Исследование механизма генерации силы в мышце тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Бершицкий, Сергей Юрьевич

• Бершицкий, Сергей Юрьевич
• доктор биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор биологических наук Бершицкий, Сергей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Объект и методы исследования

ГЛАВА 2. Исследование силогенерирующего процесса в мышечных волокнах кролика с помощью быстрых изменений длины и температуры

ГЛАВА 3. Сравнение переходных процессов напряжения, вызванных изменениями длины и температуры

ГЛАВА 4. Исследование реакции напряжения на быстрые изменения длины и температуры в мышечных волокнах кролика, обработанных ЭДК

ГЛАВА 5. Генерация силы и производство работы ковалентно пришитыми поперечными мостиками в мышечных волокнах кролика

ГЛАВА 6. Рентгенодифракционные исследования струюурных изменений, сопровождающих силогенерирующий процесс в мышце

ГЛАВА 7. Кинетика структурных изменений при развитии напряжения в мышечных волокнах кролика в ответ на скачок температуры

ГЛАВА 8. Интерпретация результатов: структурно-кинетическая модель двухшагового механизма работы поперечного мостика

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма генерации силы в мышце»

Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из интереснейших проблем биофизики. Согласно предложенным в середине 50-х годов теории скользящих нитей и мостиковой теории мышечного сокращения (Н. Huxley, Hanson, 1954; A. Huxley, Niedergerke, 1954; A. Huxley, 1957; Н. Huxley, 1969; A. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие миозиновых головок, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей. Это взаимодействие ведёт к укорочению саркомера, а длина самих нитей остаётся постоянной. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, создание атомных трехмерных реконструкций актина, миозиновой головки и актин-миозинового комплекса (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993а, б; Houdusse и др., 1999, 2000), многие важные детали механизма работы поперечных мостиков остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновый мостик может переместить акгиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др.,

1995; Simmons и др., 1996; Ishijima и др., 1998; Linari и др., 1998; A. Huxley, 2000).

Проблема изучения молекулярного механизма мышечного сокращения состоит, главным образом, в том, что механическая функция актин-миозинового мотора может быть реализована лишь при сохранении надмолекулярной структуры мышцы, а исследование изолированных сократительных белков даже с использованием всех средств современной биохимии и молекулярной биологии способно дать лишь косвенную информацию об их механической функции. С другой стороны, изучение конформационных изменений актин-миозинового комплекса в структурированных системах, способных совершать механическую работу, таких как мышечное волокно или миофибрилла, сопряжено с большими трудностями в интерперетации результатов и определении механических параметров отдельных компонентов системы.

Таким образом, представляется актуальным исследовать взаимосвязи между макроскопическими механическими процессами сокращающения мышцы и молекулярными структурными событиями в сократительных белках, которые, как представляется, лежат в основе механической функции мышцы, в демембранизованных мышечных волокнах, где состав среды, окружающей сократительные белки, полностью контролируется экспериментатором, а механическая функция сохранена. Использование клеток с проницаемой мембраной позволяет применить такие современные методы нестационарной кинетики, как импульсный фотолиз веществ и скачок температуры для синхронизации процессов, происходящих в отдельных миозиновых молекулах. Малоугловая дифракция рентгеновских лучей представляет собой один из наиболее продуктивных методов исследования структурных изменений в мышце на молекулярном уровне (Н. Huxley, 1996). Благодаря использованию мощных синхротронных источников рентгеновского излучения и быстродействующих электронных детекторов изменения интенсивностей самых ярких рефлексов от одиночных интактных клеток лягушки были измерены с субмиллисекундным временным разрешением (Irving и др., 1992; Dobbie и др., 1998). Результатом этих исследований явилось структурное подтверждение правильности мостиковой теории мышечного сокращения, предложенной А. Huxley и Simmons'oM в 1971 году. Прогресс, достигнутый в применении техники рентгеновской дифракции высокого временного разрешения к одиночным интактным мышечным волокнам, делает актуальным её применение для изучения структурных изменений в волокнах с проницаемой мембраной. В таких волокнах можно, в частности, использовать для инициализации силогенерирующего процесса в активном состоянии метод скачка температуры как альтернативу методу механических деформаций. В этом случае силогенерация происходит в изометрических условиях, то есть без относительного смещения толстых и тонких нитей. Результаты исследования механических характеристик переходных процессов в одиночных сокращающихся мышечных волокнах, вызванных высокоамплитудным скачком температуры показали, что эти характеристики существенно отличаются от таковых, вызванных механическими деформациями (Bershitsky, Tsaturyan, 1992;

Bershitsky, 2001). Более того, по нашим данным, переходные процессы напряжения, вызванные ступенчатыми деформациями и скачком температуры имеют различную природу (Bershitsky, Tsaturyan, 2002). Поэтому представляется о актуальным детально исследовать механические характеристики отдельных мостиков и структурные события, сопровождающие цикл работы мостиков, используя эти два типа воздействий. Комбинация разных методов возбуждения силогенерирующего процесса в мостиках может помочь понять основы молекулярной природы мышечного сокращения.

Цели и задачи исследования: изучить термомеханические и кинетические характеристики элементарных молекулярных генераторов силы мышечного сокращения - поперечных мостиков - во время силогенерирующего процесса в мышце, а также рентгеноструктурные изменения в мышечных волокнах теплокровных (кролика), сопровождающие этот процесс, а именно:

1. Разработать метод скачка температуры для одиночных волокон скелетных мышц с одновременным измерением их механических характеристик в субмиллисекундном и структурных изменений в миллисекундном временном диапазоне;

2. Разработать экспериментальную модель демембранизованных клеток скелетных мышц теплокровных со стабилизированной структурой саркомеров, способных к длительной (десятки минут) активации, необходимых для механических и рентгеноструюурных исследований в различных физиологических состояниях;

3. Исследовать кинетику и термодинамику силогенерирующего шага мостиков при физиологической температуре;

4. Изучить механические реакции мышечных волокон кролика на скачок температуры и выяснить, с какими процессами в поперечных мостиках связаны эти реакции;

5. Сравнить переходные процессы силы в одиночных мышечных волокнах кролика, вызванные субмиллисекундными изменениями длины и температуры;

6. Зарегистрировать и исследовать рентгеноструктурные изменения в одиночных активированных мышечных волокнах с временным разрешением 1 мс, сопровождающие силогенерирующие процессы, вызванные быстрыми изменениями длины и температуры.

Методы исследования: микромеханика одиночных мышечных волокон высокого (~0,1 мс) временного разрешения; лазерная дифракционная регистрация длины саркомеров и управляемая изометрия с использованием длины саркомеров для обратной связи; джоулев скачок температуры; частичная ковалентная сшивка миозина с актином в мышечном волокне; рентгеновская дифракция высокого (1 мс) временного разрешения с использованием источников синхротронного излучения.

Объект исследования: одиночные химически демембранизированные (скинированные) волокна скелетных мышц кролика.

Научная новизна. В ходе работе:

- Впервые разработана экспериментальная техника и модель одиночных волокон скелетных мышц теплокровных с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой, пригодная для исследования механических и структурных изменений методом рентгеновской дифракции высокого временного разрешения при физиологических условиях.

- Впервые разработан и реализован метод джоулева скачка температуры в одиночных клетках (волокнах) скелетных мышц кролика, превосходящий по своим характеристикам и возможностям известные в настоящее время методы.

- С помощью джоулева скачка температуры впервые получено независимое доказательство существования быстрого силогенерирующего шага в мостиках, присоединенных к тонким нитям, т. е. подтвержден один из главных постулатов мостиковой теории мышечного сокращения.

- Впервые показано, что силогенерирующий "шаг" мостиков может происходить без смещения толстых и тонких нитей в саркомерах и в условиях, исключающих отсоединение и присоединение миозиновых мостиков к тонким нитям.

- Впервые исследована кинетика механических ответов одиночных волокон скелетных мышц кролика на быстрое изменение температуры.

Впервые показано и доказано, что увеличение напряжения в мышце при повышении температуры происходит за счёт увеличения силогенерирующей способности мостиков, а не их числа.

Впервые получен временной ход изменения интенсивностей основных рефлексов рентгенограммы волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры.

Впервые показано, что реакция напряжения в мышце теплокровных в ответ на повышение температуры сопровождается значительным увеличением интенсивности первой акгиновой слоевой линии на рентгенограмме, свидетельствуя о переходе присоединённых мостиков в стерео-специфически связанное с актином состояние.

Впервые показано, что кинетика роста интенсивности первой акгиновой слоевой линии на рентгенограмме волокон скелетных мышц кролика в ответ на скачок температуры с временным разрешением в 1 мс совпадает с кинетикой роста силы.

Впервые показано, что силогенерирующие процессы в мышце, вызванные механическими деформациями и скачком температуры имеют разную природу.

Найдены новые и уточнены известные детали механизма работы актин-миозинового мотора, что расширяет и дополняет знания о мышечном сохфащении и ведёт к пересмотру существующих представлений о механизме генерации силы в мышце.

Практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - силогенерации в мышце, то есть того молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе биологической подвижности. Методы и подходы, разработанные в работе могут быть применены в во многих прикладных исследованиях особенностей сокращения скелетных и сердечных поперечно-полосатых мышц. К ним относятся: экспериментальная модель одиночных мышечных клеток с проницаемой мембраной, стабилизированных частичной ковалентной сшивкой; метод скачка температуры в одиночных клетках, позволяющий исследовать механическое поведение мышечных клеток с проницаемой мембраной при физиологической температуре и в изометрических условиях,; метод регистрации и контроля длины саркомеров мышечных волокон в воздухе; метод регистрации рентгенограмм одиночных клеток в воздухе, то есть с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные подходы и методы могут быть использованы для анализа особенностей работы актин-миозинового мотора в клетках различных типов в норме и при патологии, а метод джоулева скачка температуры потенциально применим и к другим биологическим объектам.

Публикации. Результаты диссертации изложены в 39 публикациях в научных журналах и сборниках конференций, а также в научных отчётах.

Апробация работы. Основные результаты были доложены на Международной конференции по медицинской биомеханике (Рига, 1986); на VI и VII

Всесоюзных съездах по теоретической и прикладной механике (Ташкент, 1986; Москва 1991); на VIII и IX Всесоюзных симпозиумах "Биофизика и биохимия биологической подвижности" (Пущино, 1987; Тбилиси, 1990); на Выездном заседании секции биологической подвижности Научного совета по проблемам биофизики АН СССР (Ереван, 1988); на Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989); на собрании Национального комитета СССР по теоретической и прикладной механике (Москва, 1986); на Всесоюзных школах по биологической подвижности (Лосево, 1985; 1989) и по физиологии и биофизике миокарда (Свердловск, 1981, 1984, 1987); на Всесоюзных семинарах "Биомеханика-84, -87, -90, -91" (Москва, 1984, 1990; Ленинград, 1987; Санкт-Петербург, 1991, 1999, 2001); на II и III Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004); на XVIII, XIX, XXIV, XXVI, XXVIII, XXX, XXXI, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Лунтерен, Нидерланды, 1989; Брюссель, Бельгия, 1990; Флоренция, Италия, 1995; Шневердинген, Германия, 1997; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Лунтерен, Нидерланды, 2002; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на IV Международной конференции по мышечной энергетике (Сиена, Италия, 1992); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 1998, 2001, 2004); на восьми ежегодных конференциях получателей грантов Медицинского Института им. Ховарда Хьюза (HHMI; Прага, Чехия, 1996; Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998; Москва, Россия, 1999; Вашингтон, США, 2000; Ванкувер,

Канада, 2001; Керне, Австралия, 2002; Таллинн, Эстония, 2004); на собраниях Физиологического общества Великобритании (Эдинбург, 1989; Бирмингем, 1994); на семинарах Лондонской мышечной серии (London Muscle Series) в 1992 и 2002, а также на других научных конференциях и семинарах.

Часть экспериментов была выполнена в Отделе биофизики (Randall Institute) Королевского колледжа Лондонского университета (King's College London) при финансовой поддержке фонда Wellcome Trust; в Отделе физической биохимии Национального Института медицинских исследований Совета по медицинским исследованиям Великобритании (National Institute for Medical Research, MRC, Лондон); в Отделе биомедицинских наук Империал Колледжа Лондона (Biomedical Sciences Division, Imperial College London), и Лаборатории Дасбери, Чешир (Daresbury Laboratory, Cheshire); на Европейском синхротроне ESRF, Гренобль, Франция. Исследования, вошедшие в работу, были поддержаны грантами РФФИ, Wellcome Trust, HHMI, INTAS, MRC, Daresbury Laboratory, NATO, ESRF, EMBL, Royal Society, Международного научного фонда ISF (фонд Сороса) и совместным грантом ISF и Правительства России.

Автор считает своим долгом почтить память своего первого учителя профессора В Л. Изакова, который побудил в нём интерес к биофизике и стоял у истоков настоящего проекта. Автор хотел бы выразить благодарность своим учителям и наставникам: профессорам A.F. Huxley и R.M. Simmons'y и доктору D.R. Trentham'y, в немалой степени содействовавшем выполнению этой работы. Автор признателен своему другу и коллеге А.К. Цатуряну за многолетнее и плодотворное сотрудничество. Автор благодарит также профессора B.C. Мархасина за его благожелательные и настойчивые усилия, подвигнувшие автора к написанию настоящей диссертации.

Реализация метода скачка температуры в одиночных мышечных волокнах и все механические и рентгеновские эксперименты, проводившиеся в течение более, чем 20 лет и представленные в данной работе, были сделаны совместно с А.К. Цатуряном (Институт механики МГУ); все эксперименты на источниках синхротронного излучения в Daresbury (Великобритания) и Grenoble (Франция) были выполнены совместно с М.А. Ferenczi (Imperial College, Лондон), значительная часть этих экспериментов была сделана в сотрудничестве с Н.А. Кубасовой (Институт механики МГУ); на разных этапах в работе принимали участие О.Н. Бершицкая, Г.И. Машанов, P. Brown, R. Burns, Z.-H. Не, М. Webb и V. Siththanandan; всем им автор глубоко признателен за сотрудничество.

ВВЕДЕНИЕ

Скелетная мышца в силу своей почти идеально правильной организации на всех структурных уровнях - от волокна до саркомера - является излюбленным объектом исследователей как собственно механизма мышечного сокращения, так и взаимодействия актина и миозина, которое лежит в основе многих видов немышечной подвижности. На рис. В.1 показана иерархическая схема организации сократительного аппарата скелетной мышцы. Мышца состоит из мышечных клеток, или волокон, лежащих параллельно друг другу, каждое волокно заканчивается на обоих концах сухожилиями. Диаметр волокон у разных видов животных находится в диапазоне 50 -200 мкм, число волокон в мышце составляет от нескольких сот до нескольких тысяч. Каждое волокно в свою очередь состоит из «нескольких тысяч миофибрилл диаметром ~1 мкм. Вдоль длины миофибриллы разделены на регулярные сегменты - саркомеры, ограниченные Z-линиями, длина покоя которых составляет в мышцах лягушки 2,2 мкм, а в мышцах теплокровных - 2,4 мкм. От Z-линий внутрь саркомера идут тонкие нити, или тонкие филаменты, представляющие собой спираль белка актина. В пространстве между тонкими нитями лежат толстые нити, или толстые филаменты, состоящие из моторного белка миозина. В участке перекрытия эти нити упакованы в гексагональную решётку, тогда как вне перекрытия акгиновые нити имеют квадратную упаковку. Перекрывающиеся и неперекрывающиеся участки называются А- и I-зонами (анизотропная и изотропная), соответственно, по ориентации двулучепреломления в них (Brttcke, 1858; Kiihne, 1864). Миофибриллы в волокне и волокна в мышце лежат в регистре, так что их Z-линии, а также А- и I-зоны совпадают и представляют собой чередующиеся тёмные и светлые полосы, идущие поперёк мышцы, что и определило название мышц - поперечно-полосатые, в отличие от гладких, не имеющих такой упорядоченной организации клеток. Поперечную исчерченность мышц можно видеть в световой микроскоп, предпочтительно интерференционный или фазово-контрастный. В силу регулярности саркомеров, их длину можно также измерять дифракционными методами, наиболее часто для этого используются гелий-неоновые или полупроводниковые лазеры.

Строение скелетной мышцы. В основе сокращения всех типов мышц и подвижности немышечных клеток лежит взаимодействие двух белков - актина и миозина. Актин - весьма консервативный белок с молекулярной массой 42 кД. В присутствии АТФ глобулярный актин (G-актин) полимеризуется с образованием нитей F-актина длина которых может достигать 20 мкм. Акгиновая нить представляют собой левую спираль (~6 оборотов на 13 субъединиц ) с осевым шагом между мономерами 2,75 нм (Holmes и др., 1990). Моторный белок миозин обладает большим разнообразием. В настоящее время описано более 15 видов миозинов и определены аминокислотные последовательности более чем 100 представителей этого супер-семейства белков (Соре и др., 1996). Все миозины содержат одну или две тяжелых полипептидных цепи и несколько легких цепей. На N-конце каждой тяжелой цепи находится глобулярная головка миозина или субфрагмент-1 (S1), которая способна связываться с актином и гидролизовать АТФ. В результате гидролиза АТФ выделяется свободная химическая энергия, которая в ходе актин-миозинового взаимодействия превращается в механическую работу (Энгельгардт и Любимова, 1939). Миозиновая головка переходит в 'шейку' - длинный а-спиральный участок тяжелой цепи, с которым ассоциированы легкие цепи. Их количество в миозинах разного типа варьирует в широких пределах. Мышечный миозин или миозин II содержит две тяжелые и четыре легких цепи. С-терминали каждой из тяжелых цепей соединены в супер-а-спиральный субфрагмент-2 (S2), переходящий в длинный стволовой и также супер-а-спиральный участок молекулы, называемый легким меромиозином (ЛММ). При физиологической ионной силе окружающего раствора (250 мМ) стволовые участки молекул миозина агрегируют и образуют миозиновые нити. В скелетных мышцах эти нити обладают спиральной симметрией и представляют собой трехзаходную правую спираль с периодом около 43 нм и осевым расстоянием между ярусами выступающих миозиновых головок ~14,3 нм. На один период миозиновой спирали приходится 9 молекул миозина или 18 миозиновых головок. Длинные суперспирализованные части молекул миозина (ЛММ) образуют ствол толстой миозиновой нити диаметром около 15 нм. Схема строения скелетной мышцы, ее клетки или волокна и основной структурной единицы - саркомера показана на рис. В.1.

Рис.В, 1. Структура скелетной мышцы.

Исследование молекулярного механизма, лежащего в основе генерации мышечного сокращения - одна из важнейших и интереснейших проблем биофизики и физиологии мышц. Начало современной истории этих исследований восходит к концу XIX века, но реальный прогресс в понимании механизма сокращения мышцы начался в 30-50-х годах XX века и связан с именами таких выдающихся учёных как A.V. Hill, A. Huxley и Н. Huxley (Gasser, Hill, 1924; Hill, 1938; A. Huxley, 1957; H. Huxley, 1952, 1953, 1957; A. Huxley,

Simmons, 1971). Сначала на целых мышцах, а затем на одиночных интактных волокнах скелетных мышц был обнаружен целый спектр механических и энергетических феноменов сокращающейся мышцы. Всё детальней исследуется структура мышечной клетки и организация её сократительного аппарата, для чего привлекаются методы фазовой и интерференционной оптической микроскопии, электронной микроскопии и рентгеновской дифракции. Анализ накопленых к тому времени данные позволил сформулировать в середине 50-х годов так называемую "мостиковую" теорию мышечного сокращения. В основе этой теории лежит циклическое взаимодействие "поперечных мостиков" -головок молекул миозина, выступающих из ствола толстой нити и взаимодействующих во время сокращения с тонкими, актиновыми, нитями. В 1971 году, была предложена механическая модель поворачивающегося, или катящегося, мостика, позволявшая описать большинство известных к тому времени экспериментальных феноменов мышечного сокращения (A. Huxley и Simmons, 1971). Использовавшийся авторами метод состоял в том, что к сокращающемуся одиночному мышечному волокну прикладывали быстрые (-0,2 мс) продольные деформации и регистрировали ответ силы в волокне на такое воздействие. Смысл такого подхода состоит в том, чтобы, нарушив равновесные условия, в данном случае микроскопических механических событий в отдельных мостиках, синхронизовать эти события в макроскопически измеримый ответ силы целого волокна и интерпретировать этот ответ в терминах «среднего» мостика. Из предположений, что мостик, соединённый с толстой нитью упругим элементом (по умолчанию предполагалось, субфрагментом 2), катится по поверхности тонкой нити через ряд дисьфетных состояний не меняя при этом формы и что жёсткость как толстых, так и тонких нитей много выше жёсткости мостиков, авторы получили модель, которая вполне удовлетворительно описывала результаты механических экспериментов.

Реакция напряжения соьфащающегося мышечного волокна в ответ на ступенчатое укорочение на величину <0,5% состоит из следующих компонентов (рис. В.2): упругое падение напряжения (фаза 1), быстрое частичное его восстановление (фаза 2), временное «плато» (фаза 3) и, наконец, относительно медленное восстановление напряжения к исходному уровню (фаза 4). В модели Huxley и Simmons'a субфрагмент-1 (S1) миозина, присоединившись к тонкой нити, может находиться в нескольких дискретных состояниях. Поворот S1 и его переход из одного состояния в другое ведёт к растяжению упругого элемента (в модели — субфратент 2, или S2), соединяющего S1 со стволом толстой нити. Энергия перехода сохраняется в виде растяжения упругого элемента. Кинетика этого перехода соответствует кинетике быстрого частичного восстановления напряжения в ответ на ступенчатое укорочение.

Позднее в механических экспериментах с одновременной регистрацией рентгеновской дифракции в целой мышце (Н. Huxley и др., 1983) и в одиночных мышечных волокнах (Irving и др., 1992) были получены данные в пользу осевого движения мостиков во время фазы 2 механического ответа, подтверждающие модель Huxley и Simmons'a. Доказательством этого служило преходящее падение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, соответствующего периоду 14,3 нм, то есть осевому периоду мостиков, синхронное с фазой быстрого частичного восстановления напряжения после ступенчатого изменения длины. Модель, объясняющая этот результат (Irving и др., 1992; Piazzesi и др., 1995), состоит в следующем: мостик, длина которого больше его ширины, после укорочения волокна оказывается в менее перпендикулярном по отношению к оси волокна положении и, соответственно, его вклад в дифракцию уменьшается. Во время силогенерирующего шага мостик опять принимает перпендикулярное положение и интенсивность рефлекса восстанавливается. Проблема такой интерпретации заключается, однако, в том, она основана на изменении интенсивности одного единственного рефлекса, и такое её поведение может объясняться также изменением формы мостика во время силогенерирующего шага (Dobbie и др., 1998; Irving и др., 2000).

Другой аргумент в пользу изменения положения S1 во время переходного процесса силы после деформации волокна был получен в экспериментах с использованием флуоресцентно-меченых лёгких цепей S1 миозина (Irving и др., 1995). Положение ковалентно присоединённых к лёгким цепям бифункциональных меток, зарегистрированное в поляризованном свете, также показывает изменение их углового положения, синхронное с быстрым восстановлением напряжения. Угол, однако, меняется всего примерно на 3°, что при длине S1 ~18 нм никак не соответствует требуемой по данным механических измерений величине шага мостика в 12-15 нм. Авторы объясняют

А

Length -1 ]

Tent ion У

XX) m»

В

Length 1 ]

Tension 1- >"----- 5 тис ---

HIHM.M.M PtMM 2 — — Phasa 3 — Ph*» 4

Рис. В.2. Ответ напряжения одиночного интактного волокна скелетной мышцы лягушки во время тетанического сокращения на ступенчатое укорочение (из A. Huxley и Simmons, 1970). На А и В показаны изменения длины и напряжения при двух временных масштабах. Т0, Ti и Тг на А обозначают уровни напряжения: начальный, в конце фазы 1 и в фазе 2, соответственно. Линии разного типа на В соответствуют фазам 1-4. такое несоответствие малым, порядка 5%, числом мостиков, участвующих в силогенерирующем шаге. Такое объяснение, в свою очередь, противоречит данным механических и рентгеновских измерений. Следует отметить однако, что та же группа исследователей нашла изменение угла поляризации вплоть до 45° вдоль оси тонких филаментов с такими же флуоресцентными метками на лёгких цепях

SI в экспериментах на in vitro подвижной системе с миозином V (Forkey и др., 2003). Это, скорей всего, указывает на то, что в мышечном волокне, в отличие от in vitro подвижной системы, существуют какие-то не обнаруженные ещё условия, препятствующие корректному измерению движения флуоресцентных меток. Однако даже этот результат не отвечает на вопрос, каким образом происходит силогенерирующий шаг мостика, так как разрешение метода не позволяет отличить движение S1 как целого от изменения относительного положения хвостового и моторного доменов (см. ниже).

В начале 90х годов были получены кристаллы глобулярного актина (Kabsch и др., 1990) и субфрагмента-1 миозина в "ригорной" конфигурации (Rayment и др., 1993а) и сняты их рентгенограммы высокого пространственного разрешения (2,8 А). На основе этих рентгенограмм были сделаны реконструкции глобулярного (Kabsch и др., 1990) и филаментарного актина (Holmes и др., 1990; Mendelson и Morris, 1994), субфрагмента-1 (Rayment и др., 1993а) и акто-миозинового комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris 1997). Впоследствии были получены 1фисталлы гладкомышечного миозина (Dominguez и др., 1998) и миозина моллюска (Houdusse и Cohen, 1996; Houdusse и др., 1999; Houdusse и др., 2000), а также ряд комплексов миозина с АДФ и негидролизуемыми аналогами нуклеотида, которые показывают разные конформации миозина, соответствующие, по мнению авторов, разным стадиям силогенерирующего шага (Houdusse и Sweeney, 2001). Реконструкции миозина показывают существование "шейного" домена (остатки 770-843 первичной последовательности миозина цыплёнка) в структуре S1, который и является упругим элементом мостика, постулированным в модели Huxley и Simmons'а 1971 г.

На основе этих реконструкций миозина и акто-миозинового комплекса была выдвинута гипотеза (Uyeda и др., 1996; Howard и Spudich, 1996; Anson и др., 1996; Holmes, 1997), согласно которой 'шейка' играет роль 'рычага', приводимого в действие 'конверторным' доменом (остатки 711-781 в аминокислотной последовательности миозина Dictyostelium discoideum; Holmes, 1997). В соответствии с этой гипотезой акгин-связывающий, или моторный, домен миозина к моменту силогенерирующего шага прочно и неподвижно связан с актином, а всё движение производится только "шейным" доменом. Например, было экспериментально показано (Uyeda и др., 1996), что скорость движения филаментарного актина по поверхности, покрытой миозином, линейно связана с числом IQ мотивов а-спирального «хвостового» участка субфрагмента 1 миозина, иначе говоря, его длиной.

В настоящее время результаты изменения интенсивности рефлекса МЗ рентгеновской дифракции на мышечном волокне, синхронные с фазой быстрого частичного всстановления напряжения после ступенчатой деформации, также интерпретируются в рамках этой гипотезы (Irving и др., 2000).

Движение хвостового домена субфрагмента 1 молекулы миозина относительно моторного домена было также показано с помощью резонансного переноса флуоресценции (Suzuki и др., 1998). Для этого в аминотерминаль моторного домена был встроен GFP (зелёный флуоресцентный белок), возбуждаемый источником света, а в его карбоксильную терминаль - BFP (голубой флуоресцентный белок), возбуждаемый флуоресценцией GFP. По интенсивности вторичной флуоресценции BFP было обнаружено, что карбоксильная терминаль меняет угол относительно аминотерминали в шаге изомеризации цикла гидролиза АТФ, а затем возвращается назад предположительно в момент сброса неорганического фосфата.

Разработанная в 80-х годах акто-миозиновая in vitro подвижная система (motility assay; Sheetz и Spudich, 1983; Harada и др., 1987) позволила визуализовать движение одиночных флуоресцентно меченых нитей актина по поверхности, покрытой миозином, с помощью флуоресцентной микроскопии и измерять скорость движения при различных экспериментальных условиях, но не исследовать механизм взаимодействия. В середине 90 годов на основе in vitro подвижной системы был создан метод оптической ловушки, который позволил с помощью флуоресцентной микроскопии в комбинации с достаточно мощным инфракрасным лазером регистрировать величину и силу шага одиночных взаимодействий актина и миозина (Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995). Однако, измеренные таким методом параметры взаимодействия белков противоречивы и не дают величин, согласующихся с результатами механических измерений на волокне. Это, видимо, объясняется некоторой неопределённостью механических характеристик, присущих самой методике, в частности, наличием неучтённой податливости при фиксации молекул миозина к подложке и нитей актина в манипуляторе. Кроме того, результаты, полученные методом оптической ловушки, позволяют получать количественные характеристики механических параметрах силогенерирующего шага мостика, но не дают детальных представлений о механизме взаимодействия актина и миозина. Следует, однако, заметить, что методика исследования взаимодействия актина и миозина на уровне одиночных молекул весьма активно развивается и совершенствуется в последние годы и результаты таких измерений становятся всё более ясными и определёнными (см., например, Veigel и др., 2003). Кроме того, такой подход не ограничивает исследователя в выборе объекта и позволяет использовать как нативные миозины различных классов, так и модифицированные молекулы со свойствами, не встречающимися в природе, но удобными для тех или иных экспериментальных целей.

Томограммы электронно-микроскопических срезов летательных мышц насекомых, полученных быстрым замораживанием (Taylor и др., 1999), показывают серьёзные отличия в конфигурации моторного домена по сравнению с реконструкциями акго-Sl комплекса (Rayment и др., 1993b; Mendelson и Morris, 1997).

Таким образом, из всего сказанного следует очевидный вывод: несмотря на огромный прогресс в изучении механизма мышечного сокращения, на целый ряд гениальных догадок, развитие и разработку уникальных методов исследования, природа генерации силы в мышце остаётся в значительной мере неизвестной. Сама модель Huxley и Simmons'a 1971 года, а также экспериментальный подход, на результатах которого она была основана, стимулировали развитие целого ряда подходов к изучению механизма мышечного сокращения, так называемых методов нестационарной кинетики. Кроме упомянутого метода быстрых деформаций, для исследования силогенерирующего процесса были разработаны метод скачка давления с целью повлиять на термодинамические параметры в сокращающейся мышце; метод импульсного фотолиза искусственно инактивированных участников биохимического цикла мостика, таких как АТФ, АДФ, неорганического фосфата и свободного кальция. Был также разработан и использован метод лазерного скачка температуры, который позволяет увеличивать температуру в экспериментальной камере объёмом в несколько десятков микролитров на 4-8°С за время порядка долей миллисекунды.

Нами был разработан метод джоулева скачка температуры для одиночного скицированного волокна скелетной мышцы. Принцип метода состоит в следующем: через волокно, подвешенное в воздухе на одну-две секунды, пропускается импульс переменного электрического тока и это ведёт к выделению в волокне джоулева тепла. Метод позволяет увеличить температуру волокна с ~5°С (то есть, от температуры воздуха в экспериментальной камере) вплоть до 35-40°С за десятые доли миллисекунды. Быстрое повышение температуры сокращающегося волокна ведёт к значительному росту силы, зависящему от величины скачка температуры. Такой подход позволяет исследовать силогенерирующий процесс в мышце и сравнивать его с переходным процессом, вызванным ступенчатыми деформациями.

Используя метод скачка температуры мы зарегистрировали и исследовали механические характеристики вызванного им переходного процесса напряжения в одиночных мышечных волокнах лягушки и кролика. Механические эксперименты были сделаны с параллельной регистрацией длины саркомеров по дифракции света He-Ne лазера на волокне, что несомненно повышает возможности контроля качества волокна и достоверности результатов, так как даёт возможность судить о влиянии укорочения саркомеров на силу и, главным образом, на кинетику переходных процессов силы. В некоторых экспериментах длина саркомеров поддерживалась постоянной при помощи обратной связи по положению первого максимума дифракции, что позволяет исключить неоднородность укорочения саркомеров вдоль волокна, которая может влиять на результаты измерений. Действительно, было найдено, что неоднородность укорочения саркомеров замедляет кинетику переходного процесса силы после скачка температуры, практически не влияя при этом на максимальное напряжение. С использованием обратной связи по длине саркомеров была зарегистрирована температурная зависимость максимального изометрического напряжения в мышце кролика. С коррекцией на увеличение площади поперечного сечения мышечных волокон в результате разрушения наружной мембраны (скинирования), максимальное напряжение при физиологической температуре достигает 400 кН м".

Было показано, что рост напряжения в ответ на скачок температуры не сопровождается сколь-либо заметным увеличением жёсткости волокон и, стало быть, рост силы с повышением температуры связан не с увеличением числа миозиновых мостиков, присоединённых к тонким нитям, а с увеличением силогенерирующей способности мостиков.

Переходный процесс напряжения в ответ на скачок температуры сравнивали с механическим, вызванным ступенчатым изменением длины в одних и тех же волокнах. Оказалось, что кинетика температурного ответа даже при скачках температуры в 30-35°С всегда медленнее кинетики механического ответа даже при нулевой температуре.

Позднее метод скачка температуры был адаптирован для одновременной регистрации рентгеноструктурных событий, происходящих во время силогенерирующего процесса, вызванного быстрым повышением температуры. С помощью такого подхода на дифракционной рентгенограмме сокращающегося мышечного волокна были обнаружены изменения, не наблюдавшиеся ранее, а именно: рост напряжения, вызванный скачком температуры, сопровождается значительным повышением интенсивности первой актиновой слоевой линии, причём это повышение, как нам удалось показать, происходит синхронно с ростом напряжения. Такой результат противоречит чисто «рычажному» механизму силогенерации в молекуле миозина, где только поворот «хвостового» домена относительно моторного полагается активным процессом. Найденные изменения интенсивности 1-й и ряда других слоевых линий актина, как показано в настоящей работе, свидетельствуют о том, что взаимодействие молекулы миозина с поверхностью актина является не менее важной фазой силогенерирующего процесса.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Бершицкий, Сергей Юрьевич

Основные результаты работы можно сформулировать в следующем виде:

1. Разработан метод высокоамплитудного джоулева скачка температуры для одиночных демембранизированных волокон и тонких пучков волокон скелетных мышц и технология измерения механических характеристик этих препаратов с субмиллисекундным временным разрешением при одновременной регистрации молекулярных структурных событий в них с помощью рентгеновской дифракции на синхротронных источниках рентгеновского излучения;

2. Впервые исследованы механические и термомеханические характеристики сокращающихся волокон скелетных мышц теплокровных (кролика) в широком диапазоне температур вплоть до физиологической и получена температурная зависимость изометрической силы теплокровных под контролем длины саркомеров;

3. Впервые показано, что жёсткость сокращающихся волокон при полной Са2+-активации не зависит от температуры. Этот результат означает независимость числа поперечных мостиков, соединяющих тонкие и толстые нити саркомера, от температуры;

4. Проведено систематическое исследование и сравнение характеристик механических переходных процессов напряжения в мышечных волокнах, вызванных скачком температуры и быстрыми ступенчатыми изменениями длины сокращающихся волокон. Показано, что механизмы, лежащие в основе этих двух типов переходных процессов, имеют различную природу;

5. Исследованы свойства отдельных миозиновых мостиков в мышечных волокнах, изолированных при помощи их сшивки с актином тонкой нити этил-диметил карбодиимидом (ЭДК). В таких условиях с использованием техники скачка температуры обнаружена кажущаяся независимость силогенерирующего шага миозиновых мостиков от напряжения;

6. Зарегистрирован временной ход изменения интенсивностей наиболее ярких рефлексов рентгенограммы сокращающихся мышечных волокон во время переходного процесса, вызванного скачком температуры, с временным разрешением в 1 миллисекунду. Обнаружено, что рост интенсивности первой актиновой слоевой линии, отражающей степень стереоспецифического связывания головок миозина с тонкой нитью, происходит одновременно с развитием механического напряжения, тогда как изменение интенсивности меридионального рефлекса МЗ, которые в экспериментах с быстрыми деформациями интерпретируются как междоменные конформационные изменения в головке миозина, имеет двухфазный характер;

7. Предложена структурно-кинетическая модель двухшагового силогенерирующего процесса в поперечном мостике, которая интегрирует механические, структурные и биохимические данные.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Бершицкий, Сергей Юрьевич, 2005 год

1. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. О характере анизотропии мышечной ткани. //Доклады Академии наук СССР. 1981. Т.259, С.53-56.

2. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Действие субмиллисекундного скачка температуры на механическое напряжение демембранизованных волокон скелетной мышцы лягушки в состоянии ригора. // Биофизика. 1985. Т.ЗО. С.868-872.

3. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Термоупругие свойства поперечных мостиков в демембранизованных волокнах скелетной мышцы лягушки в состоянии ригора. // Биофизика. 1986. Т.31. С.532-533.

4. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Скачок температуры в активированныхмышечных волокнах лягушки. // Тезисы VIII симпозиума (СССР) 'Биофизика и биохимия биологической подвижности'. Пущино. 1987. С.82.

5. Бершицкий С.Ю., Цатурян А.К. Двухфазный ответ напряжения на скачок температуры в Са-акгивированных волокнах скелетной мышцы лягушки. // Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.156-158.

6. Бэгшоу К. Мышечное сокращение. // М.: Мир. 1985. 127 с.

7. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. // М.: Наука. 1982.161 с.

8. Цатурян А.К., Бершицкий С.Ю. Реакция напряжения в демембранизированных Са-акгивированных волокнах скелетной мышцылягушки на скачок температуры после ступенчатого изменения длины. // Биофизика. 1988. Т.ЗЗ. С.570-572.

9. Энгельгардт В.А., Любимова М.Н. Аденозинтрифосфотаза и миозин мышц //Биохимия. 1939. Т.4. С.716-736.

10. Anson М., Geeves М.А., Kurzawa S.E., Manstein D. Myosin motors with artificial lever arms. // EMBO J. 1996. V.15. P.6069-6074.

11. Berger C.L., Svensson E.C., Thomas D.D. Photolysis of a photolabile precursor of ATP (caged ATP) induces microsecond rotational motions of myosin heads bound to actin. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V.86. P.8753-8757.

12. Berger C.L., Thomas D.D. Rotational dynamics of actin-bound myosin heads in active myofibrils. // Biochemistry. 1993. V.32 P.3812-3821.

13. Bershitsky S.Y. Force generation in muscle: progress and problems. // Abstracts of International symposium. Biological motility. Pushchino. 2001. P.15-17.

14. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Effect of joule temperature jump on tension and stiffness of permeabilized rabbit muscle fibers. II Biophys. J. 1989. V.56. P.809-816.

15. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Tension responses to joule temperature jump in skinned rabbit muscle fibres. // J. Physiol. 1992. V.447. P.425-448.

16. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K. Force generation and work production by covalently cross-linked actin-myosin cross-bridges in rabbit muscle fibres. // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 1011-1021.

17. Bershitsky S.Y., Tsaturyan, A.K. Comparison of tension transients induced by fast changes in length and temperature in rabbit muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1999. V. 20. P. 819-820.

18. Bershitsky S.Y, Tsaturyan A.K. The elementary force generation process probed by temperature and length perturbations in muscle fibres from the rabbit. // J. Physiol. 2002. V. 540. P. 971-988.

19. Bershitsky S.Y., Tsaturyan A.K., Bershitskaya O.N., Mashanov G.I., Brown P., Burns R., Ferenczi M.A. Muscle force is generated by myosin heads stereospecifically attached to actin. //Nature. 1997. V. 388. P. 186-190.

20. Bertrand R., Chaussepied P., Audemard E., Kassab R. Functional characterization of skeletal F-actin labeled on the NH2-terminal segment of residues 1-28. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. P. 747-754.

21. Bertrand R., Chaussepied P., Kassab R., Boyer M., Roustan C., Benyamin Y. Cross-linking of the skeletal myosin subfragment 1 heavy chain to the N-terminal actin segment of resides 40-113. // Biochemistry. 1988. V. 27. P. 57285736.

22. Bordas J., Svensson A., Rothery M., Lowy J., Diakun G.P., Boesecke P. Extensibility and symmetry of actin filaments in contracting muscles. // Biophys. J. 1999. V. 77. P. 3197-3207.

23. Brenner В., Eisenberg E. Rate of force generation in muscle: correlation with actomyosin ATPase activity in solution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. V. 83. P. 3542-3546.

24. Brticke E. Untersuchungen tiber den Bau der Muskelfasern mit Htilfe des polarisirten Lichtes. // Denkschr. Akad. Wiss. Wien. math.-naturwiss. Kl., 1858. V. 15. P. 69-84.

25. Burmeister-Getz E., Cooke R., Selvin P.R. Luminescence resonance energy transfer measurements in myosin. // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 2451-2458.

26. Burton K., Huxley A.F. Identification of source of oscillations in apparent sarcomere length measured by laser diffraction. // Biophys. J. 1995. V. 68. P. 2429-2443.

27. Chiu Y.L., Karwash S., Ford L.E. A piezoelectric force transducer for single muscle cells. // American J. Physiol. 1978, V. 235. P. 143-146.

28. Combeau С., Didry D., Carlier M.-F. Interaction between G-actin and myosin subfragment-1 probed by covalent cross-linking. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 14038-14046.

29. Cooke R., Crowder M.S., Wendt C.H., Barnett V.A., Thomas D.D. Muscle cross-bridges: do they rotate? //Adv. Exp. Med. Biol. 1984. V. 170. P. 413-427.

30. Cooke R., Franks K. All myosin heads form bonds with actin in rigor rabbit skeletal muscle. // Biochemistry. 1980. V. 19. P. 2265-2269.

31. Davis J.S., Harrington W.F. Force generation by muscle fibers in rigor: a laser temperature-jump study. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987a. V84. P. 975-979

32. Davis J.S., Harrington W.F. Laser temperature-jump apparatus for the study of force changes in fibers. //Anal. Biochem. 1987b. V. 161. P. 543-549.

33. Davis J.S., Harrington W.F. A single order-disorder transition generates tension during the Huxley-Simmons phase 2 in muscle. // Biophys. J. 1993. V. 65. P. 1886-1898.

34. Davis J.S., Rodgers M.E. Indirect coupling of phosphate release to de novo tension generation during muscle contraction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995a. V. 92. P. 10482-10486.

35. Davis J.S., Rodgers M.E. Force generation and temperature-jump and length-jump tension transients in muscle fibers. // Biophys. J. 1995b. V. 68. P. 20322040.

36. Dobbie I., Linari M., Piazzesi G., Reconditi M., Koubassova N., Ferenczi M.A., Lombardi V., Irving M. Elastic bending and active tilting of myosin heads during muscle contraction. //Nature. 1998. V. 396. P. 383-387.

37. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K.M., Cohen C. Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. // Cell. 1998. V. 94. P. 559-571.

38. Duong A.M., Reisler E. Binding of myosin to actin in myofibrils during ATP hydrolysis. //Biochemistry. 1989. V. 28. P. 1307-1313.

39. Ferenczi MA., Bershitsky S.Y., Koubassova N., Siththanandan V., Helsby W.I., Panine P., Roessle M., Narayanan Т., Tsaturyan A.K. The 'roll and lock' mechanism of force generation in muscle. // Structure. 2005. In press.

40. Ferenczi M.A., Bershitsky S.Y., Koubassova NA., Tsaturyan A.K. Stereo-specific binding of myosin heads to actin occurs synchronously with force development induced by T-jump in rabbit muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2002. V.23(5). P. 11.

41. Ferenczi M.A., Homsher E., Trentham D.R. The kinetics of magnesium adenosine triphosphate cleavage in permeabilized muscle fibers of the rabbit. // J. Physiol. 1984. V. 352. P. 575-599.

42. Finer J.T., Simmons R.M., Spudich J.A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. // Nature. 1994. V. 368. P. 113-119.

43. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. Tension responses to sudden length change in stimulated frog muscle fibers near slack length. // J. Physiol. 1977. V. 269. P. 441-515.

44. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. The relation between stiffness and filament overlap in stimulated frog muscle fibers. // J. Physiol. 1981. V. 311. P. 219-249.

45. Ford L.E., Huxley A.F., Simmons R.M. Tension transients during steady shortening of frog muscle fibres. // J. Physiol. 1985. V. 361. P. 131-150.

46. Forkey J.N., Quinlan M.E., Shaw M.A., Corrie J.E., Goldman Y.E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. //Nature. 2003. V.422. P. 399-404.

47. Gasser H.S., Hill A.V. The dynamics of muscle contraction // Proc. Roy. Soc. 1924. V. B96. P. 398-437.

48. Geeves M.A., Holmes K.C. Structural mechanism of muscle contraction. // Annual Rev. Biochem. 1999. V. 68. P. 687-728.

49. Glyn H., Sleep J. Dependence of adenosine triphosphate activity of rabbit psoas muscle fibres and myofibrils on substrate concentration. // J. Physiol. 1985. V. 365. P. 259-276.

50. Godt R.E., Maughan D.W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Experimental observations. //Biophys. J. 1977. V. 19. P. 103-116.

51. Goldman Y.E., Huxley A.F. Actin compliance: are you pulling my chain? // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 2131-2136.

52. Goldman Y.E., McCray J.A., Ranatunga K.W. Transient tension changes initiated by laser temperature jump in rabbit psoas muscle fibres. // J. Physiol. 1987. V. 392. P. 71-95.

53. Goldman Y.E., Simmons R.M. Control of sarcomere length in skinned muscle fibres of Rana temporaria during mechanical transients. // J. Physiol. 1984. V. 350. P. 497-518.

54. Goldman Y.E., Simmons R.M. The stiffness of frog skinned muscle fibres at altered lateral filament spacing. // J. Physiol. 1986. V. 378. P. 175-194.

55. Grabarek Z., Gergely J. Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.//Analyt. Biochem. 1990. V. 185. P. 131-135.

56. Harada Y., Noguchi A., Kishino A., Yanagida T. Sliding movement of single actin filaments on one-headed myosin filaments. // Nature. 1987. V. 326. P. 805808.

57. Heaphy S., Tregear R. Stoichiometry of covalent actin-subfragment 1 complexes formed on reaction with a zero-length cross-linking compound. // Biochemistry. 1984. V. 23. P. 2211-2214.

58. Herrmann C., Sleep J., Chaussepied P., Travers F., Barman T. A structural and kinetic study on myofibrils prevented from shortening by chemical cross-linking. //Biochemistry. 1993. V. 32. P. 7255-7263.

59. Higuchi H., Yanagida Т., Goldman Y.E. Compliance of thin filaments in skinned fibers of rabbit skeletal muscle. // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 1000-1010.

60. Hill A.V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. // Proc. Roy. Soc. Lond. 1938. V. B126. P. 136-195.

61. Holmes K.C. The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. // Curr. Biol. 1997. V. 7. P. R112-118.

62. Holmes К. C. A molecular model for muscle contraction. // Acta Crystallogr. A. 1998. V. 54. P. 789-797.

63. Holmes K.C., Geeves M.A. The structural basis of muscle contraction. // Philos. Trans. Royal Soc. Lond. В Biol. Sci. 2000. V. 355. P. 419-431.

64. Holmes К. C., Popp D., Gebhard W., Kabsch W. Atomic model of the actin filament//Nature. 1990. V. 347. P. 44-49.

65. Horiuti К., Higuchi H., Umazume Y., Konishi M., Okazaki O., Kurihara S. Mechanism of action of 2,3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1988. V. 9. P. 156-164.

66. Houdusse A., Cohen C. Structure of the regulatory domain of scallop myosin at 2A resolution: implications for regulation. // Structure. 1996. V. 4. P. 21-32.

67. Houdusse A., Kalabokis V.N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. // Cell. 1999. V. 97. P. 459-470.

68. Houdusse A., Sweeney H.L. Myosin motors: missing structures and hidden springs. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2001. V. 11. P. 182-194.

69. Houdusse A., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. Three conformational states ofscallop myosin SI. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 11238-11243.

70. Howard J. Molecular motors: structural adaptations to cellular functions. // Nature. 1997. V. 389. P. 56 -57.

71. Howard J., Spudich J.A. Is the lever arm of myosin a molecular elastic element? Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996. V. 93. P. 4462-4464.

72. Huxley A.F. Muscle structure and theories of contraction. // Prog. Biophys. Biophys. Chem. 1957. V. 7. P. 255-318.

73. Huxley A.F. Reflections on muscle. // Liverpool Univ. Press, Liverpool. 1980. Ill P.

74. Huxley A.F. The mechanical properties of cross-bridges and their relation to muscle contraction. // Adv. Physiol. Sci. 1981. V. 5. P. 1-12.

75. Huxley A.F. Biological motors: energy storage in myosin molecules. // Curr. Biol. 1998. V. 8. P. R485-R488.

76. Huxley A.F. Mechanics and models of the myosin motor. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 2000a. V. 355. P. 433-440.

77. Huxley A.F. Cross-bridge action: present views, prospects, and unknowns. // J. Biomech. 2000b. V. 33, P. 1189-1195.

78. Huxley A.F., Niedergerke R. Interference microscopy of living muscle fibres. // Nature. 1954. V. 173. P. 971-973.

79. Huxley A.F., Simmons R.M. A quick phase in the series-elastic component of striated muscle, demonstrated in isolated fibres from the frog. // J. Physiol. 1970. V. 208. P. 52P-53P.

80. Huxley A.F., Simmons R.M. Mechanical properties of the cross-bridges of frog striated muscle. // J. Physiol. 1971a. V. 218. P. 59P-60P.

81. Huxley A.F., Simmons R.M. Proposed mechanism of force generation in striated muscle. //Nature. 1971b. V. 233. P. 533-538.

82. Huxley H.E. X-ray analysis and the problem of muscle. // Proc. R. Soc. B. 1952. V. 141. P. 59-62.

83. Huxley H.E. Electron microscope studies of the organisation of the filaments in striated muscle. // Biochem. Biophys. Acta. 1953. V. 12. P. 387-394.

84. Huxley H.E. The double array of filaments in cross-striated muscle. // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1957. V. 3. P. 631-648.

85. Huxley H.E. The mechanism of muscular contraction. // Science. 1969. V. 164. P. 1356-1365.

86. Huxley H.E. A personal view of muscle and motility mechanisms. // Annu. Rev. Physiol. 1996. V. 58 P. 1-19.

87. Huxley H.E. Past, present and future experiments on muscle. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. 2000. V. 355. P. 539-543.

88. Huxley H.E., Brown W. The low-angle X-ray diagram of vertebrate striated muscle and its behaviour during contraction and rigor. // J. Mol. Biol. 1967. V. 30, P. 383-434.

89. Huxley H.E., Hanson J. Changes in the cross-striations of muscle during contraction and stretch and their interpretation. // Nature. 1954. V. 173. P. 973976.

90. Huxley H.E., Simmons R.M., Faruqi A.R., Kress M., Bordas J., Koch M.H. Changes in the X-ray reflections from contracting muscle during rapid mechanical transients and their structural implications. // J. Mol. Biol. 1983. V. 169. P. 469-506.

91. Irving M., Lombardi V., Ferenczi M.A., Piazzesi G. Myosin head movements are synchronous with the elementary force-generating process in muscle. // Nature. 1992. V. 357. P. 156-158.

92. Irving M., Piazzesi G., Lucii L., Sun Y.-B., Harford J.J., Dobbie I.M., Ferenczi M.A., Reconditi M., Lombardi V. Conformation of the myosin motor during force generation in skeletal muscle. //Nature Struct. Biol. 2000. V.7. P. 482-485.

93. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F., Holmes K.C. Atomic structure of the actin DNAase I complex. // Nature. 1990. V. 347. P. 37- 44.

94. Kawai M., Kawaguchi K., Saito M., Ishiwata S. Temperature change does not affect force between single actin filaments and HMM from rabbit muscles. // Biophys. J. 2000. V. 78. P. 3112-3119.

95. King R.T., Greene L.E. The conformation of cross-linked actin-S-1 in the presence and absence of ATP. // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 6128-6134.

96. Kishino A., Yanagida T. Force measurements by micromanipulation of a single actin filament by glass needles. // Nature. 1988. V. 334. P. 74-76.

97. Koubassova N.A., Bershitsky S.Y., Ferenczi M.A., Tsaturyan A.K. Quantitative interpretation of the 2D x-ray diffraction patterns from skeletal muscle using direct modelling. //Fibre Diffraction Review. 2003. V.ll. P.131-132.

98. Koubassova, N.A., Tsaturyan, A.K. Direct modeling of X-ray diffraction pattern from skeletal muscle in rigor. // Biophys. J. 2002. V. 83. P. 1082-1097.

99. Klihne W. Untersuchngen liber das Protoplasma und die Contractilitat. // Leipzig. Engelmann. 1864.

100. Linari M., Aiazzi A., Dolfi M., Piazzesi G., Lombardi V. A system for studying tension transients in segments of skinned muscle fibres from rabbit psoas. // J. Physiol. 1993. V. 473. P. 8.

101. Linari M., Dobbie I., Reconditi M., Koubassova N., Irving M., Piazzesi G., Lombardi V. The stiffness of skeletal muscle in isometric contraction and rigor: the fraction of myosin heads bound to actin. // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 24592473.

102. Lombardi V., Piazzesi G., Ferenczi M.A., Thirlwell H., Dobbie I., Irving M. Elastic distortion of myosin heads and repriming of the working stroke in muscle. //Nature. 1995. V. 374. P. 553-555.

103. Lombardi V., Piazzesi G., Linari M. Rapid regeneration of the actin-myosin power stroke in contracting muscle. // Nature. 1992. V. 355. P. 638-641.

104. Lovell S.J., Knight P.J., Harrington W.F. Fraction of myosin heads bound to thin filaments in rigor fibrils from insect flight and vertebrate muscles. // Nature. 1981. V. 293. P. 664-666.

105. Lymn R.W., Taylor E.W. Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomyosin. //Biochemistry. 1971 V.10. P. 4617-4624.

106. Mendelson R.A., Morris E.P. The structure of F-actin. Results of global searches using data from electron microscopy and X-ray crystallography. // J. Mol. Biol. 1994. V. 240. P. 138-154.

107. Mendelson R.A., Morris E.P. The structure of the acto-myosin subfragment 1 complex: results of searches using data from electron microscopy and x-ray crystallography. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 8533-8538.

108. Molloy J.E., Burns J.E., Kendrick-Jones J., Tregear R.T., White D.C. Single-molecule mechanics of heavy meromyosin and SI interacting with rabbit or Drosophila actins using optical tweezers. //Nature. 1995. V. 378. P. 209-212.

109. Molloy J.E., Kendrick-Jones J., Veigel C., Tregear R.T. An unexpectedly large working stroke from chymotryptic fragments of myosin II. // FEBS Letters. 2000. V. 480. P. 293-297.

110. Mornet D., Bertrand R., Pantel P., Audemard E., Kassab R. Structure of the actin-myosin interface. //Nature. 1981. V. 292. P. 301-306.

111. Pate E., Wilson G.J., Bhimani M., Cooke R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. //Biophys. J. 1994. V. 66. P. 1554-1562.

112. Piazzesi G., Lombardi V., Ferenczi M.A., Thirlwell H., Dobbie I., Irving M. Changes in the x-ray diffraction pattern from single, intact muscle fibers produced by rapid shortening and stretch. // Biophys J. 1995. V68. P92S-98S.

113. Piazzesi, G., Reconditi, M., Koubassova, N., Decostre, V., Linari, M., Lucii, L., Lombardi V. Temperature dependence of the force-generating process in single fibres from frog skeletal muscle. // J. Physiol. 2003. V. 549, P. 93-106.

114. Piazzesi G., Reconditi M., Linari M., Lucii L., Sun Y.-B., Narayanan Т., Boesecke P., Lombardi V., Irving M. Mechanism of force generation by myosin heads in skeletal muscle. // Nature. 2002. V. 415. P. 659-662.

115. Potma E.J., Stienen G.J.M., Barends J.P.F., Elsinga G. Myofibrillar ATPase activity and mechanical performance of skinned fibres from rabbit psoas muscle. // J. Physiol. 1994. V. 472. P. 303-317.

116. Provencher S.W. A Fourier method for the analysis of exponential decay curves. // Biophys. J. 1976. V. 16. P. 27-50.

117. Ranatunga K.W. Temperature sensitivity of isometric tension in glycerinated mammalian muscle fibres. // In: Muscle and Motility (eds. G. Marechal and U. Carraro, Intercept Ltd., Andover, UK). 1990. V. 2. P. 271-276.

118. Ranatunga K.W. Endothermic force generation in fast and slow mammalian (rabbit) muscle fibers. // Biophys. J. 1996. V. 71. P. 1905-1913.

119. Ranatunga K.W. Effects of inorganic phosphate on endothermic force generation in muscle. // Proc. Royal Soc. Lond. В Biol. Sci. 1999. V. 266. P. 1381-1385.

120. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. // Science. 1993a. V. 261. P. 50-58.

121. Rayment I., Holden H.M., Whittaker M., Yohn C.B., Lorenz M., Holmes K.C., Milligan R.A. Structure of the actin-myosin complex and its implication for muscle contraction. // Science. 1993b. V. 261. P. 58-65.

122. Reedy M.C. Visualizing myosin's power stroke in muscle contraction. // J. Cell Sci. 2000. V. 113. P. 3551-3562.

123. Reedy M.K., Holmes K.C., Tregear R.T. Induced changes in orientation of the cross-bridges of glycerinated insect flight muscle. // Nature 1965. V. 207. P. 1276-1280.

124. Sheetz M.P., Spudich J.A. Movement of myosin-coated fluorescent beads on actin cables in vitro. //Nature. 1983. V. 303. P. 31-35.

125. Shih W.M., Gryczynski Z., Lakowicz J.R., Spudich J.A. A FRET-based sensor reveals large ATP hydrolysis-induced conformational changes and three distinct states of the molecular motor myosin. // Cell. 2000. V. 102. P. 683-694.

126. Simmons R.M., Finer J.T., Chu S., Spudich J.A. Quantitative measurements offorce and displacement using an optical trap. // Biophys J. 1996. V.70. P. 18131822.

127. Stephenson D.G., Williams D.A. Temperature-dependent calcium sensitivity changes in skinned muscle fibres of rat and toad. // J. Physiol. 1985. V. 360. P. 1-12.

128. Sutoh K. Identification of myosin-binding sites on the actin sequence. // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 3654-3661.

129. Sutoh K. Mapping of actin-binding sites on the heavy chain of myosin subfragment 1. //Biochemistiy. 1983. V. 22. P. 1579-1585.

130. Suzuki Y., Yasunaga Т., Ohkura R., Wakabayashi Т., Sutoh K. Swing of the lever arm of a myosin motor at the isomerization and phosphate-release steps. // Nature. 1998. V. 396. P. 380-383.

131. Svensson E.C., Thomas D.D. ATP induced microsecond rotational motions of myosin heads cross-linked to actin. // Biophys. J. 1986. V. 50. P. 999-1002.

132. Tawada K., Huang Y.-P., Emoto Y. Force production by covalently fixed cross-bridge heads in permeabilized fibers // In: Muscle Energetics (Alan R. Liss, Inc.). 1989. P. 37-43.

133. Tawada K., Kawai M. Covalent cross-linking of single fibers from rabbit psoas increases oscillatory power. // Biophys. J. 1990. V. 57. P. 643-647.

134. Tawada K., Kimura M. Stiffness of carbodiimide-crosslinked glycerinated muscle fibers in rigor and relaxing solutions at high salt concentrations. // J. Muscle Res. Cell Motil. 1986. V. 7. P. 339-350.

135. Towns-Andrews E., Beny A., Bordas J., Mant G.R., Murray P.K., Roberts K., Sumner I., Worgan J.S., Lewis R. Time-resolved x-ray diffraction station: x-ray optics, detectors and data acquisition. // Rev. Scient. Instrument. 1989. V. 60. P. 2346-2349.

136. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y. Force generation and shortening initiated by temperature jump in cross-linked rabbit muscle fibres. // J. Physiol. 1995, V. 483, P. 92-93P.

137. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Burns R., Ferenczi M.A. Structural changes accompanying force generation induced by temperature jump in permeabilised frog muscle fibres. //J. Muscle Res. Cell Motil. 1997. V.19. C.281.

138. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Burns R., Ferenczi M.A. Structural changes in the actin-myosin cross-bridges associated with force generation induced by temperature jump in permeabilized frog muscle fibers. // Biophys. J. 1999. V. 77. P. 354-372.

139. Tsaturyan A.K., Bershitsky S.Y., Ferenczi M.A., Koubassova N.A. Direct modelling as a tool for interpretation of the x-ray diffraction pattern from skeletal muscle. // J. Muscle Res. Cell Motil. 2001. V. 22, P. 584-585.

140. Urbanke C., Wray J. A fluorescence temperature-jump study of conformational transitions in myosin subfragment 1. // Biochem. J. 2001. V. 358, P. 165-173.

141. Uyeda T.Q., Abramson P.D., Spudich J.A. The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 4459-4464.

142. Veigel C., Coluccio L.M., Jontes J.D., Sparrow J.C., Milligan R.A., Molloy J.E. The motor protein myosin-I produces its working stroke in two steps. // Nature. 1999. V. 398. P. 530-533.

143. Veigel C, Molloy J.E., Schmitz S., Kendrick-Jones J. Load-dependent kinetics of force production by smooth muscle myosin measured with optical tweezers. // Nat. Cell Biol. 2003. V.l 1. P. 980-986.

144. Wakabayashi К., Sudimoto Y., Tanaka H., Ueno Y., Takezawa Y., Amemiya Y. X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction. // Biophys. J. 1994. V. 67. P. 2422-2435.

145. Woledge R.C., Curtin N.A., Homsher E. Energetics aspects of muscle contraction. // Academic Press Inc. (London) Ltd. 1985.357 P.

146. Zhao Y., Kawai M. Kinetic and thermodynamic studies of the cross-bridge cycle in rabbit psoas muscle fibers. //Biophys. J. 1994. V. 67. P. 1655-1668.