ активности метилазы Dam в клеточном экстракте Выделение геномной ДНК Получение препаративных количеств космидной ДНК Гидролиз геномной и космидной ДНК эндонуклеазами рестрикции Гидролиз набора фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции. Отжиг адаптора и "подложки" Лигирование адаптеров Энзиматическое 5-фосфорилирование олигонуклеотидов Селективная амплификация Dpn/Sau Тш фрагментов Смена адапторов Процедура клонирования совпадающих последовательностей Создание ранжированного музея клонов Амплификация плазмидных вставок Анализ библиотеки клонов из ранжированного музея Анализ общей чувствительности к ДНКазе I Выделение ядер Обработка ядер ДНКазой Выделение ДНК из ядер Перенос по Саузерну Приготовление зонда для гибридизации Гибридизация нейлоновой мембраны с зондом 4. Результаты и обсуждение Обоснование работы Создание конструкции для экспрессии гена метилазы Dam Введение полученной конструкции в клетки линии 293Т 4 63 63 64 64 65 65 65 66 66 66 67 67 68 68 68 69 69 69 69 69 69 70 72 72 1Ъ 75 Подтверждение транскрипции бактериального гена Подтверждение наличия Daw-метилазной активности у лизата трансфицированных клеток Подтверждение Dam-метилирования геномной ДНК трансфицированных клеток Поиск метилированных сайтов GATC Анализ библиотеки Dpn I Тги91 фрагментов, принадлежащих локусу GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека Анализ профиля распределения метилированных сайтов GATC в локусе GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека 77 80 80 84 90 91 Проверка распределения Dam-сайтов в локусе методом общей чувствительности к ДНКазе I определенных участков исследуемого локуса 5. ВЫВОДЫ 6. СПИСОК_ЛИТЕРАТУРЫ 93 100 101 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ П.о. пар оснований Т.п.о. тысяч пар оснований Млн.п.о. миллион пар оснований. ДНКаза дезоксирибонуклеаза ПЦР полимеразно-цепная реакция АТР4А альфа субъединицы желудочной Н+/К+ АТФазы CAF-1 chromatin assembley factor, фактор сборки хроматина CMV цитомегловирус СОХ6В субъединицы VIb цитохромоксидазы с DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium DNMT поддерживающая метилтрансфераза dNTP дезоксинуклеозидтрифосфаты ETV2 ets variant gene 2 FCS эмбриональная сыворотка теленка GAPDS глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа HAT ацетилтрансфераза гистонов HDAC гистоновая деацетилаза HFD histone fold domain, домен гистонового фолда HMG high mobility group, белки группы высокой подвижности HP белок гетерохроматина hTERT- теломераза человека LCR locus control region, комплексный активатор транскрипции глобиновых генов LINE (Long Interspersed Element) длинный диспергированный повтор LMPCR ligation-mediated PCR LSD1 Lys-specific demethylase, лизин-специфическая деметилаза LTR (Long Terminal Repeat) длинный концевой повтор MAR/SAR matrix/scaffold attachment region, участки прикрепления к ядерному матриксу МАТ mating type, локус определения типа спаривания у дрожжей MBD methyl-binding domain, метилсвязывающий домен MMTV mouse mammary tumor virus, вирус опухоли молочных желез у мышей 6 MNase микрококковая нуклеаза ORC origin recognition complex, комплекс, узнающий ориджин репликации PRMT protein arginin methyltransferase, аргининовая метилтрансфераза SINE (Short Interspersed Element) короткий диспергированный повтор Sir silent information regulator, белок сайленсинга Su(var) белок-супрессор SV40 simian virus 40, обезьяний вирус 40 TD-PCR Terminal transferase- Dependent PCR UPK1A уроплакина 1A Xic X inactivation center, центр инактивации X хромосомы I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ В клеточном ядре геномная ДНК эукариот находится не в виде голой цепочки нуклеиновой кислоты, а представлена сложным и высокоупорядоченным комплексом ДНК и белков, названным хроматином. На цитологическом уровне в составе интерфазного хроматина различают участки гетерохроматина и эухроматина. Гетерохроматин рассматривается как транскрипционно неактивная форма, он остается конденсированным на всех стадиях клеточного цикла и характеризуется пониженной доступностью ДНК для регуляторных факторов. Напротив, транскрипционно активный хроматин деконденсирован и располагается в эухроматиновых участках в ядре. На молекулярном уровне эти два состояния различаются наборами негистоновых белков, модификациями гистонов и уровнем метилирования геномной ДНК [1]. Изменение уровня конденсации хроматина является важным механизмом регуляции клеточных функций, таких как транскрипция, репликация, репарация и других. Однако, несмотря на очевидную важность состояния хроматина для функционирования клетки, все исследования главным образом фокусируются на отдельных генах и примыкающих к ним участкам генома [2]. В то же время закономерности организации протяженных участков генома остаются изученными недостаточно. Это приводит к заметным пробелам в понимании координированной регуляции экспрессии ансамблей генов и участия в этой регуляции высших структур хроматина. Анализ структуры хроматина основан на различной доступности ДНК в составе хроматина для ДНК-модифицирующих агентов и последующей детекции этих модификаций. К основным модифицирующим агентам относят как агенты ферментативной природы (ДНК-аза, микрококковая нуклеаза, эндонуклеазы рестрикции) [3], так и неферментативные агенты [3-7]. Недостатком этих методик является то, что модификации, вносимые перечисленными выше агентами, приводят к гибели клеток, поэтому в большинстве случаев анализ проводится на изолированных ядрах, что неизбежно вызывает ряд артефактов, возникающих в процессе выделения ядра и хроматина. В последнее время появляются работы, связанные с экспрессией генов модифицирующих ферментов, в частности ДНК-азы I, в эукариотических клетках [8]. К числу таких in vivo методов также относится и использование бактериальной метилазы Dam, метилирующей аденин в последовательности GATC [9]. Данный метод применим только к тем организмам, у которых отсутствует эндогенное метилирование аденина в последовательности GATC. К числу таких организмов относятся Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogaster и Homo sapiens [10, 11]. В отличие от нуклеаз, экспрессия метилазы в дрожжах и дрозофиле не оказывала существенного влияния на жизнедеятельность организма, что значительно понижало уровень артефактов и делало анализ более достоверным [12, 13]. Метилаза Dam E.coli была успешно применена для анализа структуры хроматина у Saccharomyces cerevisiae и Drosophila melanogaster [9, 13-15]. Анализ в основном проводился для конкретных сайтов GATC в составе определенной последовательности, помещаемой в разное геномное окружение. Однако в литературе отсутствуют данные о применимости данного метода для анализа структуры хроматина млекопитающих. Поэтому проверка этой возможности и разработка методологии детекции сайтов GATC, доступных для действия метилазы, в протяженном локусе генома, представляет собой актуальную задачу. Цель данной работы заключается в разработке метода анализа структуры хроматина протяженных локусов генома млекопитающих на примере человека с использованием Dam-метилазы E.coli. В ходе работы планировалось решить следующие экспериментальные задачи. 1. Создание конструкции для экспрессии гена метилазы Dam E.coli в клетках человека. 2. Введение полученной конструкции в клетки человека и проверка экспрессии гена dam в клетках человека. 3. Проверка наличия метилированных сайтов GATC в геномной ДНК трансфицированных клеток. 4. Создание библиотеки фрагментов, получающихся в результате обработки геномной ДНК метилщепящей эндонуклеазой рестрикции и принадлежащих определенному участку генома. 5. 6. Анализ полученной библиотеки. Проверка полученных результатов альтернативным методом анализа структуры хроматина.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Буланенкова, Светлана Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Получена конструкция для экспрессии в клетках млекопитающих гена бактериальной метилазы Dam, способной метилировать аденин в последовательности GATC.

2. Показана экспрессия гена dam в клетках, трансфицированных экспрессирующей конструкцией.

3. Показано наличие метилирования геномной ДНК, выделенной из трансфицированных клеток, по сайту GATC.

4. Получена библиотека фрагментов, получающихся в результате обработки геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции Dpn I и Tru9 I и принадлежащих выбранному участку исследования.

5. Проведен анализ библиотеки Dpn I - Tru9 I фрагментов локуса GAPDS-UPK1A хромосомы 19 человека, полученных методом клонирования совпадающих последовательностей. Показано неравномерное распределение сайтов GATC, подвергшихся действию метилазы Dam. Уровень Dam-метилирования промоторных и внутригенных областей совпадает с уровнем экспрессии соответствующих генов.

6. Проведен независимый анализ структуры хроматина определенных участков исследуемого локуса методом общей чувствительности к ДНК-азе I. Для 5 из 7 исследовавшихся участков генома показано соответствие между уровнем чувствительности к ДНК-азе I и доступностью для метилазы Dam.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Буланенкова, Светлана Сергеевна, 2008 год

1. Vermaak, D., Ahmad, К. & Henikoff, S. (2003) Maintenance of chromatin states: an open-and-shut case, Curr Opin Cell Biol. 15, 266-74.

2. Dekker, J. (2003) A closer look at long-range chromosomal interactions, Trends Biochem Sci. 28,277-80.

3. Mymryk, J. S., Fryer, C. J., Jung, L. A. & Archer, Т. K. (1997) Analysis of chromatin structure in vivo, Methods. 12, 105-14.

4. Simpson, R. T. (1999) In vivo methods to analyze chromatin structure, Curr Opin Genet Dev. 9, 225-9.

5. McGhee, J. D. & Felsenfeld, G. (1979) Reaction of nucleosome DNA with dimethyl sulfate, Proc Natl Acad Sci USA. 76,2133-1.

6. Wellinger, R. E. & Sogo, J. M. (1998) In vivo mapping of nucleosomes using psoralen-DNA crosslinking and primer extension, Nucleic Acids Res. 26, 1544-5.

7. Pfeifer, G. P. & Tomaletti, S. (1997) Footprinting with UV irradiation and LMPCR, Methods. 11, 189-96.

8. Wang, X. & Simpson, R. T. (2001) Chromatin structure mapping in Saccharomyces cerevisiae in vivo with DNase I, Nucleic Acids Res. 29, 1943-50.

9. Singh, J. & Klar, A. J. (1992) Active genes in budding yeast display enhanced in vivo accessibility to foreign DNA methylases: a novel in vivo probe for chromatin structure of yeast, Genes Dev. 6,186-96.

10. Kudriashova, I. В., Kirnos, M. D. & Vaniushin, B. F. (1976) DNA-methylase activities from animal mitochondria and nuclei: different specificity of DNA methylation., Biokhimiia. 41, 196877.

11. Hattman, S., Kenny, C., Berger, L. & Pratt, K. (1978) Comparative study of DNA methylation in three unicellular eucaryotes, JBacteriol. 135, 1156-7.

12. Hoekstra, M. F. & Malone, R. E. (1985) Expression of the Escherichia coli dam methylase in Saccharomyces cerevisiae: effect of in vivo adenine methylation on genetic recombination and mutation, Mol Cell Biol. 5, 610-8.

13. Wines, D. R., Talbert, P. В., Clark, D. V. & Henikoff, S. (1996) Introduction of a DNA methyltransferase into Drosophila to probe chromatin structure in vivo, Chromosoma. 104, 332-40.

14. Gottschling, D. E. (1992) Telomere-proximal DNA in Saccharomyces cerevisiae is refractory to methyltransferase activity in vivo, Proc Natl Acad Sci USA. 89, 4062-5.

15. Boivin, A. & Dura, J. M. (1998) In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila, Genetics. 150, 1539-49.

16. Komberg, R. D. (1974) Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA, Science. 184, 868-71.

17. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F. & Richmond, T. J. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution, Nature. 389, 251-60.

18. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W. & Richmond, T. J. (2002) Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution, J Mol Biol. 319, 1097-113.

19. Spencer, V. A. & Davie, J. R. (1999) Role of covalent modifications of histones in regulating gene expression, Gene. 240, 1-12.

20. Wolffe, A. P. & Hayes, J. J. (1999) Chromatin disruption and modification, Nucleic Acids Res. 27,711-20.

21. Garcia-Ramirez, M., Dong, F. & Ausio, J. (1992) Role of the histone "tails" in the folding of oligonucleosomes depleted of histone YLl,JBiol Chem. 267, 19587-95.

22. Tse, C. & Hansen, J. C. (1997) Hybrid trypsinized nucleosomal arrays: identification of multiple functional roles of the H2A/H2B and H3/H4 N-termini in chromatin fiber compaction, Biochemistry. 36, 11381-8.

23. Dorigo, В., Schalch, Т., Bystricky, K. & Richmond, T. J. (2003) Chromatin fiber folding: requirement for the histone H4 N-terminal tail, J Mol Biol. 327, 85-96.

24. Zheng, C. & Hayes, J. J. (2003) Intra- and inter-nucleosomal protein-DNA interactions of the core histone tail domains in a model system, J Biol Chem. 278, 24217-24.

25. Thoma, F., Koller, T. & Klug, A. (1979) Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin, J Cell Biol. 83, 403-27.

26. Bartolome, S., Bermudez, A. & Daban, J. R. (1994) Internal structure of the 30 nm chromatin fiber, J Cell Sci. 107 (Pt 11), 2983-92.

27. Robinson, P. J., Fairall, L., Huynh, V. A. & Rhodes, D. (2006) EM measurements define the dimensions of the "30-nm" chromatin fiber: Evidence for a compact, interdigitated structure, Proc Natl Acad Sci USA. 103, 6506-11.

28. Dorigo, В., Schalch, Т., Kulangara, A., Duda, S., Schroeder, R. R. & Richmond, T. J. (2004) Nucleosome arrays reveal the two-start organization of the chromatin fiber, Science. 306,1571-3.

29. Marsden, M. P. & Laemmli, U. K. (1979) Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model, Cell. 17, 849-58.

30. Belmont, A. S. & Bruce, K. (1994) Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure, J Cell Biol. 127, 287-302.

31. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T. & Belmont, A. S. (2004) Visualization of early chromosome condensation: a hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure, J Cell Biol. 166, 775-85.

32. Shrader, Т. E. & Crothers, D. M. (1989) Artificial nucleosome positioning sequences, Proc Natl Acad Sci USA. 86, 7418-22.

33. Blank, T. A. & Becker, P. B. (1995) Electrostatic mechanism of nucleosome spacing, J Mol Biol. 252, 305-13.

34. Baldi, P., Brunak, S., Chauvin, Y. & Krogh, A. (1996) Naturally occurring nucleosome positioning signals in human exons and introns, J Mol Biol. 263, 503-10.

35. Stein, A. & Bina, M. (1999) A signal encoded in vertebrate DNA that influences nucleosome positioning and alignment, Nucleic Acids Res. 27, 848-53.

36. Cioffi, A., Dalai, Y. & Stein, A. (2004) DNA sequence alterations affect nucleosome array formation of the chicken ovalbumin gene, Biochemistry. 43, 6709-22.

37. Shen, С. H. & Clark, D. J. (2001) DNA sequence plays a major role in determining nucleosome positions in yeast CUP1 chromatin, J Biol Chem. 276, 35209-16.

38. Dalai, Y., Fleury, T. J., Cioffi, A. & Stein, A. (2005) Long-range oscillation in a periodic DNA sequence motif may influence nucleosome array formation, Nucleic Acids Res. 33, 934-45.

39. Cioffi, A., Fleury, T. J. & Stein, A. (2006) Aspects of large-scale chromatin structures in mouse liver nuclei can be predicted from the DNA sequence, Nucleic Acids Res. 34, 1974-81.

40. Lowary, P. T. & Widom, J. (1997) Nucleosome packaging and nucleosome positioning of genomic DNA, Proc Natl Acad Sci USA. 94, 1183-8.

41. Pennings, S., Allan, J. & Davey, C. S. (2005) DNA methylation, nucleosome formation and positioning, Brief Fund Genomic Proteomic. 3, 351-61.

42. Davey, C., Pennings, S. & Allan, J. (1997) CpG methylation remodels chromatin structure in vitro, J Mol Biol. 267, 276-88.

43. Pazin, M. J., Bhargava, P., Geiduschek, E. P. & Kadonaga, J. T. (1997) Nucleosome mobility and the maintenance of nucleosome positioning, Science. 276, 809-12.

44. Beato, M. & Eisfeld, K. (1997) Transcription factor access to chromatin, Nucleic Acids Res. 25, 3559-63.

45. Chen, C. & Yang, T. P. (2001) Nucleosomes are translationally positioned on the active allele and rotationally positioned on the inactive allele of the HPRT promoter, Mol Cell Biol. 21, 7682-95.

46. Sewack, G. F. & Hansen, U. (1997) Nucleosome positioning and transcription-associated chromatin alterations on the human estrogen-responsive pS2 promoter, J Biol Chem. 272, 3111829.

47. Vignali, M., Hassan, A. H., Neely, К. E. & Workman, J. L. (2000) ATP-dependent chromatin-remodeling complexes, Mol Cell Biol. 20,1899-910.

48. Reinke, H. & Horz, W. (2003) Histones are first hyperacetylated and then lose contact with the activated PH05 promoter, Mol Cell. 11, 1599-607.

49. Flavin, M., Cappabianca, L., Kress, C., Thomassin, H. & Grange, T. (2004) Nature of the accessible chromatin at a glucocorticoid-responsive enhancer, Mol Cell Biol. 24, 7891-901.

50. Fazzio, T. G. & Tsukiyama, T. (2003) Chromatin remodeling in vivo: evidence for a nucleosome sliding mechanism, Mol Cell. 12, 1333-40.

51. Schwanbeck, R., Xiao, H. & Wu, C. (2004) Spatial contacts and nucleosome step movements induced by the NURF chromatin remodeling complex, J Biol Chem. 279, 39933-41.

52. Kingston, R. E. & Narlikar, G. J. (1999) ATP-dependent remodeling and acetylation as regulators of chromatin fluidity, Genes Dev. 13, 2339-52.

53. Aalfs, J. D. & Kingston, R. E. (2000) What does 'chromatin remodeling* mean?, Trends Biochem Sci. 25, 548-55.

54. Eberharter, A. & Becker, P. B. (2004) ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions, J Cell Sci. 117, 3707-11.

55. Cuthbert, G. L., Daujat, S., Snowden, A. W., Erdjument-Bromage, H., Hagiwara, Т., Yamada, M., Schneider, R., Gregory, P. D., Tempst, P., Bannister, A. J. & Kouzarides, T. (2004) Histone deimination antagonizes arginine methylation, Cell. 118, 545-53.

56. Eberharter, A. & Becker, P. B. (2002) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics, EMBO Rep. 3, 224-9.

57. Furumatsu, Т., Tsuda, M., Yoshida, K., Taniguchi, N., Ito, Т., Hashimoto, M. & Asahara, H. (2005) Sox9 and рЗОО cooperatively regulate chromatin-mediated transcription, J Biol Chem. 280, 35203-8.

58. Berger, S. L. (1999) Gene activation by histone and factor acetyltransferases, Curr Opin Cell Biol. 11, 336-41.

59. Mutskov, V., Gerber, D., Angelov, D., Ausio, J., Workman, J. & Dimitrov, S. (1998) Persistent interactions of core histone tails with nucleosomal DNA following acetylation and transcription factor binding, Mol Cell Biol. 18, 6293-304.

60. Edmondson, D. G., Smith, M. M. & Roth, S. Y. (1996) Repression domain of the yeast.global repressor Tupl interacts directly with histones H3 and H4, Genes Dev. 10, 1247-59.

61. Garcia-Ramirez, M., Rocchini, C. & Ausio, J. (1995) Modulation of chromatin folding by histone acetylation, J Biol Chem. 270, 17923-8.

62. Shogren-Knaak, M., Ishii, H., Sun, J. M., Pazin, M. J., Davie, J. R. & Peterson, C. L. (2006) Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions, Science. 311, 844-7.

63. Hansen, J. C., Tse, C. & Wolffe, A. P. (1998) Structure and function of the core histone N-termini: more than meets the eye, Biochemistry. 37, 17637-41.

64. Marmorstein, R. (2001) Protein modules that manipulate histone tails for chromatin regulation, Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 422-32.

65. Bauer, U. M., Daujat, S., Nielsen, S. J., Nightingale, K. & Kouzarides, T. (2002) Methylation at arginine 17 of histone H3 is linked to gene activation, EMBO Rep. 3, 39-44.

66. Cheung, P. & Lau, P. (2005) Epigenetic regulation by histone methylation and histone variants, Mol Endocrinol. 19, 563-73.

67. Cowell, I. G., Aucott, R., Mahadevaiah, S. K., Burgoyne, P. S., Huskisson, N., Bongiorni, S., Prantera, G., Fanti, L., Pimpinelli, S., Wu, R., Gilbert, D. M., Shi, W., Fundele, R., Morrison, H.,

68. Jeppesen, P. & Singh, P. B. (2002) Heterochromatin, HP1 and methylation at lysine 9 of histone H3 in animals, Chromosoma. Ill, 22-36.

69. McBride, A. E. & Silver, P. A. (2001) State of the arg: protein methylation at arginine comes of age, Cell. 106, 5-8.

70. Ahmad, K. & Henikoff, S. (2002) Histone H3 variants specify modes of chromatin assembly, Proc Natl Acad Sci USA. 99 Suppl 4, 16477-84.

71. Duina, A. A. & Winston, F. (2004) Analysis of a mutant histone H3 that perturbs the association of Swi/Snfwith chromatin, Mol Cell Biol. 24, 561-72.

72. Krajewski, W. A. & Becker, P. B. (1998) Reconstitution of hyperacetylated, DNase I-sensitive chromatin characterized by high conformational flexibility of nucleosomal DNA, Proc Natl Acad Sci USA. 95, 1540-5.

73. Nowak, S. J. & Corces, V. G. (2000) Phosphorylation of histone H3 correlates with transcriptionally active loci, Genes Dev. 14, 3003-13.

74. Davie, J. R. & Murphy, L. C. (1990) Level of ubiquitinated histone H2B in chromatin is coupled to ongoing transcription, Biochemistry. 29, 4752-7.

75. Jason, L. J., Finn, R. M., Lindsey, G. & Ausio, J. (2005) Histone H2A ubiquitination does not preclude histone HI binding, but it facilitates its association with the nucleosome, J Biol Chem. 280, 4975-82.

76. Lee, H. L. & Archer, Т. K. (1998) Prolonged glucocorticoid exposure dephosphorylates histone HI and inactivates the MMTV promoter, Embo J. 17, 1454-66.

77. Poirier, G. G., de Murcia, G., Jongstra-Bilen, J., Niedergang, C. & Mandel, P. (1982) Poly(ADP-ribosyl)ation of polynucleosomes causes relaxation of chromatin structure, Proc Natl Acad Sci USA. 79, 3423-7.

78. Mersfelder, E. L. & Parthun, M. R. (2006) The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure, Nucleic Acids Res. 34, 2653-62.

79. Park, J. H., Cosgrove, M. S., Youngman, E., Wolberger, C. & Boeke, J. D. (2002) A core nucleosome surface crucial for transcriptional silencing, Nat Genet. 32, 273-9.

80. Cosgrove, M. S., Boeke, J. D. & Wolberger, C. (2004) Regulated nucleosome mobility and the histone code, Nat Struct Mol Biol. 11, 1037-43.

81. Li, G., Levitus, M., Bustamante, C. & Widom, J. (2005) Rapid spontaneous accessibility of nucleosomal DNA, Nat Struct Mol Biol. 12, 46-53.

82. Hyland, E. M., Cosgrove, M. S., Molina, H., Wang, D., Pandey, A., Cottee, R. J. & Boeke, J. D. (2005) Insights into the role of histone H3 and histone H4 core modifiable residues in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol. 25, 10060-70.

83. Xu, F., Zhang, K. & Grunstein, M. (2005) Acetylation in histone H3 globular domain regulates gene expression in yeast, Cell. 121, 375-85.

84. Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. (2001) Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries, Science. 293, 1150-5.

85. Braunstein, M., Sobel, R. E., Allis, C. D., Turner, В. M. & Broach, J. R. (1996) Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern, Mol Cell Biol. 16, 4349-56.

86. Jenuwein, T. & Allis, C. D. (2001) Translating the histone code, Science. 293, 1074-80.

87. Strahl, B. D. & Allis, C. D. (2000) The language of covalent histone modifications, Nature. 403, 41-5.

88. Bernstein, E. & Allis, C. D. (2005) RNA meets chromatin, Genes Dev. 19, 1635-55.

89. Akhtar, A., Zink, D. & Becker, P. B. (2000) Chromodomains are protein-RNA interaction modules, Nature. 407,405-9.

90. Muchardt, C., Guilleme, M., Seeler, J. S., Trouche, D., Dejean, A. & Yaniv, M. (2002) Coordinated methyl and RNA binding is required for heterochromatin localization of mammalian HP 1 alpha, EMBO Rep. 3, 975-81.

91. Heard, E. (2004) Recent advances in X-chromosome inactivation, Curr Opin Cell Biol. 16, 247-55.

92. Schramke, V. & Allshire, R. (2003) Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs effect RNAi and chromatin-based gene silencing, Science. 301, 1069-74.

93. Pusarla, R. H. & Bhargava, P. (2005) Histones in functional diversification. Core histone variants, Febs J. 272, 5149-68.

94. Kamakaka, R. T. & Biggins, S. (2005) Histone variants: deviants?, Genes Dev. 19, 295-310.

95. Catez, F., Yang, H., Tracey, K. J., Reeves, R., Misteli, T. & Bustin, M. (2004) Network of dynamic interactions between histone HI and high-mobility-group proteins in chromatin, Mol Cell Biol. 24, 4321-8.

96. Bianchi, M. E. & Beltrame, M. (2000) Upwardly mobile proteins. Workshop: the role of HMG proteins in chromatin structure, gene expression and neoplasia, EMBO Rep. 1,109-14.

97. Eissenberg, J. C. & Elgin, S. C. (2000) The HP1 protein family: getting a grip on chromatin, Curr Opin Genet Dev. 10, 204-10.

98. Grunstein, M. (1998) Yeast heterochromatin: regulation of its assembly and inheritance by histones, Cell. 93, 325-8.

99. Kass, S. U., Pruss, D. & Wolffe, A. P. (1997) How does DNA methylation repress transcription?, Trends Genet. 13, 444-9.

100. White, C. L., Suto, R. K. & Luger, K. (2001) Structure of the yeast nucleosome core particle reveals fundamental changes in internucleosome interactions, Embo J. 20, 5207-18.

101. Avramova, Z. V. (2002) Heterochromatin in animals and plants. Similarities and differences, Plant Physiol. 129, 40-9.

102. Arney, K. L. & Fisher, A. G. (2004) Epigenetic aspects of differentiation, J Cell Sci. 117, 4355-63.

103. Cleveland, D. W., Mao, Y. & Sullivan, K. F. (2003) Centromeres and kinetochores: from epigenetics to mitotic checkpoint signaling, Cell. 112,407-21.

104. LeBel, C. & Wellinger, R. J. (2005) Telomeres: what's new at your end?, J Cell Sci. 118, 2785-8.122. de Lange, T. (2005) Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres, Genes Dev. 19, 2100-10.

105. Fajkus, J. & Trifonov, E. N. (2001) Columnar packing of telomeric nucleosomes, Biochem Biophys Res Commun. 280, 961-3.

106. Nikitina, T. & Woodcock, C. L. (2004) Closed chromatin loops at the ends of chromosomes, J Cell Biol. 166, 161-5.

107. Sadaie, M., Naito, T. & Ishikawa, F. (2003) Stable inheritance of telomere chromatin structure and function in the absence of telomeric repeats, Genes Dev. 17, 2271-82.

108. Bottomley, M. J. (2004) Structures of protein domains that create or recognize histone modifications, EMBORep. 5, 464-9.

109. Di Mauro, E., Verdone, L., Chiappini, B. & Caserta, M. (2002) In vivo changes of nucleosome positioning in the pretranscription state, J Biol Chem. 277, 7002-9.

110. Truss, M., Candau, R., Chavez, S. & Beato, M. (1995) Transcriptional control by steroid hormones: the role of chromatin, Ciba Found Symp. 191, 7-17; discussion 17-23.

111. Nemeth, A. & Langst, G. (2004) Chromatin higher order structure: opening up chromatin for transcription, Brief Fund Genomic Proteomic. 2, 334-43.

112. Lorch, Y., Maier-Davis, B. & Romberg, R. D. (2006) Chromatin remodeling by nucleosome disassembly in vitro, Proc Natl Acad Sci USA. 103, 3090-3.

113. Syntichaki, P., Topalidou, I. & Thireos, G. (2000) The Gcn5 bromodomain co-ordinates nucleosome remodelling, Nature. 404, 414-7.

114. Krebs, J. E., Fry, C. J., Samuels, M. L. & Peterson, C. L. (2000) Global role for chromatin remodeling enzymes in mitotic gene expression, Cell. 102, 587-98.

115. Memedula, S. & Belmont, A. S. (2003) Sequential recruitment of HAT and SWI/SNF components to condensed chromatin by VP16, CurrBiol. 13, 241-6.

116. Gelbart, M. E., Bachman, N., Delrow, J., Boeke, J. D. & Tsukiyama, T. (2005) Genome-wide identification of Isw2 chromatin-remodeling targets by localization of a catalytically inactive mutant, Genes Dev. 19, 942-54.

117. Georgel, P. Т., Fletcher, Т. M., Hager, G. L. & Hansen, J. C. (2003) Formation of higher-order secondary and tertiary chromatin structures by genomic mouse mammary tumor virus promoters, Genes Dev. 17, 1617-29.

118. Gilbert, N. & Ramsahoye, B. (2005) The relationship between chromatin structure and transcriptional activity in mammalian genomes, Brief Funct Genomic Proteomic. 4,129-42.

119. Chambeyron, S. &Bickmore, W. A. (2004) Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription, Genes Dev. 18, 1119-30.

120. Hill, D. A., Peterson, C. L. & Imbalzano, A. N. (2005) Effects of HMGN1 on chromatin structure and SWI/SNF-mediated chromatin remodeling, J Biol Chem. 280, 41777-83.

121. Park, Y. J., Chodaparambil, J. V., Bao, Y., McBryant, S. J. & Luger, K. (2005) Nucleosome assembly protein 1 exchanges histone H2A-H2B dimers and assists nucleosome sliding, J Biol Chem. 280, 1817-25.

122. Thiel, G., Lietz, M. & Hohl, M. (2004) How mammalian transcriptional repressors work, Eur JBiochem. 271,2855-62.

123. Padjen, K., Ratnam, S. & Storb, U. (2005) DNA methylation precedes chromatin modifications under the influence of the strain-specific modifier Ssml, Mol Cell Biol. 25, 4782-91.

124. Hashimshony, Т., Zhang, J., Keshet, I., Bustin, M. & Cedar, H. (2003) The role of DNA methylation in setting up chromatin structure during development, Nat Genet. 34, 187-92.

125. Bachman, К. E., Park, В. H., Rhee, I., Rajagopalan, H., Herman, J. G., Baylin, S. В., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. (2003) Histone modifications and silencing prior to DNA methylation of a tumor suppressor gene, Cancer Cell. 3, 89-95.

126. Mutskov, V. & Felsenfeld, G. (2004) Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9, Embo J. 23, 138-49.

127. Tamaru, H. & Selker, E. U. (2001) A histone H3 methyltransferase controls DNA methylation in Neurospora crassa, Nature. 414, 277-83.

128. Khan, A. U. & Hampsey, M. (2002) Connecting the DOTs: covalent histone modifications and the formation of silent chromatin, Trends Genet. 18, 387-9.

129. Forsberg, E. С. & Bresnick, E. H. (2001) Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world, Bioessays. 23, 820-30.

130. Haq'u, S., McQueen, K. J. & Peterson, K. R. (2002) Chromatin structure and control of betalike globin gene switching, Exp Biol Med (Maywood). 227, 683-700.

131. Burgess-Beusse, В., Farrell, C., Gaszner, M., Litt, M., Mutskov, V., Recillas-Targa, F., Simpson, M., West, A. &Felsenfeld, G. (2002) The insulation of genes from external enhancers and silencing chromatin, Proc Natl Acad Sci USA. 99 Suppl 4, 16433-7.

132. Belmont, A. (2003) Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus, Curr Opin Cell Biol. 15, 304-10.

133. Cremer, T. & Cremer, C. (2001) Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells, Nat Rev Genet. 2, 292-301.

134. Cockell, M. & Gasser, S. M. (1999) Nuclear compartments and gene regulation, Curr Opin Genet Dev. 9, 199-205.

135. Gilfillan, G. D., Dahlsveen, I. K. & Becker, P. B. (2004) Lifting a chromosome: dosage compensation in Drosophila melanogaster, FEBS Lett. 567, 8-14.

136. Lipford, J. R. & Bell, S. P. (2001) Nucleosomes positioned by ORC facilitate the initiation of DNA replication, Mol Cell. 7, 21-30.

137. Flanagan, J. F. & Peterson, C. L. (1999) A role for the yeast SWVSNF complex in DNA replication, Nucleic Acids Res. 27, 2022-8.

138. Gruss, C., Wu, J., Roller, T. & Sogo, J. M. (1993) Disruption of the nucleosomes at the replication fork, Embo J. 12, 4533-45.

139. Tagami, H., Ray-Gallet, D., Almouzni, G. & Nakatani, Y. (2004) Histone H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome assembly pathways dependent or independent of DNA synthesis, Cell. 116, 51-61.

140. Taddei, A., Roche, D., Sibarita, J. В., Turner, В. M. & Almouzni, G. (1999) Duplication and maintenance ofheterochromatin domains, J Cell Biol. 147, 1153-66.

141. Verreault, A., Kaufman, P. D., Kobayashi, R. & Stillman, B. (1996) Nucleosome assembly by a complex of CAF-1 and acetylated histones H3/H4, Cell. 87, 95-104.

142. Shibahara, K. & Stillman, B. (1999) Replication-dependent marking of DNA by PCNA facilitates CAF-l-coupled inheritance of chromatin, Cell. 96, 575-85.

143. Mosammaparast, N., Ewart, C. S. & Pemberton, L. F. (2002) A role for nucleosome assembly protein 1 in the nuclear transport of histones H2A and H2B, Embo J. 21, 6527-38.

144. Verreault, A. (2000) De novo nucleosome assembly: new pieces in an old puzzle, Genes Dev. 14, 1430-8.

145. Ehrenhofer-Murray, A. E. (2004) Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair, Eur JBiochem. 271, 2335-49.

146. Meijsing, S. H. & Ehrenhofer-Murray, A. E. (2001) The silencing complex SAS-I links histone acetylation to the assembly of repressed chromatin by CAF-I and Asfl in Saccharomyces cerevisiae, Genes Dev. 15, 3169-82.

147. Milutinovic, S., Zhuang, Q. & Szyf, M. (2002) Proliferating cell nuclear antigen associates with histone deacetylase activity, integrating DNA replication and chromatin modification, J Biol Chem. 277, 20974-8.

148. Chuang, L. S., Ian, H. I., Koh, T. W., Ng, H. H., Xu, G. & Li, B. F. (1997) Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAFl, Science. 277, 1996-2000.

149. Rountree, M. R., Bachman, К. E. & Baylin, S. B. (2000) DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci, Nat Genet. 25, 269-77.

150. Moshkin, Y. M., Armstrong, J. A., Maeda, R. K., Tamkun, J. W., Verrijzer, P., Kennison, J. A. & Karch, F. (2002) Histone chaperone ASF1 cooperates with the Brahma chromatin-remodelling machinery, Genes Dev. 16,2621-6.

151. Felsenfeld, G., Clark, D. & Studitsky, V. (2000) Transcription through nucleosomes, Biophys Chem. 86, 231-7.

152. Kaplan, C. D., Laprade, L. & Winston, F. (2003) Transcription elongation factors repress transcription initiation from cryptic sites, Science. 301, 1096-9.

153. Nourani, A., Robert, F. & Winston, F. (2006) Evidence that Spt2/Sinl, an HMG-like factor, plays roles in transcription elongation, chromatin structure, and genome stability in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol. 26, 1496-509.

154. Wang, A., Kurdistani, S. K. & Grunstein, M. (2002) Requirement of Hos2 histone deacetylase for gene activity in yeast, Science. 298, 1412-4.

155. Ferreiro, J. A., Powell, N. G., Karabetsou, N., Mellor, J. & Waters, R. (2006) Roles for Gcn5p and Ada2p in transcription and nucleotide excision repair at the Saccharomyces cerevisiae MET 16 gene, Nucleic Acids Res. 34, 976-85.

156. Orlando, V., Strutt, H. & Paro, R. (1997) Analysis of chromatin structure by in vivo formaldehyde cross-linking, Methods. 11, 205-14.

157. Sun, F. L., Cuaycong, M. H. & Elgin, S. C. (2001) Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Drosophila melanogaster pericentric heterochromatin, Mol Cell Biol. 21, 2867-79.

158. Suter, В., Livingstone-Zatchej, M. & Thoma, F. (1997) Chromatin structure modulates DNA repair by photolyase in vivo, Embo J. 16, 2150-60.

159. Kladde, M. P. & Simpson, R. T. (1994) Positioned nucleosomes inhibit Dam methylation in vivo, Proc Natl Acad Sci USA. 91, 1361-5.

160. Cheng, Т. H. & Gartenberg, M. R. (2000) Yeast heterochromatin is a dynamic structure that requires silencers continuously, Genes Dev. 14, 452-63.

161. Mueller, P. R. & Wold, B. (1989) In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR, Science. 246, 780-6.

162. Komura, J. & Riggs, A. D. (1998) Terminal transferase-dependent PCR: a versatile and sensitive method for in vivo footprinting and detection of DNA adducts, Nucleic Acids Res. 26, 1807-11.

163. Carter, N. P. & Vetrie, D. (2004) Applications of genomic microarrays to explore human chromosome structure and function, Hum Mol Genet. 13 Spec No 2, R297-302.

164. Lee Kang, S. H., Vieira, K. & Bungert, J. (2002) Combining chromatin immunoprecipitation and DNA footprinting: a novel method to analyze protein-DNA interactions in vivo, Nucleic Acids Res. 30, e44.

165. Low, D. A., Weyand, N. J. & Mahan, M. J. (2001) Roles of DNA adenine methylation in regulating bacterial gene expression and virulence, Infect Immun. 69, 7197-204.

166. Herman, G. E. & Modrich, P. (1982) Escherichia coli dam methylase. Physical and catalytic properties of the homogeneous enzyme, J Biol Chem. 257, 2605-12.

167. Maniatis, Т., Fritsch, E. F. & Sambrook. (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual, 2nd edition edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

168. Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids, Gene. 96, 23-8.

169. Seibler, J. & Bode, J. (1997) Double-reciprocal crossover mediated by FLP-recombinase: a concept and an assay, Biochemistry. 36, 1740-7.

170. Feigner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M. & Danielsen, M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure, Proc Natl Acad Sci USA. 84, 7413-7.

171. Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. Т., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J. & Klenk, D. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid, Anal Biochem. 150, 76-85.

172. Miller, J. H. (1972) Experiments in molecular genetics., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

173. Nakai, H., Storm, T. A. & Kay, M. A. (2000) Recruitment of single-stranded recombinant adeno-associated virus vector genomes and intermolecular recombination are responsible for stable transduction of liver in vivo, J Virol. 74, 9451-63.

174. Wang, S. & Zhu, J. (2004) The hTERT gene is embedded in a nuclease-resistant chromatin domain, J Biol Chem. 279, 55401-10.