Иммуногенные свойства белковых частиц, капсулированных в полисахаридную матрицу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Лялина Татьяна Сергеевна

• Лялина Татьяна Сергеевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Лялина Татьяна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение вакцинации для профилактики вирусных инфекций

1.2 Типы противовирусных вакцин

1.3 Механизмы презентации антигенов Т-клеткам

1.4 Вакцины на основе частиц

1.4.1 Материалы для создания партикулярных вакцин

1.4.2 Влияние размера и заряда частиц на захват антиген-презентирующими клетками

1.5 Хитозан и его применение в биомедицинских исследованиях

1.5.1 Хитин и хитозан

1.5.2 Характеристики хитозана, их влияние на биологическую активность и изменение свойств путем химической модификации

1.6 Применение частиц на основе хитозана и других полимеров для разработки вакцин

1.6.1 Влияние упаковки антигена в нано- и микроструктуры на длительность защитного эффекта и иммунного ответа

1.6.2 Влияние метода иммунизации

1.6.3 Введение агонистов паттерн-распознающих рецепторов,

1.6.4 Влияние размера и заряда частиц на эффективность ответа

Глава II. Экспериментальная часть

2.1 Реагенты и растворители

2.2 Лабораторное оборудование

2.3 Выделение белков и исследование биологической активности лактоферрина

2.3.1 Выделение Р-лактоглобулина (ЛГ) из сыворотки коровьего молока

2.3.2 Выделение лактоферрина,

2.3.3 Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.3.4 ВЭЖХ анализ белков молочной сыворотки и оценка чистоты выделенного лактоферрина

2.3.5 Исследование аутентичности белка методом двойной радиальной иммунодиффузии

2.3.6 Получение апо-лактоферрина

2.3.7 Метод атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС)

2.3.8 Метод количественного колориметрического определения содержания железа в белке по реакции с динатриевой солью 3-(2-пиридил)-5,6-бис(4-сульфофенил)-1,2,4-триазина (феррозином) без депротеинизации

2.3.9 Определение рибонуклеазной активности лактоферрина

2.3.10 Метод ингибирования перекисного окисления липидов

2.3.11 Определение антимикробной и антимикотической активности лактоферрина

2.4 Подготовка образцов хитозана и синтез его производных

2.4.1 Переосаждение хитозана

2.4.2 Кислотный гидролиз хитозана

2.4.3 Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана

2.4.4 Высокоэффективная гель-проникающая хроматография

2.4.5 Определение степени дезацетилирования хитозана (СД) методом кондуктометрического титрования

2.4.6 Определение степени дезацетилирования хитозана и степени замещения его производных методом протонного ядерного магнитного резонанса (1Н-КМЯ)

2.4.7 Синтез ^гексаноилхитозана

2.4.8 Синтез ^сукцинилхитозана

2.4.9 Синтез №[2-(3)-(додец-2'-ен-1'-ил)сукцинил]хитозана,

2.5 Формирование и характеристика частиц

2.5.1 Формирование частиц на основе лактоферрина и сукцинилхитозана методом термической обработки

2.5.2 Получение производных хитозана и белков, а также частиц меченых флуоресцеином изотиоцианатом

2.5.3 Определение белка по методу Бредфорд

2.5.4 Определение содержания белка в частицах методом флуоресцентной спектрофотометрии

2.5.5 Высвобождение белка из частиц

2.5.6 Метод динамического светорассеяния (ДСР)

2.5.7 Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

2.6 Исследования in vitro

2.6.1 Исследование цитотоксичности частиц и производных хитозана

2.6.2 Исследование захвата производных хитозана и частиц клетками методом проточной цитометрии

2.6.3 Анализ захвата частиц клетками методом конфокальной микроскопии

2.7 Исследования in viyom

2.7.1 Иммунизация мышей

2.7.2 Иммуноферментный анализ

2.7.3 Исследование клеточного состава лимфатических узлов и селезенки

2.7.4 Анализ пролиферации клеток

Глава III. Результаты и их обсуждение

3.1 Выделение белков из молочной сыворотки

3.2 Исследование биологических свойств полученного препарата лактоферрина

3.2.1 Рибонуклеазная активность ЛФ

3.2.2 Определение антимикробной активности лактоферрина

3.2.3 Исследование антиоксидантной активности лактоферрина методом ингибирования перекисного окисления липидов

3.3 Получение низкомолекулярного хитозана и синтез производных

хитозана

3.4 Получение и физико-химические свойства частиц содержащих белок, инкапсулированный в полисахаридную матрицу на основе хитозана и его производных

3.4.1 Формирование частиц методом контролируемой термической обработки

3.4.2 Введение полисахаридов в состав частиц

3.4.3 Влияние ПЭГ на частицы

3.4.4 Введение незаряженных полисахаридов в частицы

3.4.4 Характеристика частиц методами атомно-силовой микроскопии и динамического светорассеяния

3.4.5 Высвобождение антигена из частиц in vitro

3.5 Исследование взаимодействия частиц с клетками макрофагов

3.6 Внутриклеточный транспорт производных хитозана

3.7 Внутриклеточный транспорт частиц

3.8 Токсичность частиц

3.9 Исследование иммунного ответа

3.9.1 Гуморальный иммунный ответ

3.9.2 Характеристика типа клеточного иммунного ответа

3.7.3 Механизмы кросс-презентации СХ-ГМ-ЛФ и СХ-ЛФ-Х

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуногенные свойства белковых частиц, капсулированных в полисахаридную матрицу»

Актуальность проблемы

Вакцинация - это основной способ профилактики вирусных инфекций. Защита от внеклеточных патогенов обеспечивается за счет выработки иммунной системой антител, распознающих поверхностные белки патогенов. Для защиты от внутриклеточных инфекций обязательным является формирование Т-клеточного цитотоксического ответа. Для активации цитотоксических Т-клеток требуется внутриклеточный процессинг антигена через протеасомный путь, для чего необходимо попадание белков антигена в цитозоль АПК. Задача доставки антигенов в протеасомный путь АПК сейчас решается с помощью использования ослабленных патогенов (живые аттенуированные вакцины), что у людей с ослабленным иммунитетом может вызвать заболевание. В настоящее время используются аттенуированные вирусные вакцины против полиомиелита, кори, свинка, краснухи и ветряной оспы. Субъединичные вакцины характеризуются отсутствием патогенности, низкой реактогенностью и возможностью легкой стандартизации, но не обладают достаточной иммуногенностью.

Поиск безопасных вакцин, обеспечивающих эффективное формирование цитотоксического ответа и не представляющих опасности перенесения заболевания, является актуальной медико-биологической задачей.

Одним из возможных шагов в направлении повышения эффективности вакцин является разработка вакцин на основе нано- и микрочастиц (так называемые «партикулярные вакцины»), о чем свидетельствуют результаты многочисленных исследований [1].

Партикулярные вакцины могут сочетать в себе иммуномодулирующие свойства, свойства целевой доставки антигена и работать как адъювант [2,3]. Крупный размер таких систем способствует их проникновению в клетку путем фагоцитоза, что является преимуществом, так как фагосомам отводится ведущая роль в процессе кросс-презентации.

В качестве таких композиций широко применяются липосомы[4,5]; наночастицы на основе PGA, PLGA, PLA [6,7]; а также частицы на основе хитозана и его производных [8,9].

Хитозан и его производные являются перспективным материалом для разработки нано- и микроразмерных систем для доставки антигенов и лекарств. Часто такие частицы используются для мукозальной иммунизации пероральным или интраназальным путем, что связано с мукоадгезивными свойствами хитозана. Благодаря этому, частицы на основе хитозана и его производных увеличивают продолжительность пребывания антигена на слизистых оболочках и их поглощение [6,8].

Цель работы: Разработать системы доставки белковых антигенов на основе природных полисахаридов и охарактеризовать тип иммунного ответа на капсулированный антиген.

Задачи исследования:

1. Оптимизация методики получения наночастиц методом термической обработки белка и их характеристика.

2. Модификация белковых наночастиц природными полисахаридами: хитозаном и его производными, а также векторными молекулами (галактоманнан) и их характеристика.

3. Анализ взаимодействия полученных наночастиц с эпителиальными и макрофагальными клетками in vitro.

4. Индукция гуморального иммунного ответа полученными наночастицами in vivo в мышиной модели.

5. Анализ клеточного иммунного ответа на наночастицы методом ex vivo.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение вакцинации для профилактики вирусных инфекций

Вакцинация - основной способ профилактики вирусных инфекций. В течение двух веков, начиная со времен Дженнера, вакцинация или преднамеренная стимуляция иммунного ответа путем иммунизации, достигла значительных успехов. Массовые программы вакцинации принятые в развитых странах привели к практически полному искоренению некоторых болезней, ассоциируемых с высокой заболеваемостью и смертностью, таких, например, как оспа.

Согласно докладу Global Vaccine Action Plan 2011 - 2020, представленному ВОЗ, за период с 2000 по 2010 год благодаря вакцинации в сочетании с другими мерами здравоохранения и социальной защиты показатель детской смертности снизился с 9,6 млн. до 7,6 млн., несмотря на значительно повысившуюся за этот период рождаемость. [10,11]. Такие успехи говорят о целесообразности и перспективах вакцинации. Однако, в настоящее время, существует немало заболеваний, против которых не существует вакцин, кроме того, требуется повышать эффективность существующих вакцин и снижать их стоимость, что особенно важно для развивающихся стран, в которых смертность от инфекционных заболеваний все ещё остаётся высокой.

Ключевым принципом вакцинации является антиген-специфичная активация иммунного ответа. Существуют патогены, для защиты от которых достаточно выработки антител (например, вирус гриппа), однако, для таких инфекций как малярия, туберкулез или ВИЧ антитела не являются надежной защитой. В связи с этим, особое внимание при разработке вакцин уделяется активации цитотоксического ответа для уничтожения пораженных возбудителем клеток.

Для медленно реплицирующихся вирусов вакцинация аттенуированными патогенами в настоящее время не используется, что связано с отсутствием прямой

угрозы жизни и здоровью человека в зрелом возрасте. Однако медленно реплицирующиеся вирусы, такие как, например, герпесвирусы, оказывают значительное влияние на организм человека в пренатальный период, а также в пожилом и старческом возрасте.

Внутриутробное инфицирование герпесвирусами приводит к ряду осложнений, среди которых пороки сердца, задержка развития, поражения ЦНС, гемморагический синдром, слепота, глухота, эпилепсия, микро/гидроцефалия, поражение печени и почек. В зависимости от стадии развития плода внутриутробное инфицирование может заканчиваться остановкой развития и гибелью плода, младенческой смертностью, а также инвалидностью [12]. Показано участие вируса простого герпеса I типа в развитии болезни Альцгеймера [13]. Развитие нейродегенеративных заболеваний в пожилом возрасте значительно снижает качество жизни больных и их семей, а также требует больших финансовых затрат на поддержание жизни и здоровья таких больных. Особую актуальность данная проблема приобретает вследствие широкого распространения персистирующих вирусных инфекций. Так, носительство цитомегаловируса наблюдается уже у 60% детей 6-летнего возраста и возрастает в течение жизни до 90% у людей 80 лет.

Эффективность вакцинации против таких хронических латентных инфекций остается низкой. Так, по состоянию на 2009 год эффективность вакцины против цитомегаловируса составила не более 50 %, то есть половина вакцинированных оказалась впоследствии заражена. Вакцины против вируса Эпштейна-Барр не существует вовсе. Соответственно, разработка подходов к созданию вакцины против персистирующих патогенов является актуальной задачей здравоохранения.

1.2 Типы противовирусных вакцин

На сегодняшний день существует несколько типов противовирусных вакцин, которые имеют свои достоинства и недостатки [14].

1. Цельновирионные вакцины:

а) Живые вакцины (штаммы дикого типа, аттенуированные вакцины):

«+»:

активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный иммунный ответ;

относительная дешевизна, так как для вакцинации требуется небольшая доза вируса, поскольку он размножается в зараженном организме; «-»:

сохраняют некоторый уровень остаточной патогенности; биологическая нестабильность при хранении и использовании; б) Инактивированные вакцины:

«+»:

риск заражения при вакцинации минимален;

более просты в хранении, по сравнению с живыми вакцинами;

«-»:

уступают живым вирусам в отношении индукции Т-клеточного ответа; для эффективной индукции гуморального ответа необходимо вводить относительно большие дозы вакцины с определенной периодичностью, что может приводить с течением времени к аллергизации организма;

при инактивации часть антигенов может полностью или частично разрушаться, что также снижает качество вакцины;

повышенные требования безопасности при производстве вакцин, в связи с чем, повышается стоимость производства;

2. Субъединичные: безопасны;

легко поддаются стандартизации;

«-»:

не могут индуцировать долговременный иммунитет, вследствие чего необходимы повторные вакцинации;

часто для таких вакцин требуются носители. 3. ДНК-вакцины

«+»:

• стимулируют как гуморальный, так и цитотоксический иммунный

ответ;

«-»:

• относительно слабый ответ;

• не доказана безопасность.

Большинство используемых в настоящее время противовирусных вакцин имеют в своей основе либо аттенуированные живые, либо инактивированные вирусы. Живые аттенуировнные вакцины наиболее эффективны: они стимулируют большее число эффекторных механизмов, включая активацию СЭ4+ Т-клеток и цитотоксических СЭ8+ Т-клеток. В настоящее время используются аттенуированные вирусные вакцины против полиомиелита, кори, паротита, краснухи и ветряной оспы.

Инактивированные вирусы не способны продуцировать белки в цитозоле, поэтому пептиды из вирусных антигенов не представляются молекулами ГКГС I класса.

Субъединичные вакцины являются перспективными вследствие отсутствия патогенности, низкой реактогенности и возможности более легкой

стандартизации, однако они не обладают достаточной иммуногенностью. Эффективность таких вакцин обусловлена, в большей мере стимуляцией выработки антител, чем клеточно-опосредованного иммунитета.

Для создания вакцин, предупреждающих распространение некоторых вирусов, таких как ВПЧ, вирус герпеса, ВИЧ и т.п., требуется развитие цитотоксического иммунного ответа. В связи с этим важным направлением в исследованиях является разработка безопасной вакцины, позволяющей наряду с гуморальным ответом также индуцировать и цитотоксический иммунный ответ. Перспективным направлением для повышения эффективности вакцин является разработка вакцин на основе нано- и микрочастиц, о чем свидетельствуют результаты многочисленных исследований [1,8,15,16].

1.3 Механизмы презентации антигенов Т-клеткам

Т-клетки узнают антигены, представленные на поверхности собственных клеток организма. Эти антигены происходят либо из патогенов реплицирующихся в клетке, таких как вирусы, либо от патогенов и их продуктов, которые были интернализованы клетками путем эндоцитоза из внеклеточной жидкости [17].

Существует два классических пути презентации антигена Т-клеткам. При попадании экзогенного антигена в везикулярный компартмент АПК, задействуется первый путь, в котором презентация антигена происходит с помощью молекул ГКГС класса II. В процессе презентации, макрофаги и незрелые дендритные клетки захватывают экзогенный антиген путем фагоцитоза, либо путем рецептор-опосредованного эндоцитоза в случае B-клеток. Образующаяся фагосома (эндосома) сливается с лизосомой с образованием фаголизосомы, при этом ферменты лизосом расщепляют захваченные белки на пептидные фрагменты. Эти пептиды молекулами ГКГС класса II выносятся на поверхность АПК, где распознаются Т-хелперами (CD4+ Т-клетки)

Второй путь презентации протекает в цитоплазме ядерных клеток и затрагивает эндогенные антигены (синтезированные внутри клетки вирусные

белки, белки внутриклеточных бактерий и паразитов, собственные поврежденные белки). Такие белки подвергаются расщеплению на пептиды с помощью мультисубъединичного комплекса протеаз, называемого протеасомой. Специальный белковый комплекс - транспортер, ассоциированный с процессингом антигенов (ТАР), переносит пептиды в эндоплазматический ретикулум, где они ассоциируются с ГКГС класса I и вместе с ним попадают на поверхность клетки. Молекулы ГКГС класса I представляют антиген CD8+ Т-лимфоцитам.

Антиген, содержащийся в инактивированной или субъединичной вакцине, не способен самостоятельно проникать и реплицироваться в цитоплазме, и является для клеток экзогенным. Поэтому преимущественным является путь процессинга антигена через ГКГС класса II. Однако существуют механизмы, в результате которых экзогенный антиген может быть представлен CD8+ Т-клеткам. В 1976 году Бвуап описал взаимодействие экзогенных пептидов с молекулами ГКГС класса I, с последующей антигензависимой индукцией CD8+ Т-клеточного ответа [18]. Также показано, что захват макрофагами клеток, подвергшихся апоптозу, приводил к развитию цитотоксического иммунного ответа. Механизм кросс-презентации в настоящее время не изучен, однако существует несколько гипотез [19] (Рисунок 1):

A. Прямой перенос пептидов из инфицированной клетки в цитоплазму

дендритных клеток;

Б. Механизм рециркуляции молекул ГКГС I;

B. ЭПР-фагосомальная гипотеза;

Г. Транспорт через эндосомальную мембрану;

Д. Связывание экзосом, секретируемых инфицированной клеткой.

Рисунок 1 - Различные модели кросс-презентации антигенов.

Адаптировано из [19]. Описание приведено в тексте

Согласно этой ЭПР-фагосомальной гипотезе, презентация экзогенного антигена молекулами ГКГС класса I происходит при непосредственном участии ЭПР и фагосом [20,21]. Считается, что дендритные клетки, в отличие от макрофагов обладают более высокой способностью к кросс-презентации. В качестве возможной причины этого называется более высокое значение рН внутри фагосом дендритных клеток, которое поддерживается с использованием ряда механизмов [22,23]. При попадании антигена в фагосомы с высоким рН, в противоположность фаголизосомам, происходит лишь его частичная деградация, вследствие малого количества и ингибирования активности ферментов. Фрагменты белков транспортируются в цитоплазму и расщепляются убиквитин-протеасомной системой (ЭПР-ассоциированная деградация). Было показано

присутствие в структуре фагосомальной мембраны белков ЭПР, отвечающих за транслокацию поврежденных белков из ЭПР в цитоплазму [24]. Предполагается, что это становится возможным благодаря слиянию ЭПР с фагосомой и образованию компартмента, способного самостоятельно осуществлять перенос антигенов с помощью TAP и последующую загрузку пептидных фрагментов на молекулы ГКГС класса I.

Альтернативным путем кросс-презентации является процессинг антигена комплексом лизосомальных/эндосомальных протеаз до конечных пептидов и их загрузка на молекулы ГКГС I класса прямо в фагосоме [20].

1.4 Вакцины на основе частиц

Внимание исследователей в настоящее время сосредоточено на создании композиций, способных не только индуцировать сильный и длительный гуморальный ответ, но и клеточный ответ, основанный на активации CD4+ и CD8+ Т-клеток. Такие композиции, часто упоминаются в литературе под названием «партикулярные вакцины». Они могут сочетать в себе иммуномодулирующие свойства, свойства целевой доставки антигена и работать как адъювант [2,3]. Крупный размер таких систем способствует их проникновению в клетку путем фагоцитоза, что является преимуществом, так как фагосомам отводится ведущая роль в процессе кросс-презентации.

В качестве таких композиций широко применяются липосомы [4,5]; наночастицы на основе PGA, PLGA, PLA [6,7]; а также частицы на основе хитозана и его производных [8,9].

1.4.1 Материалы для создания партикулярных вакцин

Частицы на основе липидов

Липосомы - сферические пузырьки, состоящие из фосфолипидного бислоя, заполненные водной средой, размер которых составляет от 20-50 нм до нескольких микрометров. Антиген может быть инкапсулированным в липосомальную оболочку, связанным с поверхностью липосомы или встроенным

15

в липидный бислой. Липосомы наиболее часто, по сравнению с системами на основе эмульсий, нано- и микрочастиц и иммуностимулирующих комплексов, применяются как системы для доставки вакцин [25]. Сообщается о проведении клинических исследований липосом, использующихся для доставки терапевтических противоопухолевых вакцин [26,27], терапевтической вакцины против ВИЧ [28], против гриппа [29]и др.

Иммуностимулирующие комплексы (ISCOMs) - коллоидные системы доставки антигенов размером около 40 нм, состоящие из матрицы на основе сапонинов, холестерина и фосфолипидов и включенного в нее антигена. Интересно, что сапонины являются токсичными [30], однако, в комплексе с холестерином их токсичность значительно снижается и усиливается иммуностимулирующая способность [31]. Эффективность

иммуностимулирующих комплексов в отношении индукции гуморального и клеточного иммунного ответа показана в экспериментах in vivo при иммунизации парентерально и интраназально [32,33]. На животных моделях и в клинических исследованиях были протестированы различные вакцины на основе ISCOMATRIX®[34]. Такие комплексы показывают высокий адъювантный эффект даже при использовании очень низких доз антигена.

Вакцины на основе полимерных частиц

Частицы на основе полимеров молочной и гликолевой кислот (PLA, PLGA) имеют долгую историю применения для различных медицинских целей. Использование частиц на основе PLGA для доставки антигена связано с пролонгированным высвобождением антигена, что может позволить проводить однократную вакцинацию взамен многократной. Разными научными группами было показано, что такие частицы эффективно фагоцитируются АПК в экспериментах in vitro\l]A in vivo[35].

Хитозан и его производные являются следующими по популярности материалами для создания нано- и микрочастиц для доставки антигена. Часто

такие частицы используются для мукозальной иммунизации пероральным или интраназальным путем, что связано с мукоадгезивными свойствами хитозана. Благодаря этому, частицы на основе хитозана и его производных увеличивают продолжительность пребывания антигена на слизистых оболочках и их поглощение [6,8].

Микро- и наногели чувствительные к рН обладают высоким потенциалом для применения в доставке антигенов. Такие материалы деградируют в кислой среде фагосом антиген-презентирующих клеток, благодаря чему повышается осмотическое давление, что вызывает разрушение мембраны фагосом и высвобождение белкового антигена в цитоплазму [36].

1.4.2 Влияние размера и заряда частиц на захват антиген-презентирующими клетками

Коммерчески доступные вакцины, содержащие адъюванты, в большей мере способствуют формированию антител и Тх2 ответа, что обеспечивает защиту от внеклеточных возбудителей. В то же время, для защиты от многих вирусных и бактериальных инфекций требуется активация иммунного ответа, обеспечивающего уничтожение зараженных клеток организма. Защиту от внутриклеточных инфекций или трансформированных собственных клеток обеспечивают цитотоксические CD8+ Т-клетки и Тх1. CD8+ Т-клетки при активации антигеном посредством молекул главного комплекса гистосовместимости I класса, экспрессирующегося во всех ядерных клетках, дифференцируются в цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) которые убивают пораженные клетки, выделяя перфорины и гранзимы, а также рекрутируя и активируя дополнительные эффекторные клетки (нейтрофилы и макрофаги) с помощью выделения цитокинов и хемокинов [37], [38]. Для активации цитотоксических лимфоцитов при иммунизации антигеном требуется выполнение двух условий [39]: процессинг антигена по механизму кросс-презентации, а также лицензирование для взаимодействия ДК с ЦТЛ. В процессе лицензирования в

случае возникновения вирусной инфекции происходит взаимодействие Толл-подобных рецепторов (TLR) со специфическими лигандами. При введении субъединичной вакцины такого процесса не происходит вследствие отсутствия лиганда для TLR. Поэтому для стимуляции иммунного ответа в состав композиций вводятся также лиганды TLR (неметилированные участки CpG ДНК, липополисахариды, двухцепочечная РНК, поли I:C и др.) [40].

Ключевым параметром для активации иммунного ответа является поглощение антигена антиген-презентирующими клетками. Макрофаги и дендритные клетки относятся к группе мононуклеарных фагоцитирующих клеток и имеют размер от 10 до 18 мкм. Макрофаги способны захватывать антигены разных размеров: вирусы, бактерии и даже такие крупные объекты как опухолевые клетки, а также частицы различной природы, соизмеримые с размером антигена, что было показано в экспериментах in vitro [41,42]. «Судьба» антигена в составе нано- или микрообъекта, поглощенного АПК, существенным образом зависит от свойств его носителя, который может «направлять» антиген.

Путь, по которому полимерные частицы попадают в АПК, зависит от размера частиц. На рисунке 2 приведены основные пути транспорта в клетки.

Рисунок 2 - Механизмы эндоцитоза [43]

Для частиц размером более 0,4 мкм, с использованием ингибитора полимеризации актина - цитохалазина Д, на культурах макрофагов и дендритных клеток, было показано их актин-зависимое проникновение [44-46], в то время как интернализация частиц размером 100 и 200 нм носила актин-независимый характер [46].

В работе [47] приведены результаты исследования посвященного влиянию размера частиц на активацию макрофагов in vitro. Авторы исследовали частицы, полученные из хитозана размером 400 нм, 1.9 мкм и 4.8 мкм. Согласно данным конфокальной микроскопии и проточной цитометрии все частицы интернализовались макрофагальными клетками линии J774A через 6 часов инкубации. Причем методами конфокальной микроскопии и трансмиссионной электронной микроскопии было показано, что интернализация наночастиц

19

происходила преимущественно эндосомально-лизосомальным путем, в то время как колокализация микрочастиц с лизосомами отсутствовала. Было показано, что с уменьшением размера частиц снижается уровень ИЛ-10, препятствующего активности макрофагов, их функционирования в роли АПК, по сравнению с контролем, а то же время для всех частиц существенно повышался уровень ИЛ-12 и ИФН-у, стимулирующих дифференцировку Тх1. Авторы отмечают, что частицы с размером 4,8 мкм не вызывают активации, что также может использоваться для разработки неиммуногенных носителей.

Kanchan и Panda в работе [48] исследовали PLA-частицы с размерами 200600 нм и 2-8 мкм. Методом проточной цитометрии с блокированием внеклеточной флуоресценции трипановым синим было показано, что микрочастицы практически не попадали внутрь клеток, в отличие от наночастиц, а оставались ассоциированными с их поверхностью в течение длительного времени, что, как отмечают сами авторы, может происходить не только вследствие крупного размера частиц, но и из-за гидрофобного характера PLA. Следует заметить, что концентрация антител класса IgG в крови иммунизированных животных при увеличении размера частиц повышалась, что показано и другими исследованиями [49,50]. Кроме того, крупный размер частиц, вероятно, приводит к пролонгированному высвобождению антигена по мере деградации частиц, что может способствовать усилению и пролонгации гуморального ответа при однократной иммунизации. При иммунизации микрочастицами был показан высокий уровень синтеза ИЛ-4, что говорит об активации B-клеток и стимуляции синтеза антител. Частицы размером около 400 нм вызвали повышение синтеза ИФН-у, свидетельствующего об активации Т-клеток.

В работе [51] также были исследованы частицы разного размера, на основе хитозана: 300 нм, 1 мкм и 3 мкм. Авторами было показано на клетках линии RAW264.7, что интернализация антигена является процессом, зависящим от размера частиц, времени инкубации и концентрации антигена. При достижении

пороговой концентрации антигена в среде при любом размере частицы эффективность захвата частиц макрофагами снижается. Максимальная интернализация наблюдалась при размере частиц 1 мкм.

Наряду с размером, важное значение имеет и заряд частиц. Не с соавторами методом флуориметрии показал, что более заряженные частицы эффективнее захватываются клетками, чем частицы с низким по абсолютному значению зарядом. Однако, при сравнении по знаку заряда, было выявлено, что положительно заряженные частицы эффективнее захватываются макрофагами, чем отрицательно заряженные [52]. Другие данные были получены в работе [53] при исследовании внутриклеточного трафика производных хитозана и наночастиц, полученных на их основе. Методом проточной цитометрии было также показано более эффективное связывание положительно заряженного производного хитозана и частиц с клетками различных клеточных линий. Тем не менее, методом конфокальной микроскопии выявлено, что положительно заряженные производные и частицы в течение длительного времени остаются ассоциированными с клеточной мембраной, в то время как отрицательно заряженные - в течение короткого времени проникают в клетку. Кроме того, отличается и путь частиц внутри клетки, авторы делают вывод о внутриклеточном сортинге заряженных производных и частиц, целью которого является нейтрализация заряда чужеродного объекта. Отрицательно заряженные частицы проходят по эндосомально-лизосомальному пути, в то время как производные и частицы с положительным зарядом попадают в митохондрии, внутренняя среда которых имеет щелочную реакцию. Авторами также сообщается о токсичности положительно заряженных частиц, приводящей к деполяризации митохондрий, что согласуется с данными других авторов полученных с положительно заряженными частицами хитозана размером 60 нм [54]. Zaki с соавторами [55] также сообщают об отличном от лизосомального пути положительно заряженных частиц хитозана, в то время как хитозановые частицы, модифицированные гиалуроновой кислотой имеющие отрицательный заряд, показали частичную

колокализацию с лизосомами. В то же время, авторы делают вывод о том, что интернализация как положительно, так и отрицательно заряженных частиц происходит по клатрин-зависимому механизму и, в основном, не по эндосомальному пути. Обобщая данные различных исследований, Fröhlich с соавторами делают вывод о более предпочтительном поглощении фагоцитирующими клетками отрицательно заряженных частиц [56].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лялина Татьяна Сергеевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zhao L. et al. Nanoparticle vaccines. // Vaccine. 2014. V. 32. № 3. P. 327-337.

2. Ferreira S. a, Gama F.M., Vilanova M. Polymeric nanogels as vaccine delivery systems. // Nanomedicine. 2013. V. 9. № 2. P. 159-173.

3. De Temmerman M.-L. et al. Particulate vaccines: on the quest for optimal delivery and immune response. // Drug Discov. Today. 2011. V. 16. № 13-14. P. 569-582.

4. Wang N. et al. Using procedure of emulsification-lyophilization to form lipid A-incorporating cochleates as an effective oral mucosal vaccine adjuvant-delivery system (VADS). // Int. J. Pharm. 2014. V. 468. № 1-2. P. 39-49.

5. Badiee A. et al. The role of liposome size on the type of immune response induced in BALB/c mice against leishmaniasis: rgp63 as a model antigen. // Exp. Parasitol.. 2012. V. 132. № 4. P. 403-409.

6. Moon H.-J. et al. Mucosal immunization with recombinant influenza hemagglutinin protein and poly gamma-glutamate/chitosan nanoparticles induces protection against highly pathogenic influenza A virus. // Vet. Microbiol. 2012. V. 160. № 3-4. P. 277-289.

7. Waeckerle-Men Y. et al. Encapsulation of proteins and peptides into biodegradable poly(D,L-lactide-co-glycolide) microspheres prolongs and enhances antigen presentation by human dendritic cells. // Vaccine. 2006. V. 24. № 11. P. 18471857.

8. Amidi M. et al. N-trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles loaded with influenza subunit antigen for intranasal vaccination: biological properties and immunogenicity in a mouse model. // Vaccine. 2007. V. 25. № 1. P. 144-153.

9. Slütter B. et al. Conjugation of ovalbumin to trimethyl chitosan improves immunogenicity of the antigen. // J. Control. Release. 2010. V. 143. № 2. P. 207214.

10. Global Vaccine Action Plan 2011-2020. World Health Organization. 2013.

11. Dellepiane N., Wood D. Twenty-five years of the WHO vaccines prequalification programme (1987-2012): lessons learned and future perspectives //Vaccine. 2015.

V. 33. №. 1. P. 52-61.

12. Prober C.G., Arvin A.M. Perinatal Viral Infections // Eur. J. Clin. Microbiol. 1987. V. 6. № 3. P. 245-261.

13. Lin W.-R. et al. Herpesviruses in brain and Alzheimer's disease. // J. Pathol. 2002. V. 197. № 3. P. 395-402.

14. Щелкунов С.Н. Противовирусные вакцины :□□ от Дженнера до наших дней // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 7. C. 43-50.

15. Sexton A. et al. A protective vaccine delivery system for in vivo T cell stimulation using nanoengineered polymer hydrogel capsules. // ACS Nano. 2009. V. 3. № 11. P. 3391-3400.

16. Heffernan M.J. et al. The stimulation of CD8+ T cells by dendritic cells pulsed with polyketal microparticles containing ion-paired protein antigen and poly(inosinic acid)-poly(cytidylic acid). // Biomaterials. 2009. V. 30. № 5. P. 910918.

17. Janeway A.C. et al. Immunobiology: the immune system in health and disease. New York: Garland Publishing. 2001.

18. Bevan M. J. Cross-priming for a secondary cytotoxic response to minor H antigens with H-2 congenic cells which do not cross-react in the cytotoxic assay //The Journal of experimental medicine. 1976. V. 143. №. 5. С. 1283-1288.

19. Groothuis T.A.M., Neefjes J. The many roads to cross-presentation. // J. Exp. Med. 2005. V. 202. № 10. P. 1313-1318.

20. Blanchard N., Shastri N. Topological journey of parasite-derived antigens for presentation by MHC class I molecules // Trends Immunol. 2010. V. 31. № 11. P. 414-421.

21. Villadangos J.A., Heath W.R., Carbone F.R. Outside looking in: the inner workings of the cross-presentation pathway within dendritic cells. // Trends Immunol. 2007. V. 28. № 2. P. 45-47.

22. Savina A. et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. // Cell. 2006. V. 126. № 1. P. 205-218.

23. Bougneres L. et al. A role for lipid bodies in the cross-presentation of phagocytosed antigens by MHC class I in dendritic cells. // Immunity. 2009. V. 31. № 2. P. 232-244.

24. Houde M. et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation // Nature. 2003. V. 425. № September. P. 402-406.

25. Correia-Pinto J. F., Csaba N., Alonso M. J. Vaccine delivery carriers: insights and future perspectives //International journal of pharmaceutics. 2013. V. 440. №. 1. P. 27-38.

26. Neelapu S.S. et al. Human autologous tumor-specific T-cell responses induced by liposomal delivery of a lymphoma antigen // Clin. Cancer Res. 2004. V. 10. P. 8309-8317.

27. Butts C. et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25): phase IIB randomized, multicenter, open-label trial // J Cancer Res Clin Oncol. 2011. V. 137. P. 1337-1342.

28. Román V.R.G. et al. Therapeutic vaccination using cationic liposome-adjuvanted HIV type 1 peptides representing HLA-supertype-restricted subdominant T cell epitopes: safety, immunogenicity, and feasibility in Guinea-Bissau. // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2013. V. 29. № 11. P. 1504-1512.

29. Glück U., Gebbers J. O., Glück R. Phase 1 evaluation of intranasal virosomal influenza vaccine with and without Escherichia coli heat-labile toxin in adult volunteers //Journal of virology. 1999. V. 73. №. 9. P. 7780-7786.

30. Podolak I., Galanty A., Sobolewska D. Saponins as cytotoxic agents: a review //Phytochemistry Reviews. 2010. V. 9. №. 3. P. 425-474.

31. Skene C.D., Sutton P. Saponin-adjuvanted particulate vaccines for clinical use // Methods. 2006. V. 40. № 1. P. 53-59.

32. Sjölander A. et al. Immune responses to ISCOM® formulations in animal and primate models // Vaccine. 2001. V. 19. № 17-19. P. 2661-2665.

33. Hu K. F., Lôvgren-Bengtsson K., Morein B. Immunostimulating complexes (ISCOMs) for nasal vaccination //Advanced drug delivery reviews. 2001. V. 51. №. 1. P. 149-159.

34. Kersten G., Crommelinb D.J.. Liposomes and ISCOMs // Vaccine. 2003. V. 21. № 9-10. P. 915-920.

35. Newman K.D. et al. Uptake of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) microspheres by antigen-presenting cells in vivo. // J. Biomed. Mater. Res. 2002. V. 60. № 3. P. 480-486.

36. Wilson J.T. et al. PH-responsive nanoparticle vaccines for dual-delivery of antigens and immunostimulatory oligonucleotides // ACS Nano. 2013. V. 7. P. 3912-3925.

37. Shresta S. et al. How do cytotoxic lymphocytes kill their targets? //Current opinion in immunology. 1998. V. 10. №. 5. P. 581-587.

38. Harty J.T., Bevan M.J. Responses of CD8(+) T cells to intracellular bacteria. // Curr. Opin. Immunol. 1999. V. 11. P. 89-93.

39. Foged C., Hansen J., Agger E. M. License to kill: Formulation requirements for optimal priming of CD8+ CTL responses with particulate vaccine delivery systems //European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2012. V. 45. №. 4. P. 482-491.

40. Silva A.L. et al. Poly-(lactic-co-glycolic-acid)-based particulate vaccines: Particle uptake by dendritic cells is a key parameter for immune activation // Vaccine. 2015. V. 33. P. 847-854.

41. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Москва: Мир, 2000. 592 c.

42. dos Santos T. et al. Quantitative assessment of the comparative nanoparticle-uptake efficiency of a range of cell lines. // Small. 2011. V. 7. № 23. P. 33413349.

43. Xiang S. D. et al. Pathogen recognition and development of particulate vaccines: does size matter? //Methods. 2006. V. 40. №. 1. P. 1-9.

44. Elamanchili P. et al. Characterization of poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) based nanoparticulate system for enhanced delivery of antigens to dendritic cells. //

Vaccine. 2004. V. 22. № 19. P. 2406-2412.

45. Thiele L. et al. Evaluation of particle uptake in human blood monocyte-derived cells in vitro. Does phagocytosis activity of dendritic cells measure up with macrophages? // J. Control. Release. 2001. V. 76. № 1-2. P. 59-71.

46. Geiser M. et al. Ultrafine Particles Cross Cellular Membranes by Nonphagocytic Mechanisms in Lungs and in Cultured Cells // Environ. Health Perspect. 2005. V. 113. № 11. P. 1555-1560.

47. Yue H. et al. Particle size affects the cellular response in macrophages //European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2010. V. 41. №. 5. P. 650-657.

48. Kanchan V., Panda A.K. Interactions of antigen-loaded polylactide particles with macrophages and their correlation with the immune response. // Biomaterials. 2007. V. 28. № 35. P. 5344-5357.

49. Gutierro I. et al. Size dependent immune response after subcutaneous, oral and intranasal administration of BSA loaded nanospheres //Vaccine. 2002. V. 21. №. 1.P. 67-77.

50. Katare Y.K., Muthukumaran T., Panda A.K. Influence of particle size, antigen load, dose and additional adjuvant on the immune response from antigen loaded PLA microparticles // Int. J. Pharm. 2005.

51. Koppolu B., Zaharoff D.A. The effect of antigen encapsulation in chitosan particles on uptake, activation and presentation by antigen presenting cells // Biomaterials. 2013. V. 34. № 9. P. 2359-2369.

52. He C. et al. Effects of particle size and surface charge on cellular uptake and biodistribution of polymeric nanoparticles //Biomaterials. 2010. V. 31. №. 13. P. 3657-3666.

53. Zubareva A.A. et al. Intracellular sorting of differently charged chitosan derivatives and chitosan-based nanoparticles. // Nanoscale. 2015. V. 7. № 17. P. 7942-7952.

54. Xia T. et al. Cationic polystyrene nanosphere toxicity depends on cell-specific endocytic and mitochondrial injury pathways. // ACS Nano. 2008. V. 2. № 1. P.

85-96.

55. Zaki N.M., Nasti A., Tirelli N. Nanocarriers for cytoplasmic delivery: cellular uptake and intracellular fate of chitosan and hyaluronic acid-coated chitosan nanoparticles in a phagocytic cell model. // Macromol. Biosci. 2011. V. 11. № 12. P. 1747-1760.

56. Fröhlich E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles //Int J Nanomedicine. 2012.V. 7. P. 5577-5591.

57. Hillaireau H., Couvreur P. Nanocarriers' entry into the cell: relevance to drug delivery // Cell. Mol. Life Sci. 2009. V. 66. P. 2873-2896.

58. Raghuvanshi R.S. et al. Improved immune response from biodegradable polymer particles entrapping tetanus toxoid by use of different immunization protocol and adjuvants // Int. J. Pharm. 2002. V. 245. P. 109-121.

59. Thomann-Harwood L.J. et al. Nanogel vaccines targeting dendritic cells: Contributions of the surface decoration and vaccine cargo on cell targeting and activation // J. Control. Release. 2013. V. 166. P. 95-105.

60. Михайлов С.Н., Варламов В.П. Хитозан - биополимер с уникальными свойствами // Хитозан / ed. Скрябин К.Г., Михайлов С.Н., Варламов В.П. Москва: Центр "Биоинженерия". 2013. C. 5-17.

61. Хитин и хитозан: природа, получение, применение / ed. Варламов В.П., Немцев С.В., Тихонов В.Е. г. Щелково: Российское Хитиновое Общество. 2010. 292 c.

62. Northcote D.H. The biology and chemistry of the cell walls of higher plants, algae, and fungi // Int. Rev. Cytol. 1963. V. 14. P. 223-265.

63. Bartnicki-Garcia S., Nickerson W.J. Isolation, composition, and structure of cell walls of filamentous and yeast-like forms of Mucor rouxii // Biochim. Biophys. Acta. 1962. V. 58. № 1. P. 102-119.

64. Kreger D.R. Observations on cell walls of yeasts and some other fungi by X-ray diffraction and solubility tests // Biochim. Biophys. Acta. 1954. V. 13. P. 1-9.

65. Sashiwa H. et al. Chemical modification of chitosan . Part 15 : Synthesis of novel

chitosan derivatives by substitution of hydrophilic amine using N-carboxyethylchitosan ethyl ester as an intermediate // Carbohydr. Res. 2003. V. 338. P. 557-561.

66. Jayakumar R. et al. Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials — A short review // Carbohydr. Polym. 2010. V. 82. № 2. P. 227232.

67. No H.K. et al. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // Int. J. Food Microbiol. 2002. V. 74. № 1-2. P. 6572.

68. Zheng L.-Y., Zhu J.-F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weights // Carbohydr. Polym. 2003. V. 54, № 4. P. 527-530.

69. Younes I. et al. Influence of acetylation degree and molecular weight of homogeneous chitosans on antibacterial and antifungal activities. // Int. J. Food Microbiol. 2014. V. 185. P. 57-63.

70. Крыжановская E. B. и др. Получение низкомолекулярного хитозана и изучение его антимикробных свойств //Достижения науки и техники АПК. 2008. №. 11.

71. Kulikov S. et al. Molecular weight and pH aspects of the efficacy of oligochitosan against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) // Carbohydr. Polym. 2012. V. 87, № 1. P. 545-550.

72. Куликов С.Н. и др. Роль структуры в биологической активности хитозана // Вестник казанского технологического университета. 2007. Т. 6. С. 11-16.

73. Lehr C.M. et al. In vitro evaluation of mucoadhesive properties of chitosan and some other natural polymers // Int. J. Pharm. 1992. V. 78. № 1. P. 43-48.

74. He P., Davis S.S., Illum L. In vitro evaluation of the mucoadhesive properties of chitosan microspheres // Int. J. Pharm. 1998. V. 166. № 1. P. 75-88.

75. Leithner K., Bernkop-Schnurch A. Chitosan and Derivatives for Biopharmaceutical Use: Mucoadhesive Properties // Chitosan-based systems for biopharmaceuticals: delivery, targeting and polymer therapeutics. 2012. P. 159125

76. Rao S.B., Sharma C.P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential // J. Biomed. Mater. Res. 1997. V. 34. № 1. P. 21-28.

77. Malette W.G. et al. Chitosan: A New Hemostatic // Ann. Thorac. Surg. 1983. V. 36. № 1. P. 55-58.

78. Vikhoreva G.A. et al. Preparation and anticoagulant activity of a low-molecular-weight sulfated chitosan // Carbohydr. Polym. 2005. V. 62. № 4. P. 327-332.

79. Kaminski K. et al. Chitosan derivatives as novel potential heparin reversal agents. // J. Med. Chem. 2010. V. 53. № 10. P. 4141-4147.

80. Nishimura K. et al. Immunological activity of chitin and its derivatives // Vaccine. 1984. V. 2. № 1. P. 93-99.

81. Bueter C.L. et al. Chitosan but Not Chitin Activates the Inflammasome by a Mechanism Dependent upon Phagocytosis // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. № 41. P. 35447-35455.

82. Sorlier P. et al. Preparation and development of anti-chitosan antibodies // J. Biomed. Mater. Res. 2003. V. 67A. № 3. P. 766-774.

83. VandeVord P.J. et al. Evaluation of the biocompatibility of a chitosan scaffold in mice // J. Biomed. Mater. Res. 2002. V. 59. № 3. P. 585-590.

84. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология // Учебник. Москва: "Медицина". 2000. 432 c.

85. Svirshchevskaya E. V et al. Mucoadjuvant properties of lipo- and glycoconjugated derivatives of oligochitosans. // Eur. J. Med. Chem. 2009. V. 44. № 5. P. 20302037.

86. Хантимирова Л.М. и др.. Сравнительная оценка иммуногенности охарактеризованных препаратов на основе хитозана и других адъювантов в составе инактивированных вакцин против гриппа // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. № 1(86). С. 86-92.

87. Boonyo W. et al. Chitosan and trimethyl chitosan chloride (TMC) as adjuvants for inducing immune responses to ovalbumin in mice following nasal administration //

J. Control. Release. 2007. V. 121. № 3. P. 168-175.

88. Vasiliev Y.M. Chitosan-based vaccine adjuvants: incomplete characterization complicates preclinical and clinical evaluation. // Expert Rev. Vaccines. 2015. V. 14. № 1. P. 37-53.

89. Scherließ R. et al. In vivo evaluation of chitosan as an adjuvant in subcutaneous vaccine formulations. // Vaccine. 2013. V. 31. № 42. P. 4812-4819.

90. Zhu B.D. et al. Chitosan microspheres enhance the immunogenicity of an Ag85B-based fusion protein containing multiple T-cell epitopes of Mycobacterium tuberculosis. // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007. V. 66. № 3. P. 318-326.

91. Neimert-Andersson T. et al. Evaluation of safety and efficacy as an adjuvant for the chitosan-based vaccine delivery vehicle ViscoGel in a single-blind randomised Phase I/IIa clinical trial. // Vaccine. 2014. V. 32. № 45. P. 5967-5974.

92. Reed S.G., Orr M.T., Fox C.B. Key roles of adjuvants in modern vaccines // Nat. Med. 2013. V. 19. № 12. P. 1597-1608.

93. Slobbe L. et al. A prolonged immune response to antigen delivered in poly ( £ -caprolactone) microparticles // Immunol. Cell Biol. 2003. V. 81. P. 185-191.

94. Nagamoto T. et al. Novel chitosan particles and chitosan-coated emulsions inducing immune response via intranasal vaccine delivery // Pharm. Res. 2004. V. 21. № 4. P. 671-674.

95. Sayin B. et al. TMC-MCC (N-trimethyl chitosan-mono-N-carboxymethyl chitosan) nanocomplexes for mucosal delivery of vaccines // Eur. J. Pharm. Sci. 2009. V. 38. № 4. P. 362-369.

96. Slütter B. et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen // Vaccine. 2010. V. 28. № 38. P. 6282-6291.

97. Bal S.M. et al. Adjuvanted, antigen loaded N-trimethyl chitosan nanoparticles for nasal and intradermal vaccination: Adjuvant- and site-dependent immunogenicity in mice // Eur. J. Pharm. Sci. 2012. V. 45. № 4. P. 475-481.

127

98. Salman H.H., Irache J.M., Gamazo C. Immunoadjuvant capacity of flagellin and mannosamine-coated poly(anhydride) nanoparticles in oral vaccination // Vaccine. 2009. V. 27. № 35. P. 4784-4790.

99. Slutter B., Jiskoot W. Dual role of CpG as immune modulator and physical crosslinker in ovalbumin loaded N-trimethyl chitosan (TMC) nanoparticles for nasal vaccination // J. Control. Release. 2010. V. 148. № 1. P. 117-121.

100. Wendorf J. et al. A comparison of anionic nanoparticles and microparticles as vaccine delivery systems. // Hum. Vaccin. 2008. V. 4. № 1. P. 44-49.

101. Gou M. et al. Preparation of mannan modified anionic PCL-PEG-PCL nanoparticles at one-step for bFGF antigen delivery to improve humoral immunity // Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2008. V. 64. № 1. P. 135-139.

102. Joshi V.B., Geary S.M., Salem A.K. Biodegradable Particles as Vaccine Delivery Systems: Size Matters // AAPS J. 2013. V. 15. № 1. P. 85-94.

103. Thomas C., Gupta V., Ahsan F. Influence of surface charge of PLGA particles of recombinant hepatitis B surface antigen in enhancing systemic and mucosal immune responses // Int. J. Pharm. 2009. V. 379. № 1-2. P. 41-50.

104. Costa Lima S.A. et al. Crucial CD8+ T-lymphocyte cytotoxic role in amphotericin B nanospheres efficacy against experimental visceral leishmaniasis // Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. 2014. V. 10. № 5. P. e1021-e1030.

105. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

106. Mazurier J., Spik G. Comparative study of the iron-binding properties of human transferrins: I. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin // Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1980. P. 399-408.

107. Gamzazade A.I. et al. Investigation of the hydrodynamic properties of chitosan solutions // Acta Polym. 1985. V. 36. № 8. P. 420-424.

108. Yamaguchi R. et al. Preparation of partially N-succinylated chitosans and their cross-linked gels // Carbohydr. Reseach. 1981. V. 88. P. 172-175.

109. Tikhonov V.E. et al. Amphiphilic N-[2(3)-(dodec-2'-en-1'-yl)succinoyl]chitosan:

Synthesis and properties // React. Funct. Polym. 2008. V. 68. № 2. P. 436-445.

110. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

111. Denuziere A. et al. Chitosan-chondroitin sulfate and chitosan-hyaluronate polyelectrolyte complexes: biological properties // Biomaterials. 1998. V. 19. № 14. P. 1275-1285.

112. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods. 1983. V. 65. № 1-2. P. 55-63.

113. Бакулин А.В. и др. Использование хитозана для выделения Р-лактоглобулина из смеси белков молочной сыворотки // Биотехнология. 2011. № 1. С. 34-41.

114. Бакулин А.В. и др. Использование хитозана ракообразных в технологии переработки молочной сыворотки // Рыбпром. 2010. № 4. С. 64-67.

115. Курченко В.П. и др. Выделение лактоферрина из женского, козьего и коровьего молока различными методами аффинной хроматографии // Труды БГУ. 2011. Т. 6, № 1. С. 86-96.

116. Garcia-Montoya I.A. et al. Lactoferrin a multiple bioactive protein: An overview // Biochim. Biophys. Acta 2012. V. 1820. № 3. P. 226-236.

117. Furmanski B.Y.P. et al. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity // J. Exp. Med. 1989. V. 170. № 2. P. 415-429.

118. Devi A.S., Das M.R., Pandit M.W. Lactoferrin contains structural motifs of ribonuclease // Biochim. Biophys. Acta. 1994. № 1205. P. 275-281.

119. Ye X.Y. et al. Radical scavenging activities of the iron-binding protein lactoferrin from bovine milk // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. V. 32. P. 235-241.

120. Jenssen H., Hancock R. Antimicrobial properties of lactoferrin // Biochimie. 2009. V. 91. № 1. P. 19-29.

121. Arnold R.R., Brewer M., Gauthier J.J. Bactericidal activity of human lactoferrin:

sensitivity of a variety of microorganisms // Infect. Immun. 1980. V. 28. № 3. P. 893-898.

122. Viejo-Di-az M., Andres M.T., Fierro J.F. Effects of human lactoferrin on the cytoplasmic membrane of Candida albicans cells related with its candidacidal activity // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2004. V. 42. № 2. P. 181-185.

123. Britigan B.E. et al. Stimulated human neutrophils limit iron-catalyzed hydroxyl radical formation as detected by spin-trapping techniques // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. № 36. P. 17026-17032.

124. Борзенкова Н., Балабушевич Н., Ларионова Н. Лактоферрин: физико-химические свойства, биологические функции, системы доставки, лекарственные препараты и биологически активные добавки (обзор) // Биофармацевтический журнал. 2010. Т. 2, № 3.С. 3-19.

125. Gutteridge J.M.C. et al. Inhibition of lipid peroxidation by the iron-binding protein lactoferrin // Biochem. J. 1981. V. 199, № 1. P. 259-261.

126. Курганов Б.И. Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков // Успехи биологической химии. 2002. Т. 42. С. 89-138.

127. Hoffmann M.A.M., van Mil P.J.J.M. Heat-induced aggregation of P-lactoglobulin: role of the free thiol group and disulfide bonds // J. Agric. Food Chem. 1997. V. 45. № 8. P. 2942-2948.

128. Xiong Y.L., Dawson K. a., Wan L. Thermal aggregation of P-lactoglobulin: effect of pH, ionic environment, and thiol reagent // J. Dairy Sci. 1993. V. 76. № 1. P. 70-77.

129. Биохимия. Учебник для ВУЗов. / Под ред. Северина Е.С. Москва: ГЭОТАР-Медиа. 2005. 784 с.

130. Jones O.G., McClements D.J. Recent progress in biopolymer nanoparticle and microparticle formation by heat-treating electrostatic protein-polysaccharide complexes // Advances in Colloid and Interface Science. 2011. V. 167. P. 49-62.

131. Ku T. et al. Predicting melting temperature directly from protein sequences //

Comput. Biol. Chem. 2009. V. 33. № 6. P. 445-450.

132. Чеботарева Н.А., Курганов Б.И., Ливанова Н.Б. Биохимические эффекты молекулярного краудинга // Биохимия. 2004. Т. 69. № 11. С. 1522-1536.

133. Mahler H.-C. et al. Protein aggregation: pathways, induction factors and analysis // J. Pharm. Sci. 2009. V. 98. № 9. P. 2909-2034.

134. Roefs S.P.F.M., De Kruif K.G. A model for the denaturation and aggregation of beta-lactoglobulin // Eur. J. Biochem. 1994. V. 226. № 3. P. 883-889.

135. Bengoechea C., Peinado I., McClements D.J. Formation of protein nanoparticles by controlled heat treatment of lactoferrin: Factors affecting particle characteristics // Food Hydrocoll. 2011. V. 25. № 5. P. 1354-1360.

136. Mata L. et al. Thermal Denaturation of Human Lactoferrin and Its Effect on the Ability To Bind Iron // J. Agric. Food Chem. 1998. V. 46. № 10. P. 3964-3970.

137. Lin L.N. et al. Calorimetric Studies of the Binding of Ferric Ions to Ovotransferrin and Interactions between Binding Sites // Biochemistry. 1991. V. 30. № 50. P. 11660-11669.

138. Wu L., Zhang J., Watanabe W. Physical and chemical stability of drug nanoparticles // Adv. Drug Deliv. Rev. 2011. V. 63. № 6. P. 456-469.

139. Farruggia B. et al. Destabilization of human serum albumin by polyethylene glycols studied by thermodynamical equilibrium and kinetic approaches // Int. J. Biol. Macromol. 1997. V. 20. № 1. P. 43-51.

140. Farruggia B., Nerli B., Pico G. Study of the serum albumin-polyethyleneglycol interaction to predict the protein partitioning in aqueous two-phase systems // J. Chromatogr. B. 2003. V. 798. № 1. P. 25-33.

141. Farruggia B. et al. Destabilization of human serum albumin by polyethylene glycols studied by thermodynamical equilibrium and kinetic approaches // Int. J. Biol. Macromol. 1997. V. 20. № 1. P. 43-51.

142. Abuchowski A. et al. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. № 11. P. 3578-3581.

143. Hinds K.D., Kim S.W. Effects of PEG conjugation on insulin properties // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54. № 4. P. 505-530.

144. Lee W.Y., Sehon A.H. Suppression of Reaginic Antibodies // Immunol. Rev. 1978. V. 41. P. 200-247.

145. Davis F.F. et al. Reduction of immunogenicity and extension of circulating halflife of peptides and proteins // Pept. protein drug Deliv. 1991. P. 831-864.

146. Caliceti P., Veronese F.M. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates // Adv. Drug Deliv. Rev. 2003. V. 55. № 10. P. 1261-1277.

147. Tiraferri A. et al. Reduced aggregation and sedimentation of zero-valent iron nanoparticles in the presence of guar gum // J. Colloid Interface Sci. 2008. V. 324. № 1-2. P. 71-79.

148. Ильина А.В. и др. Получение, исследование и перспектива использования наночастиц на основе хитозана и галактоманнана // Российские нанотехнологии. 2011. Т. 6. № 1-2. P. 18-25.

149. Irina A.V. et al. Preparation and characterization of biopolymer nanoparticles based on lactoferrin-polysaccharide complexes // React. Funct. Polym. 2016.

150. Tizard I.R. et al. The biological activities of mannans and related complex carbohydrates. // Mol. Biother. 1989. V. 1. № 6. P. 290-296.

151. Loike J.D., Silverstein S.C. A fluorescence quenching technique using trypan blue to differentiate between attached and ingested glutaraldehyde-fixed red blood cells in phagocytosing murine macrophages // J. Immunol. Methods. 1983. V. 57. № 13. P. 373-379.

152. Sahlin S., Hed J., Runfquist I. Differentiation between attached and ingested immune complexes by a fluorescence quenching cytofluorometric assay // J. Immunol. Methods. 1983. V. 60. № 1-2. P. 115-124.

153. Gagnon E. et al. Endoplasmic reticulum-mediated phagocytosis is a mechanism of entry into macrophages // Cell. 2002. V. 110. № 1. P. 119-131.

Приложение 1

1Н-ЯМР спектры производных хитозана

Хитозан ММ=20 кДа, СД=90% (Х20)

ДХ (на основе хитозана с ММ=50 кДа, СД=90%), СЗ=9%

Приложение 1 (продолжение)

СХ (на основе хитозана с ММ=340 кДа, СД=85%), СЗ=60%

( ррт)