Интерлейкин-1 в молекулярных механизмах нейроиммунных взаимодействий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Рыбакина, Елена Георгиевна

• Рыбакина, Елена Георгиевна
• доктор биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации доктор биологических наук Рыбакина, Елена Георгиевна

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Интерлейкин-1: структура, механизмы образования и сигнальной трансдукции.

1.1.1. История развития проблемы и номенклатура.

1.1.2. Клеточные источники и стимуляторы образования интерлейкина-1.

1.1.3. Структура молекул семейства интерлейкина-1.

1.1.4. Механизмы внутри- и внеклеточного процессинга интерлейкина-1.

1.1.5. Рецепторы интерлейкина-1 как одно из звеньев регуляции его активности.

1.1.6. Трансдукция сигнала интерлейкина-1.

1.1.6.1. Классические пути трансдукции сигнала интерлейкина-1.

1.1.6.2. Сфингомиелиновый путь сигнальной трансдукции интерлейкина-1.

1.2. Интерлейкин-1 как эндогенный регулятор защитных функций организма и медиатор нейро-иммунных взаимодействий.

1.2.1. Биологические эффекты интерлейкина-1.

1.2.2. Роль интерлейкина-1 в активации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы.

1.2.3. Интерлейкин-1 при стрессе и патологии.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Общие условия работы.

2.2. Экспериментальные животные.

2.3. Модели экспериментального стресса.

2.4. Получение макрофагов из перитонеальной полости крыс и мышей и условия инкубации клеток.

2.5. Определение активности лимфоцит-активирующего фактора в инкубатах перитонеальных макрофагов.

2.6. Выделение лимфоцитов из периферической крови крыс по методу

А. Воушп (1968).

2.7. Постановка реакции бласттрансформации лимфоцитов периферической крови крыс и тимоцитов мышей.

2.8. Определение величины гуморального иммунного ответа.

2.8.1. Определение общих титров антител и титров IgG в сыворотке крови.

2.8.2. Определение антителообразующих клеток в селезенке.

2.9. Определение концентрации интерлейкина-1а в крови мышей методами радиоиммунологического и иммуноферментного анализа.

2.9.1. Определение концентрации интерлейкина-1а в плазме крови мышей радиоиммунологическим методом.

2.9.2. Определение концентрации интерлейкина-1а в сыворотке крови мышей иммуноферментным методом.

2.10. Определение концентрации кортикостерона в крови мышей и крыс.

2.11. Определение концентрации трииодтиронина и тироксина в сыворотке крови мышей.

2.12. Модели экспериментального повышения и понижения уровня кортикостерона в сыворотке крови мышей.

2.13. Методы оценки иммунопротективного действия препаратов интерлейкина- lß.

2.14. Определение аффинности связывания препаратов рекомбинантного интерлейкина-1 ß и ASND с рецепторами I и II типа к интерлейкину-1.

2.14.1. Клетки-мишени для связывания рекомбинантного интерлейкина-1 ß и

ASND.

2.14.2. Присоединение метки [1251] к рекомбинантному интерлейкину-1 ß.

2.14.3. Оценка аффинности связывания цитокинов-лигандов с рецепторами.

2.15. Методы сравнительного исследования биологической активности препаратов рекомбинантного интерлейкина-lß и ASND.

2.16. Определение влияния рекомбинантного интерлейкина-1 ß на активность нейтральной сфингомиелиназы в мембранах клеток коры головного мозга мышей.

2.16.1. Получение мембранной фракции Р2 из коры головного мозга мышей и синаптосом мозга крыс.

2.16.2. Определение удельной активности нейтральной сфингомиелиназы.

2.16.3. Оценка влияния рекомбинантного интерлейкина-lß и рецепторного антагониста интерлейкина-1 на активность нейтральной сфингомиелиназы

2.16.4. Определение комитогенного действия препаратов нейтральной сфингомиелиназы, сфингомиелина и церамида на пролиферацию тимоцитов мышей.

2.17. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Физиологическая роль интерлейкина-1 в реализации стресс-индуцированных изменений защитных функций организма.

3.1.1. Исследование продукции и биологического действия интерлейкина-1 при стрессорных воздействиях различной длительности и интенсивности.

3.1.1.1. Клеточно-молекулярные механизмы развития стрессорной реакции у мышей при ротационном и комбинированном воздействиях.

3.1.1.2. Клеточно-молекулярные механизмы развития стресс-индуцированной иммуносупрессии у крыс, вызванной острым охлаждением

3.1.2. Интерлейкин-1 и глюкокортикоидне гормоны, как взаимодействующие звенья в нейро-иммунорегуляторной цепи.

3.1.3. Иммунопротективные эффекты интерлейкина-1 р при стрессе и введении глюкокортикоидных гормонов в высоких дозах.

3.2. Взаимосвязь структуры и функции интерлейкина-1. Влияние модификации структуры интерлейкина-1 на аффинность его связывания с рецепторами и проявление биологической активности.

3.2.1. Особенности связывания рекомбинантного интерлейкина-1 (3, рецепторного антагониста интерлейкина-1 и ASND с рецепторами I и II типа на иммунокомпетентных клетках.

3.2.2. Влияние структурных изменений в молекуле интерлейкина-1 р на его физиологическую активность.

3.3. Анализ сфингомиелинового пути трансдукции сигнала интерлейкина-1Р в нервных клетках и его роли в механизмах развития стрессорной реакции.

3.3.1. Влияние интерлейкина-1Р на активность нейтральной сфингомиелиназы в клетках коры головного мозга мышей и роль рецептора I типа в инициации сфингомиелинового каскада.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АР-1 - активирующий белок

АОК - антителообразующие клетки

AT - антитела

Hsp-27 - белок теплового шока

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГК - гидрокортизон

ГГАКС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система

ДАГ - диацилглицерол

IgG - иммуноглобулин G

IkB - ингибиторные белки ядерного фактора NF-kB

ИЛ-1 - интерлейкиннИЛ-1 - нативный ИЛрИЛ-1 - рекомбинантный ИЛ

ИЛ-1ра - рецепторный антагонист ИЛпроИЛ-1 - предшественник ИЛ

ИГИФ - интерферон-у-индуцирующий фактор

IRAK - киназа, ассоциированная с рецептором ИЛ-11типа

JAK - киназа Janus

К-СМаза - кислая сфингомиелиназа

Кон А - конканавалин А

КРФ - кортикотропинреализующий фактор

Кс - кортикостерон

КСФ - колоние-стимулирующий фактор

ГГАКС - гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система

Г-КСФ - гранулоцитарный КСФ

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный КСФ

ЛАФ - лимфоцит-активирующий фактор

ЛПС - липополисахарид

ЛЭМ - лейкоцитарный эндогенный медиатор

МПД - минимальная пирогенная доза мпо - медиальная преоптическая область (переднего гипоталамуса)

МАП - митоген-активированная протеин(киназа)

Н-СМаза - нейтральная сфингомиелиназ

OVLT - Organum vasculosum laminae terminalis

ПГЕ2 - простагландин E

ПКС - протеинкиназа С

ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

STAT - сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции

СМФ - система мононуклеарных фагоцитов

ТРФ-ß - трансформирующий ростовый фактор-ß

Тз - трииодтиронин

Т4 . тироксин

FAN - фактор, ассоциированный с активацией Н-СМазы

ФНО - фактор некроза опухолей

ФРФ - фактор роста фибробластов

ФГА - фитогемагглютинин

ЦНС - центральная нервная система

ЦАПК - церамид-активированная протеинкиназа

ЦАПФ - церамид-активированная протеинфосфатаза цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

Сох 2 - циклооксигеназа

ЭБ - эритроциты барана

ЭП - эндогенный пироген

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интерлейкин-1 в молекулярных механизмах нейроиммунных взаимодействий»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Основным предметом иммунофизиологии, возникшей как научное направление в первой трети ушедшего века (С. Метальников, 1925, 1934), а окончательно сформировавшейся в научную дисциплину благодаря классическим работами преимущественно отечественных и американских авторов в его последней трети (Е.А. Корнева, Л.М. Хай, 1967; G.F. Solomon, 1969; G.F. Solomon et al, 1974; W. Pierpaoli, H.O. Besedovsky, 1975; Е.А. Корнева и соавт, 1978; E. Sorkin et al, 1981; J.E. Blalock, E.H. Smith, 1985; B.D. Jankovic, N.H. Spector, 1986; Е.А. Корнева, Э.К. Шхинек, 1988; J.E. Blalock, 1989, 1994; Е.А.Корнева, 1993; A.V. Turnbull, C.L. Rivier, 1999; E.A. Korneva et al, 2000), является изучение взаимодействия нервной и иммунной систем организма в норме и при различных видах патологии. Особеностью развития этой области теоретической и экспериментальной медицины в последние годы стало изучение все более тонких механизмов реализации этих взаимодействий - лиганд-рецепторных, сигнальных и генетических. Использование современных высокоточных и информативных экспериментальных методов позволило получить строгие факты, доказывающие двусторонние отношения нейроэндокринной и иммунной систем, а также сместить акценты исследований с получения экспериментального подтверждения возможности координирующего влияния нервной системы на функции иммунной, в сторону анализа эффектов и механизмов влияния процессов, происходящих в иммунной системе, на функции мозга. Именно поэтому равноправными партнерами термина «иммунофизиология» стали понятия «нейроиммуномодуляция» и «психонейроиммунология».

В реализации взаимодействия нервной и иммунной систем определяющую роль играют эндогенные биорегуляторы, в том числе глюкокортикоидные гормоны и иммуномодулирующие цитокины. Важнейшим медиатором иммуно-нейроэндокринных взаимодействий является цитокин интерлейкин-1 (ИЛ-1) - первый из открытых и охарактеризованных интерлейкинов, один из ключевых регуляторов защитных функций организма, инициирующий каскад реакций защиты, как врожденных, так и приобретенных. В последние полтора десятилетия установлено, что ИЛ-1 экспрессируется и обладает рецепторами не только на иммунокомпетентных и родственных им клетках, но и на клетках различных структур головного мозга, включая нейроны, а также активирует глюкокортикоидную функцию гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (И.О. Besedovsky et al, 1986; A. Bateman et al, 1989; Т. Bartfai, M. Schultzberg, 1993; E.B. De Souza, 1993; J. Bristulf, 1995; S.J. Hopkins, N.J. Rothwell, 1995; A.Y. Turnbull, C.L. Rivier, 1999; A.J. Dunn, 2000). В ЦНС именно ИЛ-lß является той формой цитокина, через которую он реализует свое биологическое действие.

Одной из наиболее адекватных моделей исследования роли ИЛ-1 во взаимодействии нервной и иммунной систем является экспериментальный стресс, поскольку важнейшим механизмом развития дисфункций иммунной системы при стрессе является нарушение иммуно-нейроэндокринных взаимодействий (Е.А. Корнева, Э.К. Шхинек, 1988; J.C. Buckingham, 1996; А. Takaki et al., 1998; D.A. Padgett et al., 1998). В настоящее время исследование физиологической роли ИЛ-1 в развитии защитных реакций при стрессе становится все более актуальным. Стрессорная реакция является составляющей любого патологического процесса, поэтому использование экспериментального стресса позволяет в определенной степени воспроизвести универсальную модель любой формы патологии. Кроме того, в последние годы подтверждается возможность не только негативного, подавляющего, но и активирующего эффекта стрессорных воздействий на защитные функции. (Б.А. Фролов и соавт., 1993; A.J. Dunn, 1993; R. Glaser et al, 1993; G.R. Acker et al, 1993; D.A. Padgett et al, 1998; G. Laue et al, 1998).

Вместе с тем, данные литературы, рассматривающие физиологическую роль ИЛ-1 в центральных и иммунологических механизмах развития стрессорной реакции, неоднозначны и часто носят противоречивый характер. Так, в качестве основного критерия участия цитокинов в развитии стрессорной реакции рассматривается их продукция и уровень в крови. Представляется целесообразным и перспективным комплексное исследование изменений продукции ИЛ-1, его лиганд-рецепторных взаимодействий с иммунокомпетентными и нервными клетками-мишенями и дальнейшей сигнальной транедукции цитокина в реализации стресс-индуцированных защитных реакций.

На современном этапе развития представлений о механизмах внутриклеточного проведения сигнала ИЛ-1, наибольший интерес вызывает сфингомиелиновый путь его сигнальной транедукции, как основной сигнальный механизм, обеспечивающий реализацию большинства биологических эффектов цитокина (R.N. Kolesnik, D.W. Golde, 1994; L.R. Ballou et al, 1996; S. Mathias et al, 1998). Тем не менее, этот путь транедукции сигнала ИЛ-1 изучается в основном в клеточных линиях лимфоцитов и фибробластов. Принципиально важным, но до настоящего времени практически неисследованным, является изучение возможности проведения сигнала ИЛ-1 по сфингомиелиновому пути в нервных клетках и его роли в механизмах взаимодействия нервной и иммуной систем.

Требует дальнейшего развития сложившаяся к настоящему времени концепция о двусторонних отношениях по типу обратной связи между ИЛ-1 и глюкокортикоидными гормонами (Н. Besedovsky et al, 1986; E.B. De Souza et al, 1993). Одним из ключевых, но малоизученных вопросов в исследовании этого аспекта проблемы нейро-иммунных взаимодействий, является определение характера влияния физиологических колебаний эндогенного уровня глюкокортикоидов на продукцию и биологические эффекты ИЛ-1.

Начавшееся в последние годы использование ИЛ-1 и его рецепторного антагониста в клинической практике, определяет актуальность исследования структурно-функциональных отношений в молекуле ИЛ-1 - влияния модификаций его структуры на проявления биологических эффектов, открывающее перспективу создания препаратов цитокинов с ограниченным спектром биологической активности.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы явилось исследование физиологической роли цитокина ИЛ-1 в молекулярных механизмах стресс-индуцированных изменений защитных функций организма, включающее анализ структурно-функциональных отношений и лиганд-рецепторных взаимодействий ИЛ-1 с иммунокомпетентными и нервными клетками-мишенями.

В задачи работы входило:

1. Сравнительное изучение интенсивности продукции лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ) перитонеальными макрофагами, концентрации в крови ИЛ-1 и его биологических эффектов на примере комитогенного действия на лимфоидные клетки, при стрессорных воздействиях различной природы и длительности.

2. Исследование взаимного модулирующего действия ИЛ-1 и глюкокортикоидных гормонов, как звеньев нейро-иммунорегуляторной цепи.

3. Изучение эффектов действия ИЛ-1(3 на гуморальный иммунный ответ при иммуносупрессии, вызванной стрессом и введением глюкокортикоидных гормонов в высокой дозе.

4. Анализ влияния структурных изменений в молекуле ИЛ-1р на аффинность его связывания с рецепторами I и II типа и проявление ключевых биологической свойств цитокина.

5. Идентификация и исследование трансдукции сигнала ИЛ-1Р по сфингомиелиновому пути в мембранах клеток коры головного мозга мышей и его участия в реакции организма на стресс.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведенное исследование позволило расшифровать новые клеточно-молекулярные механизмы взаимодействия нервной и иммунной систем, определяющие развитие стресс-индуцированных нарушений защитных функций организма. Впервые проведено комплексное сравнительное изучение изменения продукции ИЛ-1 иммунокомпетентными клетками, его лиганд-рецепторных взаимодействий с клетками-мишенями и дальнейшей сигнальной трансдукции цитокина в нервных клетках при стрессе. Сформулировано новое представление о том, что стрессорная реакция сопровождается продукцией ИЛ-1, но характер стресс-индуцированных защитных реакций, инициируемых ИЛ-1, определяется лиганд-рецепторными взаимодействиями ИЛ-1 с клетками-мишенями.

Получены новые данные о взаимном модулирующем действии ИЛ-1 и глюкокортикоидных гормонов, как взаимодействующих звеньев единой нейро-иммунорегуляторной цепи.

Оригинальный методический прием использования мутантных молекул рекомбинантного ИЛ-1Р - ДБЫБ - позволил установить особенности структурно-функциональных отношений в молекуле цитокина и постулировать необходимость целостности структуры для проявления всего спектра биологической активности ИЛ-1.

Приоритетный характер носят результаты исследования, доказывающие существование сфингомиелинового пути внутриклеточной трансдукции сигнала ИЛ-1Р в нервных клетках и необходимость интерлейкинового рецептора I типа для его реализации. Впервые установлено, что рецептор ИЛ-1 II типа не только выполняет функции регуляторной «ловушки» для цитокина, но также является ингибирующим типом рецептора. Полученные в работе новые данные о вовлечении трансдукции сигнала ИЛ-1Р в коре головного мозга по сфингомиелиновому пути в центральные механизмы развития стресс-индуцированных изменений функций иммунной системы, не имеют аналогов в мировой литературе.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Представленная работа, посвященная анализу важнейшего аспекта проблемы взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем в норме и при различных видах стресса - исследованию физиологической роли цитокина ИЛ-1 в лиганд-рецепторных и сигнальных механизмах этого взаимодействия, носит фундаментальный характер. Основное теоретическое значение работы состоит в раскрытии новых клеточно-молекулярных механизмов нейро-иммунных взаимодействий, включающих лиганд-рецепторные взаимодействия ИЛ-1 с иммунокомпетентными и нервными клетками-мишенями и трансдукцию сигнала ИЛ-1(3 по сфингомиелиновому пути, определяющих развитие стресс-индуцированных нарушений защитных функций организма.

Вместе с тем, проведенное исследование создает экспериментальный базис для разработки и внедрения новых диагностических и прогностических подходов в клинической практике. Интенсивность трансдукции сигнала ИЛ-1 по сфингомиелиновому пути является информативным показателем вектора изменений защитных реакций организма при стрессе, а его ключевой энзим - нейтральная сфингомиелиназа (Н-СМаза), в лимфоидных клетках может рассматриваться, как потенциальная мишень для тестирования активности фармацевтических препаратов, а в последующем - для фармакологической коррекции дисфункций иммунной системы.

Результаты исследования позволяют использовать изменение таких функциональных показателей, как интенсивность продукции ЛАФ и ИЛ-1 и их уровень в крови, а также комитогенное действие ИЛ-1 на пролиферацию лимфоидных клеток, в качестве маркеров тяжести патологического процесса и нарушения функций иммунной системы.

Проведенный в работе анализ влияния модификаций структуры ИЛ-ф на возможность проявления его ключевых биологических эффектов, вносит существенный вклад в перспективу создания препаратов цитокинов с ограниченным спектором физиологической активности для их использования в лабораторной и клинической практике.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Стрессорные воздействия на мышей (CBAxC57BL6)Fl и крыс Wistar, вызывающие развитие как иммуностимуляции, так и иммуносупрессии, индуцируют продукцию ИЛ-1 в составе ЛАФ и повышение его уровня, а также концентрации Кс в крови, но приводят к изменению эффекта действия ИЛ-1р на лимфоидные клетки, коррелирующее с изменением характера гуморального имунного ответа.

2. Развитие супрессии гуморального иммунного ответа, вызванной острым охлаждением крыс Wistar и комбинированным стрессорным воздействием на мышей-гибридов F1, сопровождается продукцией ЛАФ перитонеальными макрофагами, но снижением реакции этих клеток на стимуляцию убитыми Staphylococcus aureus in vitro и введение ЛПС in vivo, а также угнетением реакции бласттрансформации лимфоидных клеток (тимоцитов мышей и лимфоцитов периферической крови крыс) в ответ на комитогенное действие ИЛ-1 р.

3. Взаимное модулирующее действие ИЛ-1 и глюкокортикоидных гормонов проявляется в повышении уровня Кс в крови после внутрибрюшинного введения мышам и крысам рекомбинантного и нативного ИЛ-ip, а также в эффектах влияния физиологических колебаний эндогенного уровня глюкокортикоидов, вызванных адреналэктомией или внутрибрюшинным введением животным гидрокортизона, на продукцию и комитогенное действие ИЛ-1.

4. Внутрибрюшинное введение рекомбинантного и нативного ИЛ-ip оказывает протективное действие на развитие иммуносупрессии, вызванной Холодовым стрессом у крыс и введением глюкокортикоидных гормонов в высоких дозах у мышей.

5. Модификация структуры рекомбинантного ИЛ-lp человека - удаление 3-х аминокислот (серина, аспарагина и аспарагиновой кислоты) в положении 52-54 в его мутанте ASND, приводит к существенному изменению его связывания с рецептором I типа и вызывает частичную утрату мутантом ключевых биологических свойств цитокина: пирогенных, кортикотропных и комитогенных, а также его стимулирующего действия на активность Н-СМазы в мембранах клеток коры головного мозга мышей.

6. Рекомбинантный ИЛ-1(3 дозозависимо активирует Mg^-зависимую Н-СМазу в мембранной фракции Р2 коры головного мозга мышей и в синаптосомах мозга крыс, что свидетельствует о вовлечении сфингомиелинового каскада в трансдукцию сигнала ИЛ-ip в клетках коры головного мозга мышей и крыс.

7. При использовании мембран клеток коры головного мозга мышей, лишенных интерлейкинового рецептора I типа в результате геномных мутаций, установлено, что для инициации рИЛ-ip сфингомиелинового пути трансдукции его сигнала в нервных клетках, необходимо связывание цитокина с рецептором I типа, при условии сохранения функциональной активности его компонентов, включая акцессорный белок.

8. Препарат экзогенной Н-СМаза из Staph, aureus индуцирует реакцию бласттрансформации мышиных тимоцитов и воспроизводит одно из ключевых свойств ИЛ-1 - его комитогенный эффект, что подтверждает инициирующую роль фермента в проведении сигнала цитокина в клетку-мишень.

9. Комбинированный стресс у мышей, индуцирующий развитие иммносупрессии, приводит к подавлению активности Н-СМазы в Р2 фракции коры головного мозга, иммуностимулирующий ротационный стресс вызывает увеличение активности этого фермента. Трансдукция сигнала ИЛ-ip по сфингомиелиновому пути в клетках коры головного мозга вовлечена в центральные механизмы развития стресс-индуцированных изменений функций иммунной системы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Рыбакина, Елена Георгиевна

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальные стрессорные воздействия на мышей-гибридов (CBAxC57BL6)Fl: иммуностимулирующее ротационное (1 ч, 78 об/мин) и иммуносупрессирующее комбинированное (2 ч, 4-5° С, затем иммобилизация 18 ч, 20° С), индуцируют образование ЛАФ перитонеальными макрофагами, повышение концентрации ИЛ-1а и Кс в крови животных, но оказывают различное влияние на реакции бласттрансформации тимоцитов мышей в ответ на комитогенное действие ИЛ-1Р, которые коррелируют с изменениями характера гуморального иммунного ответа: происходит изменение эффектов действия ИЛ-1 на лимфоидные клетки-мишени.

2. Острое охлаждение крыс Wistar (20 мин, -20° С) и комбинированное стрессорное воздействие на мышей-гибридов F1, вызывающие супрессию гуморального иммунного ответа, индуцируют продукцию ЛАФ перитонеальными макрофагами, но снижают реакцию этих клеток на стимуляцию убитыми Staph, aureus in vitro и введение ЛПС in vivo, а также вызывают угнетение реакции бласттрансформации лимфоидных клеток (тимоцитов мышей и лимфоцитов периферической крови крыс) в ответ на комитогенное действие ИЛ-1 р.

3. Внутрибрюшинное введение мышам и крысам рекомбинантного и нативного ИЛ-ip приводит к повышению уровня Кс в крови животных, что подтверждает его кортикотропное действие. Падение уровня Кс в крови мышей, вызванное двусторонней адреналэктомией, или его повышение при внутрибрюшинном введении гидрокортизона в низкой дозе (0,3 мкг/г массы) индуцируют увеличение концентрации ИЛ- 1а в крови, продукцию ЛАФ макрофагами и (при адреналэктомии) стимуляцию реакции бластрансформации тимоцитов. При введении гидрокортизона в высокой дозе (50 мкг/г массы) происходит торможение продукции ЛАФ макрофагами и пролиферативной активности тимоцитов.

4. Внутрибрюшинное введение мышам препарата нИЛ-1(3 до иммунизации ЭБ предотвращает угнетающее действие гидрокортизона (50 мкг/г) на интенсивность гуморального иммунного ответа. Предварительное (до имммунизации и аппликации стресса) внутрибрюшинное введение крысам препарата рИЛ-1р (50 пг/100 г) предотвращает развитие иммуносупрессии, индуцированной острым Холодовым стрессом: введение ИЛ-1Р оказывает протективное действие в отношении обусловленной глюкокортикоидами и стресс-индуцированной иммуносупрессии.

5. Установлена различная аффинность связывания трех цитокинов - рИЛ-1р, ИЛ-1ра и мутанта АЗИБ 52-54 - с интерлейкиновыми рецепторами I и II типа на клеточных линиях ЕЬ-4 и Ла^. Рецепторный антагонист ИЛ-1 связывается с высокой аффиностью с рецептором I типа, и низкой - с рецептором II типа. Препараты рИЛ-1р и АБКБ связываются с одинаковой аффинностью с рецептором II типа, для рецептора I типа она выше у рИЛ-1р - модификация структуры рекомбинантного ИЛ-1р человека в мутанте АБКБ приводит к изменению степени его связывания с рецептором I (но не II) типа на клетке-мишени.

6. Модификация структуры ИЛ-1Р приводит к изменению его биологических эффектов - частичной утрате мутантом АБИЭ ключевых биологических свойств цитокина: пирогенных, кортикотропных и комитогенных, его стимулирующего действия на активность Н-СМазы в мембранах клеток коры головного мозга мышей. Мутант А8ЫБ, введенный внутрибрюшинно мышам в дозе 0,05 нг/г, не изменяет количества АОК в селезенке, но вызывает снижение титров АТ в сыворотке крови.

7. Во фракции Р2 коры головного мозга мышей и в синаптосомах мозга крыс рИЛ-1Р дозозависимо активирует мембранную, Mg -зависимую Н-СМазу, то есть сфингомиелиновый каскад является одним из путей трансдукции сигнала ИЛ-1Р в клетках коры головного мозга мышей и крыс.

8. Активация Н-СМазы не происходит при воздействии рИЛ-ф на мембраны нервных клеток мышей, дефицитных по рецептору ИЛ-1 I типа, при инкубации рИЛ-1р вместе с рецепторным антагонистом ИЛ-1, а также при использовании антител 4С5 к акцессорному белку интерлейкинового рецептора I типа. Для инициации рИЛ-1р сфингомиелинового каскада в мембранах клеток коры головного мозга, необходимо связывание цитокина с рецептором I типа, при условии сохранения функциональной активности его компонентов, включая акцессорный белок, то есть проведение сигнала ИЛ-1(3 в нервных клетках по сфингомиелиновому пути опосредовано рецептором I типа.

9. В мембранной фракции Р2 коры головного мозга мышей, лишенных интерлейкиновых рецепторов I типа в результате геномных мутаций, но экспрессирующих рецепторы II типа, рИЛ-1р в концентрациях 10"10 - 10"11 М подавляет активность Н-СМазы. Рецепторы ИЛ-1 II типа опосредуют ингибирующее действие цитокина на активность Н-СМазы в мембранах клеток коры головного мозга.

10. Экзогенная Н-СМаза в дозах 10"3 и 10"4 специальных единиц индуцирует реакцию бласттрансформации мышиных тимоцитов и воспроизводит комитогенный эффект ИЛ-1, что подтверждает инициирующую роль фермента в проведении сигнала цитокина в клетку-мишень.

11. Комбинированный стресс у мышей, индуцирующий развитие иммносупрессии, приводит к подавлению активности Н-СМазы в Р2 фракции коры головного мозга, иммуностимулирующий ротационный стресс вызывает увеличение активности этого фермента.

12. Сфингомиелиновый путь трансдукции сигнала ИЛ-1Р в клетках коры головного мозга вовлечен в центральные механизмы развития стресс-индуцированных

218 изменений функций иммунной системы. Изменение интенсивности сфингомиелинового каскада, инициированного ИЛ-1(3, является информативным показателем вектора изменений защитных реакций организма при стрессе.

13. Стрессорные воздействия различной природы, стимулирующие или угнетающие функции иммунной системы, индуцируют продукцию ИЛ-1, для проявления физиологической активности которого необходима целостная молекула цитокина.

14. Изменение лиганд-рецепторных взаимодействий ИЛ-10 с нервными и иммунокомпетентными клетками-мишенями, включающих связывание его с рецепторами и внутриклеточную трансдукцию сигнала по сфингомиелиновому пути, является одним из клеточно-молекулярных механизмов реализации взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем организма.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Рыбакина, Елена Георгиевна, 2001 год

1. Александров В.Н. Патология иммунной системы при травме // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1982. - № 6. - С. 45-47.

2. Андреенко Г.В., Ашмарин И.П., Карабасова М.А., Рыбакина Е.Г., Козинец И.А., Лютова Л.В. Влияние интерлейкина-1 на животных с дисфункцией фибринолиза // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова. 1989. - Т. 75. - С. 194-199.

3. Ашмарин И.П., Обухова М.Ф. Регуляторные пептиды, функционально-непрерывная совокупность // Биохимия. 1986. - Т. 21. - Вып. 4. - С. 531-545.

4. Белявский Е.М., Лесников В.А. Центральные механизмы температурного гомеостаза// Физиология человека. 1979. - №. 5. - С. 818-826.

5. Ботерашвили Н.М., Рыбакина Е.Г., Шанин С.Н., Козинец И.А., Сорокина М.Н., Иванова В.В. Продукция и эффекты действия интерлейкина-1 при серозных и гнойных менингитах у детей // Медицинская иммунология. 2000. - Т. 2. - № 3. -С. 321-328.

6. Веселкин П.Н. Изменение уровня температурного гомеостаза в норме и патологии // Гомеостаз / Под ред. П.Д. Горизонтова. М.: Медицина, 1976. - С. 363-375.

7. Вязов О.В., ХоджаеваШ.Х. Руководство по иммунологии. М. : Медицина, 1973. - С. 3-13.

8. Гончаров Н.П., Воронцов В.И., Кация Г.В., Антоничев A.B., Бутнев В.Ю. Изучение гормональной функции надпочечников и половых желез в опытах на обезьянах // Вестн. АМН СССР. 1977. - Т. 8. - С. 13-20.

9. Ефремов О.М., Сорокин A.B. О роли цАМФ в механизмах лихорадочной реакции // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 1981. - Т. 91. - № 4. - С. 416-418.

10. Зимин Ю.И. Стресс: иммунологические аспекты // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Иммунология. М., 1983. - Вып. 12.-С. 41-45.

11. Ивантер Э.В., Коросов A.B. Основы биометрии. Введение в статистический анализ биологических явлений и процессов. Петрозаводск: Изд-во ПГУ, 1992. - 168 с.

12. Кетлинский С. А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ, 1992. - 256 с.

13. Кокряков В.Н. Биология антибиотиков животного происхождения. СПб.: Наука, 1999. - 162с.

14. Корнева Е.А., Хай Л.М. О влиянии раздражения различных структур промежуточного мозга на протекание иммунологических реакций // Физиол. журн. СССР. 1967. - Т. 53. - № 1. - С. 42-47.

15. Корнева Е.А., Клименко В.М., Шхинек Э.К. Нейрогуморальное обеспечение иммунного гомеостаза. Л., 1978. - 175 с.

16. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Л.: Наука, 1988. - 251 с.

17. Корнева Е.А. Иммунофизиология как новое научное направление: предпосылки и история развития // Иммунофизиология / Под ред. Е.А. Корневой. СПб.: Наука, 1993.-С. 11-36.

18. Лесников В.А. О некоторых механизмах центрального управления развитием лихорадочной реакции // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1975. - № 4. -С.55-58.

19. Лесникова М.П., Рыбакина Е.Г., Козинец И.А., Фомичева Е.Е., Шхинек Э.К. Сочетанное действие глюкокортикоидных гормонов и интерлейкина 1 на развитие иммунного ответа // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1990. - № 2. - С. 422-424.

20. Ломакин М.С., Арцимович Н.Г. Интерлейкины как биологически активные полифункциональные молекулы // Успехи совр. биол. -1991. № 1. - С. 34-41.

21. Михайлова A.A., Василенко A.M. Роль миелопептидов в нейроиммуномодуляции // Иммунофизиология / Под ред. Е.А. Корневой. СПб.: Наука, 1993. - С. 592-605.

22. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1987. - 416 с.

23. Симбирцев A.C., Рыбакина Е.Г., Перумов Н.Д., Сорокин A.B., Кетлинский С.А. Сравнительная характеристика пирогенного и лимфоцитактивирующего действия интерлейкина-1 кролика // Иммунология. 1987. - № 4. - С. 79-82.

24. Симбирцев A.C., Конусова В.Г., Варюшина Е.А., Кетлинский С.А. Взаимосвязанные этапы транскрипции гена, трансляции мРНК и секреции биологически активного интерлейкина-1 ß моноцитами периферической крови человека // Иммунология. 1995. - № 3. - С. 48-51.

25. Симбирцев A.C. Биология семейства интерлейкина-1 человека // Иммунология. -1998.-№3,-С. 9-17.

26. Сорокин A.B. Пирогены. Л., 1965. - 210 с.

27. Сорокин A.B., Ефремов О.М., Уханова И.К., Элькина O.A., Рыбакина Е.Г. О влиянии лейкоцитарного пирогена на проницаемость сосудов для коллоидного красителя // Патол. физиология и эксперим. терапия 1978. - Вып. 2. - С. 29-33.

28. Сорокин A.B., Ефремов О.М., Панина Л.П. Механизмы повышения белков острой фазы в крови при воспалении // Патол. физиология и эксперим. терапия 1988. -№5.-С. 41-44.

29. Фомичева Е.Е., Гущин Г.В. Уровень глюкокортикоидов и гуморальный иммунный ответ у адреналэктомированных крыс // Физиол. журн. СССР. им. И.М.Сеченова. -1981.-Т. 67.-С. 1882-1885.

30. Фрейдлин И.С. Иммунная система и ее дефекты: руководство для врачей. СПб.: Полисан, 1998. - ИЗ с.

31. Фролов Б.А., Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Функции иммунной системы при действии чрезвычайных раздражителей на организм // Иммунофизиология / Под ред. Е.А. Корневой. СПб.: Наука, 1993. - С. 418-464.

32. Шанин С.Н., Рыбакина Е.Г., Фомичева Е.Е., Козинец И.А., Корнева Е.А. Иммунопротективные эффекты фитопрепаратов-адаптогенов при стрессе // Int. J. Immunorehabilitation. 1999. - № 11. - P. 48-57.

33. Шхинек Э.К. Функции иммунной системы и активность различных популяций иммунокомпетентных клеток при действии экзогенных гормонов // Иммунофизиология / Под ред. Е.А.Корневой. СПб.: Наука, 1993. - С.369-388.

34. Шхинек Э.К. Циклические нуклеотиды в реализации влияний глюкокортикоидных гормонов на функции иммунной системы // Иммунофизиология / Под. ред. Е.А.Корневой. СПб.: Наука, 1993. - С. 519-533.

35. Aarden L.A., Brunner T.K., Cerottini J.-C. et al. Revised nomenclature for antigennospecific T-cell proliferation and helper factors (letter) // J. Immunol.- 1979. -Vol.123. P.2928-2929.

36. Acker G.R., Moyna N.H., Robertson R.J., Rabin B.S. The effect of exercise-stress on the immune system in young healthy fit and sedentary individuals // Research perspectives in phychoneuroimmunology IV. Boulder, Colorado, 1993. - Abstract № 78.

37. Adam D., Wiegmann K., Adam-Klages S., Ruff A., Kronke M. A novel cytoplasmic domain of the p55 tumor necrosis factor receptor initiates the neutral sphingomyelinase pathway // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - № 24. - P. 14617-14622.

38. Adam-Klagers S., Adam D., Wiegmann K., Struve S., Kolanus W., Schneider-Mergener J., Kronke M. FAN, a novel WD-repeat protein, couples the p55 TNF-receptor to neutral sphingomyelinase // Cell. 1996. - Vol. 86. - P. 937-947.

39. Adashi E.Y. The potential role of IL-1 in the ovulatory process: an evolving hypothesis // J. Reprod. Immunol. 1997. - Vol. 35. - P. 1-9.

40. Alcami A., Smith G.L. A soluble receptor for interleukin-1 P encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of virus modulation of the host response to infection // Cell. 1992. -Vol. 71.-P. 153-167.

41. Anderson K.V. Toll signalling pathways in the innate immune response // Current opinion in immunology. 2000. - Vol. 12. - P. 13-19.

42. Andersson J., Bjork L., Dinarello C.A., Towbin H., Andersson U. Lipopolysaccharide induces human interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 production in the same cell // Eur. J. Immunol. 1992. - Vol. 22. - P. 2617-2623.

43. Andersen L.S., Petersen J., Bendtzen K. Production of Interleukin-1 (IL)-lp, IL-1 receptor antagonist and IL-10 by blood mononuclear cells in chronic artritis // Cytokine. 2000. - Vol. 12. - № 1. - P.62-68.

44. Arend W.P., Welqus H.G., Thompson R.C., Disenberg S.P. Biological properties of recombinant human monocyte-derived interleukin 1 receptor antagonist // J. Clin. Invest.- 1990. Vol. 85. - P. 1694.

45. Arend W.P. Interleukin-1 receptor antagonist a new member of the interleukin-1 family //J. Clin. Invest. - 1991. - Vol. 88. - P. 1445-1451.

46. Arend W.P. Interleukin-1 receptor antagonist // Adv. Immunol. 1993. - Vol. 54. - P. 167-227.

47. Atkins E, Bodel P. Fever // New Engl. J. .Med. 1972. - Vol. 286. - P.27-34.

48. Auron P.E., Webb A.C., Rosenwasser L.J., Mucci S.F., Rich A., Wolff S.M., Dinarello C.A. Nucleotide sequence of human monocyte interleukin-1 precursor cDNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. - № 24. - P. 7907-7911.

49. Auron P.E. The interleukin 1 receptor: ligand interactions and signal transduction // Cytokine Growth Factor Rev. 1998. - Vol. 9. - № 3-4. - P. 221-237.

50. Ballou L.R., Laulederkind S.J.F., Rosloniec E.F., Raghow R. Ceramide signalling and the immune response // Biochim. Biophys. Acta. 1996. - Vol. 1301. - P. 273-287.

51. Bankers-Fulbright J.L., Kalli K.R., McKean D J. Interleukin-1 signal transduction // Life Sci. 1996. - Vol. 59.-№ 2. - P. 61-83.