Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфо́ров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Миронова Кристина Евгеньевна

• Миронова Кристина Евгеньевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Миронова Кристина Евгеньевна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические характеристики фотосенсибилизаторов

2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы

2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG

2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG

2.3.2. Кофактор MiniSOG - производное рибофлавина

2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG

2.4. Механизм клеточной гибели при воздействии ФС на клетки

2.4.1. Апоптоз

2.4.1.1. Основные пути внутренней передачи сигнала в ответ на ФДТ

2.4.1.2. ФДТ-индуцируемый внутренний путь гибели клеток, независимый от каспаз

2.4.2. Аутофагия

2.4.3. Некроз

2.5. Механизмы клеточной защиты

2.6. Нацеливание фотосенсибилизаторов на рецептор НЕЯ2/пеи

2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств

4.1.1. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG

4.1.2 Характеристика функциональных свойств 4D5scFv-miniSOG

4.1.2.1 Связывание с рецептором НЕЯ2/пеи - иммунохимический метод

4.1.2.2 Спектральные свойства 4D5scFv-miniSOG

4.1.2.3 Специфичность связывания с HER2/neu на клетках

4.1.2.4 Конкурентное ингибирование

4.1.2.5 Внутриклеточная локализация 4D5scFv-miniSOG

4.2. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облучении синим светом

4.2.1 Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG in vitro

4.2.2 Сочетанное действие 4D5scFv-miniSOG и таксола®

4.2.3 Выяснение механизмов гибели клетки под воздействием 4D5scFv-miniSOG

4.2.3.1 Микроскопия

4.2.3.2 Активность каспазы-3

4.2.3.3 Фрагментация ДНК

4.3. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров

4.3.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ:4D5scFv-miniSOG, возбуждаемых ближним ИК-светом

4.3.1.1 Перекрывание спектров

4.3.1.2 Стабилизация НАФ в водных растворах

4.3.1.3 FRET

4.3.1.4 Фёрстеровский радиус

4.3.1.5 Доказательство FRET

4.3.1.6 Конъюгация НАФ с белками

4.3.2. Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом

4.3.2. 1 Получение и характеристика адресного белка DARPin-mCherry

4.3.2.2 Получение и характеристика связывания с клетками конъюгатов НАФ-РМАОЛАЯРт-т^еп-у

4.3.2.3 Оценка цитотоксичности конъюгата НАФ(Тт3+)РМАО^АЯРт-т^еггу при облучении ближним ИК-светом

4.3.3. Оценка использования рибофлавина в качестве ФС

4.3.3.1. Изучение способности рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых клетках

4.3.3.2. Изучение онкоспецифической цитотоксичности рибофлавина при облучении УФА1

Выводы:

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

1. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунофотосенсибилизаторы на основе рибофлавина и апконвертирующих нанофосфо́ров для фотоиндуцированного разрушения раковых клеток»

Актуальность темы исследования

В современной онкологии все большее значение приобретают высокотехнологичные методы диагностики и лечения, разработка которых требует объединения физических, химических и биологических подходов для увеличения эффективности и безопасности лечения. Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой многообещающий и перспективный метод разрушения раковых клеток, который, по сравнению с другими современными методами воздействия на злокачественные новообразования (химиотерапия, лучевая терапия), является наименее агрессивным по отношению к здоровым тканям. ФДТ позволяет воздействовать на опухоль локально, активируя светом предварительно доставленный в опухоль химический фотосенсибилизатор (ФС), что приводит к образованию активных форм кислорода, вызывающих гибель клеток. Препараты, применяемые в ФДТ, были одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) уже 20 лет назад. В России данный вид терапии был внесен в «Перечень видов высокотехнологичной медицинской помощи, оказываемой за счет средств федерального бюджета в федеральных медицинских учреждениях» в 2007 году.

На сегодняшний день ФДТ с использованием низкомолекулярных ФС успешно применяется в лечении разных видов опухолей, однако имеет ряд недостатков: только поверхностное воздействие, недостаточная селективность и частое возникновение местных неспецифических реакций. Поэтому актуальной задачей является поиск новых ФС, которые могли бы удовлетворять одновременно нескольким условиям: избирательно накапливаться в опухолевой ткани; не вызывать фотодерматит; иметь высокий квантовый выход образования синглетного кислорода; обладать постоянством состава и свойств как при хранении, так и при введении в организм; не являться токсичными и относительно быстро выводиться из организма.

Многие современные подходы к созданию ФС имеют своей целью адресную доставку молекул к опухоли. В настоящее время селективности воздействия добиваются либо путем пассивного преимущественного накопления ФС в опухоли за счет различий в метаболизме и внутриклеточных процессах в опухоли по сравнению со здоровыми тканями, либо путем активной адресной доставки ФС к опухолевым клеткам [1]. Поскольку оба подхода имеют ряд значительных недостатков, создание адресных ФС, избирательно воздействующих только на опухолевые клетки определенного молекулярного профиля, остается весьма актуальной проблемой.

Достижения современной молекулярной онкологии в области изучения механизмов опухолевого перерождения и резистентности опухолей к терапии свидетельствуют о необходимости комбинированных подходов к лечению онкологических заболеваний. В клинической практике для усиления эффекта ФДТ часто прибегают к использованию комбинированной терапии в сочетании с цитостатиками. Изучение их совместного действия с разрабатываемыми ФС также представляет актуальную задачу.

Используемые сегодня ФС, как правило, возбуждаются коротковолновым светом, не проникающим в глубь тканей, поэтому их применяют для лечения либо небольших поверхностных опухолей на коже и слизистой оболочке, либо опухолей на внутренней поверхности различных органов с локальной доставкой света оптоволокном в сочетании с лапароскопией. Актуальной проблемой является расширение области применения ФС, поиски решения которой лежат в двух направлениях: создание нового поколения ФС с максимумами поглощения в «окне прозрачности» биоткани (750-1000 нм), что позволит воздействовать на патологический очаг на глубине тканей, и поиск альтернативных подходов для доставки коротковолнового света в глубине тканей.

Разработка новых адресных ФС с улучшенными фотолюминесцентными характеристиками и поиск альтернативных подходов для доставки возбуждающего света в глубь тканей является важной задачей, решение которой позволит получить новые соединения, перспективные для фундаментальных исследований и терапии социально значимых опухолевых заболеваний, а также позволит создать общую методическую основу для конструирования аналогичных адресных ФС с другими иммунологическими характеристиками.

Цель работы: создание и изучение свойств флавинового рекомбинантного ФС, специфичного к опухолевым клеткам аденокарциномы молочной железы, и поиск подходов к доставке возбуждающего УФА1 и синего света вглубь тканей с использованием апконвертирующих нанофосфоров

Задачи:

1) Создание, физико-химическая и иммунохимическая характеристика рекомбинантного иммуноФС на основе флавинового белка и адресных мини-антител;

2) Изучение фотоцитотоксичности рекомбинантного иммуноФС, состоящего из флавинового белка и адресных мини-антител, на линии НЕЯ2/пеи-гиперэкспрессирующих опухолевых клеток;

3) Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров.

а) Создание и исследование донорно-акцепторных пар, возбуждаемых ближним ИК-светом, на основе апконвертирующих нанофосфоров и рекомбинантного флавинового иммуноФС.

б) Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые получен и охарактеризован генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-miniSOG на основе адресных противоопухолевых мини-антител 4D5scFv и фототоксичного белка miniSOG. Показана опосредованная рецептором интернализация иммуноФС 4D5scFv-miniSOG и селективная фототоксичность по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека.

Впервые изучена возможность доставки УФА1 (340-400 нм) и синего света, возбуждающего флавиновые ФС, к опухолевым клеткам с использованием сочетания адресных флавиновых ФС и апконвертирующих нанофосфоров (НАФ). Впервые показана способность НАФ (донор энергии), характеризующихся УФА1 и синим излучением, передавать энергию возбужденного состояния на фототоксичный белок 4D5scFv-miniSOG (акцептор энергии) по механизму ферстеровского резонансного переноса энергии и вычислен ферстеровский радиус, отделяющий донор от акцептора . Впервые разработан способ адресной доставки НАФ к клеткам аденокарциномы молочной железы человека с помощью адресного полипептида DARPin-mCherry, специфичного к опухолевому рецептору HER2/neu. Впервые показана селективная фотоцитотоксичность адресного ФС НАФЛАИРт-т^еггу по отношению к клеткам аденокарциномы молочной железы человека при облучении ИК-светом.

Степень достоверности и апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: XI конференция «Лазеры и лазерно-информационные технологии: фундаментальные проблемы и применения» (2014, Шатура); 5th International conference on advanced nanomaterials (2014, Авейру, Португалия); VI Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (2013, Москва, Россия); Международная молодежная научно-практическая

конференция "Биофизика биоэнергетических процессов" (2013, Звенигород, Россия); IV International Symposium «Topical problems of biophotonics - 2013» (2013, Нижний Новгород, Россия); XXIV Зимняя молодежная научная школа ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2012, Москва, Россия); 16-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2012, Пущино, Россия).

2. Обзор литературы

Фотосенсибилизаторы различной природы для фотодинамической терапии рака и их механизмы действия

2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические

характеристики фотосенсибилизаторов

ФДТ включает в себя 3 основных фактора: ФС, свет и кислород. Все факторы безопасны сами по себе, но в совокупности обладают цитотоксичностью: в кислородной среде при облучении ФС запускает фотохимическую реакцию с выходом активных форм кислорода (АФК), которые, являясь токсичными, приводят к повреждению клетки. Противоопухолевое действие ФДТ обусловлено тремя взаимосвязанными процессами: прямым токсическим действием АФК на клетки, повреждением сосудов опухоли и запусканием обильной воспалительной реакции, которая способна привести к развитию иммунного ответа. Относительный вклад каждого из этих процессов во многом зависит от типа и дозы ФС, промежутка времени между введением ФС и облучением, дозы и интенсивности облучения, концентрации кислорода в опухоли, а, возможно, и от других, плохо изученных факторов. Однако выбор ФС является наиболее критичным для успешного проведения ФДТ.

Как правило, ФС в основном состоянии имеет 2 спаренных электрона с противоположными спинами с суммарным спином S=0 и мультиплетностью, равной 1. Такое состояние называется синглетным, а конфигурация всех электронов на их низшей энергетической орбитали -основным состоянием S0. Поглотив квант света определенной энергии, один из электронов этой пары переходит на более высокую энергетическую орбиталь. В зависимости от энергии, полученной ФС, он переходит в возбужденное синглетное состояние Sx, но сохраняет тот же спин, что и в синглетном состоянии. Такое возбужденное состояние является короткоживущим, и ФС теряет энергию, которая переходит в свет либо в тепло. В возбужденном синглетном состоянии Sx ФС также может запускать процесс так называемой интеркомбинационной конверсии, которая заключается в смене направления спина возбужденного электрона. Это приводит к образованию триплетного состояния ФС (Т*), электроны которого имеют параллельные спины [2]. Именно триплетное возбужденное состояние ФС является фотореакционноспособным., и большинство ФС имеют высокий квантовый выход интеркомбинационной конверсии. Как правило, триплетные состояния характеризуются относительно долгим временем жизни (вплоть до секунд).

Находясь в возбужденном триплетном состоянии, ФС может принимать участие в двух типах реакций. В реакциях I типа ФС может передавать электрон (или протон) на кислород или другие близлежащие молекулы, например, на мембрану клетки, формируя анион-радикал или катион-радикал, соответственно (рис. 1, реакции 1-3) [3]. Радикалы с большой вероятностью могут вступать в реакции с кислородом с образованием активных форм кислорода. Зачастую в результате фотохимических реакций I типа путем переноса электрона от ФС на молекулярный кислород образуется супероксид-анион (О2 ) (рис. 1, реакция 3). В биологических системах

О2 не отличается большой реакционноспособностью, но может в результате реакции,

катализируемой SOD, превращаться в перекись водорода (Н2О2), которая легко диффундирует через мембрану клетки (рис. 1, реакция 5). В высоких концентрациях Н2О2 может реагировать с

О2 , с образованием высокореактивного гидроксильного радикала ОН (реакция Габера-Вейса (6) на рис. 1). ОН легко диффундирует через мембрану клетки и способен наносить

повреждения далеко за пределами одной клетки. Также ОН может образоваться из

супероксид-аниона в результате реакции Фентона в присутствии ионов металлов (железа или меди, рис. 1, реакции 7 и 8) [4].

В реакциях II типа ФС в триплетном состоянии напрямую переносит энергию (не электроны) на молекулярный кислород, который, являясь в основном состоянии триплетным O2(3E"g), переходит в возбужденную синглетную форму O2(1Ag или 1O2) (рис. 1, реакция 4). В клетках время жизни 1O2 очень коротко (~ 10-320 нс), что сокращает их диффузию до ~10-55 нм [5, 6]. Поэтому фотодинамическому воздействию подвергаются только те молекулы и структурные элементы клетки, которые оказываются вблизи локализации ФС внутри клетки [5].

Реакции I и II типа могут протекать одновременно и конкурировать между собой в зависимости от природы ФС, его дозы, концентрации кислорода и рН среды [2, 4].

Цитотоксические реакции

А (О

«А ОГ

Субстрат!*"

Окисление

Субстрапов __

С Л

Повреждение клетки

Рисунок 1. Фотохимических реакции в процессе ФДТ. Различные типы первичных и вторичных фотохимических реакций вызывают образование АФК и дозозависимое повреждение клетки. Н2О2 - перекись водорода; O2(*Ag) - синглетный кислород (возбужденное состояние); O2(3E"g) -триплетный кислород (основное состояние); О2 • - супероксид-анион; ОН - гидроксильный радикал; SOD - супероксиддисмутаза.

2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы

Большинство используемых в онкологической практике ФС имеют тетрапиррольную структуру, сходную с протопорфирином гемоглобина. В качестве ФС используют очищенное природное соединение, что позволяет контролировать его качество без лишних затрат на производство, а также гарантирует стабильность вещества при хранении.

Первый используемый в лечении рака ФС представлял собой водорастворимую смесь порфиринов, производных гематопорфирина ^D. Их очищенная форма, порфимер натрия, позже стала основой коммерческого препарата Фотофрина. Несмотря на то, что порфимер натрия широко используется и по сей день, он имеет некоторые недостатки: сохранение фоточувствительности кожи в течение длительного времени после отмены препарата и относительно низкая величина поглощения ФС при 630 нм. Исследователями было приложено немало усилий по поиску ФС с улучшенными характеристиками, и было предложено несколько сотен соединений, потенциально пригодных для ФДТ опухолей. В таблице 1 приведены сведения о наиболее перспективных ФС, прошедших клинический контроль (как одобренных, так и испытываемых).

На сегодняшний день 5-аминолевулиновая кислота (АЛК), биосинтетический предшественник ФС протопорфирина, нашла множество применений. Так, АЛК или сложные эфиры АЛК могут применяться перорально или местно. Эти вещества являются неактивной

формой лекарства, и только в раковых клетках с повышенной активностью 5-аминолевулинатсинтазы преобразуется в активный ФС протопорфирин [7].

Таблица 1. Фотосенсибилизаторы (ФС), используемые в клинической практике (серым цветом выделены ФС, разрешенные к применению в России) [7].

Фотосенсибилизатор Химическое название ФС Длина волны возбужден ия, нм Список тканей и органов, пораженных опухолью, для лечения которых применяется ФС

Порфимер натрия (Фотофрин) (HPD) Порфирин 630 Легкие, пищевод, желчный проток, мочевой пузырь, головной мозг, яичники

АЛК Предшественник порфирина 635 Кожа, мочевой пузырь, головной мозг, пищевод

Сложные эфиры АЛК Предшественник порфирина 635 Кожа, мочевой пузырь

Темопорфин (Фоскан) (mTHPC) Хлорин 652 Голова и шея, легкие, головной мозг, кожа, желчный проток

Вертепорфин Хлорин 690 Глаз, поджелудочная железа, кожа

HPPH (производные гематопорфирина) Хлорин 665 Голова и шея, пищевод, легкие

SnEt2 (Purlytin) Хлорин 660 Кожа, грудь

Talaporfin (LS11, MACE, NPe6) 660 Печень, толстая кишка, головной мозг

Ce6-PVP (Fotolon), Ce6 derivatives (Radachlorin, Photodithazine) Хлорин 660 Носоглотка, головной мозг

Silicon phthalocyanine (Pc4) Фталоцианин 675 Кожа (Т-клеточная лимфома)

Padoporfin (TOOKAD) Бактериохлорин 672 Простата

Motexafin lutetium (Lutex) Таксафирин 732 Молочная железа

Важным свойством всех перечисленных низкомолекулярных ФС является их способность неспецифически аккумулироваться в опухоли. Это может быть связано как с повышенной проницаемостью сосудов опухоли и эффектом удерживания (the enhanced permeability and retention effect, EPR-эффект) [8], так и со способностью ФС связываться с липопротеинами низкой плотности (low-density lipoprotein, LDL) и селективно доставляться к опухоли [9].

2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG

Генетически кодируемые ФС являются новым классом ФС, имеющим белковую природу. На сегодняшний день известно всего два таких белка: KillerRed и miniSOG. Они находят широкое применение в электронной микроскопии, хромофор-ассистируемой световой инактивации (chromophore-assisted light inactivation, CALI) белков и оптогенетике [10]. Использование белков - фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии является новым и перспективным направлением

Большим преимуществом белков - фотосенсибилизаторов является возможность их модификации с использованием генно-инженерных методов. В результате становится возможным специфически доставлять модифицированные ФС в различные клеточные компартменты (ядро или лизосомы) либо к различным типам клеток, а также контролировать генерацию АФК как по времени, так и по локализации. Это является основным отличием генетически кодируемых ФС от низкомолекулярных. Генетически кодируемые ФС могут вызывать различные эффекты при облучении, например: предотвращать деление клеток при ядерной локализации [11], вызывать некроз клеток при мембранной локализации [3] или апоптоз при лизосомной локализации [12].

2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG

На сегодняшний день белковый ФС miniSOG ("mini Singlet Oxygen Generator") является вторым известным генетически кодируемым ФС после KillerRed. Данный белок был получен в лаборатории Р. Тсиена (R. Tsien) в 2011 году из LOV-домена (light, oxygen, and voltage) фототропина 2 Arabidopsis thaliana (AtPhot2), который отвечает за восприятие синего света [13]. Восприятие синего света обусловлено наличием хромофорной группы флавинмононуклеотида (ФМН) в составе LOV-домена. Под действием синего света ФМН в LOV-домене переходит в возбужденное состояние, энергия которого расходуется на формирование ковалентной связи с

цистеином [14]. В результате образуется цистеинил-флавиновый аддукт, который инициирует автофосфорилирование AtPhot2, что определяет роль этого белка как светозависимой протеинкиназы. В темноте ковалентная связь аддукта распадается обратно. Таким образом процесс представляет собой замкнутый фотоцикл [14, 15] (рис. 2).

Рисунок 2. Фотохимические и фотофизические превращения хромофорной группы ФМН в составе LOV-домена с образованием цистеинил-флавинового аддукта. Инициируемое светом образование ковалентной связи между цистеином и атомом С(4а) флавина. Энергия фотона синего света обозначена Ьу, звездочкой обозначено возбужденное синглетное состояние, Т -возбужденное триплетное состояние [4]

Чтобы направить энергию возбужденного состояния ФМН на образование синглетного кислорода в последовательности LOV2-домена AtPhot2 была произведена замена Cys426 на Gly с получением мутанта C426G, который лег в основу нового белка miniSOG. MiniSOG имеет 106 а. о., прочно связывается с простетической группой ФМН (К ~ 170 рМ). При индукции экспрессии белка бактериальная клетка поддерживает повышенный уровень синтеза ФМН для того, чтобы miniSOG был насыщен кофактором [13]. Также авторами было показано, что токсичный в условиях освещения белок miniSOG в отсутствие освещения не проявляет токсичности ни на клетках прокариот, ни на клетках эукариот.

2.3.2. Кофактор MiniSOG - производное рибофлавина

Флавинмононуклеотид, который включается в состав miniSOG, образуется в клетке из витамина В2, или рибофлавина (Рф) с участием фермента флавокиназы. Далее, в зависимости от нужд клетки, ФМН может преобразовываться в флавинадениндинуклеотид (ФАД) путем

о'

присоединения остатка АМФ (рис. 3). Боковая цепь в структуре флавинов играет важную роль в их связывании с флавопротеинами [16], в том числе с miniSOG. Также в связывание большинства флавиновых белков с простетической группой вносят вклад водородные связи, ионные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса. Формирование вторичных структур происходит с участием укладки Россмана .

Рисунок 3. Структура флавиновых производных [6]

Основу молекулы рибофлавина составляет изоаллоксазин, в котором сочетаются бензольный, пиразиновый и пиримидиновый циклы и остаток пятиатомного спирта - рибита в положении 10 (рис. 3). Рибофлавин флуоресцирует в желто-зеленой области (ХеХС ~ 450 нм, 565 нм) с наибольшей интенсивностью при рН 6-8. Рибофлавин стабилен в кислой среде и быстро разрушается в щелочной [17]. Способность рибофлавина легко окисляться и восстанавливаться лежит в основе его биологического действия. Полностью восстановленная форма Рф (два электрона в положениях N(1) и N(5)) не способна к флуоресценции и практически не поглощает видимый свет (рис. 4).

Рисунок 4. Спектр поглощения ФМН в окисленной и восстановленной формах.

Как и любой ФС, рибофлавин, находясь в возбужденном триплетном состоянии, может вступать в реакции I типа с образованием радикалов кислорода и в реакции II типа с образованием синглетного кислорода по конкурентному механизму. Исход зависит только от микроокружения молекулы - растворителя [18], концентрации кислорода [19] и самого ФС в среде. Так, Crozier-Reabe и соавт. было показано, что при высокой концентрации О2 в среде рибофлавин может служить более эффективным продуцентом синглетного кислорода по сравнению с экзогенным ФС - порфирином, используемым в ФДТ [20]. Данный результат имеет критическое значение для сравнения экспериментов in vitro (парциальное давление кислорода, рО2 ~ 150 мм рт. ст.) и in vivo (рО2 < 20 мм рт. ст.) [20]

В условиях хорошей аэрации (концентрация кислорода ~ 280 мкМ) при облучении УФА1 светом Рф эффективно продуцирует синглетный кислород с квантовым выходом Фд= 0.54. При низкой концентрации кислорода (менее 2 мкМ) выход 1O2 уменьшается до Фд< 0.2. Данный результат особенно важно принимать во внимание при исследовании всех эндогенных ФС, поскольку концентрация кислорода внутри клетки составляет не более 7.5 мкМ [21]. Это означает, что, находясь внутри клетки, ФС не способен к продуцировать максимально возможного количества 1O2. В то же время понижение концентрации кислорода может способствовать увеличению образования АФК (I тип реакций). Это предположение подтверждается результатами, полученными на культурах клеток, где авторы показали высокую цитотоксичность Рф для клеток, облученных в условиях гипоксии, в то время как для клеток, облученных в условиях хорошей аэрации, Рф оказался гораздо менее цитотоксичным [22]. Данный результат был зарегистрирован только при использовании низких доз облучения (до 5 кДж/ м2). Авторы объяснили эффект тем, что цитотоксичность обусловлена образованием не синглетного кислорода, а перекиси водорода.

2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG

MiniSOG, полученный генно-инженерным способом, имеет молекулярную массу 15.3 кДа, близкую к теоретической, и не склонен к олигомеризации. Как и все флавопротеины, miniSOG при возбуждении синим светом флуоресцирует в зеленой области спектра. Максимум поглощения белка приходится на Х=448 нм с плечом при Х=473 нм, а коэффициенты экстинкции при этих значениях составляют (16.7±0.7)*103 и (13.6±0.5)*103 М-1см-1, соответственно. Максимумы испускания белка находятся в области 500 и 528 нм, а квантовый выход флуоресценции Фд составляет 0.30[13].

Авторами [13] было продемонстрировано, что гибридные белки, состоящие из miniSOG и различных сигналов локализации, надлежащим образом локализуются как в культурах клеток млекопитающих, так и в живых объектах (нематодах, грызунах). Способность miniSOG к продуцированию синглетного кислорода используется для локального преобразования диаминобензидина в осмиофильный осадок, который детектируется в клетке при высоком разрешении. Таким образом, miniSOG позволяет использовать приемы флуоресцентной корреляционной спектроскопии и электронной микроскопии для анализа больших объемов ткани, фиксированной альдегидом, не прибегая к использованию эндогенных лигандов, красителей и детергентов для пермеабилизации. Также авторами [13] было показано, что miniSOG позволяет получать снимки высокого разрешения и информацию о локализации того или иного белка в трехмерном формате. Например, с использованием электронной микроскопии было показано, что близкородственные молекулы клеточной адгезии SynCAM1 и SynCAM2, при раздельном связывании с miniSOG, локализуются преимущественно на пресинаптической и постсинаптической мембранах, соответственно. В то же время локализация данной молекулы клеточной адгезии с использованием антител против SynCAM1 была затруднена [23].

В работе авторов [13] было показано, что при облучении miniSOG способен продуцировать синглетный кислород с квантовым выходом Фд=0.47 ± 0.05 [13], что близко к значению для свободного ФМН (0.51 ±0.07) [20]. В качестве сенсора для измерения данного показателя белка авторы использовали антрацен-9,10-дипропионовую кислоту (ADPA), а в качестве стандарта раствор ФМН. Позже, в 2013 году, группа физиков под руководством C. Flors исследовала кинетику образования и испускания 1О2 в ближней ИК области спектра при Х=1275 нм и показала, что Фд образования синглетного кислорода miniSOG значительно ниже заявленного ранее и составляет 0,03 [24]. То же значение было показано с применением мочевой кислоты в качестве сенсора синглетного кислорода. Примечательно, что проведение

эксперимента в дейтериевом PBS (dPBS) не привело к увеличению квантового выхода *О2, а в случае применения ADPA в качестве сенсора, более того, привело к его снижению (Таблица 2).

Таблица 2 Определение квантового выхода синглетного кислорода у белка miniSOG с применением различных методик [24]

Способ определения синглетного кислорода Фд

PBS dPBS

Люминесценция 0.03±0.01 0.03±0.01

Мочевая кислота 0.03±0.01 0.03±0.01

ADPA 0.42±0.02 0.18±0.02

Известно, что флавины способны к переносу энергии не только на !О2, но и на другие подходящие доноры электронов. Поэтому, в свете полученных результатов, авторы [24] сделали заключение, что помимо образования !О2 miniSOG способен окислять субстраты под действием света также по I типу фотоокислительных реакций. На рис. 5 представлена структура белка miniSOG, где зеленым цветом обозначены мутации в LOV-домене фототропина 2, специфичные для miniSOG.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Миронова Кристина Евгеньевна, 2015 год

Список литературы

1. Lamberti, M.J. Breast cancer as photodynamic therapy target: Enhanced therapeutic efficiency by overview of tumor complexity / M.J. Lamberti [et al] // World J Clin Oncol. - 2014. - Vol. 5, № 5.- P. 901-7.

2. Robertson, C.A. Photodynamic therapy (PDT): a short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT / C.A. Robertson [et al] // J Photochem Photobiol B. -2009. - Vol. 96, № 1. - P. 1-8.

3. Girotti, A.W. Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms / A.W. Girotti // J Photochem Photobiol B. - 2001. -Vol. 63, № 1-3 - P. 103-13.

4. Plaetzer, K. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: fundamental aspects / K. Plaetzer [et al] // Lasers Med Sci. - 2009. - Vol. 24, №2 - P. 259-68.

5. Dysart, J.S. Characterization of Photofrin photobleaching for singlet oxygen dose estimation during photodynamic therapy of MLL cells in vitro/ J.S. Dysart and M.S. Patterson // Phys Med Biol. - 2005. - Vol. 50, № 11 - P. 2597-616.

6. Миронов, А.Ф. Фотодинамическая терапии рака новый эффективный метод диагностики и лечения злокачественных опухолей / А. Ф. Миронов // Сорос.образоват. журн. - 1996. -№ 8. - С. 32 - 40

7. Agostinis, P. Photodynamic therapy of cancer: An update / P. Agostinis [et al]// CA: A Cancer Journal for Clinicians. - 2011. - Vol. 61, № 4 - P. 250-281.

8. Iyer, A.K. Polymeric micelles of zinc protoporphyrin for tumor targeted delivery based on EPR effect and singlet oxygen generation / A.K. Iyer [et al] // J Drug Target. - 2007. - Vol. 15, № 78 - P. 496-506.

9. Kessel, D. The role of low-density lipoprotein in the biodistribution of photosensitizing agents / D. Kessel [et al] // J Photochem Photobiol B. - 1992. - Vol. 14, № 3 - P. 261-2.

10. Serebrovskaya, E.O. Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein / E.O. Serebrovskaya [et al]// Biochem J. - 2011. - Vol.435, № 1 - P. 65-71.

11. Bulina, M.E. Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed / M.E. Bulina [et al] // Nat Protoc. - 2006. - Vol. 1, № 2 - P. 947-53.

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

Serebrovskaya, E.O. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed /E.O. Serebrovskaya [et al] // J Biomed Opt. - 2014. - Vol.19, № 7 -P. 1-4.

Shu, X. A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms / Xiaokun Shu [et al] // PLoS Biol. - 2011. - Vol. 9, № 4. - P. 110.

Katsura, H. Oligomeric structure of LOV domains in Arabidopsis phototropin / H. Katsura // FEBS Lett. - 2009. - Vol. 583, № 3 - P. 526-30.

Crosson, S. The LOV domain family: photoresponsive signaling modules coupled to diverse output domains / S. Crosson, S. Rajagopal and K. Moffat // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42, №1 - P. 2-10.

Chapman, S.K. Flavoprotein Protocols / S.K. Chapman and G. A.Reid // Methods in Molecular Biology. - 2010 - Springer-Verlag New York. LLC. - 246p.

Crozier-Reabe, K. Form follows function: structural and catalytic variation in the class a flavoprotein monooxygenases / K. Crozier-Reabe and G.R. Moran // Int J Mol Sci. - 2012. -Vol.13, № 12 - P. 15601-39.

Vakrat-Haglili, Y. The microenvironment effect on the generation of reactive oxygen species by Pd-bacteriopheophorbide / Y. Vakrat-Haglili [et al] // J Am Chem Soc. - 2005. - Vol. 127, № 17 - 6487-97.

Engl, R. Singlet Oxygen Generation by 8-Methoxypsoralen in Deuterium Oxide: Relaxation Rate Constants and Dependence of the Generation Efficacy on the Oxygen Partial Pressure / R. Engl [et al] // The Journal of Physical Chemistry B. - 2002. - Vol. 106, № 22 - P. 5776-5781. Baier, J. Singlet oxygen generation by UVA light exposure of endogenous photosensitizers / J. Baier [et al] // Biophys J. - 2006. - Vol. 91, № 4 - P. 1452-9.

Baumgartel, H. A. Clinacal oxygen pressure measurement ed. / H. A. Baumgartel, K. Ehrly, S. Lorenz and D. Lubbers // Renate Huch. - 1987: Springer.

Minami, H. Hypoxia potentiates ultraviolet A-induced riboflavin cytotoxicity / H. Minami [et al] // J Invest Dermatol. - 1999. - Vol. 113, № 1 - P. 77-81.

Biederer, T. SynCAM, a synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly / T. Biederer [et al] // Science. - 2002. - Vol. 297, № 5586 - P. 1525-31.

Ruiz-Gonzalez, R. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG / R. Ruiz-Gonzalez // J Am Chem Soc. - 2013. - Vol. 135, № 26 - P. 9564-7. Pimenta, F.M. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin / F.M. Pimenta [et al] // Photochem Photobiol. - 2013. - Vol. 89, № 5 - P. 111626.

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

Nonell, S. Time-resolved singlet oxygen detection / S. Nonell and S.E. Braslavsky // Methods Enzymol. - 2000. - Vol. 319 - P. 37-49.

Dysart, J.S. Characterization, of Photofrin photobleaching for singlet oxygen, dose estimation during photodynamic, therapy of MLL cells in vitro / J.S. Dysart and M.S. Patterson // Phys Med Biol. - 2005. - Vol. 50 - P. 2597-2616

Moan, J. Intracellular, localization of photosensitizers / J. Moan, [et al] // Ciba, Found Symp. -1989. - Vol. 146 - P. 95-11.

Allison, R.R. Oncologic photodynamic, therapy photosensitizers: a clinical, review / R.R. Allison and C.H. Sibata // Photodiagnosis Photodyn Ther. - 2010. - Vol. 7 - P. 61-75. Korbelik, M. Induction of tumor immunity by photodynamic therapy / M. Korbelik // J. Clin. Laser Med. Surg. 1996. - Vol. 14 - P. 329-334.

Garg, A.D. Immunogenic cell death, DAMPs and anticancer therapeutics: an emerging amalgamation / A.D. Garg, D. Nowis, J. Golab, P. Vandenabeele, D.V. Krysko, P. Agostinis // Biochim Biophys Acta. - 2010. - Vol. 1805 - P. 53-71.

Danial, N.N. Cell death: critical control points. / N.N. Danial and S.J. Korsmeyer // Cell. -2004. - Vol. 116 - P. 205-219.

Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes. / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev., Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 378-390.

Tait, S.W. Mitochondria and celld eath: outer membrane permeabilization and beyond / S.W. Tait and D R. Green // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010. - Vol. 11 - P. 621-632. Buytaert, E. Role of endoplasmic reticulum depletion and multidomain proapoptotic BAX and BAK proteins in shaping cell death after hypericin-mediated photodynamic therapy / E. Buytaert [et al] // FASEB J. - 2006. - Vol. 20 - P. 756-758.

Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic therapy / B.Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. - Vol. 14 - P. 4157-4172,

Tait, S.W. Caspase-independent cell death: leaving the set without the final cut / S.W. Tait and D R. Green // Oncogene - 2008. - Vol. 27 - P. 6452-61.

Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 378-90.

Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death / S. Elmore [et al] // Toxicol Pathol. -2007. - Vol. 35 - P. 495-516

Льюин Б. Клетки / под ред. Б. Льюин и др.; пер. с англ.- Л48: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 951 с.

Youle, R.J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate cell death / R.J. Youle and A. Strasser // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 47-59.

42. Westphal, D. Molecular biology of Bax and Bak activation and action / D. Westphal, G. Dewson, P.E. Czabotar and R.M. Kluck // Biochim. Biophys. Acta. -2011. - Vol. 1813 - P. 521-31.

43. Almeida, R.D. Intracellular signaling mechanisms in photodynamic therapy / R.D. Almeida [et al] // Biochim. Biophys. Acta. - 2004. - Vol. 1704 - P. 59-86.

44. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert, M. Dewaele and P. Agostinis // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1776. - P. 86-107.

45. Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic therapy / B. Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. - Vol. 14 - P. 4157-72.

46. Xue, L.Y. Photodamage to multiple Bcl-xL isoforms by photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc / L.Y. Xue, S.M. Chiu, A. Fiebig, D.W. Andrews and N.L. Oleinick // Oncogene - 2003. - Vol. 22 - P. 9197-04.

47. Rodriguez, M.E. Structural factors and mechanisms underlying the improved photodynamic cell killing with silicon phthalocyanine photosensitizers directed to lysosomes versus mitochondria / M.E. Rodriguez [et al] // Photochem. Photobiol. - 2009. - Vol. 85 - P. 11891200.

48. Marchal, S. Relationship, between subcellular localisation of Foscan and caspase activation in photosensitised, MCF-7 cells / S. Marchal, A. Francois, D. Dumas, F. Guillemin and L. Bezdetnaya // Br. J. Cancer - 2007. - Vol. 96 - P. 944-51.

49. Kessel, D. Ruthenium red-mediated suppression of Bcl-, 2 loss and Ca(2) release initiated by photodamage to the endoplasmic reticulum:, scavenging of reactive oxygen species / D. Kessel, M. Castelli and J.J. Reiners // Cell Death Differ. - 2005. - Vol. 12 - P. 502-11.

50. Ke, M.S. Apoptosis mechanisms related to the increased sensitivity of Jurkat T-cells vs A431, epidermoid cells to photodynamic therapy with the phthalocyanine Pc 4 / M.S. Ke [et al] // Photochem. Photobiol. - 2008. - Vol. 84 - P. 407-14.

51. Xue, L.Y. Differential responses of Mcl-1 in photosensitized, epithelial vs lymphoid-derived human cancer cells / L.Y. Xue, S.M. Chiu and N.L. Oleinick // Oncogene- 2005. - Vol. 24- P. 6987-92.

52. Kim, H.R. Enhanced apoptotic response to photodynamic, therapy after bcl-2 transfection / H.R. Kim, Y. Luo, G. Li and D. Kessel // Cancer Res. - 1999. - Vol. 59 - P. 3429-32.

52. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death, pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert [et al] // Biochim. Biophys. Acta - 2007. - Vol. 1776 - P. 86-107.

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

Usuda, J. Promotion of photodynamic therapy-induced apoptosis by the mitochondrial protein, Smac/DIABLO: dependence on Bax / J. Usuda [et al] // Photochem. Photobiol. - 2002. - Vol. 76_P. 217-23.

Chiu, S.M. Photodynamic therapyinduced, death of HCT 116 cells: apoptosis with or without Bax expression / S.M. Chiu, L.Y. Xue, K. Azizuddin and N.L. Oleinick // Apoptosis - 2005. -Vol. 10 - P.1357-68.

Scorrano, L. BAX and BAK regulation of endoplasmic reticulum Ca(2): a control point for, apoptosis / L. Scorrano [et al] // Science - 2003. - Vol. 300 - P.135-9.

Buytaert, E. Deficiency in, apoptotic effectors Bax and Bak reveals an autophagic cell death pathway initiated by, photodamage to the endoplasmic reticulum / E. Buytaert [et al] // Autophagy - 2006. - Vol. 2 - P. 238-40.

Chiu, S.M. Photodynamic therapyinduced, death of HCT 116 cells: apoptosis with or without Bax expression / S.M. Chiu, L.Y. Xue, K. Azizuddin and N.L. Oleinick // Apoptosis. - 2005. -Vol. 10 - P. 1357-68.

Kurokawa, M. Caspases and kinases in a death grip / M. Kurokawa [et al] // Cell - 2009. - Vol. 138 - P.838-54.

Youle, R.J. The BCL-2 protein family: opposing activities that mediate, cell death / R.J. Youle and A. Strasser // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 47-59.

Chipuk, J.E. Do inducers of apoptosis trigger caspase-independent cell, death? / J.E. Chipuk and D R. Green // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2005. - Vol. 6 - P. 268-75. Tait, S.W. Caspase-independent cell death: leaving the set without the, final cut / S.W. Tait and D R. Green // Oncogene - 2008. - Vol. 27 - P. 6452-61.

Galluzzi, L. Mitochondrial apoptosis without VDAC / L. Galluzzi and G. Kroemer // Nat. Cell Biol. - 2007. Vol. 9 - P. 487-9.

Lorenzo, H.K. Therapeutic potential of AIF-mediated caspase-independent, programmed cell death / H.K. Lorenzo and S.A. Susin // Drug Resist. Updat. - 2007. -Vol. 10 - P. 235-55. Ly, J.D. The mitochondrial membrane potential (deltapsi, (m)) in apoptosis: an update / J.D. Ly, D R. Grubb and A. Lawen // Apoptosis- 2003. -Vol. 8 - P. 115-28.

Norberg, E. An increase in intracellular Ca(2) is required for the activation of mitochondrial calpain to release AIF during cell death / E. Norberg [et al] // Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15 - P. 1857-64.

Vahsen, N. AIF, deficiency compromises oxidative phosphorylation / N. Vahsen [et al] // EMBO J. - 2004. - Vol. 23 - P. 4679-46.

Green, D.R. The pathophysiology of mitochondrial cell death / D.R. Green and G. Kroemer // Science - 2004. - Vol. 305 - P. 626-29.

69. Lorenzo, H.K. Therapeutic potential of AIF-mediated caspase-independent, programmed cell death / H.K. Lorenzo and S.A. Susin // Drug Resist. Updat. - 2007. - Vol. 10 - P. 235-55.

70. Norberg, E. An, increase in intracellular Ca(2) is required for the activation of mitochondrial calpain to, release AIF during cell death / E. Norberg [et al] // Cell Death Differ. - 2008. - Vol. 15 - P. 1857-64.

71. Sanges, D. Cross-talk between two apoptotic pathways activated by, endoplasmic reticulum stress: differential contribution of caspase-12 and AIF / D. Sanges and V. Marigo // Apoptosis -2006 - Vol. 11 - P. 1629-41.

72. Zhu, C. Apoptosis inducing factor is a major contributor to neuronal loss induced by neonatal cerebral hypoxia-ischemia / C. Zhu [et al] // Cell Death Differ. - 2007. - Vol. 14 - P. 775-84.

73. Furre, I.E. Targeting PBR by hexaminolevulinate-mediated photodynamic therapy induces apoptosis, through translocation of apoptosis-inducing factor in human leukemia cells / I.E. Furre [et al] // Cancer Res. - 2007 - Vol. 65 - P. 11051-60.

74. Vittar N. B. Caspase-independent apoptosis, in human MCF-7c3 breast cancer cells, following photodynamic therapy, with a novel, water-soluble phthalocyanine / N.B. Vittar [et al] // Int. J. Biochem. Cell Biol. 42, P. 1123-1131.,

75. Yuan, J. Alternative cell death mechanisms in development and, beyond / J. Yuan and G. Kroemer // Genes Dev. - 2010. - Vol. 24 - P. 2592-2602.

76. Chung, P.S. Photodynamic, therapy with 9-hydroxypheophorbide alpha on AMC-HN-3 human head and neck, cancer cells: induction of apoptosis via photoactivation of mitochondria and endoplasmic, reticulum / P.S. Chung, P. He, J.I. Shin, H.J .Hwang, S.J. Lee and J.C. Ahn // Cancer Biol. Ther. - 2009. - Vol. 8 - P. 1343-51.

77. Karmakar, S. 5-Aminolevulinic acid-based, photodynamic therapy suppressed survival factors and activated proteases for apoptosis, in human glioblastoma U87MG cells / S. Karmakar, N.L. Banik, S.J. Patel and S.K.Ray // Neurosci. Lett. - 2007. - Vol. 415 - P. 242-7.

78. Yoo, J.O. Transglutaminase 2 promotes both, caspase-dependent and -independent apoptotic cell death via the calpain/Bax signaling, pathway / J.O. Yoo, Y.C. Lim, Y.M. Kim and K.S. Ha // The Journal of Biological Chemistry. - 2012. - Vol. 287 - Р. 14377-88.

79. Almeida, R.D. Intracellular signaling, mechanisms in photodynamic therapy / R.D. Almeida, B.J. Manadas, A.P. Carvalho and C.B. Duarte // Biochim. Biophys. Acta - 2004. - Vol. 1704 -P. 59-86.

80. Buytaert, E. Molecular effectors of multiple cell death, pathways initiated by photodynamic therapy / E. Buytaert, M. Dewaele and P. Agostinis // Biochim. Biophys. Acta - 2007. - Vol. 1776 - P. 86-107.

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

Ortel, B. Molecular mechanisms of photodynamic, therapy / B. Ortel, C.R. Shea and P. Calzavara-Pinton // Front. Biosci. - 2009. - Vol. 14 - P. 4157-72.

Chen, B. Photodynamic therapy, with hypericin induces vascular damage and apoptosis in the RIF-1 mouse tumor model / B. Chen, T. Roskams, Y. Xu, P. Agostinis and P.A. de Witte // Int. J. Cancer - 2002. - Vol. 98 - P. 284-90.

Oleinick, N.L. The role of apoptosis in response to, photodynamic therapy: what, where, why, and how / N.L. Oleinick, R.L. Morris and I. Belichenko // Photochem. Photobiol. Sci. - 2002. -Vol. 1 - P. 1-21.

Ahmad, N. Involvement of Fas (APO-1/CD-, 95) during photodynamic-therapy-mediated apoptosis in human epidermoid carcinoma, A431 cells / N. Ahmad, S. Gupta, D.K. Feyes and H. Mukhtar // J. Invest. Dermatol. - 2000. - Vol. 115 - P. 1041-46.

Ali, S.M. Photodynamic therapy induced Fasmediated, apoptosis in human carcinoma cells / S.M. Ali, S.K. Chee, G.Y. Yuen and M. Olivo // Int. J. Mol. Med. - 2002. - Vol. 9 - P. 257-70. Olivo, M. Apoptosis signalling mechanisms in human cancer cells, induced by Calphostin-PDT / M. Olivo, M. Ali-Seyed // Int. J. Oncol. - 2007. - Vol. 30 - P. 537-48.

Billen, L P. Bid: a Bax-like BH3 protein / L P. Billen [et al] // Oncogene - 2008. - Vol. 27 - P. 93-S104.

Cirman, T. Selective disruption of lysosomes in HeLa cells triggers apoptosis mediated by cleavage of, Bid by multiple papain-like lysosomal cathepsins./ T. Cirman [et al] // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279 - P. 3578-3587.

Kantari, C. Caspase-8 and bid: caught in the act between death, receptors and mitochondria. / C. Kantari and H. Walczak //Biochim. Biophys. Acta - 2011. - Vol. 1813 - P. 558-563. Reiners Jr., J.J. Release of cytochrome c and activation of pro-caspase-9 following lysosomal photodamage, involves Bid cleavage./ J.J. Reiners Jr., J.A. Caruso, P. Mathieu, B. Chelladurai, X.M. Yin, D. Kessel // Cell Death Differ. - 2002. - Vol. 9 - P. 934-44.

Stoka, V. Lysosomal protease pathways to apoptosis. Cleavage of bid, not pro-caspases, is the, most likely route. / V. Stoka [et al] // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276 - P. 3149-57. Ichinose, S. Lysosomal cathepsin initiates apoptosis, which is regulated by photodamage to Bcl-2 at, mitochondria in photodynamic therapy using a novel photosensitizer, ATX-s10 (Na). / S. Ichinose [et al]// Int. J. Oncol. - 2006. - Vol. 29 - P. 349-55.

Wan, Q. Bid is required in NPe6-PDT-induced, apoptosis. / Q. Wan, L. Liu, D. Xing and Q. Chen // Photochem. Photobiol. - 2008. - Vol. 84 - P. 250-57.

Chiu, S.M. A requirement for bid for induction of apoptosis by photodynamic therapy with a, lysosome- but not a mitochondrion-targeted photosensitizer. / S.M. Chiu [et al] // Photochem. Photobiol. - 2010. - Vol.86 - P. 1161-73.

95. Quiogue, G. Signaling from lysosomes enhances mitochondria-mediated photodynamic therapy, in cancer cells. / G. Quiogue [et al] // Proc. Soc. Photo Opt. Instrum. Eng. - 2009. -Vol. 7380 P. 1-8.

96. Agostinis, P. Photodynamic Therapy of Cancer: An Update / P. Agostinis [et al] // CA Cancer J Clin. - 2011. - Vol. 61, № 4. - P. 250-81

97. Kessel, D. Initiation of apoptosis and autophagy by, photodynamic therapy. / D. Kessel, M.G.

Vicente, J.J. Reiners Jr. // Lasers Surg. Med. - 2006. - Vol. 38 - P. 482-8.

98. Reiners Jr., J.J. Assessing autophagy, in the context of photodynamic therapy. / J.J. Reiners Jr., P. Agostinis, K. Berg, N.L. Oleinick and D. Kessel // Autophagy - 2010. - Vol. 6 - P. 7-18.

99. Hotchkiss, R.S. Cell death. / R S. Hotchkiss [et al] // N. Engl. J., Med. - 2009. - Vol. 361 - P. 1570-83.

100. Degterev, A. Expansion and evolution of cell death programmes. / A. Degterev and J. Yuan // Nat. Rev., Mol. Cell Biol. - 2008. - Vol. 9 - P. 378-90.

101. Janku, F. Autophagy as a target for, anticancer therapy. / F. Janku, D.J. McConkey, D.S. Hong and R. Kurzrock // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2011. - Vol. 8 - P. 528-39.

102. Tasdemir, E. Methods for assessing autophagy and autophagic cell death. / E. Tasdemir [et al] // Methods Mol. Biol. - 2008. - Vol. 445 - P. 29-76.

103. Janku, F., McConkey, D.J., Hong, D.S., Kurzrock, R., 2011. Autophagy as a target for, anticancer therapy. Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 528-539.

104. Hayashi-Nishino, M. A subdomain of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome, formation. / M. Hayashi-Nishino [et al] // Nat. Cell Biol. - 2009. - Vol. 11 - P. 1433-37.

105. Hailey, D.W. Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during, starvation. / D.W. Hailey [et al] // Cell - 2010. - Vol. 141 - P. 656-67.

106. Ravikumar, B. Plasma membrane, contributes to the formation of pre-autophagosomal structures. / B. Ravikumar, K. Moreau, L. Jahreiss, C. Puri, D.C. Rubinsztein // Nat. Cell Biol. -2010. - Vol. 12 - P. 747-57.

107. Yang, Z. Mammalian autophagy: core molecular machinery and, signaling regulation. / Z. Yang and D.J. Klionsky // Curr.Opin. Cell Biol. - 2010. - Vol. 22 - P. 124-31.

108. Mizushima, N., Autophagy: process and function. / Genes Dev. - 2007. - Vol. 21, 2861-2873.,

109. Debnath, J., Baehrecke, E.H., Kroemer, G.,. Does autophagy contribute to cell death?, Autophagy 2005. - Vol. 1, 66-74.,

110. Morselli, E., Galluzzi, L., Kepp, O., Vicencio, J.M., Criollo, A., Maiuri, M.C., et al.,., Anti- and pro-tumor functions of autophagy. Biochim.Biophys. Acta. - 2009. - Vol. 1793, 1524-1532.,

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

Apel, A., Herr, I., Schwarz, H., Rodemann, H.P., Mayer, A.,. Blocked autophagy, sensitizes resistant carcinoma cells to radiation therapy. Cancer Res. - 2008. - Vol. 68, 1485-1494., Qadir, M.A., Kwok, B., Dragowska, W.H., To, K.H., Le, D., Bally, M.B., et al.,., Macroautophagy inhibition sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells and enhances, mitochondrial depolarization. Breast Cancer Res. Treat. - 2008. - Vol. 112, 389-403., Kim, K.W., Hwang, M., Moretti, L., Jaboin, J.J., Cha, Y.I., Lu, B.,. Autophagy upregulation by inhibitors of caspase-3 and mTOR enhances radiotherapy in a mouse model of lung cancer. Autophagy. - 2008. - Vol. 4, 659-668.

Kondo, Y., Kondo, S.,. Autophagy and cancer therapy. Autophagy 2006. - Vol. 2, 85-90. Kondo, Y., Kanzawa, T., Sawaya, R., Kondo, S.,. The role of autophagy in cancer development and response to therapy. Nat. Rev. Cancer. - 2005. - Vol. 5, 726-734.

Moretti, L., Yang, E.S., Kim, K.W., Lu, B.,. Autophagy signaling in cancer and its potential as novel target to improve anticancer therapy. Drug Resist. Updat. - 2007. - Vol. 10, 135-143. Vazquez-Martin, A., Oliveras-Ferraros, C., Menendez, J.A.,. Autophagy facilitates the, development of breast cancer resistance to the anti-HER2 monoclonal antibody trastuzumab., PLoS One. - 2009. - Vol. 4, e6251.

Golstein P., Kroemer G. Cell death by necrosis: .towards a molecular definition // TiBS. -. 2006. - Vol. 32. P. 37-43

Proskuryakov S.Ya., Konoplyannikov A.G., Gabai V.L. Necrosis: a specific form of programmed cell death? // Exp. Cell Res. - 2003. - Vol. 283. P. 1-16.

Zong W.(X., Thompson C.B. Necrotic death as a cell fate // Genes Dev. - 2006. V. 20. P. 1-15) Baldea/, Filip AG. Photodynamic therapy in melanoma - an update. J Physiol Pharmacol. 2012. - Vol. 63(2):109-118.,j.

Узденский, А. Б. Управляемый некроз / А. Б. Узденский // Биологические мембраны -2010. - Т. 27, № 1. - С. 7-17

Galluzzi, L., Kroemer, G.,. Necroptosis: a specialized pathway of programmed necrosis.Cell. -2008. - Vol. 135, 1161-1163

Fabris, C., Valduga, G., Miotto, G., Borsetto, L., Jori, G., Garbisa, S., et al.,. Photo sensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis. Cancer Res. - 2001. - Vol. 61, 7495-7500).

Sattler UG, Mueller-Klieser W. The antioxidant, capacity of tumour glycolysis. Int, J Radiat Biol. - 2009. - Vol. 85:963-971.,

Frank J, Flaccus A, Schwarz C, Lambert C,, Biesalski HK. Ascorbic acid suppresses, cell death in rat DS-sarcoma cancer cells, induced by 5-aminolevulinic acid-based, photodynamic therapy. Free Radic Biol, Med. - 2006. - Vol. 40:827-836.,

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

Golab J, Nowis D, Skrzycki M, et al. Antitumor, effects of photodynamic therapy are, potentiated by 2-methoxyestradiol. A, superoxide dismutase inhibitor. J Biol, Chem. - 2003. -Vol. 278:407-414.,

Hadjur C, Richard MJ, Parat MO, Jardon, P, Favier A. Photodynamic effects of hypericin, on lipid peroxidation and antioxidant, status in melanoma cells. Photochem, Photobiol. - 1996. -Vol. 64:375-381.,

Matroule JY, Bonizzi G, Morliere P,, et al. Pyropheophorbide-a methyl estermediated, photosensitization activates, transcription factor NF-kappaB through, the interleukin-1 receptor-dependent signaling, pathway. J Biol Chem. - 1999. - Vol. 274:, 2988-3000., Хлусова М.Ю., Антипов С.А., Хлусов И.А., Дамбаев Г.Ц., Федущак Т.А. Новые методы биотерапии рака пищеварительного тракта. Патофизиологические и клинические аспекты (обзор) // Сибирский медицинский журнал. - 2009. № 6. С.31-36 Sibani SA, McCarron PA, Woolfson AD,, Donnelly RF. Photosensitiser delivery for, photodynamic therapy. Part 2: systemic, carrier platforms. Expert Opin Drug Deliv. - //2008. -Vol. 5:1241-1254

Sorkin, A., Goh, L.K. Endocytosis and intracellular trafficking of ErbBs // Exp. Cell. Res -2009. - Vol.315, 683-696.

Yarden, Y., Sliwkowski, M. X. Untangling the ErbB signalling network // Nat. Rev. Mol.. -Cell Biol., 2001. - Vol. 2,127-137.

Arteaga, C.L., Engelman, J.A. ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics // Cancer Cell. - 2014. - Vol.5,282-303. http://www.biooncology.com/therapeutic-targets/her2

Slamon, D. J., Godolphin, W., Jones, L. A., Holt, J. A., Wong, S. G., Keith, D. E., Levin, W. J., Stuart, S. G., Udove, J., Ullrich, A., Press, M. // Science, 1989. - Vol. 244, 707-712. Поляновский, О.Л., ErbB-онкогены - мишени моноклональных антител / Поляновский, О.Л., Лебеденко, Е.Н., Деев, С.М. // Биохимия, 2013. - Vol. 77, 289-311. Citri, A., Gan, J., Mosesson, Y., Vereb, G., Szollosi, J., Yarden, Y. // EMBO Rep., 2004. - Vol. 5, 1165-1170.

Sliwkowski MX, Lofgren JA, Lewis GD, et al: Nonclinical studies addressing the mechanism of action of trastuzumab (Herceptin). // Semin Oncol 1999. - Vol. 26:60-70, Деев С.М., Лебеденко Е.Н. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения. // Acta Naturae. 2009. № 1. С. 32-50

Peterson, E. Monoclonal antibody form and function: manufacturing the right antibodies for treating drug abuse / E. Peterson , S.M. Owens, R.L. Henry // AAPS J. - 2006. - Vol. 26, № 8(2). - P.383-390.

142 Kuimova, M.K., Bhatti, M., Deonarain, M., Yahioglu, G., Levitt, J.A., Stamati, I., et al.,. Fluorescence characterisation of multiply-loaded anti-HER2 single chain Fv-photosensitizer conjugates suitable for photodynamic therapy. // Photochem. Photobiol.Sci. 2007. - Vol. 6, 933-939

143 Serebrovskaya, E. Targeting cancer cells by using an antireceptor antibody-photosensitizer fusion protein / Ekaterina O. Serebrovskaya [et al] // PNAS USA. - 2009. - Vol. 106, № 23. -P. 9221-9225

144 KasparBinz, H., Stumpp, M.T., Forrer, P., Amstutz, P., Plückthun A J. Designing repeat proteins: well-expressed, soluble and stable proteins from combinatorial libraries of consensus ankyrin repeat proteins // Mol. Biol., 2003. - Vol. 332, 489-503.

145 Tamaskovic, R., Simon, M., Stefan, N., Schwill, M., Plückthun, A. Designed ankyrin repeat proteins (DARPins) from research to therapy // Methods Enzymol., 2012. - Vol. 503, 101-134.

146 Kobe, B., Kajava, A. When protein folding is simplified to protein coiling: the continuum of solenoid protein structures // Trends Biochem. Sci., 2000. - Vol. 25, 509-515.

147. Kohl A1, Binz HK, Forrer P, Stumpp MT, Plückthun A, Grütter MG. Designed to be stable: crystal structure of a consensus ankyrin repeat protein // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003

148. Münch, R.C.,1 Mühlebach, M. D., Schaser, T., Kneissl, S, Jost, C, Plückthun,A., Cichutek, K., Buchholz, C.J. DARPins: an efficient targeting domain for lentiviral vectors // Mol Ther. -2011. - Vol.19(4), 686-693.

149. Henderson B.W. Fluence rate as a modulator of PDT mechanisms / B. W. Henderson, T. M. Busch, J. W. Snyder // Lasers Surg. Med. - 2006. - T. 38 - № 5 - 489-493c.

150. Brancaleon L. Laser and non-laser light sources for photodynamic therapy. / L. Brancaleon, H. Moseley // Lasers Med. Sci. - 2002. - T. 17 - № 3 - 173-186c.

151. Agostinis P. Photodynamic therapy of cancer: An update / P. Agostinis, K. Berg, K. A. Cengel, T. H. Foster, A. W. Girotti, S. O. Gollnick, S. M. Hahn, M. R. Hamblin, A. Juzeniene, D. Kessel, M. Korbelik, J. Moan, P. Mroz, D. Nowis, J. Piette, B. C. Wilson, J. Golab // CA. Cancer J. Clin. - 2011. - T. 61 - № 4 - 250-281c.

152. Juzeniene A. Effectiveness of different light sources for 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy. / A. Juzeniene, P. Juzenas, L.-W. Ma, V. Iani, J. Moan // Lasers Med. Sci. - 2004. - T. 19 - № 3 - 139-149c.

153. Beyer W. Systems for light application and dosimetry in photodynamic therapy. / W. Beyer // J. Photochem. Photobiol. B. - 1996. - T. 36 - № 2 - P. 153-156.

154. Plaetzer K. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: fundamental aspects. / K. Plaetzer, B. Krammer, J. Berlanda, F. Berr, T. Kiesslich // Lasers Med. Sci. - 2009. - T. 24 - № 2 - 259-268c.

155. Chatterjee D.K. Small upconverting fluorescent nanoparticles for biomedical applications. / D. K. Chatterjee, M. K. Gnanasammandhan, Y. Zhang // Small - 2010. - Т. 6 - № 24 - 2781-2795с.

156. Boyer J.-C. Synthesis of colloidal upconverting NaYF4 nanocrystals doped with Er3+, Yb3+ and Tm3+, Yb3+ via thermal decomposition of lanthanide trifluoroacetate precursors. / J.-C. Boyer, F. Vetrone, L. A. Cuccia, J. A. Capobianco // J. Am. Chem. Soc. - 2006. - Т. 128 - № 23 - 7444-7445с.

157. Chen J. Upconversion Nanoparticles: Design, Nanochemistry, and Applications in Theranostics / G. Chen, H. Qiu, P. N. Prasad, and X. Chen // Chem Rev. - 2014. - №114 (10) - Р. 51615214

158. N. Bloembergen No Title // Phys. Rev. Lett. - 1959. - Т. 2 - 84-85с.

159. В.Л. В.Фотоника биологических структур / В. В.Л. - , 1988.- 164 сх

160. Xia L. An upconversion nanoparticle--Zinc phthalocyanine based nanophotosensitizer for photodynamic therapy. / L. Xia, X. Kong, X. Liu, L. Tu, Y. Zhang, Y. Chang, K. Liu, D. Shen, H. Zhao, H. Zhang // Biomaterials - 2014. - Т. 35 - № 13 - 4146-4156с.

161. Ungun B. Nanofabricated upconversion nanoparticles for photodynamic therapy. / B. Ungun, R. K. Prud'homme, S. J. Budijon, J. Shan, S. F. Lim, Y. Ju, R. Austin // Opt. Express - 2009. -Т. 17 - № 1 - 80-86с.

162. Zhou A. Pyropheophorbide A and c(RGDyK) comodified chitosan-wrapped upconversion nanoparticle for targeted near-infrared photodynamic therapy. / A. Zhou, Y. Wei, B. Wu, Q. Chen, D. Xing // Mol. Pharm. - 2012. - Т. 9 - № 6 - 1580-1589с

163. Qian H.S. Mesoporous-silica-coated up-conversion fluorescent nanoparticles for photodynamic therapy. / H. S. Qian, H. C. Guo, P. C.-L. Ho, R. Mahendran, Y. Zhang // Small - 2009. - Т. 5 - № 20 - 2285-2290с.

164. Guo H. Singlet oxygen-induced apoptosis of cancer cells using upconversion fluorescent nanoparticles as a carrier of photosensitizer. / H. Guo, H. Qian, N. M. Idris, Y. Zhang // Nanomedicine - 2010. - Т. 6 - № 3 - 486-495с.

165. Chatterjee D.K. Upconverting nanoparticles as nanotransducers for photodynamic therapy in cancer cells. / D. K. Chatterjee, Z. Yong // Nanomedicine (Lond). - 2008. - Т. 3 - № 1 - 73-82с.

166. Liu K. Covalently assembled NIR nanoplatform for simultaneous fluorescence imaging and photodynamic therapy of cancer cells. / K. Liu, X. Liu, Q. Zeng, Y. Zhang, L. Tu, T. Liu, X. Kong, Y. Wang, F. Cao, S. A. G. Lambrechts, M. C. G. Aalders, H. Zhang // ACS Nano -2012. - Т. 6 - № 5 - 4054-4062с

167. Shan J. Pegylated Composite Nanoparticles Containing Upconverting Phosphors and meso-Tetraphenyl porphine (TPP) for Photodynamic Therapy / J. Shan, S. J. Budijono, G. Hu, N. Yao, Y. Kang, Y. Ju, R. K. Prud'homme // Adv. Funct. Mater. - 2011. - Т. 21 - № 13 - 2488-2495с

168. Qiao X.-F. Triple-functional core-shell structured upconversion luminescent nanoparticles covalently grafted with photosensitizer for luminescent, magnetic resonance imaging and photodynamic therapy in vitro. / X.-F. Qiao, J.-C. Zhou, J.-W. Xiao, Y.-F. Wang, L.-D. Sun,

C.-H. Yan // Nanoscale - 2012. - Т. 4 - № 15 - 4611-4623с.

169. Zhao Z. Multifunctional core-shell upconverting nanoparticles for imaging and photodynamic therapy of liver cancer cells. / Z. Zhao, Y. Han, C. Lin, D. Hu, F. Wang, X. Chen, Z. Chen, N. Zheng // Chem. Asian J. - 2012. - Т. 7 - № 4 - 830-837с

170. Wang C. Near-infrared light induced in vivo photodynamic therapy of cancer based on upconversion nanoparticles. / C. Wang, H. Tao, L. Cheng, Z. Liu // Biomaterials - 2011. - Т. 32 - № 26 - 6145-6154с

171. Chen F. A uniform sub-50 nm-sized magnetic/upconversion fluorescent bimodal imaging agent capable of generating singlet oxygen by using a 980 nm laser. / F. Chen, S. Zhang, W. Bu, Y. Chen, Q. Xiao, J. Liu, H. Xing, L. Zhou, W. Peng, J. Shi // Chemistry - 2012. - Т. 18 - № 23 -7082-7090с.

172. Cui S. Amphiphilic chitosan modified upconversion nanoparticles for in vivo photodynamic therapy induced by near-infrared light / S. Cui, H. Chen, H. Zhu, J. Tian, X. Chi, Z. Qian, S. Achilefu, Y. Gu // J. Mater. Chem. - 2012. - Т. 22 - № 11 - 4861-4873с.

173. Park Y. Il Theranostic probe based on lanthanide-doped nanoparticles for simultaneous in vivo dual-modal imaging and photodynamic therapy. / Y. Il Park, H. M. Kim, J. H. Kim, K. C. Moon, B. Yoo, K. T. Lee, N. Lee, Y. Choi, W. Park, D. Ling, K. Na, W. K. Moon, S. H. Choi, H. S. Park, S.-Y. Yoon, Y. D. Suh, S. H. Lee, T. Hyeon // Adv. Mater. - 2012. - Т. 24 - № 42 - 5755-5761с

174. Idris N.M. In vivo photodynamic therapy using upconversion nanoparticles as remote-controlled nanotransducers. / N. M. Idris, M. K. Gnanasammandhan, J. Zhang, P. C. Ho, R. Mahendran, Y. Zhang // Nat. Med. - 2012. - Т. 18 - № 10 - 1580-1585с.

175. Hermanson G.T. Chapter 1 - Introduction to Bioconjugation / под ред. G.T.B.T.-B.T. (Third edition) Hermanson. Boston: Academic Press, 2013. - 1-125с.

176. Kotov N. Luminescence of Nanoparticle-Labeled Antibodies and Antigens CRC Press, 2004

177. Santes K. De Radiolabeled antibody targeting of the HER-2/neu oncoprotein. / K. De Santes,

D. Slamon, S. K. Anderson, M. Shepard, B. Fendly, D. Maneval, O. Press // Cancer Res. -1992. - Т. 52 - № 7 - 1916-1923с.

178. Edelweiss E. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells. / E. Edelweiss, T. G. Balandin, J. L. Ivanova, G. V Lutsenko, O. G. Leonova, V. I. Popenko, A. M. Sapozhnikov, S. M. Deyev // PLoS One - 2008. - T. 3 - № 6 - e2434c.

179. Ivanova J.L. Application of fusion protein 4D5 scFv-dibarnase:barstar-gold complex for studying P185HER2 receptor distribution in human cancer cells. / J. L. Ivanova, E. F. Edelweiss, O. G. Leonova, T. G. Balandin, V. I. Popenko, S. M. Deyev // Biochimie - 2012. -T. 94 - № 8 - 1833-1836c

180. Ren X.-R. Polyclonal HER2-specific antibodies induced by vaccination mediate receptor internalization and degradation in tumor cells. / X.-R. Ren, J. Wei, G. Lei, J. Wang, J. Lu, W. Xia, N. Spector, L. S. Barak, T. M. Clay, T. Osada, E. Hamilton, K. Blackwell, A. C. Hobeika, M. A. Morse, H. K. Lyerly, W. Chen // Breast Cancer Res. - 2012. - T. 14 - № 3 - R89c

181. Murakami L.S. Photocytotoxicity of a cyanine dye with two chromophores toward melanoma and normal cells. / L. S. Murakami, L. P. Ferreira, J. S. Santos, R. S. da Silva, A. Nomizo, V. A. Kuz'min, I. E. Borissevitch // Biochim. Biophys. Acta - 2015. - T. 1850 - № 6 - 1150-1157c.

182. Morgan J. Mitochondria-based photodynamic anti-cancer therapy. / J. Morgan, A. R. Oseroff // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2001. - T. 49 - № 1-2 - 71-86c

183. Zinchuk V. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. / V. Zinchuk, O. Grossenbacher-Zinchuk // Prog. Histochem. Cytochem. - 2009. - T. 44 - № 3 -125-172c

184. Nagy P. Activation-dependent clustering of the erbB2 receptor tyrosine kinase detected by scanning near-field optical microscopy. / P. Nagy, A. Jenei, A. K. Kirsch, J. Szollosi, S. Damjanovich, T. M. Jovin // J. Cell Sci. - 1999. - T. 112 ( Pt 1 - 1733-1741c.

185. Nagy P. Lipid rafts and the local density of ErbB proteins influence the biological role of homo- and heteroassociations of ErbB2. / P. Nagy, G. Vereb, Z. Sebestyen, G. Horvath, S. J. Lockett, S. Damjanovich, J. W. Park, T. M. Jovin, J. Szollosi // J. Cell Sci. - 2002. - T. 115 -№ Pt 22 - 4251-4262c.

186. Sakharov D. V Prolonged lipid oxidation after photodynamic treatment. Study with oxidation-sensitive probe C11-BODIPY581/591. / D. V Sakharov, E. D. R. Elstak, B. Chernyak, K. W. A. Wirtz // FEBS Lett. - 2005. - T. 579 - № 5 - 1255-1260c

187. Girotti A.W. Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathways, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms. / A. W. Girotti // J. Photochem. Photobiol. B. - 2001. -T. 63 - № 1-3 - 103-113c.

188

189

190

191

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

Bhatti M. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. / M. Bhatti, G. Yahioglu, L. R. Milgrom, M. Garcia-Maya, K. A. Chester, M. P. Deonarain // Int. J. Cancer - 2008. - T. 122 - № 5 - 1155-1163c

Manfredi J.J. Taxol binds to cellular microtubules. / J. J. Manfredi, J. Parness, S. B. Horwitz // J. Cell Biol. - 1982. - T. 94 - № 3 - 688-696c

Schiff P.B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. / P. B. Schiff, J. Fant, S. B. Horwitz // Nature - 1979. - T. 277 - № 5698 - 665-667c.

Savellano M.D. Photochemical targeting of epidermal growth factor receptor: a mechanistic study. / M. D. Savellano, T. Hasan // Clin. Cancer Res. - 2005. - T. 11 - № 4 - 1658-1668c. Zhivotovsky B. Determination of apoptosis and necrosis. / B. Zhivotovsky, A. Samali, S. Orrenius // Curr. Protoc. Toxicol. - 2001. - T. Chapter 2 - Unit 2.2c

Fabris C. Photosensitization with zinc (II) phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis. / C. Fabris, G. Valduga, G. Miotto, L. Borsetto, G. Jori, S. Garbisa, E. Reddi // Cancer Res. - 2001. - T. 61 - № 20 - 7495-7500c

Castano A.P. Photodynamic therapy and anti-tumour immunity. / A. P. Castano, P. Mroz, M. R. Hamblin // Nat. Rev. Cancer - 2006. - T. 6 - № 7 - 535-545c

Berg K. Photochemical internalization (PCI): a technology for drug delivery. / K. Berg, A. Weyergang, L. Prasmickaite, A. Bonsted, A. Hogset, M.-T. R. Strand, E. Wagner, P. K. Selbo // Methods Mol. Biol. - 2010. - T. 635 - 133-145c.

Yang Y. Thienopyrrole-expanded BODIPY as a potential NIR photosensitizer for photodynamic therapy. / Y. Yang, Q. Guo, H. Chen, Z. Zhou, Z. Guo, Z. Shen // Chem. Commun. (Camb). - 2013. - T. 49 - № 38 - 3940-3942c.

Yuan A. Application of near-infrared dyes for tumor imaging, photothermal, and photodynamic therapies. / A. Yuan, J. Wu, X. Tang, L. Zhao, F. Xu, Y. Hu // J. Pharm. Sci. - 2013. - T. 102 -№ 1 - 6-28c

Zhang P. Versatile Photosensitizers for Photodynamic Therapy at Infrared Excitation / P. Zhang, W. Steelant, M. Kumar, M. Scholfield // J. Am. Chem. Soc. - 2007. - T. 129 - № 15 -4526-4527c

Hao S. Sensing using rare-earth-doped upconversion nanoparticles. / S. Hao, G. Chen, C. Yang // Theranostics - 2013. - T. 3 - № 5 - 331-345c

Förster T. Intermolecular Energy Migration and Fluorescence / T. Förster // Ann. Phys - 1948. - T. 2 - 55-75c

Generalova A.N. Submicron polyacrolein particles in situ embedded with upconversion nanoparticles for bioassay. / A. N. Generalova, I. K. Kochneva, E. V Khaydukov, V. A.

Semchishen, A. E. Guller, A. V Nechaev, A. B. Shekhter, V. P. Zubov, A. V Zvyagin, S. M. Deyev // Nanoscale - 2015. - T. 7 - № 5 - 1709-1717c.

202. N. Miyoshia, M. Uedaa, K. Fukeb, Y. Tanimotoa, M. Itoha and G.T. Lifetime of Singlet Oxygen and Quenching by NaN3 in Mixed Solvents / and G. T. N. Miyoshia, M. Uedaa, K. Fukeb, Y. Tanimotoa, M. Itoha // Z. Naturforsch - 1981. - T. 37 - 649-652c

203. Harvey P. Ratiometric detection of enzyme turnover and flavin reduction using rare-earth upconverting phosphors. / P. Harvey, C. Oakland, M. D. Driscoll, S. Hay, L. S. Natrajan // Dalton Trans. - 2014. - T. 43 - № 14 - 5265-5268c

204. Morris HP. EFFECTS ON THE GENESIS AND GROWTH OF TUMORS ASSOCIATED WITH VITAMIN INTAKE / H. P. Morris // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1947. - T. 49 - № 1 -119-140c

205. http://www.expasy.org/

206. Steiner D. Efficient selection of DARPins with sub-nanomolar affinities using SRP phage display. / D. Steiner, P. Forrer, A. Pluckthun // J. Mol. Biol. - 2008. - T. 382 - № 5 - 1211-1227c.

207. Shaner N.C. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. // Nat. Biotechnol. - 2004. - T. 22. - № 12. - 1567-1572c

208. Chudakov D.M. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. / D. M. Chudakov, M. V Matz, S. Lukyanov, K. A. Lukyanov // Physiol. Rev. - 2010. - T. 90 -№ 3 - 1103-1163c

209. Jost C. Structural basis for eliciting a cytotoxic effect in HER2-overexpressing cancer cells via binding to the extracellular domain of HER2. / C. Jost, J. Schilling, R. Tamaskovic, M. Schwill, A. Honegger, A. Pluckthun // Structure - 2013. - T. 21 - № 11 - 1979-1991c.

210. Steiner D. Efficient selection of DARPins with sub-nanomolar affinities using SRP phage display. / D. Steiner, P. Forrer, A. Pluckthun // J. Mol. Biol. - 2008. - T. 382 - № 5 - 1211-1227c

211. Dong B. Multifunctional NaYF4 : Yb3+,Er3+@Ag core/shell nanocomposites: integration of upconversion imaging and photothermal therapy / B. Dong, S. Xu, J. Sun, S. Bi, D. Li, X. Bai, Y. Wang, L. Wang, H. Song // J. Mater. Chem. - 2011. - T. 21 - № 17 - 6193c.

212. Cheng L. Facile preparation of multifunctional upconversion nanoprobes for multimodal imaging and dual-targeted photothermal therapy. / L. Cheng, K. Yang, Y. Li, J. Chen, C. Wang, M. Shao, S.-T. Lee, Z. Liu // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. - 2011. - T. 50 - № 32 - 7385-7390c.

213. Dai Y. Doxorubicin conjugated NaYF4: Yb3+/Tm3+ Nanoparticles for therapy and sensing of drug delivery by luminescence resonance energy transfer / Y. Dai, D. Yang, P. Ma, X. Kang, X. Zhang, C. Li, Z. Hou, Z. Cheng, J. Lin // Biomaterials - 2012. - T. 33 - № 33 - 8704-8713c.

214. Kerr A.C. Ultraviolet A1 phototherapy: a British Photodermatology Group workshop report / A. C. Kerr, J. Ferguson, S. K. Attili, P. E. Beattie, A. J. Coleman, R. S. Dawe, B. Eberlein, V. Goulden, S. H. Ibbotson, H. du P. Menage, H. Moseley, L. Novakovic, S. L. Walker, J. A. Woods, A. R. Young, R. P. E. Sarkany // Clin. Exp. Dermatol. - 2012. - T. 37 - № 3 - 219-226c.

215. Morris H.P. Effectson the genesis and growth of tumors associated with vitamin intake. / H. P. Morris // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1947. - T. 49 - № 1 - 119-140c.

216. Rao P.N. Elevation of serum riboflavin carrier protein in breast cancer. / P. N. Rao, E. Levine, M. O. Myers, V. Prakash, J. Watson, A. Stolier, J. J. Kopicko, P. Kissinger, S. G. Raj, M. H. Raj // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 1999. - T. 8 - № 11 - 985-990c

217. Vaidya S.M. Molybdenum, xanthine oxidase and riboflavin levels in tamoxifen treated postmenopausal women with breast cancer. / S. M. Vaidya, P. L. Kamlakar, S. M. Kamble // Indian J. Med. Sci. - 1998. - T. 52 - № 6 - 244-247c

218. Karande A.A. Riboflavin carrier protein: a serum and tissue marker for breast carcinoma. / A. A. Karande, L. Sridhar, K. S. Gopinath, P. R. Adiga // Int. J. Cancer - 2001. - T. 95 - № 5 -277-281c.

219. Phelps M.A. A novel rhodamine-riboflavin conjugate probe exhibits distinct fluorescence resonance energy transfer that enables riboflavin trafficking and subcellular localization studies. / M. A. Phelps, A. B. Foraker, W. Gao, J. T. Dalton, P. W. Swaan // Mol. Pharm. -2004. - T. 1 - № 4 - 257-266c

220. York N.R. UVA1 phototherapy: A review of mechanism and therapeutic application / N. R. York, H. T. Jacobe // Int. J. Dermatol. - 2010. - T. 49 - № 6 - 623-630c

Конфокальные изображения клеток СНО после инкубации с 4D5scFv-miniSOG при 4°С. А -изображение клеток в проходящем свете, Б - флуоресцентное изображение в зеленом канале.

А 1 Б

г Я . шг ' ОВ-< 1 *

Приложение 2.

Цитотоксичность таксола® на клетках SKBR-3. Ось абсцисс - концентрация таксола® в логарифмической шкале, ось ординат - относительная жизнеспособность клеток (±стандартное отклонение).

Л

■«—к

о 1Ю

г

у

ё » 1

0 £

1 и

о

[=

и Ш

к

э;

о; -

л

«О 70 €0 М 10 30 30

ю -] о

\

0.00

10

Концентр алия таксола, нЫ

Результат измерения дзета-потенциала НАФ, покрытых полимерной оболочкой ПМАО

Приложение 4.

Детекция связывания нанокомплекса с клетками.

Представлены изображения НБК2/пеи-положительных клеток SK-BR-3 (а, б) и НЕЯ2/пеи-отрицательных клеток СНО (в, г), обработанных нанокомплексом, полученные на эпилюминесцентном инвертированном микроскопе (ИПЛИТ РАН). Изображения а,в, сделанные в проходящем свете, соответствуют изображениям б,г, полученным в канале люминесценции нанофосфоров.

Морфологические изменения клеток SK-BR-3, инкубированных с НАФ(Тт3)-РМАО^АЯРт-т^еггу и облученных ИК-лазером в течение 10 мин. Снимки клеток сделаны в трех каналах: проходящий свет (А), красный флуоресцентный канал (Б), канал люминесценции НАФ (В).

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность всему коллективу лаборатории молекулярной иммунологии, в особенности научному руководителю Сергею Михайловичу Дееву. Особую благодарность автор выражает Галине Михайловне Прошкиной за живое обсуждение работы и за помощь в ее реализации на этапах от постановки экспериментов и до написания статей.

Огромную благодарность за помощь в работе над изложением диссертации автор выражает Екатерине Николаевне Лебеденко. Автор очень признателен Татьяне Здобновой, Олегу Стремовскому, Виктории Шипуновой, Екатерине Ивукиной, Юрию Ходаровичу за ценные методические советы. Автор выражает благодарность Анастасии Рябовой (лаборатория лазерной биоспектроскопии, ИОФ РАН) за высококвалифицированную помощь в получении конфокальных изображений клеток, Андрею Нечаеву (кафедра химии и технологии биологически активных соединений им.Н.А.Преображенского, МИТХТ) за синтез нанофосфоров, Алле Генераловой (лаборатория «Полимеры для биологии», ИБХ РАН) за покрытие НАФ полимерными оболочками, Марине Шевченко и Александру Прохорову (лаборатория клеточных взаимодействий, ИБХ РАН) за отзывчивость и помощь в работе с оборудованием .

Отдельную благодарность автор выражает Евгению Хайдукову и Владимиру Анатольевичу Семчишену (Лаборатории нелинейной оптики поверхности и лазерно-плазменных процессов, ИПЛИТ РАН) за интерес к работе и за неоценимую помощь в реализации ее физической части.