ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Козлов, Алексей Юрьевич

• Козлов, Алексей Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козлов, Алексей Юрьевич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

Глава 1. Генетическая иммунизация.

Глава 2. ДНК-иммунизация при герпетических инфекциях.

2.1 Классификация герпесвирусов.

2.2 Пути передачи ВПГ.

2.3 Строение ВПГ.

2.4 Взаимодействие вируса с клеткой.

2.5 Иммунный ответ при герпетической инфекции.

2.6 Современные вакцины против ВПГ.

2.6.1 Инактивированные вакцины.

2.6.2 Субъединичные вакцины.

2.6.3 Живые аттенуированные, генноинженерные вакцины.

2.7 ДНК-вакцины против ВПГ-инфекции.

2.8 Адъюванты для ДНК-вакцин.

Глава 3. ГМ-КСФ и ФНО как потенциальные адъюванты для ДНК-вакцин.

3.1 ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор).

3.2 Фактор некроза опухоли (ФНО).

Глава 4. Отечественные иммуномодуляторы нового поколения.

4.1 Глюкозаминил-мурамилдигхептид (ГМДП).

4.2 Гепон.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

5.1 Получение гибридом, продуцирующих МКА к белкам ВПГ1.

5.1.1 Иммунизация.

5.1.2 Миеломная клеточная линия.

5.1.3 Культивирование клеток.

5.1.4 Слияние клеток и выращивание гибридом.

5.1.5 Криоконсервирование гибридом.

5.1.6 Получение асцитных жидкостей, содержащих МК.

5.1.7 Получение МКА из асцитных жидкостей.

5.1.8 Определение концентрации белка.

5.1.9 Субтипирование МКА.

5.1.10 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА).

5.1.11 Непрямой иммунофлюоресцентный анализ (нИФ).

5.2. Животные.

5.3. Вирус и клетки.

5.4. Определение летальной дозы ВПГ1.

5.5. Иммуноген (плазмида pDNAgD).

5.6. Выделение рекомбинантного фактора некроза опухоли мышей (мФНОа).

5.7. Конструирование плазмиды для эукариотической экспрессии гена мышиного TNFa.

5.8. Конструирование плазмиды для эукариротической экспрессии гена мышиного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF).

5.9. Трансфекция in vitro.

5.10. ДНК-иммунизация.

5.11. Изучение активности антител к ВПГ1.

5.12. Реакция нейтрализации.

5.13. Определение ВПГ-специфических иммуноглобулинов класса IgGl и IgG2a.

5.14. Определение количества CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов.

5.15. Определение пролиферативного ответа Т-лимфоцитов.

5.16. Активность интерферона (ИФа).

5.17. Протективный ответ

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 6. Получение и характеристика МКА к ВПГ.

6.1 Слияние и скрининг гибридом.

6.2 Характеристика MICA.

6.2.1. Активность МКА в реакции нИФ.

6.2.2. Активность МКА в реакции ИФА.

6.2.3. Субтипирование Ig, представляющих МКА.

6.2.4. Способность МКА подавлять инфекционную активность ВПГ в реакции нейтрализации.

Глава 7. Определение летальной дозы ВПГ.

Глава 8. Трансфекция in vitro.

Глава 9. Генетическая иммунизация in vivo.

9.1. Изучение динамики клеточного и гуморального иммунного ответов на введение плазмиды pDNAgD, содержащей ген gD ВПГ1.

9.2. Исследование действия ФНО на иммунный ответ при иммунизации животных pDNAgD.

9.3. Исследование адъювантного действия ГМ-КСФ на ДНК-иммунизацию мышей против герпетической инфекции.

9.4. Влияние ГМДП на иммунный ответ при ДНК-иммунизации против вируса простого герпеса.

9.5. Исследование адъювантного действия препарата Гепон на ДНКиммунизацию животных против ВПГ-инфекции.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «ДНК-иммунизация против вируса простого герпеса 1 типа: сравнительный анализ протективного действия генов цитокинов и синтетических пептидов»

Актуальность проблемы.

Вирус простого герпеса (ВПГ) является причиной многих тяжелых заболеваний человека, проявляющихся в виде воспалительных поражений различных органов и тканей (герпетического кератита, энцефалита, уретритов, вагинитов). Большинство людей вступают в контакт с ВПГ1 в раннем возрасте (в 3 года - 6 лет). В 99% случаев после контакта у иммунокомпетентных детей клинические симптомы не развиваются, но в сыворотке можно обнаружить антитела. К 13-14-летнему возрасту, в среднем, инфицировано уже 70-83% детей, в возрасте 50 лет и старше антитела к ВПГ1 и/или 2 типа выявляются уже у 90% населения (1). В США от ВПГ1 и 2 страдает более 150 млн. человек, и ежегодно инфицируется еще около 0.5 млн. человек (218, 142). В России ввиду отсутствия должной выявляемости и учета показатель заболеваемости генитальным герпесом (ВПГ2) составил в 1996 -1999 гг. лишь 11-16 случаев на 100 тыс. населения (против 80-200 случаев на 100 тыс. населения за рубежом) (43). По данным опубликованных работ инфицировано ВПГ 1/2 около 22 млн. человек (24). Можно предположить, что эта цифра занижена в 5-10 раз.

В настоящее время имеется большое количество лекарственных препаратов для лечения герпетической инфекции, однако заболеваемость, вызванная ВПГ1 и ВПГ2, продолжает расти. Существующая в нашей стране противогерпетическая вакцина на основе инактивированного вируса прошла успешные испытания, однако, при ее применении, существует вероятность реактивации вируса в случае его неполной инактивации (7). В зарубежных странах разрабатывают вакцины против герпеса с использованием различных подходов. Один из них основан на получении индивидуальных рекомбинантных вирусных белков. Как показали испытания в США, субъединичные вакцины на основе вирусных белков обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения и приводят к незначительному сокращению рецидивов заболевания у людей, страдающих генитальным герпесом (200). Это стимулирует дальнейшее развитие альтернативных подходов, одним из которых является генетическая иммунизация и создание ДНК-вакцин. ДНК-иммунизация основана на использовании ДНК-конструкций, кодирующих специфические иммуногены. В качестве специфического иммуногена в нашей работе использовался поверхностный гликопротеин gD ВПГ, так как он играет важную роль во взаимодействии вируса с клетками-мишенями и содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Одним из важных компонентов вакцинных препаратов являются адъюванты. Преимущество ДНК-вакцин состоит в возможности комбинирования ДНК-конструкций с другими генами, например с генами цитокинов, что по имеющимся данным позволяет существенно повысить уровни как Т-клеточного, так и гуморального иммунного ответов. Перспективными компонентами ДНК-вакцин могли бы быть также новые синтетические иммуномодуляторы, в том числе отечественные, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Разработка вакцин на основе новых биотехнологических подходов позволит предотвратить заболевания, вызванные ВПГ 1/2.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение иммунного ответа и протективных свойств ДНК-конструкции, содержащей ген белка gD ВПГ, и сравнительный анализ адъювантных свойств двух генов - гена фактора Некроза опухоли (TNF) и гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), а также двух синтетических пептидов - глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) и Гепона.

Для достижения цели ставились следующие задачи:

1. Получить гибридомные клеточные линии, стабильно продуцирующие моноклональные антитела (MICA), взаимодействующие с белком gD ВПГ1.

2. Изучить способность ДНК-конструкции на основе плазмиды pcDNA-3.1(+)> содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках линии Vero.

3. Провести сравнительный анализ эффективности различных способов введения pDNAgD in vivo и определить наиболее эффективный способ введения плазмидной конструкции pDNAgD.

4. Исследовать показатели Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов на ДНК-иммунизацию pDNAgD, установить сроки формирования их максимальных уровней, и длительность циркуляции противовирусных антител в крови иммунизированных животных.

5. Провести сравнительный анализ адъювантных свойств 2-х ДНК-плазмид, содержащих ген TNF (pDNATNF) и ген GM-CSF (pDNAGM-CSF), и 2-х синтетических пептидов ГМДП и Гепона.

6. Изучить защитный эффект ДНК-иммунизации pDNAgD, проведенной совместно с изученными адъювантами.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Получены гибридомы, продуцирующие МКА, взаимодействующие с белком gD ВПГ1 и ВПГ2.

2. Показано, что внутримышечная ДНК-иммунизация pDNAgD приводит к формированию более высоких уровней Т-клеточного ответа, чем подкожное введение ДНК.

3. Показано, что использование в качестве адъювантов при ДНК-иммунизации pDNAGM-CSF и ГМДП приводит к повышению защитного эффекта однократной иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.

4. Установлено, что усиление Т-клеточного и В-клеточного иммунных ответов in vitro, происходящее под действием pDNATNF при ДНК-иммунизации, не приводит к усилению защитного эффекта in vivo.

Основные положения, выносимые на защиту.

-101. МКА, полученные в ходе работы, направлены к белку gD ВПГ и активно взаимодействуют с ВПГ1 и 2 в иммунохимических, иммунологических и вирусологических реакциях.

2. Показана способность полученных МКА выявлять белок gD in situ в эукариотических клетках, трансфицированных ДНК-конструкцией pDNAgD in vitro, а также в клетках, инфицированных ВПГ1/2.

3. Установлена оптимальная схема введения pDNAgD in vivo. Определены сроки формирования максимальных уровней Т- и В-клеточных иммунных ответов и длительность циркуляции анти-ВПГ1 антител.

4. Проведен сравнительный анализ адъювантных свойств белка TNF (мФНО), pDNATNF, pDNAGM-CSF, ГМДП и Гепона и установлено, что pDNAGM-CSF и ГМДП существенно повышают эффективность защиты животных от заражения летальными дозами ВПГ1.

-11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1 Генетическая иммунизация.

Вакцины - одно из самых значительных достижений медицины. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные препараты для предупреждения многих распространенных инфекционных заболеваний. Кроме того, увеличились заболевания, обусловленные теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. В связи с этим актуальным является поиск новых вакцинных препаратов, обладающих высокой иммуногенностью и способных активировать оба типа иммунного ответа (клеточный и гуморальный).

В настоящее время используется 4 основных вида противовирусных вакцин, которые разделяют в зависимости от методов их получения. Одним из них являются вакцины на основе живых аттенуированных вирусов. Опасность применения этих препаратов связана с возможностью появления спонтанных мутаций, приводящих к восстановлению вирулентности. Второй тип -инактивированные вакцины. К недостаткам вакцин на основе инактивированнош вируса относится опасность заражения в случае его неполной инактивации. В последнее время получили распространение вакцины третьего типа - субъединичные вакцины. Однако, наработка вирусного антигена в промышленном масштабе, очистка и выделение вирусных белков предполагает большие материальные затраты и необходимость работы с инфицированным материалом. 4 тип вакцин - генно-инженерные. Вакцины этого типа в большинстве случаев характеризует меньшая иммуногенность по сравнению с вакцинами на основе природных антигенов. Кроме того, белки, полученные методами генной инженерии, бывает трудно выделить и очистить, что сильно удорожает их использование на практике.

-12В последние годы все большее внимание исследователей привлекает новое направление в разработке вакцин, связанное с генетической иммунизацией (ДНК-иммунизацией). Идеи о возможности введения в организм генов с лечебной целью были высказаны еще в начале 60-х годов прошлого века, однако реальные попытки такого рода относятся к концу 80-х годов (13).

В 1990 году была осуществлена попытка лечения тяжелого, обычно несовместимого с жизнью наследственного иммунологического заболевания (иммунодефицита), вызванного дефектом в гене, который кодирует синтез фермента аденозиндезаминазы (ADA). У двух девочек в возрасте до четырех лет, страдавших врожденным дефектом в гене ADA, были взяты клетки костного мозга и перенесены в питательную среду для роста вне организма. В эти клетки был введен ген ADA. Затем трансфицированные клетки были размножены в культуре, после чего введены больным, от которых они были получены. Авторы сообщили о четко выраженном лечебном эффекте (83). Хотя впоследствии возник ряд сомнений в устойчивости полученного эффекта и его конкретных механизмах, именно эта работа послужила мощнейшим толчком для развития генной терапии.

Уже в 1992-1993 годах несколько независимых групп исследователей экспериментально доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета (220).

Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки вирусов или патогенных микроорганизмов. В организме хозяина выбранный ген экспрессируется и индуцирует клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного белка вируса, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой ДНК, которая способна к репликации в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего белок вируса, в пламиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии этого гена в клетках эукариот. Плазмиду нарабатывают в культуре бактериальных клеток. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий и очищают.

В настоящее время разработаны различные методы введения чужеродной ДНК в организм хозяина. Среди способов направленного введения генных конструкций можно выделить следующие:

1. Прямая инъекция генетического материала. Это самый простой метод доставки плазмидной ДНК в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы. Причем достаточно продолжительная (до года) экспрессия трансгена наблюдается преимущественно в мышечной ткани. Эффективность такой трансфекции обычно низкая, но вполне достаточная для генетической иммунизации. Обычно ДНК вводится в солевом растворе внутримышечно или внутрикожно. При этом большая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки (13, 141, 175).

2. Баллистическкая трансфекция. Этот метод основан на обстреле органов и тканей микрочастицами тяжелых мелаллов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК. Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в клетки. Ускорение частицам придается с помощью так называемой генетической пушки (gene gun), которая основана на принципе работы охотничьего ружья. Скорость микрочастиц, используемых в различных системах, значительно варьирует. По данным Клейна с соавторами (124), она может превышать 1000 м/с. Глубина проникновения микрочастиц, как правило невелика - до 1 мм, поэтому метод используется преимущественно для трансфекции клеток кожи или подлежащего хряща. Однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить ген в волокна поперечно-полосатых мышц. Метод баллистической трансфекции был предложен в 1987 г. Клейном и Стенфордом (123) для генетической трансформации растительных клеток. В нашей стране этот метод был использован в 1988г. Колесниковым и Зелениным (25) для трансформации мышиных клеток культивированных in vitro. В дальнейшем этот метод получил широкое распространение, и был использован для трансфекции клеток животных in vivo (59,203, 214).

3. Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган. Этот подход находит применение в первую очередь для лечения болезней печени. Используется также введение генетического материала в почку путем инъекций в питающие кровеносные сосуды, в почечную паренхиму и мочевыводящие пути (13,25,18).

4. Аэрозольное введение. Этот способ эффективен при введении генетического материала в дыхательные пути и используется для лечения заболеваний легких (18).

ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

При ДНК-иммунизации антиген презентируется иммунной системе хозяина в нативной форме, тогда как в процессе производственного получения и очистки рекомбинантных белков (генно-инженерные вакцины) могут произойти изменения трехмерной конфигурации этих молекул. Поэтому иммунизация может быть низкоэффективной в связи с образованием антител, специфичных к иммуногенным молекулам, но не к нативным вирусным белкам.

ДНК-вакцины эффективно индуцируют Т-клеточный иммунный ответ, который играет решающую роль при элиминации вирусных патогенов. Другие вакцины индуцируют главным образом В-клеточный иммунитет.

С помощью ДНК-иммунизации можно избирательно активировать различные субпопуляции Т-хелперных клеток (79,136) .

Кроме того, ДНК-вакцины можно комбинировать с другими лекарственными препаратами и адьювантами, путем встраивания генов этих биологически активных веществ в молекулу ДНК, содержащую вирусный ген.

Важным преимуществом технологии ДНК-вакцин является то, что она позволяет получить вакцины для агентов, которые невозможно культивировать.

Однако, несмотря на ряд преимуществ ДНК-иммунизации, при использовании данного типа вакцин существует несколько неясных моментов. Например, до конца не изучены сроки, в течение которых клетки организма будут вырабатывать антигенный белок. Не все ясно с безопасностью ДНК-вакцин. Неизвестно, может ли в дальнейшем введенная ДНК вызывать рак, или будет ли антиген, продуцируясь в избыточных количествах, вызывать развитие различных форм иммуносупрессии или других патологических явлений (18).

В настоящее время накапливается все больше работ по ДНК-вакцинации. Для успешного использования ДНК-вакцины необходимо индуцирование эффективного и длительного антивирусного иммунитета способного предотвратить последующие вирусные атаки. Особое внимание авторы уделяют изучению реакции различных звеньев иммунитета. Вирус-специфический Т-клеточный иммунный ответ определяется МНС П-го класса - CD4+ Т-клетками, обладающими Т-хелперным фенотипом (Thl) и МНС 1-го класса - CD8+ цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), которые убивают инфицированные клетки (223). Опыты ведутся на различных животных моделях: высшие обезьяны, кошки, кролики, крысы, мыши и т.д. (223, 142, 185).

Существуют различные схемы иммунизации животных. Для разных патогенов авторами подбирается разнообразный цикл иммунизаций и концентрации вводимой ДНК. Так, в работе Harrison R.A. с соавторами приводится схема иммунизации мышей эукариотической плазмидой, содержащей ген L3 нематоды. В первой группе мышей иммунизировали три раза, с интервалом 4 месяца, методом баллистической трансфекции. Во второй группе мышей иммунизацию проводили 5 раз с интервалом 1 месяц. Авторы показали, что уровни гуморального и клеточного иммунного ответа были выше во второй группе животных (105).

В исследованиях Ruitenberg R.M. et al, 1999 было показано, что после однократного внутримышечного введения плазмиды, содержащей ген gD EHS-1 через две недели после инъекции были обнаружены специфические антитела, уровень которых удерживался в течение 23 недель (титр 1/1250). Иммунный ответ был пропорционален дозе ДНК и вторичное введение ДНК, увеличивало гуморальный ответ. Также было показано, что после двукратного введения ДНК наблюдали образование нейтрализующих антител IgG2a, что может свидетельствовать об активации Thl клеточного ответа, который играет главную роль в элиминации вирусных агентов. Пролиферативный ответ лимфоцитов на белок gD незначительно увеличивался после первой инъекции, однако после второго введения ДНК возрастал в 11 раз по сравнению с контролем. Кроме этого было показано, что при интраназальном заражении вакцинированных животных, очищение от вируса ткани легкого происходит быстрее, а также отмечено уменьшение патологии легких у мышей иммунизированных ДНК, в сравнении с контрольными животными (179).

В работе Abendroth A. et al. приводится схема иммунизации мышей плазмидой содержащей гены IE62 и gE вируса Varicella zoster. Мышей иммунизировали трехкратно с интервалом между первой и второй иммунизациями - 1 неделя, второй и третьей - 3 недели. Плазмиду вводили по 50 мкг, внутримышечно. Через три недели после 3 инъекции у мышей анализировали наличие специфических противовирусных антител и уровень Т-клеточного ответа. Было установлено, что у 20% мышей иммунизированных плазмидой содержащей гены белков IE62 и gE присутствовали антитела против этих белков. Анализ Т-клеточного иммунитета, показал, что у 90% животных, иммунизированных плазмидой содержащей ген IE62 наблюдеется увеличение специфического Т-клеточного ответа. Таким образом, авторами было установлено, что ДНК иммунизация против вируса Varicella Zoster индуцирует возникновение, в основном, Т-клеточного иммунитета (52).

Увеличение Т-клеточного ответа также наблюдали при анализе ДНК-вакцинации плазмидами, содержащими гены белков NS3, NS4, NS5, и Core вируса гепатита С, при 2- и 3-х кратном введении с интервалом в 2 недели между инъекциями. Цитокиновый профиль определяемый после ДНК-иммунизациии демонстрировал классический Т-хелперный ответ 1 типа, с высокими уровнями ИФ-у и ИЛ-2 (90, 98).

Клеточная цитотоксичность - важный механизм защиты против внутриклеточно локализованных возбудителей, таких как вирусы, некоторые бактерии и простейшие. При активации цитотоксических Т-клеток они мигрируют в ткань, находят клетку-мишень и взаимодействуют с ней с помощью Т-клеточного рецептора, узнающего комплекс молекула гистосовместимости - пептид. Одновременно происходит взаимодействие с помощью молекул адгезии. Вследствие такого взаимодействия происходит перестройка ультраструктуры клетки. Аппарат Гольджи ориентируется в сторону контакта. Сюда же подходят микротрубочки и микрофиламенты. К месту контакта приближаются секреторные везикулы и образуется иммунный синапс (место контакта Т-клетки и клетки-мишени). После формирования иммунного синапса наступает эффекторная фаза взаимодействия и в его просвет выбрасывается содержимое секреторных везикул, в состав которых входят перфорин и гранзимы. Молекулы перфорина встраиваются в мембрану клетки-мишени и образуют поры, состоящие из двух десятков мономеров перфорина, через которые внутрь клетки входят гранзимы. Если на клетке-мишени экспрессируется CD95, то происходит его влаимодействие с молекулой-лигандом CD95L на цитотоксическом Т-лимфоците и запускаются механизмы, приводящие к апоптозу пораженной клетки. Аналогичную функцию играют и гранзимы. Помимо этого CTL продуцируют фактор некроза опухоли (ФНО) и интерферон-у (ИФ-у). Взаимодействие ФНО с соответствующим рецептором на клетке-мишени также приводит к возникновению сигнала апоптоза. ИФ-у привлекает к месту взаимодействия клеток макрофаги, которые поглощают апоптотические тельца, образовавшиеся в результате апоптоза (42).

В исследованиях Martins L.P. et al., было показано, что ДНК-вакцинация может индуцировать протективный иммунный ответ при дессиминированной персистентной LCMV-инфекции у мышей. Исследовались две группы мышей, у одной создавалась острая инфекция, у другой персистентная LCMV-инфекция. В первой группе наблюдали высокий уровень CTL-ответа, тогда как у второй группы этот ответ был очень низким. Вторую группу мышей иммунизировали ДНК-плазмидами, содержащими различные гены LCMV. Было показано, что при 3-х кратной иммунизации с интервалом в 3 недели между инъекциями ДНК, резко увеличивался вирусспецифический CTL-ответ у 50% мышей. Данными исследованиями было подтверждено, что генная иммунизация является оптимальным методом для стимулирования CD8+ Т-лимфоцитов (141).

Данные о том, что вакцинация на основе ДНК может индуцировать вирус специфический CTL ответ, были получены и в ряде других работ. Было установлено, что ДНК-векторы, экспрессирующие белки вирусов гриппа, бешенства, гепатита С, ВИЧ, LCMV, а также возбудителя малярии, увеличивают CTL-ответ у экспериментальных животных (175, 90, 223, 207, 221, 54, 103). Показано, что ДНК- вакцины, которые активируют цитотоксические Т-лимфоциты, могут иметь протективные свойства в защите организма, как при острой, так и при персистентной вирусной инфекции, даже при отсутствии противовирусных антител (79).

Детальные механизмы клеточного ответа на ДНК-иммунизацию до конца не изучены. Мышечная ткань часто используется для экспрессии in vivo генов, встроенных в плазмиду (207). Однако, на мышечных клетках нет молекул гистосовместимости II класса, необходимых для презентации антигена Т-лимфоцитам и молекул В7 (CD80/CD86), соединение которых с соответствующим лигандом на Т-клетке (CD28) ведет к формированию коактивационного сигнала, необходимого для превращения наивной Т-клетки в армированную. Экспрессирующийся в мышечных клетках антиген скорее всего поступает в межклеточное пространство, где он будет захватываться транзиторыми антиген-представляющими клетками (АПК), например, клеткам Лангерганса. АПК в свою очередь будут презентировать данный антиген CD4+ Т-лимфоцитам (221). Другие исследователи изучали зависимость CTL-ответа на ДНК-вакцинацию от МНС класса II CD4+ Т-клеток. Для подтверждения данной гипотезы, мышей иммунизировали внутримышечно и внутрикожно ДНК, кодирующей цельный ген OVA, (К-Ь)-ограниченный пептид эпитопа OVA класс I и смесью класса I пептида OVA и смежного (1-аЬ)-ограниченного эпитопа класса II. Было показано, что при иммунизации конструкцией, состоящей из эпитопа класса I, был очень низкий CTL-ответ. У мышей иммунизированных цельным OVA и смесью двух эпитопов (класса I и II) был одинаково высокий уровень цитотоксического Т-клеточного ответа. Для подтверждения того, что природа данного ответа определяется CD4+ Т-хелперами, мыши были истощены как по CD4+, так и по CD8+ до ДНК-иммунизиции. У мышей, истощенных как по CD4+, так и по С08+-клеткам, не было CTL-ответа на иммунизацию ДНК, содержащей цельную молекулу OVA. На основании данных результатов можно сделать заключение, что CTL-ответ при обеих иммунизациях прямо зависит от генерации CD4+ Т-хелперов (136).

2. ДНК-иммунизация при герпетических инфекциях.

Почти треть населения Земли поражена герпетической инфекцией, причем у 50% из них наблюдаются рецидивы заболевания. В России и странах СНГ почти 22 млн. человек страдают от герпетической инфекции (24), а число госпитализированных только с офтальмогерпесом превышает 2.5 млн. в год (26). По данным ВОЗ, заболевания, вызываемые вирусом простого герпеса (ВПГ), занимают второе место (15.8%) после гриппа (35.8%) среди причин смерти от вирусных инфекций (27). Имеются данные, что к пятилетнему возрасту около 60% детей уже инфицировано, а к 15 годам

-20- почти 90% детей и подростков имеют антитела к ВПГ. Большинство людей являются пожизненными вирусоносителями. Причем в 85-99% случаев первичная инфекция у них протекает бессимптомно и только в 1 - 15% - в виде системной инфекции (32). В США более 100 млн. человек инфицировано ВПГ 1 и по разным данным от 40 до 60 млн. - ВПГ 2 (218), причем ежегодно инфицируются до 500 тыс. американцев (142).

В настоящее время имеется большое количество вирусспецифических и неспецифических препаратов для лечения герпетической инфекции, однако, заболеваемость, вызванная ВПГ, продолжает расти. Исследования субъединичных вакцин на основе вирусных белков в США показали, что данные вакцины обеспечивают лишь частичную защиту от первичного заражения ВПГ и практически не снижают рецидивы заболевания у людей, страдающих генитальным герпесом (200). Другие типы современных вакцин, например, основанные на получении мутантных штаммов ВПГ, находятся в стадии разработки.

Тремин герпес (от греческого herpes - ползучий) был использован Геродотом в 100-м году до нашей эры для описания волдырей, сопровождающихся лихорадкой. В настоящее время известно более 100 герпесвирусов, которые инфицируют позвоночных. Большинство из них инфицируют млекопитающих или птиц, но есть представители поражающие рептилий, амфибий и рыб. ДНК-геном герпесвирусов имеет большие размеры и составлен 120-230 kb. Он кодирует несколько десятков белков, не все из которых идентифицированы и описаны в настоящее время (217).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Козлов, Алексей Юрьевич

выводы.

1. Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА), взаимодействующие с рекомбинантным белком gD вируса простого герпеса (ВПГ) и с натуральным белком gD в составе ВПГ1 и ВПГ2, в различных иммунохимических реакциях.

2. С помощью МКА установлена способность ДНК-конструкции, содержащей ген gD ВПГ1 (pDNAgD), экспрессироваться в эукариотических клетках, трансфицированных in vitro.

3. Сравнительный анализ эффективности различных способов введения плазмидной ДНК при иммунизации мышей линии BALB/c ДНК-конструкцией pDNAgD показал, что внутримышечное введение обеспечивает более высокую эффективность иммунного ответа по сравнению с подкожным введением ДНК.

4. Установлено, что однократная иммунизация pDNAgD позволяет увеличить пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в 8 раз, соотношение анти-ВПП IgG2a/IgGl в 2 раза. Двукратная иммунизация pDNAgD с интервалом 2 недели, приводит дополнительно к увеличению активности антител к ВПГ1 в 16 раз и формированию вируснейтрализующих антител.

5. Сравнительный анализ адъювантного действия соединений на основе генов цитокинов и синтетических пептидов на эффективность ДНК-иммунизации показал, что использование ДНК-конструкции содержащей ген фактора некроза опухоли (pDNATNF) стимулирует увеличение активности Т-клеточного и В-клеточного звеньев иммунитета in vitro, однако снижает защиту животных in vivo. Использование синтетического пептида Гепон стимулирует увеличение активности В-клеточного ответа. Применение в качестве адъюзантов ДНК-конструкции содержащей ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (pDNAGM-CSF) и глюкозаминил-мурамилдипептида (ГМДП) приводит к формированию высоких уровней Т-клеточного ответа.

6. Показано, что pDNAGM-CSF и ГМДП оказывают адъювантный эффект, повышая эффективность протекции от летальной дозы ВПГ1 (160 LD50) после однократной ДНК-иммунизации pDNAgD с 63% до 96-100%.

-116

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козлов, Алексей Юрьевич, 2004 год

1. Абазова Ф.И., Безух С.М., Борисенко К.К. и др. Неизвестная эпидемия: герпес (патогенез, диагностика, клиника, лечение). Смоленск: Фармаграфикс. -1997.

2. Атауллханов Р.И., Холмс Р.Д., Катлинский А.В. и др. Иммуномодулятор «Гепон» подавляет репликацию вируса гепатита С в культуре клеток человека in vitro // Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Том. 47. - №.8. -С.9-11.

3. Атауллханов Р.И., Холмс Р.Д., Наровлянский А.Н. и др. Механизмы противовирусного действия препарата «Гепон»: изменение транскрипции генов цитокинов в перевиваемых клетках человека // Иммунология. — 2003. №.1. - С.9-12.

4. Баринский И .Ф., Шубладзе А.К. Этиология хронических вирусных инфекций. М., 1984. - С.51.

5. Баринский И.Ф., Каспаров А.А., Лазаренко А.А. и др. Убитая коммерческая вакцина против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов как средство иммунокоррекции при хронической герпетической инфекции // Журн. Микробиол. 1999. - №.6. - С.98-102.

6. Бибичева Т.В., Силина JI.B. Иммуномодулятор Гепон для местной терапии герпес-вирусной инфекции // В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». — Москва. -2002.-С.55.

7. Бибичева Т.В., Силина JI.B. Лечение рецидивирующего генитального герпеса иммуномодулятором Гепон // В кн.: Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва.2002.-С.56.

8. Вирусология. Методы: Пер. с англ. / Под. Ред. Б. Мейхи. М.:Мир, 1988. -344с.

9. Генная терапия медицина будущего / Редактор составитель А.В.Зеленин. М.: ВИНИТИ РАН-ППФНТП «Геном человека». - 2000.

10. Горбарец И.П., Воронкова Н.В., Лопатина Т.В. и др. Опыт применения препарата Гепон в сочетании с рекомбинантным интерфероном-альфа у больных хроническим гепатитом С // Русский медицинский журнал.2003. -№.12. -С.714-717.

11. Грибенча С. В., Холмс Р. Д., Атауллаханов Р. И., Баринский И. Ф. Противовирусная активность пептидного иммуномодулятора "Гепон" в экспериментах на модели уличного вируса бешенства // Вопросы вирусологии. 2003. - №.4. - С.40-45

12. Зеленин А. В. Генная терапия на границе третьего тысячелетия И Вестник российской академии наук. 2001. - Том 71. - №.5. - С.387-395.

13. Игнатьев Г.М., Бычкова Е.Н., Грибенча С.В. и др. А.С. №381904/28-14 (130215).-1986.

14. Карсонова М.И., Андронова Т.М., Пинегин Б.В., Хаитов P.M. Иммуностимулирующая активность мурамилдипептида и его производных // Журн. микробиол. 1999. - №.3, - С. 104-110.

15. Каспаров А.А. Офтальмогерпес. М., 1994.

16. Кладова О.В., Харламова Ф.С., Щербакова А.А. и др. Эффективное лечение синдрома крупа с помощью иммуномодулятора Гепон // Русский медицинский журнал. 2002. - Том. 10. - №.3. - С .138-141.

17. Кладова О.В., Харламова Ф.С., Щербакова А.А. и др. Первый опыт интраназального применения гепона у детей с респираторными заболеваниями // Педиатрия. 2002. - №.2. - С.86-88.

18. Козлова В. И., Пухнер А.Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий. Москва. 1997. - С.536.

19. Колесников В.А., Титомиров А.В., Зеленин А. В. Генетическая трансформация клеток животных в культуре с помощью высокоскоростного механического пробоя // Докл. АН СССР. 1988. -Том 305. — С. 1265-1267.

20. Кунгуров Н.В., Герасимова Н.М., Зудин А.Б., Кузовкина Т.В. Генитальный герпес. Екатеринбург: Издательство Уральского университета. 2001. - С.7.

21. Майчук Ю.Ф. Селективная противовирусная терапия при герпетических кератитах //Клиническая медицина. -2001. -№.9. С.70-71.

22. Манько В.М., Скворцов В., Мастернак Т.Б., Иванова А.С. Экспериментальное изучение иммуномодулирующего действия глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП). Влияние ГМДП на гуморальный ответ // Иммунология. — 1988. №.6. - С.34-37.

23. Манько В.М., Скворцов В., Мастернак Т.Б., Ларин А.С. и др. Экспериментальное изучение иммуномодулирующего действия глюкозаминил-мурамил-дипептида (ГМДП). Влияние ГМДП на клеточный иммунитет // Иммунология. 1989. - №. 1. - С.38-41.

24. Мурзич А.В., Голубев М.А. Герпетическая инфекция // Южно-Российский медицинский журнал. 1998. - №.3. - С.44-47.

25. Насонов E.JI. Фактор некроза опухоли-а новая мишень для противовоспалительной терапии ревматоидного артрита // Клин. Фармакол. Терапия - 2001. - №. 1. - С.64-70.

26. Носков Ф.С., Никитина JI.E., Масленникова Л.К., Фридман Е.А. // Иммунология. 1984. - №.4. - С.53-55.

27. Пинегин Б.В., Минкина Г.Н., Агикова Л.А. и др. Использование нового иммуномодулятора ГМДП при лечении больных папилломавирусной инфекцией шейки матки // Иммунология. 1997. - №. 1. - С.49-51.

28. Пинегин Б.В., Ханухова Л.М., Рабинович О.Ф., Андронова Т.М. Новые аспекты клинического применения ликопида при заболеваниях, связанныхс нарушением иммунитета // Медицинская иммунология. 1999. - №.3-4. -С.127-128.

29. Позднякова В.В. Иммунотерапия герпесвирусных заболеваний глаз // Materia Medica. 1999. - №.4. - С.36-45.

30. Полякова Т.С., Магомедов М.М., Артемьев М. Е. и др. Новый подход к лечению хронических заболеваний глотки // Лечащий врач. 2002. - №.4. — С.64-65.

31. Птушкин В.В. Роль гранулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующих факторов в лечении инфекции при нейтропении // Современная Онкология. 2001. - Том.З. - №.3. -С.23-28.

32. Рахмилевич А.Л., Рахимова В.К., Андронова Т.М., Бовин Н.В. Иммуностимулирующее действие мурамилдипептида, глюкозаминилмурамилдипептида и их синтетических производных в системе in vitro // Антибиотик, химиотер. 1989. - №.34. - С.586-588.

33. Рожнова У. А., Гуляева Н. В., Степаничев М. Ю., Алесенко А. В. Роль сфинголипидов в передаче сигнала ФНО В разных отделах мозга // Материалы Второй Российской конференции 18-20 октября 1999.

34. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М.: Мир, 2000. - 592с.

35. Тихонова Л.И. О состоянии заболеваемости болезнями, передаваемыми половым путем (по итогам 1996 г.), и мерах по их предупреждению в России // заболевания, передаваемые половым путем. 1997. - №.4. -С.22-26.

36. Тищенко АЛ. Новый подход к лечению рецидивирующего урогенитального кандидоза // Гинекология. 2001. - Том.З. - №.6. -С.210-212.

37. Уманский В., Тараховский А., Андронова Т. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины XCIX. 1985. - С.685-687.

38. Чернецова Л.Ф., Зотов П.Б. Иммунотерапия сопровождения ликопидом больных распространенными формами злокачественных новообразований // Российский онкологический журнал. 2001. - №.5. - С.49-53.

39. Шаков И.М. Наружное лечение рецидивирующего генитального герпеса препаратом Гепон // Вестник последипломного медицинского образования. 2003. - №.1. - С.51-52.

40. Шестопалов A.M., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопросы Вирусологии. 2002. - №.3. - С.37-40.

41. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Беркова Н.П., Коробко В.Г. Взаимодействие анти-ФНОа моноклональных антител Е7/Н2 с мутантными и гибридными белками // Биоорган.химия. 1997. - Т.23. -С.428-433.

42. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутантный человеческий ФНО: получение и некоторые свойства // Биоорган, химия. 1996. - №.22. - С.234-251.

43. Шмелев В.А., Григорьев Б.В., Можарова Т.И., Попов С. Г. Тимозин-ai и гибридные белки, состоящие из фактора некроза опухолей-a и тимозина-di увеличивают эффективность вакцинации против возбудителя чумы // Журн. Микробиол. 1994. - №.4. - С.85-89.

44. Abendroth A., Slobedman В., Springer M.L. et al. Analysis of immune responses to varicella zoster viral proteins induced by DNA vaccination // Antiviral research. 1999. - V.44. - P.179-192.

45. Agadjanyan M.G., Chattergoon M.A., Holterman M.J. Costimulatory molecule immune enhancement in a plasmid vaccine model is regulated in part through the Ig constant-like domain of CD80/86 // J. Immunol. 2003. - V.171. -P.4311-4319.

46. Andronova Т., Ivanov V. The structure and immunological function of glucosaminylmuramyl peptides // Sov. Medical Reviews. D. Immunology (Harwood Academic Publishers). 1991. - V.4. - P. 1-63.

47. Ankel H., Westra D.F., Wellingwester S. Induction of interferon-alpha by glycoprotein D of herpes simplex virus a possible role of chemokine receptors // Virology. - 1998. - V.251. - Iss.2. - P.317-326.

48. Baca-Estrada M.E., Folvari M., Snider M. et al. Effect of IL-4 and IL-12 liposomal formulation on the induction of immune response to bovine herpesvirus type-1 glycoprotein D // Vaccine. 1997. - V.15. - P.1753-1760.

49. Balitsky K.P., Umansky; V.Y., Tarakhovsky A.M., Andronova T.M. et al. Glucosaminylmuramyl dipeptide induced changes in murine macrophage metabolism // Int. J.Immunopharmac. 1989. - V.l 1. - P.429-434.

50. Bartholdy C., Olszewska W., Stryhn A. et al. Gene-gun DNA vaccination aggravates respiratory syncytial virus-induced pneumonitis // J. Gen. Virol. 2004. - V.85. - P.3017-3026.

51. Behbehani K., Beller D.I., Unanue E.R. The effect of beryllium and other adjuvants on la expression by macrophages // J. Immunol. 1985. - V.l34. -P.2047-2049.

52. Beutler B. et al. Cachectin (tumor necrosis factor): a macrophage hormone governing cellular metabolism and inflammatory response // Endocr. Rev. — 1988. V.9. -P.57-66.

53. Bilsborough J., Uyttenhove C., Colau D. et al. TNF-mediated toxicity after massive induction of specific CD8+ T cells following immunization of mice a tumor-specific peptide // The Journal of Immunology. 2002. - V.l69. -P.3053-3060.

54. Bomford R., Stapleton M., Winsor S., McKnight A. et al. The control of the antibody isotype response to recombinant human immunodeficiency virusgpl20 antigen by adjuvants // AIDS Res. Human Retrov. 1992. - P. 17651771.

55. Bopegamage S.A., Petrovicova A. Tumor necrosis factor alfa and glucose levels in sera of mice infected with Coxsackie B4 and A7 viruses // Acta. Virol. 1998. - V.42. - P.409-412.

56. Bourne N., Milligan G.N. Evaluation in mice of intramuscular, intravaginal and intrarectal immunization with a DNA vaccine against experimental genital herpes / 13th Meeting of ISSTDR. July 11-14. 1999. - Denver. Colorado. USA.

57. Bozkurt В., Kribbs S.B., Clubb F.J. et al. Pathophysiological^ relevant concentrations of tumor necrosis factor-a promote progressive left ventricular dysfunction and remodeling in rats // Circulation. -1998. V.97. - P. 13821391.

58. Browne H., Bruun В., Minson T. Plasma membrane requirements for cell fusion induced by herpes simplex virus type 1 glycoproteins gB, gD, gH and gL // Journal of General Virology. 2001. - V.82. - P.1419-1422.

59. Campadelli-Fiume G., Cocchi F., Menotti L., Lopez M. The novel receptors that mediate the entry of herpes simplex viruses and animal herpesviruses into cells // Rev. Med. Virol. 2000. - V.10. - P.305-339.

60. Cantin, E.M. et al. Expression of herpes simplex virus 1 glycoprotein В by a recombinant vaccinia virus and protection of mice against lethal herpes simplex virus infection // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.5908-5912.

61. Cappel, R., DeCuyper, F., and Rikaert, F. Efficacy of a nucleic acid free herpetic subunit vaccine // Arch. Virol. 1980. - V.65. - P. 15-23.

62. Carswell E.A., Old L.J., Kassel R.L. et al. An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. - V.72. -P.3666-3670.

63. Caselli E., Grandi P., Argnani R., et al. Mice genetic immunization with plasmid DNA encoding a secreted form of HSV-1 gB induces a protective immune response against Herpes simplex virus type 1 infection // Intervirology. -2001.-V.44.-P.1-7.

64. Cedillo-Barron L., Foster-Cuevas M., Cook A. et al. Immunogenicity of plasmids encoding T and В cell epitopes of foot-and-mouth disease virus (FMDV) in swine // Vaccine. 2003. - V.21. - P.4261-4269.

65. Chapin H.B., Wong S.C., Reapsome J. The value of tissue culture vaccine in the prophylaxis of recurrent attacks of herpetic keratitis // Am. J. Ophthalmol. 1962. - V.54. - P.255-265.

66. Chow Y.H., Chiang B.L., Lee Y.L. et al. Development of Thl and Th2 populations and the nature of immune responses to hepatitis В virus DNA vaccines can be modulated by codelivery of various cytokine genes // J. Immunol. 1998. - V.160. - P.1320-1329.

67. Christenson В., Bottiger M., Svensson A. et al. A 15 year surveillance study to antibodies to herpes simplex virus types 1 and 2 in a cohort of young girls // J.Infect. 1992. -V.25. - №.2. - P.147-154.

68. Cockrell A.S., Muggeridge M.I. Herpes simplex virus 2 U145 is a type II membrane protein // J. Virol. 1998. - V.72. - Iss.5. - P.4430-4433.

69. Corr. M., Lee D.J., Carson D.A., Tighe H. Gene vaccination with naked plasmid DNA: mechanism of CTL priming // J. Exp. Med. 1996. - V.184. -P.1555-1560.

70. Cruz P.E., Khalil P.L., Dryden T.D. et al. A novel immunization method to induce cytotoxic T-lymphocyte responses (CTL) against plasmid-encoded Herpes simplex vims type-1 glycoprotein D // Vaccine. 1999. - V.17. -P.l 091-1099.

71. Culver K.W. Gene Therapy. A Handbook for Physicians. 2nd Eddition NY: Mary Ann Inc. Publishers. 1996.

72. Disis M.L., Bernhard H., Shiota F.M. et al. Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor: an effective adjuvant for protein and peptide-based vaccines // Blood. 1996. - V.88. - P.202-210.

73. Dix, R.D., and Mills, J. Acute and latent herpes simplex virus neurological disease in mice immunized with purified virus-specific glycoproteins gB or gD //J.Med. Virol.- 1985.-V.17.-P.9-18.

74. Dundarov, S., Andonov, P., Bakalov, В., Nechev, K., and Tomov, C. Immunotherapy with inactivated polyvalent herpes vaccines // Dev. Biol. Stand.- 1982. -V.52.-P.351-358.

75. Eling D.J., Johnson P.A., Sharma S. et al. Chronic lymphocytic leukemia В cells are highly sensitive to infection by herpes simplex virus-1 via herpesvirus-entry-mediator A // Gene Ther. 2000. - V.7. - P. 1210-1216.

76. Encke J., zu Putlitz J., Geissler M., Wands J.R. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis С virus in a murine model // J. Immunol. 1998, - V.161. - P.4917-4923.

77. Ertel W., Morrison M.H., Wang P. et al. The complex pattern of cytokines in sepsis//Ann. Surg.- 1991.-V.214.-P.141-148.

78. Esmann J. The many challenges of facial herpes simplex virus infection // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2001. - V.47. - P.17-27.

79. Evans J.A., Darlington D.N., Gann D.S. A circulating factors mediates cell depolarization in hemorrhagic shock // Ann. Surg. 1991. - V.213. - P.549-557.

80. Farrar W.L., Johnson H.M., Farrar J.J. Regulation of the production of immune interferon and cytotoxic T lymphocytes by interleukin-2 // J. Immunol. 1981.1. V.126. P.l 120-1125.

81. Flo J., Perez B.A., et al. Superiority of intramuscular route and full length glycoprotein D for DNA vaccination against herpes simplex viruse-2. Enhancement of protection by the co-delivery of the GM-CSF gene // Vaccine.- 2000. V.18. - P.3242-3253.

82. Gallichan W.S., Rosenthal K.L. Long-term immunity and protection against herpes simplex virus type 2 in the murine female genital tract after mucosal but not systemic immunization // Infect Dis. 1998. - V.177. - P.l 155-1161.

83. Gately M.K., Wolitzky A.G., Quinn P.M., Chizzonite R. Regulation of human cytolytic lymphocyte responses by interleukin-12 // Cell. Immunol. 1992. -V.143. - P.127-142.

84. Geissler M., Gesien A., Tokushige K., Wands J.R. Enhancement of cellular and humoral immune responses to hepatitis С virus core protein using DNA-based vaccines augmented with cytokine-expressing plasmids // J. Immunol. -1997. V.l 58 - P.1231-1237.

85. Ghiasi H., Kaiwar R., Nesburn A.B., et al. Expression of seven herpes simplex virus type 1 glycoproteins (gB, gC, gD, gE, gG, gH, and gl): comparativeprotection against lethal challenge in mice // Journal of Virology. 1994. -P.2118-2126.

86. Griffiths P. Neonatal HSV and evidence based medicine // Rew. Med. Virol. - 1997. - V.7. -Iss.4. -P.197-198.

87. Haarr L., Shukla D., Rodahl E. et al. Transcription from the gene encoding the herpesvirus entry receptor nectin-1 (HveC) in nervous tissue of adult mouse // Virology. 2001. - V.287. - P.301-309.

88. Haddad D., Ramprakash J., Sedegah M. et al. Plasmid vaccine expressing granulocyte-macrophage colony-stimulating factor attracts infiltrates including immature dendritic cells into injected muscles // J. Immunol. 2000. — V.165. -P.3772-3781.

89. Hadden J.W. Immunostimulants // Immunol. Today. 1993. - V. 14. - P.275-280.

90. Harrison R.A., Wu Y., Egerton G., Bianco A.E. DNA immunisation with Onchocerca volvulus chitinase induces partial protection against challenge infection with L3 larvae in mice // Vaccine. -1999. V.8. - P.647-655.

91. Hashido M., Kawana T. Herpes simplex virus-specific IgM, IgA and IgG subclass antibody responses in primary and nonprimary genital herpes patients // Microbiol.-Immunol. 1997. - V.41. - P.415-420.

92. Higgins T.J., Herold K.M. et al. Plasmid DNA-Expressed Secreted and Nonsecreted Forms of Herpes Simplex Virus Glycoprotein D2 induce Different Types of Immune Responses // J. Inf. Dis. 2000. - V. 182. - P. 1311 -1320.

93. Hofman P. Molecular regulation of neutrophil apoptosis and potential targets for therapeutic strategy against the inflammatory process // Curr. Drug. Targets. Inflamm. Allergy. 2004. - V.3. - C.l-9.

94. Honess R.W., Roisman B. Regulation of herpesvirus macro-molecular synthesis. I. Cascade regulation of the synthesis of three groups of viral proteins // J. Virol. 1974. - V.14. - P.8-14.

95. Ito M., O'Malley Y.A. Antiviral effects of recombinant human tumor necrosis factor // Lymphokine Res. 1987. - V.6. - P.309-318.

96. Jawetz, E., Allende, M.E., and Coleman, V.R. Studies on herpes simplex virus. VT. Observations on patients with recurrent herpetic lesions injected with herpes viruses or their antigens // Am. J. Med. Sci. 1955. - V.229. — P.477-485.

97. Kalden JR. Emerging role of anti-tumor necrosis factor therapy in rheumatic disease // Arthritis. Res. 2002. - V.4. - P.34-40.

98. Kern A.B., Schiff B.L. Vaccine therapy in recurrent herpes simplex // Arch. Dermatol. 1964. - V.89. - P.844-845.

99. Khaidukov S.V., Komaleva R.I., Nesmeyanov V.A. N-acetylglucosamine-containing muramyl peptides directly affect macrophages // Int. J. Immuiopharmacol. 1995. - V. 17. - P.903-911.

100. Khaitov R.M., Pinegin B.V., Butakov A.A., Andronova T.M. Immunotherapy of infectious postoperative complications with glucosaminyl dipeptide // Immunotherapy of Infections. 1994. - P.213-223.

101. Kim J.J., Trivedi N.N., Nottingham L.K. et al. Modulation of amplitude and direction of in vivo immune responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens // Eur. J. Immunol. 1998. -V.28. -P.1089-1103.

102. Kim. J.J., Bagarazzi M.L., Trivedi N. Engineering of in vivo immune responses to DNA immunizations via codelivery of costimulatory molecule genes // Nat. Biotechnol. 1997. - V.l7. - P.614-646.

103. Kitces, E.N., Morahan, P.O., Tew, J.G., and Murray, B.K. Protection from oral herpes simplex virus infection by a nucleic acid-free virus vaccine // Infect. Immun. 1977. - V.16. -P.955-960.

104. Klein T.M. Wolf E.D. Wu R. et al. High velocity microprojectiles for delivering nuclei acids into living cells // Ibid 1987 - V.327. - P.70-73.

105. Klein T.M., Arentzen R., Lewis P.A., Fitzpatric-McElligot S. Transformation of microbes, plants and animals by particle bombardment // Biotechnology. -1992.- V.10. -P.286-291.

106. Klimova R., Zelenina I., Kolesnicov V., Zelenin A., Kushch A. 9-th Meeting of the European Society of Gene Therapy. 2001. - Antalia, Turkey. -Abstract book.-P.201.

107. Koelle D.M., Corey L. Recent progress in herpes simplex virus immunobiology and vaccine research // Clinical microbiology reviews. -2003-V.16.-№.1.-P.96-113.

108. Kohl S. A hypothesis on the pathophysiology of neonatal herpes simplex virus encephalitis: clinical recurrence after asymptomatic primary infection // Pediatr. Infect. Dis. J. 1990. - V.9. - P.307-308.

109. Kramer S.M., Carwer M.E. Serum-free in vitro bioassay for the detection of tumor necrosis factor // J. Immunol. Meth. 1986. - V.93. - P.201-206.

110. Lasky, L.A., Dowbenko, D., Simonsen, C.C., and Berman, P.W. Protection of mice from lethal herpes-simplex virus-infection by vaccination with a secreted form of cloned glycoprotein-D // Bio-Technology. 1984. - V.2. - P.527.

111. Loomis-Huff R., Jennifer E., et al. Immunogenicity of a DNA vaccine against herpes virus in mice and rhesus macaques // Vaccine. 2001. - V.19. - P.4865-4873.

112. Maecker H.T., Umetsu D.T., DeKruyff R.H., Levys S. Cytotoxic T cell responses to DNA vaccination: dependence on antigen presentation via class II MHC // J. Immunol. -1998. V.161. - Iss.12. - P.6532-6536.

113. Maggi E., Parronchi P., Manetti R. et al. Reciprocal regulatory effects of IFN-gamma and IL-4 on the in vitro development of human Thl and Th2 clones // J. Immunol. 1992. - V.148. - P.2142-2147.

114. Manickan E, Rouse B.T. Roles of different T-cell subsets in control of herpes simplex virus infection determined by using T-cell deficient mouse model // J. Virol. 1995. - V.69. - P.8178-8179.

115. Mannel D.N., Moore R.N., Mergenhagen S.E. Macrophages as a source of tumoricidal activity (tumor-necrotizing factor) // Infect. Immunol. -1980. -V.30. P.523-530.

116. Martins L.P., Lau L.L., Asano M.S., Ahmed R. DNA vaccination against persistent viral infection // J. Virol. 1995. - V.69. - №4. - P.2574-2582.

117. McDermott, M.R., Graham, F.L., Hanke, Т., and Johnson, D.C. Protection of mice against lethal challenge with herpes simplex virus by vaccination with an adenovirus vector expressing HSV glycoprotein В // Virology. — 1989. — V. 169.- P.244-247.

118. Meignier, В., Longnecker, R., and Roizman, B. In vivo behavior of genetically engineered herpes simplex virus R7017 and R7020. Construction and evaluation in rodents // J. Infect. Dis. 1988. - V.158. - P.602-614.

119. Mertz, G.J. et al. Double-blind, placebo-controlled trial of a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine in persons at high risk for a genital herpes infection // J. Infect. Dis. 1990. - V.161. - P.653-660.

120. Mertz, G.J. et al. Herpes simplex virus type-2 glycoprotein-subunit vaccine: tolerance and humoral and cellular responses in humans // J. Infect. Dis. 1984.- V.150. P.242-249.

121. Meyer J.D., Yurt R.W., Duhaney R. et al. Tumor necrosis factor-enhanced leukotriene B4 generation and chemotaxis in human neutrophils // Arch. Surg. -1988. V.123. - P.1454-1458.

122. Mikloska Z., Bosnjak L., Cunningham A.L. Immature monocyte-derived dendritic cells are productively infected with herpes simplex virus type 1 // J. Virol. 2001. - V.75. - P.5958-5964.

123. Minami M, Kita M, Yan X.Q. et all. Role INF-gamma and tumor necrosis factor-alpha in herpes simplex virus type 1 infection // J Intrferon Cytokine Res.- 2002. -V.22. P.671-676.

124. Mocarski, E.S., Post, L.E., and Roizman, B. Molecular engineering of the herpes simplex virus genome: insertion of a second L-S junction into the genome causes additional genome inversions // Cell. 1980. - V.22. - P.243-255.

125. Montgomery R.L., Warner M.S., Lum B.J., Spear P.G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family // Cell. 1996. - V.87. - P.427-436.

126. Moore A.C., Kong W.P., Chakrabarti B.K., Nabel G.J. Effects of antigen and genetic adjuvants on immune responses to human immunodeficiency virus DNA vaccines in mice // J. Virol. 2002. - V.76. - P.243-250.

127. Murray D.R., Freeman G.L. Tumor necrosis factor-a induces a biphasic effect on myocardial contractility in conscious dogs // Circ. Res. 1996. - V.28. -P.964-971.

128. Nascimento M.C., Sumita L.M., deSouza V.A., Pannuti C.S. Detection and direct typing of herpes simplex virus in perianal ulcers of patients with AIDS by PCR // Journal of Clinical Microbiology. 1998. - V.36. - №.3. - P.848-849.

129. Nasemann, Т., and Schaeg, G. Herpes simplex virus, type II: microbiology and clinical experiences with attenuated vaccine // Hautarzt. 1973. - V.24. -P.133-139.

130. Nass P.H., Karen L.E., Jerry P.W. Protective immunity against herpes simplex virus generated by DNA vaccination compared to natural infection // Vaccine. 2001. - V. 19. - P.1538-1546.

131. Nesmeyanov V., Golovina Т., Valyakina Т., Andronova T.M. Cellular and molecular mechanisms of biological activity of muramyl peptides // Immunotherapy of Infections. 1994. - P.203-212.

132. Nesmeyanov V.A., Khaidukov S.V., Komaleva R.L., Andronova T.M. et al. Muramylpeptides augment expression of la-antigens on mouse macrophages // Biomed. Sci. 1990. - V.l. -P.151-154.

133. Pachuk C.J., Arnold К, Herold R.B. et all. Humoral and cellular immune responses to herpes simplex virus-2 glycoprotein D generated by facilitated DNA immunization of mice // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1998. -V.226. - P.234.

134. Paine R 3rd., Wilcoxen S.E., Morris S.B. et al. Transgenic overexpression of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in the lung prevents hyperoxic lung injury // Am. J. Pathol. 2003. - V.163. - P.2397-2406.

135. Pan C.H., Chen H.W., Tao M.H. Modulation of immune responses to DNA vaccines by codelivery of cytokine genes // J. Formos. Med. Assoc. 1999. — V.98. - P.722-729.

136. Pepos J.S., Leib D.A., Stuart P.M., Easty E.L. Herpes simplex virus diseases: anterior segment of the eye // Ocular Infection and Immunity. 1996. — P.905-932.

137. Pereira L., Ali M., Kousoulas K. Domain structure of herpes simplex virus 1 glycoprotein B: Neutralizing epitopes map in regions of continuous and discontinuous residues // Virology. 1989. - V.172. - P. 11-24.

138. Ratner A., Clark W.R. Role of TNF-alpha in CD8+ cytotoxic T lymphocyte-mediated lysis //J. Immunol. 1993. - V.150. -P.4303-4314.

139. Rieckmann P., D'alessandro F., Nordan R. P. et al. IL-6 and tumor necrosis factor-a: autocrine and paracrine cytokines involved in В cell function // J. Immunol. 1991. - V.146. -P.3462-3468.

140. Robinson H.L., Torres C.A. DNA vaccines // Semin. Immunol. 1997. - V.9. -P.271-283.

141. Rossol-Voth R., Rossol S., Schutt K.H. et al. In vivo protective effect of tumour necrosis factor alpha against experimental infection with herpes simplex virus type 1 // J. Gen. Virol. 1991. - V.72. - P.143-147.

142. Rothel J.S., Scow H.F., Lightwiers M.W. et al. The use of recombinant ovine IL-ip and TNF-a as natural adjuvants and their physiological effects in vivo // Immunol. Cell Biol. 1998. - V.76. - P.167-172.

143. Ruitenberg K.M., Walker C., Wellington J.E. et al. Potential of DNA-mediated vaccination for equine herpesvirus 1 // Veterinary Microbiology. -1999.-V.68.-P. 35-48.

144. Sarrias M.R., Whitbeck J.C., Rooney I. et al. The three HveA receptor ligands, gD, LT-alpha and LIGHT bind to distinct sites on HveA // Mol. Immunol. -2000. V.37. - P.665-673.

145. Sheppard B.C., Fraker D.L., Norton J.A. Prevention and treatment of endotoxin and sepsis lethality with recombinant human tumor necrosis factor // Surgery. 1989.- V.106.-P.156-161.

146. Sin J., Kim J.J., Pachuk C. et al. DNA vaccines encoding interleukin-8 and RANTES enhance antigen-specific Thl-type CD4(+) T-cell-mediated protective immunity against herpes simplex virus type 2 in vivo // J. Virol.2000. V.74. - P. 11173-11180.

147. Sin J.I., Ayavo V., Boyer J., et al. Protective immune correlates can segregate by vaccine type in a murine herpes model system // Int. Immunology. — 1999. -V.l 1. -P.1763-1773.

148. Sin J.I., Kim J., Dang K., et al. LFA-3 plasmid DNA enhances Ag-specific humoral- and cellular- mediated protective immunity against herpes simplex virus-2 in vivo: involvement of CD4+ T cells in protection // Cell Immunol.2001. V.203. - P. 19-28.

149. Smith, G.L., Mackett, M., and Moss, B. Infectious vaccinia vims recombinants that express hepatitis В virus surface antigen // Nature. 1983. -V.302. - P.490-495.

150. Socinski M.A., Cannistra S.A., Sullivan R. et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces the expression of the CD1 lb surface adhesion molecule on human granulocytes in vivo // Blood. 1988. - V.72. - P.691-697.

151. Soltz-Szots, J. Therapy of recurrent Herpes simplex // Z. Haut. Geschlechtskr. 1971. - V.46. - P.267-272.

152. Spear P.G. A first step towards understanding membrane fusion induced by herpes simplex virus // Mol. Cell. 2001. - V.8. - P.2-4.

153. Spear P.G., Eisenberg R.J., Cohen G.H. Three classes of surface receptors for alphaherpesvirus entry // Virology. 2000. - V.275. - P. 1-8.

154. Stanbeny, L.R., Bernstein, D.I., Burke, R.L., Pachl, C., and Myers, M.G. Vaccination with recombinant herpes simplex virus glycoproteins: protection against initial and recurrent genital herpes // J. Infect. Dis. 1987. - V.155. -P.914-920.

155. Stanberry, L.R., Myers, M.G., Stephanopoulos, D.E., and Burke, R.L. Preinfection prophylaxis with herpes simplex vims glycoprotein immunogens: factors influencing efficacy // J. Gen. Virol. 1989. - V.70. - P.3177-3185.

156. Straus S.E., Corey R.L., Tigges A.G. et all. Placebo-controlled trial of vaccination with recombinant glycoprotein D of herpes simplex vims type 2 for immunotherapy of genital herpes // Lancet. 1994. - V.343. - P. 1460-1463.

157. Sun X., Hodge L.M., Jones H.P. et al. Co-expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor with antigen enhances humoral and tumor immunity after DNA vaccination // Vaccine. 2002. - V.20. - P. 14661474.

158. Sykes K.F., Lewis M.G., Squires В., Johnston S.A. Evaluation of SIV libraiy vaccines with genetic cytokines in a macaque challenge // Vaccine. 2002. -V.20. - P.2382-2395.

159. Tanaka Y., Fujii Т., Yamana H. et al. Experimental gene therapy using p21Wafl gene for esophageal squamous cell carcinoma by gene gun technology // Int. J. Mol. Med. 2004. - V.14. - P.545-551.

160. Tizard M., Chan W.L. Differential T cell response induced by certain recombinant oligopeptides of Herpes simplex vims glycoprotein В in mice // J.Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.1625-1632.

161. Tracey K.J., Beutler В., Lowry S.F. et al. Shock and tissue injury induced by recombinant human cachectin // Science. 1986. - V.24. - P.470-474.

162. Trillet-Lenoir V., Green J., Manegold C. et al. Recombinant granulocyte colony stimulating factor reduces the infectious complications of cytotoxic chemotherapy // Eur. J. Cancer. 1993. - V.29. - P.319.

163. Ulmer J.B., Donnelly J.J., Parker S.E. et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein // Science. 1993. -V.259 - P.l 745-1749.

164. Wachsman, M. et al. Protection of guinea pigs from primary and recurrent herpes simplex vims (HSV) type 2 cutaneous disease with vaccinia vimsrecombinants expressing HSV glycoprotein D // J. Infect. Dis. 1987. - V.l55. -P.l 188-1197.

165. Wada H., Noguchi Y., Marino M.W., Dunn A.R., Old L.J. T cell functions in granulocyte/macrophage colony-stimulating factor deficient mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.12557-12561.

166. Wang J.M. Griffin J.D., Rambaldi A. et al. Induction of monocyte migration by recombinant macrophage colony-stimulating factor // J. Immunol. 1988. -V. 141(2). -P.575-579.

167. Webster R.G., Robinson H.L. DNA Vaccines A Review of Development // Biodrugs. - 1997. - V.8. - Iss.4. - P.273-292.

168. Wedlock D.N., Gon L.P., McCarthy A.R. et al. Physiological effects and adjuvanticity of recombinant brushtail possum TNF-a // Immunology and Cell Biology. 1999. - V.77. - P.28-33.

169. Weisbart R.H., Kwan L., Golde D.W., Gasson J.C. Human GM-CSF primes neutrophils for enhanced oxidative metabolism in response to the major physiological chemoattractants // Blood. 1987. - V.69. - P. 18-21.

170. Whithly R.S. Herpes Simplex Virus (in Fields Virology ed. by DM Knipe and RM Howley) // Lippincott Williams & Wilkins. 2001. - P.2461-2509.

171. Whitley R.J., Cobbs C.G., Alford C.A.Jr. et al. Diseases that mimic herpes simplex encephalitis: diagnosis, presentation and outcome // NIAD Collaborative Antiviral Study Group. JAMA. 1989. - V.262. - P.234-239.

172. Whitley R.J., Roizman B. Herpes simplex virus infection // Lancet. 2001. -V.357. -P.1513-1518.

173. Wolff J.A., Lederberg L. A history of gene transfer and therapy // Gene therapeutics. Methods and applications of direct gene transfer. 1994. - P.3-25.

174. Xiang Z.Q., Spitalnik S., Tran M. et al. Vaccination with a plasmid vector carrying the rabies virus glycoprotein gene induces protective immunity against rabies virus // Virology. 1994. - V.199. - P. 132-140.

175. Yokota S., Gepret T.D., Lipsky P.E. Enhancement of antigen- and mitogen-induced human T-lymphocyte proliferation by tumor necrosis factor-a // J. Immunol.- 1988.-V.140.-P.531-536.

176. Yokoyama M., Zhang J., Whitton J.L. DNA immunization confers protection against lethal lymphocytic choriomeningitis virus infection // J. Virol. 1995. -V.69. — P.2684-2688.

177. Young K.L. Linch D.C. Differential effects of granulocyte- and granulocyte-macrophage colony-stimulating factors (G- and GM-CSF) on neutrophil adhesion in vitro and in vivo // Eur. J. Haematol. 1992. - V.49 - P.251-259.