Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа при старении эритроцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Лакомая, Юлия Александровна

• Лакомая, Юлия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лакомая, Юлия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности энергетического обмена ретикулоцитов и эритроцитов.

1.2. Пентозофосфатный путь.

1.3. Нормальный и напряженный эритропоэз.

1.4. Старение эритроцитов.

1.5. Характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа при старении эритроцитов»

Актуальность темы. Одной из основных проблем современной биологии и медицины является выяснение молекулярных процессов, определяющих продолжительность жизни организмов. Удобным и информативным объектом для исследования процессов старения служат эритроциты млекопитающих - высокоспециализированные клетки, лишенные ядра, органелл и белоксинтезирующего аппарата. Кроме того, особые преимущества эритроцитов связаны с их легкой доступностью и возможностью разделения на возрастные группы.

Старение эритроцитов сопровождается существенным снижением их метаболической активности. Значительно уменьшается интенсивность гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов (Grimes A.J., 1986). Это в свою очередь приводит к целому ряду изменений в метаболизме клетки: снижению концентрации АТФ, НАДН и НАДФН (БогатскаяЛ.Н., Рагимова А.А., 1986; Смолина Е.В., 1984); нарушению работы ионных насосов (Hadengue A.L., 1998), повышению внутриклеточной концентрации

24* ионов Са (Minetti G. et al., 2001), вызывающее агрегацию мембранных белков (Jain S.K. et al., 1980; Preiano B.S., Guerini D., 1996), активации фосфолипазы A2 (Никитченко Ю.В., 1999) и накоплению лизофосфолипидов (Боровкова Г.И., 1983; Jain S.K., 1988; Kale М., 1998). Нарушается синтез низкомолекулярных соединений - глутатиона, фосфорибозилпирофосфата, НАД*, НАДФ+, ФАД (Piccinini G. et al., 1995) и накапливается метгемоглобин (Akintonwa D.A., 2000). При снижении концентрации АТФ происходит дефосфорилирование спектрина, вызывающее структурные перестройки мембраны, гликопротеинового спектра, что приводит к изменению антигенной структуры эритроцитов и обеспечивает селективную элиминацию из кровяного русла старых клеток (Kay J.J. et al., 1991; Козлова Н.М.идр, 1998).

На данном этапе развития науки существует огромное количество теорий, пытающихся объяснить прогрессирующие вредные изменения, происходящие при старении (Титов С.А., Крутько В.Н., 1996; Анисимов В.Н., 2000; Подколозин А.А. и др., 2001; Sharpless N.E., DePinho R.A., 2004). В настоящее время самой популярной теорией старения является свободнорадикальная теория, предложенная D. Harman в 1956. Согласно этой теории, неполное восстановление кислорода приводит к образованию ряда цитотоксичных активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион-радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал. Эти высоко реактивные АФК могут вызывать различные клеточные повреждения, включая перекисное окисление липидов, повреждение ДНК, изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала и инактивацию ферментов (Halliwell В., Gutteridge М.С., 2003; Ozturk О., Gumuslu S., 2004). Для эритроцитов, чей род деятельности связан с транспортом высоких концентраций кислорода, данная теория является наиболее актуальной.

Процессы свободнорадикального окисления ограничиваются антиоксидантной системой. Самым важным антиоксидантным ферментом в эритроцитах является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Глкжозо-6-фосфатдегидрогеназа - ключевой и скорость лимитирующий фермент пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Роль этого фермента в метаболизме эритроцитов чрезвычайно велика, поскольку в ходе реакций, катализируемых Г6ФД, а также 6-фосфоглюконатдегидрогеназой, происходит образование НАДФН, необходимого для поддержания функциональной активности и целостности эритроцита. Восстановленный НАДФ необходим для роста, дифференцировки и запрограммированной гибели клеток (Tain W-N. et al., 1998; Tian W-N. et al., 1999; Filosa S., 2003). Огромная роль НАДФН в эритроцитах состоит в регенерации окисленного глутатаиона, который предотвращает денатурацию гемоглобина, предохраняет от окисления SH-группы мембранных белков красных клеток крови участвует в обезвреживании перекиси водорода и активных форм кислорода (Deutsch J., 1990). Снижение активности Г6ФД приводит к дефициту НАДФН и восстановленного глутатиона, что вызывает ранний гемолиз эритроцитов в селезенке.

В работах, посвященных исследованию активности Г6ФД при старении клеток, возрастные изменения только констатируются без достаточного анализа их причин. Между тем, выяснение механизмов изменения активности фермента является существенным звеном для изучения причин снижения интенсивности и регуляции пентозофосфатного пути при старении эритроцитов.

Подходом к изучению механизмов изменения и значения роли Г6ФД в старении клеток может быть сравнительное исследование динамики активности и кинетических параметров фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, характеризуются укороченным сроком жизни, рядом метаболических и физико-химических особенностей (Поэтова В.Т. и др., 1967). Поведение Г6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза не изучено.

Цель работы. Исследовать активность и кинетические свойства Г6ФД, а также влияния температуры и рН среды на активность фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Задачи исследования.

1. Изучить динамику активности Г6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

2. Изучить кинетические свойства Г6ФД в онтогенезе эритроцитов нормального эритропоэза.

3. Исследовать кинетические параметры Г6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза.

4. Изучить влияние температуры на активность Г6ФД в эритроцитах разного возраста, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

5. Исследовать влияние рН среды на активность Г6ФД при старении эритроцитов нормального и напряженного эритропоэза.

Научная новизна. Впервые показано, что при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, происходит изменение кинетических свойств Г6ФД: повышение Км для глюкозо-6-фосфата и [S]o,5 для НАДФ+; уменьшение кооперативных свойств фермента по отношению к НАДФ+, вплоть до полного исчезновения кооперативных взаимодействий в старых клетках; увеличение ингибирующего влияния НАДФН и АТФ на активность фермента.

Впервые, изучены исследуемые параметры при старении эритроцитов, продуцированных при напряженном эритропоэзе, вызванного массивной, одноразовой кровопотерей. Показано, что Г6ФД в эритроцитах, образованных в условиях напряженного эритропоэза первоначально характеризуется повышенной активностью и существенными отличиями в кинетических свойствах, что может свидетельствовать о качественном отличии эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, от клеток, образованных в нормальных условиях кроветворения. Впервые изучено влияние температуры и рН среды на активность Г6ФД при старении эритроцитов нормального напряженного эритропоэза.

Теоретическая и практическая ценность работы.

Результаты работы вносят вклад в понимание механизмов снижения активности ферментов при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Кроме того, исследования, проведенные в данной работе, свидетельствуют о том, что эритроциты, образованные после стресс воздействия (массивной кровопотери), являются качественно иными по сравнению с клетками, образованными в условиях нормального эритропоэза.

Материалы, полученные в данной работе, используются при чтении лекций по спецдисциплинам (энзимология, кинетика ферментативных реакций, термодинамика, биохимия крови) студентам биологического факультета Красноярского Государственного Университета. Методики, изложенные в диссертации, включены в разделы большого и малого практикума по биохимии, энзимологии и кинетике ферментативных реакций на кафедре биохимии и физиологии человека и животных КрасГУ и используются студентами в процессе выполнения курсовых и дипломных работ, а также могут быть рекомендованы для внедрения в деятельность клинико-биохимических лабораторий учреждений здравоохранения и НИИ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза сопровождается значительным снижением активности Г6ФД и изменением кинетических параметров: увеличением константы Михаэлиса и снижением Vmax для глюкозо-6-фосфата; уменьшением кооперативных взаимодействий и повышением [S]o,5 для НАДФ+; усилением ингибирующего влияния НАДФН и АТФ на активность фермента.

2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа в эритроцитах, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, существенно отличается по активности и свойствам от Г6ФД в клетках, образованных в условиях нормального кроветворения.

3. При старении эритроцитов, образованных в условиях как нормального, так и напряженного эритропоэза оптимумы температуры и рН Г6ФД не меняются, но повышается чувствительность к воздействию высоких температур и значений рН среды.

Апробация материалов диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Между нар. научен, кона, студентов и молодых ученых "Экология Южной Сибири и сопредельных территорий", Абакан, 2002; Межрегион, науч.-практич. конф. "Молодежь Сибири - науке России", Красноярск, 2003; Итоговой науч. конф. "Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири", Красноярск, 2003; Междунар. конф. "Механизмы функционирования висцеральных систем", Санкт-Петербург, 2003; XIX Съезде Физиол. общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 10 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, главы результатов исследований и их обсуждений, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (197 источников, в том числе 139 иностранных). Диссертация содержит 9 таблиц и 18 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Лакомая, Юлия Александровна

ВЫВОДЫ

1. Зависимость скорости ГбФД-ной реакции от концентрации глюкозо-6-фосфата в эритроцитах кролика имеет гиперболический характер, который сохраняется при старении клеток.

2. Зависимость скорости реакции от концентрации НАДФ+ во фракции молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массе следует кинетике Хилла, во фракции старых клеток - кинетике Михаэлиса-Ментен.

3. Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, сопровождается значительным снижением активности Г6ФД и изменением кинетических параметров: увеличением константы Михаэлиса и уменьшением Vmax для глюкозо-6-фосфата; уменьшением кооперативных взаимодействий и повышением [S]o,5 для НАДФ+; усилением ингибирующего влияния НАДФН и АТФ на активность фермента.

4. Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, первоначально характеризуются повышением активности Г6ФД, Vmax для глюкозо-6-фосфата и НАДФ+, увеличением кооперативных взаимодействий по отношению к НАДФ+, уменьшением Км для глюкозо-6-фосфата и [S]o,5 для НАДФ+, меньшим ингибирующим эффектом НАДФН и АТФ. Выраженность изменений зависит от степени напряженности эритропоэза, определяемой временем после кровопотери. Старение этих клеток сопровождается более быстрым, чем в норме, снижением активности Г6ФД, изменением кинетических параметров фермента.

5. При старении эритроцитов, образованных в условиях как нормального, так напряженного эритропоэза оптимум температуры не меняется, но повышается термочувствительность.

6. При старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза, повышается чувствительность Г6ФД к воздействию высоких значений рН.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Высокая специализация эритроцита привела к определенным изменениям в его структуре и биохимической организации. Эритроциты, лишенные ядра, рибосом, митохондрий, эндоплазматического ретикулума, утрачивают способность к метаболическим процессам, неразрывно связанным с органеллами, - к синтезу нуклеотидов, белков, гемоглобина; они не способны осуществлять полный цикл Кребса и окислительное фосфорилирование. Энергетические возможности зрелых эритроцитов ограничены гликолизом. Помимо гликолиза, в эритроцитах активно функционирует пентозофосфатный шунт и связанная с ним система глутатиона.

Пентозофосфатный путь в эритроцитах имеет чрезвычайно важное значение, т.к. является единственным источником НАДФН. Восстановленный НАДФ используется в клетке для восстановления, окисленного глутатиона, метгемоглобина, аскорбата (Salvemini F. et al.,1990). Играет огромную роль в росте и смерти клеток, потому что он участвует в поддержании окислительно-восстановительного потенциала клетки.

НАДФН образуется в двух реакциях в окислительной части пентозофосфатного цикла, катализируемых глюкозо-6фосфатдегидрогеназой и 6-фосфоглюконатдегидрогеназой, но ключевым и скорость лимитирующим ферментом является Г6ФД.

В работах, посвященных исследованию активности Г6ФД при старении клеток, возрастные изменения только констатируются без достаточного анализа их причин. Между тем, выяснение механизмов изменения активности фермента является существенным звеном для изучения причин снижения интенсивности и регуляции пентозофосфатного пути при старении эритроцитов.

Целью наших исследований явилось сравнительное изучение активности и кинетических свойств Г6ФД, а также влияние температуры и рН среды на активность фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Напряженный эритропоэз использовали как модель ускоренного старения эритроцитов.

Объектом исследования служили полуторагодовалые кролики породы Шиншилла весом 2,5 - 3 кг. Всего в работе было использовано 105 животных. Определение активности Г6ФД, Км, максимальной скорости, Kj для НАДФН, исследование влияния температуры и рН среды на активность фермента проводили во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов и анемизированных животных на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери. Глубина кровопотери составляла 43% от общего объема крови животного. Результаты экспериментов подвергали статистической обработке. Все серии опытов сравнивали по непараметрическим ранговым критериям Уилкоксона и Манна-Уитни.

Проведенные исследования показали, что старение эритроцитов сопровождается значительным снижением активности Г6ФД. Наибольшая активность фермента присуща фракции молодых эритроцитов, обогащенных на 10 - 12% ретикулоцитами - 9,21±0,03 мкмоль НАДФН/мин*гНЬ, а во фракции старых эритроцитов она снижена на 40,1%.

Одной из причин снижения активности фермента может быть изменение количества ферментативных молекул при старении эритроцитов. Известно, что зрелый эритроцит не способен к синтезу белков, поэтому в течение своей жизни он пользуется тем набором белков, в том числе и ферментов, которые были синтезированы в ядерных предшественниках и в ретикулоцитах. Вместе с тем, в эритроцитах показано наличие протеолитических ферментов, расположенных в цитозоле и на мембране. Активность этих ферментов увеличивается с возрастом красных кровяных клеток. Поэтому вполне возможна деградация части молекул фермента в процессе старения эритроцитов (Davies K.J.A. et al, 1987; Brecher A.S. et al, 1999; Bulteau A-L. et al, 2001; Carrard G. et al, 2002).

Уменьшение активности Г6ФД в процессе старения красных кровяных клеток может быть также обусловлено посттрансляционными модификациями, происходящими при старении белковой молекулы и приводящими, в конечном итоге, к определенным конформационным перестройкам белка и изменению его каталитических характеристик.

Одним из методических приемов, позволяющих оценить наличие конформационных изменений в белковой молекуле является изучение кинетических параметров фермента в процессе старения: константы Михаэлиса, максимальной скорости, а в случае ферментов, обладающих кооперативными свойствами - коэффициента Хилла. Известно, что Км не зависит от концентрации фермента и ее изменения при строго одинаковых условиях проведения эксперимента (концентрация субстрата и кофермента, температура, рН) могут отражать изменения свойств молекулы фермента (Корниш-Боуден Э, 1978). В связи с этим, мы изучили зависимость скорости ГбФД-ной реакции от концентрации Г6Ф и НАДФ+ во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе, а также рассчитали кинетические константы фермента.

Нами было показано, что для всех фракций эритроцитов зависимость скорости реакции от концентрации Г6Ф следовала кинетике Михаэлиса-Ментен. Гиперболический характер кривых зависимости v от [S] подтверждается значением коэффициента Хилла, практически не отличающимся от единицы, а также линейным характером зависимости скорости Г6ФД от [Г6Ф] в координатах Вульфа-Хайнса.

Математическая обработка кривых v от [ГбФ] показала, что при старении эритроцитов происходит изменение кинетических характеристик Г6ФД: увеличение Км и уменьшение Vmax для Г6Ф. Км для Г6Ф увеличивалась во ФСЭ на 85,7% по сравнению с величиной этого показателя во ФМЭ.

При исследовании зависимости скорости ГбФД-ной реакции от концентрации НАДФ+ было обнаружено, что она не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен во фракции молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массе. В пользу этого свидетельствует отсутствие линеаризации кривых v от [НАДФ+] в координатах Вульфа-Хайнса. Графический расчет коэффициента Хилла в координатах 1/v от lg[S] для НАДФ+, свидетельствует о положительных кооперативных эффектах в этих фракциях клеток у интактных кроликов. Во фракции старых эритроцитов коэффициент Хилла близок к единице, следовательно, кинетическое поведение фермента в этой фракции клеток подчиняется гиперболическому закону Михаэлиса-Ментен. Во ФСЭ [S]o,5 имеет максимальное значение, равное 54,11+2,10 мкМ, что на 137,8% выше величины [S]0,5 для НАДФ+ во фракции молодых эритроцитов.

При исследовании влияния различных концентраций НАДФН на кинетику фермента установили, что при старении эритроцитов ингибирующий эффект НАДФН усиливается. НАДФН изменяет характер зависимости скорости реакции от концентрации НАДФ+, переводя сигмоидную кинетику в обычную зависимость Михаэлиса-Ментен во всех фракциях эритроцитов. Результатом конкурентного ингибирования НАДФН является увеличение Км кажущейся для НАДФ+, причем с повышением концентрации ингибитора значение Км кажущейся возрастает.

Согласно современным представлениям, ключевым фактором старения клетки и всего организма в целом, является усиление свободнорадикального окисления. В 1954 г. D. Harman сформулировал основные положения свободнорадикальной теории. Согласно ей, универсальной причиной старения служит свободнорадикальное окисление липидов, белков организма кислородом воздуха (Harman D, 1994; Beckman К.В, Ames B.N,1998). Для эритроцита, чей род деятельности связан с транспортом высоких концентраций 02, данная теория является наиболее актуальной (Kiefer C.R, Snyder L.M, 2000; Comporti M. et al, 2002).

Действительно, в работах многих авторов, показано, что при старении клеток происходит увеличение образования активных форм кислорода, которые реагируют с различными биомолекулами (Демченко А.П, Орловская Н.Н, 1981; Дубинина Е.Е. и др., 2002; Knight J.A, 1995; Junqueira V.B.S. et al, 2004). В частности они могут вызывать различные структурные модификации в молекулах белков (Davies К.J.А, 1987; Davies К.J.A. et al, 1987; Stadtman E.R, Oliver C.N, 1991; BerlettB.S, Stadtman E.R, 1997; Chang W-Y. et al, 2000).

Так, в первую очередь удар со стороны окислителей на себя принимают белковосвязанные SH-группы. Известно, что от количества восстановленных тиоловых групп в белковой молекуле зависит ее способность адекватно выполнять свою функцию. Показано, что гликолитический и пентозофосфатный пути имеют в своем составе 95% ферментов , содержащих SH-группы, окисление в среднем 30 - 50% таких групп в данных энзимах приведет к инактивации соответствующих белков (Giannerini F. et al, 2001; McMillan M.C, 2001; Thomas T.M, Scopes R.K, 2001). В эритроцитах помимо этих систем присутствует гемоглобин (имеет 6 SH-групп), ферменты антиоксидантной системы, другие метаболические пути, которые также, в большей части, представляют собой тиол-чувствительные белковые молекулы, то есть энзимы, активность которых варьирует от количества окисленных и восстановленных SH-групп (Е. Miclet et al, 2001). Восстановление постоянно окисляемых белковосвязанных SH-групп осуществляется тиолтрансферазой при участии восстановленного глутатиона (Кулинский В .И, Колесниченко JI.C, 1993). Однако, при старении эритроцитов отмечается снижение содержания восстановленного глутатиона (Кудряшов A.M. и др., 2000; Oztiirk О, Gumuslu S, 2004), что может привести к уменьшению скорости восстановления окисленных SH-групп и как следствие, к инактивации ферментов.

Помимо этого активные формы кислорода ускоряют процессы перекисного окисления липидов. Этот факт подтверждается в работе A.M. Кудряшова (2002), в которой показано увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегида и диеновых конъюгатов - при старении эритроцитов (Кудряшов A.M., 2002).

При окислении липидов образуется большое количество очень реакционноспособных а,(3-ненасыщенных альдегидов (малоновый диальдегид, 4-гидрокси-2-ноненаль). Эти альдегиды, как и активные формы кислорода, способны вызывать необратимую модификацию белковых молекул. Так Szweda с соавторами показал, что в конъюгации белка с а,(3-ненасыщенными альдегидами вовлекаются SH-группы цистеина, имидазольная группа гистидина и s-NH2-rpynna лизина (Szweda L.I, Stadtman E.R, 1992; Szweda L.I. et al, 1993; FriguetB. et al, 1994).

Известно, что аминокислотой, обеспечивающей связывание Г6Ф в субстратсвязывающем сайте Г6ФД, является лизин. Исходя из выше сказанного, можно предположить, что при старении эритроцитов может происходить конъюгация а,(3-ненасыщенных альдегидов с лизином субстратсвязывающего сайта Г6ФД и в конечном итоге приводить к снижению активности фермента.

В работе Е. Gordillo с соавторами (1988) показано, что окислительная модификация одного остатка гистидина НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (декарбоксилирующей), происходящая при старении организма, приводит к потере каталитической активности на 36% (Gordillo Е. et al, 1988). Г6ФД также содержит остаток гистидина, необходимый для связывания Г6Ф, поэтому потеря данной аминокислоты может привести к снижению активности фермента.

Кроме того, Г6ФД является олигомерным белком, и поэтому нельзя исключить, что в процессе старения эритроцитов кроликов может происходить частичная диссоциация димерной формы до мономерной, не обладающей ферментативной активностью, как это показано, например, для Г6ФД старых эритроцитов человека (Oliver C.N. et al.,1987).

Наблюдаемое снижение активности Г6ФД способствует угнетению антиоксидантной системы клетки, уменьшению концентрации восстановленного глутатиона, окислению тиоловых групп белков, способствуя тем самым падению ферментативной активности и изменению метаболизма эритроцитов (Jollow D.J., McMillan D.C., 2001; Cheng M-L. et al., 2004). Так, работами многих авторов показано значительное снижение активности гексокиназы, фосфофруктокиназы, пируваткиназы, лактатдегидрогеназы при старении эритроцитов. Нарушаются структура мембранных белков вследствие снижения скорости фосфорилирования спектрина; процессы репарации липидов мембраны. Это приводит к изменению структуры и химического состава мембраны эритроцита; уменьшению содержания липидов, воды, нарушению ее проницаемости, что выражается в увеличении выхода ионов калия из эритроцитов в плазму и увеличению содержания ионов натрия внутри клетки. В результате этих процессов изменяется метаболизм эритроцита в целом, нарушается целостность мембраны клетки, что приводит к ее деформации и элиминации эритроцита из кровяного русла.

Наряду с изучением Г6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, исследовались активность и кинетические параметры фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях напряженного эритропоэза. Сравнительное изучение Г6ФД эритроцитов, продуцированных как в условиях нормального, так и напряженного эритропоэза, позволяет понять определенные закономерности в механизме изменения активности фермента в процессе старения.

Исследование активности Г6ФД во фракции молодых эритроцитов на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери показало, что молодые эритроциты, образованные в условиях напряженного эритропоэза, характеризуются повышенной активностью фермента по сравнению с молодыми клетками интактных кроликов. Выраженность изменений зависит от степени напряженности эритропоэза, определяемой временем после кровопотери. Максимальное увеличение активности наблюдалось на 7 сутки (на 53,9% от фона), менее выраженное на 20 сутки (на 23,6%), а к 30 суткам активность практически приходила к фоновому уровню.

Обнаруженное нами увеличение активности фермента во фракции молодых клеток на 7 сутки после кровопотери может быть обусловлено как более молодым составом эритроцитов в этой фракции, так и особенностями клеток, образованных в условиях напряженного эритропоэза. Так, в данных клетках возможно повышение содержания фермента. В пользу увеличения количества фермента в ходе его синтеза с мРНК указывает обнаруженный контроль экспрессии антиоксидантных генов от продукции активных форм кислорода (Cimino F. et al., 1997; Ursini M.V. et al., 1997). Гипоксия, вызванная кровопотерей, нарушает физиологический баланс системной гемодинамики. Возникает генерализованная ишемия всех тканей организма, вследствие избытка доноров электронов (Бурлакова Е.Б. и др., 1992; Marshall A J. et al, 1996; Lee E. et al., 2001). В этих условиях резко активируется симпатико-адреналовая система, повышающая скорость потребления кислорода в кроветворных органах с одновременным снижением функциональной активности всего организма за счет активации опиоидной системы (Платонов А.Г. и др., 1999; Белан Е.И., 2000; Кудряшов Ю.А. и др., 2000). Ввиду значительных изменений в содержании биогенных аминов и потребления кислорода в кроветворных органах, скорость одноэлектронного восстановления 02 повышается (Wilhelm J. et al., 1995). Это в конечном итоге может активировать экспрессию генов антиоксидантной системы в клетках эритроидного ряда, находящихся еще в кроветворных органах. С выходом в периферическую кровь в эритроидных клетках полностью прекращаются процессы, требующие ДНК, но сохраняется мРНК, с которой может осуществляться синтез белка (Bettinger Т. et al, 2001; Ostareck D.H, 2001). Выявлено, что в ретикулоцитах с момента их выхода в общий кровоток и перехода в зрелый эритроцит происходит интенсивный синтез глобина с долгоживущей мРНК (Huisman М. et al, 2001).

Увеличение активности Г6ФД сопровождалось изменением кинетических свойств фермента: уменьшением Км и увеличением максимальной скорости для ГбФ, увеличением сродства фермента к НАДФ+, снижением ингибирующего влияния НАДФН. Характер кривой зависимости скорости ГбФД-ной реакции от концентрации Г6Ф во ФМЭ, образованных в условиях напряженного эритропоэза подчиняется гиперболическому закону Михаэлиса-Ментен, зависимость скорости реакции от концентрации НАДФ+, также как и у интактных кроликов, следует кинетике Хилла. В изменении величин констант Михаэлиса для Г6Ф и [S]o,5 для НАДФ+ прослеживается та же тенденция, что и в изменении активности фермента: наибольшее снижение величины Км отмечено во ФМЭ на 7 сутки после кровопотери, а к 30 суткам величина константы Михаэлиса практически не отличалась от фонового значения.

Изменение активности и кинетических свойств Г6ФД по отношению к Г6Ф и НАДФ+ в общей эритроцитарной массе на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери имели одинаковую направленность с молодыми клетками, но были менее выраженными.

Исследование фракции старых эритроцитов на 20 сутки после кровопотери обнаружило увеличение активности Г6ФД на 23% по сравнению с аналогичной фракцией у интактных кроликов.

Фракция старых эритроцитов на 20 сутки представлена клетками, значительно более молодыми, чем соответствующая фракция у интактных кроликов, поскольку эритроциты, образованные до кровопотери, по данным иммунных эритрограмм, к 20 суткам покидают кровяное русло. Средний возраст эритроцитов фракции старых клеток в этот период меньше, чем средний возраст общей эритроцитарной массы у интактных кроликов.

Сопоставление значений активности и кинетических параметров Г6ФД старых клеток на 20 сутки с величинами этих показателей у интактных кроликов в общей эритроцитарной массе свидетельствует, что активность Г6ФД ниже, а Км для Г6Ф выше, чем в клетках соответствующего возраста у интакных кроликов. В этих клетках наблюдается уменьшение кооперативных свойств Г6ФД в отношении связывания НАДФ+ и более выраженный ингибирующий эффект НАДФН по сравнению с соответствующими показателями в ОЭМ у интактных кроликов.

На 30 сутки после кровопотери во ФСЭ активность и кинетические свойства Г6ФД практически не отличаются от аналогичных величин у интактных кроликов, хотя на 30 сутки эритроциты в этой фракции значительно более моложе по календарному возрасту, чем старые клетки фоновых животных.

Кроме кинетических параметров были изучены и некоторые физико-химические свойства Г6ФД, в частности влияние температуры и рН среды на активность фермента. Показано, эритроциты образованные после кровопотери отличаются от эритроцитов нормального эритропоэза - они более чувствительны к изменению рН среды и термостабильны.

Влияние температуры на скорость ферментативных реакций может быть обусловлено действием ряда различных факторов. Температура влияет на стабильность фермента; на скорость распада фермент-субстратного комплекса; сродство фермента к субстрату; на величину рН-функций одного или всех компонентов (в результате изменения рК, определяемых по теплоте ионизации); на сродство фермента к активаторам и ингибиторам

Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. рН среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.

В данном случае изменение рН от 5 до 9 сказывается на уровне ионизации двух субстратов - глюкозо-6-фосфата и НАДФ+, в области рН 6, поскольку обе молекулы имеют величины рКа в этой области (Г6Ф имеет величину рКа около 6,11; НАДФ+ около 6,1). Кроме этого, изучение литературных данных по величинам рКа аминокислот, составляющих активный центр молекулы фермента, выявило, что рКа имидозольной группы гистидина-201, входящей в ГбФ-связывающий сайт, равна 6,04. Возможно, этим можно объяснить резкое повышение активности фермента от рН 6 до рН 7.

Также от рН зависит как максимальная скорость реакции, так и константа Михаэлиса.

Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, являются качественно новыми клетками и отличаются от нормальных эритроцитов некоторыми метаболическими особенностями и физико-химическими свойствами.

Особенности «стресс» - эритроцитов могут быть связаны с перестройкой всего эритропоэтического процесса после массивной кровопотери, с запуском зарепрессированной в норме программы «терминального» или «резервного» эритропоэза. Известно, что формирование эритроидных клеток в гемопоэтической ткани в условиях нормального эритропоэза включает несколько стадий дифференцировки, первые три из которых способны пролиферировать. При терминальном эритропоэзе, с целью ускоренного восполнения утраченных при кровопотери эритроцитов, происходит ускорение цикла развития клеток эритроидного ряда за счет редукции части делений. Стимуляция эритропоэза при этом выражается в индукции дифференцировки стволовых клеток в эритроидном направлении, укорочении интермитотического цикла редукцией одного или нескольких промежуточных митотических делений, уменьшением объема неэффективного эритропоэза, укороченным созреванием неделящихся клеток.

Таким образом, эритроциты, продуцированные в ответе на стресс-воздействие, являются качественно новыми клетками. Первоначально они характеризуются повышенной активностью Г6ФД, большим сродством фермента к Г6Ф и НАДФ+, увеличением кооперативных свойств по отношению к НАДФ+, меньшим ингибирующим эффектом.

Однако при старении этих клеток наблюдается более быстрое, чем в норме, снижение активности фермента и изменение кинетических свойств Г6ФД: возрастание Км для Г6Ф, снижение кооперативных свойств, усиление ингибирующего влияния НАДФН, что может явиться косвенным подтверждением отличия свойств Г6ФД в эритроцитах, образованных в разных условиях кроветворения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лакомая, Юлия Александровна, 2006 год

1. Авраамова Т.В. Руководство по большому биохимическому практикуму / Т.В. Авраамова, Н.М. Титова. Красноярск, 1978. -102 с.

2. Алексеев С.Б. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа культивируемых клеток человека. Выделение фермента / С.Б. Алексеев, В.Б. Мамаев // Биохимия. 1979. - №5. - С.940 - 944.

3. Алексеенко Л.П. Полиспецифические эндопептидазы в гемолизате эритроцитов человека / Л.П. Алексеенко, Н.Н. Золотов, В.Н. Орехович, В.Ф. Позднеев //Докл. АН СССР. 1982. - №6. - С. 1258 -1261.

4. Анисимов В.Н. Современные представления о природе старения /

5. B.Н. Анисимов // Успехи современной биологии. 2000. - №2.1. C.146 -164.

6. Атауллаханов Ф.И. Взаимодействие пути Эмбдена Мейергофа гексозомонофосфатного шунта в эритроцитах / Ф.И. Атауллаханов, В.Н. Буравцев // Биохимия. - 1981. - №4. - С.723 - 731.

7. Атауллаханов Ф.И. Зависимость функционирования пентозофосфатного пути в эритроцитах от степени восстановленного глутатиона / Ф.И. Атауллаханов, A.M. Жаботинский, А.В. Пичугин, Н.Ф. Толокнова // Биохимия. 1981. -№3.-С.350-541.

8. Атауллаханов Ф.И. Зависимость пропускной способности пентозного пути от концентрации АТФ в эритроцитах / Ф.И. Атауллаханов, А.В. Пичугин // Биохимия. 1981. - №4. - С.758 -760.

9. Бабаева А.Г. Изменение характера дифференцировки эритроидного ростка костного мозга у мышей под влиянием перитонеальнахклеток доноров, подвергнутых кровопусканию / А.Г. Бабаева, Е.И. Белан // Онтогенез. 1988. - №2. - С.125 - 131.

10. Белан Е.И. Динамика изменения способности клеток перитонеального экссудата запускать различные механизмы эритроидной дифференцировки при массивной кровопотере у мышей / Е.И. Белан // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2000. - №5. -С.521 -.

11. Боровкова Г.И. Фосфолипиды и холестерин при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза: Автореф. дис. . .канд. биол. наук / Г.И. Боровкова. Ленинград, 1983. - 23с.

12. Бриллиант М.Д. К вопросу о фракционировании эритроцитов по возрастным группам / М.Д. Бриллиант, А. И. Воробьев // Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. Красноярск, 1961. -С.62-64.

13. Бурлакова Е.Б. Модуляция перекисного окисления липидов биогенными аминами в модельных системах / Е.Б. Бурлакова, А.Е. Губарева, Г.В. Архипова, В.А. Розинский // Вопр. мед. химии. -1992.-№2.-0.17-21.

14. Быков В.Л. Цитология и общая гистология / В.Л. Быков. СПб.: СОТИС, 1998.-520с.

15. Волкова М.А. Эритропоэтин в лечении анемии при онкологических заболеваний / М.А. Волкова, А.Д. Ширин // Гематол. и трансфузиол.- 1997. №6. - С.ЗЗ - 36.

16. Гаврилов O.K. Клетки костного мозга и периферической крови / O.K. Гаврилов, Т.И. Козинец, Н.Б. Черняк. М.: Медицина, 1985. -258с.

17. Гольдберг Е.Д. Динамическая теория регуляции кроветворения / Е.Д.Гольдберг, A.M. Дыгай, В.В. Жданов, И.А. Хлусов // Бюлл. экспер. биол.и мед. 1999. - №5. - С.484 - 490.

18. Григорьев Г.П. Электрофоретическое исследование мембранных белков эритроцитов разного возраста / Г.П. Григорьев // Вопр. мед. химии. 1981. - №3. - С.91 - 96.

19. Демченко А.П. Изменения структуры и функции белков при старении и их возможные механизмы / А.П. Демченко, Н.Н. Орловская // Успехи современной биологии. 1981. - №2(5). - С. 180- 197.

20. Диксон М. Ферменты /М. Диксон, Э. Уэбб. М.: Мир, 1982. - 392с.

21. Идельсон Л.И. Гемолитические анемии / Л.И. Идельсон, Н.А. Дибковский, Г.В. Ермильченко. М.: Медицина, 1975. - 288с.

22. Коган Г.Л. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа DROSOPHILA MELANOGASTER: очистка и некоторые свойства фермента в норме и при мутациях / Г.Л. Коган; Я.М Розовский, В.А. Гвоздев // Биохимия. 1981. - №3. - С.542 - 551.

23. Козлова Н.М. Окисление мембранных белков и изменение поверхностных свойств эритроцитов / Н.М. Козлова, Е.И. Слобожанина, Е.А. Черницкий // Биофизика. 1998. - №3- С.480 -483.

24. Корвин-Павловская Е.Г. Характеристика путей дифференцировки эритроидных клеток птиц в условиях анемии / Е.Г. Корвин-Павловская, А.С. Кульминская, Е.М. Каралова, Ю.А. Магакян // Цитология. 1983. - №2. - С.148 - 155.

25. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден. М.: Мир, 1978. - 280с.

26. Крупянко В.И. О выборе концентраций субстрата для определения константы Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции / В.И. Крупянко, П.В. Крупянко // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - №2. - С.133 - 136.

27. Кудрявцева Г.В. Некоторые молекулярно-кинетические характеристики ферментов пентозофосфатного пути метаболизма углеводов / Г.В. Кудрявцева // Успехи современной биологии. -1980. №1. - С.74 - 89.

28. Кудряшов A.M. Изменение содержания SH-групп в онтогенезе эритроцитов / A.M. Кудряшов, Н.М. Титова. М,2000. - с. - Деп. в ВИНИТИ 26.07.2000, №2081, В00.

29. Кудряшов A.M. Исследование роли глутатионовой системы в естественном старении эритроцитов, продуцированных в условияхнормального и напряженного эритропоэза: Автореф. дис. канд. биол. наук / A.M. Кудряшов. Тюмень, 2002. - 21с.

30. Кудряшов Ю.А. Адренергическая реактивность органных вен при действии на организм гипоксии и гипотермии / Ю.А. Кудряшов, М.С. Табаров, Б.И. Ткаченко // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2000. - №11. - С.524 - 526.

31. Кулинский В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатиона / В.И. Кулинский, JI.C. Колесниченко //Успехи современной биологии. 1993. - №3. - С. 187 - 195.

32. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. / Б.И. Курганов М.: Наука, 1978. - 248с.

33. Ленинджер А. Основы Биохимии. /А. Ленинджер. -М.: Мир, 1985.

34. Магакян Ю.А. Изменения состава популяций, темпов пролиферации и специализации клеток эритроидного ряда крыс при экспериментальной анемии / Ю.А. Магакян, Е.М. Каралова, Л.О. Аброян // Цитология. 1993. - №8. - С. 17 - 23.

35. Магакян Ю.А. Изменения в кинетике содержания гемоглобина, суммарного белка и ДНК в эритроидных клетках крыс при экспериментальной анемии. II. Костный мозг / Ю.А. Магакян, Е.М. Каралова, Л.О. Аброян, С.А. Карапетян // Цитология. 1997. - №8. -С.711 -718.

36. Милман Л.С. Механизмы регуляции углеводного обмена в раннем эмбриогенезе /Л.С. Милман, Ю.Г. Юровицкий. М.: Наука, 1973. -236с.

37. Мовсум Заде К.М. Молекулярная природа нарушений в гене глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Подходы к их ДНК-диагностике / К.М. Мовсум-Заде, Т.П. Цаликова // Успехи современной биологии. - 1992. - №3. - С.452 - 461.

38. Мосягина Е.И. Эритропоэз / Е.И. Мосягина, Н.А. Федоров, В.И. Гудим // Нормальное кроветворение и его регуляция / Под ред. Н.А. Федорова. -М. Медицина, 1976. С.341 - 457.

39. Никитченко Ю.В. Ферментативная регуляция свободно-радикального окисления липидов при действии факторов, влияющих на скорость старения / Ю.В. Никитченко // Цитология. -1999. -№9.-С.788.

40. Павлов А.Д. Регуляция эритропоэза: физиологические и клинические аспекты / А.Д. Павлов, Е.Ф. Морщакова. М.: Медицина, 1987.-272с.

41. Панкова Е.С. Глутатионредуктаза при старении эритроцитов: Автореф. дис. . канд. биол. наук / Е.С. Панкова. Ленинград, 1990.- 20с.

42. Подколозин А.А. Антиоксидантная защита организма при старении и некоторых патологических состояниях с ним связанных / А.А. Подкол озин, В.И. Донцов, В.Н. Крутько // Клиническая геронтология. 2001. - №3 (4). - С.50 - 58.

43. Поэтова В.Т. Изменения в качественном составе эритроцитов, продуцированных при напряженном эритропоэзе / В.Т. Поэтова,

44. И.И. Гительзон, И.А. Терсков // Вопросы биофизики, биохимии и патологии эритроцитов. М.: Наука, 1967. - С.27 - 31.

45. Рубина Х.М. Биохимия эритроцита /Х.М. Рубина // Физиология системы крови. Физиология эритропоэза. -JL: Наука, 1979 С.211 -232.

46. Сарычева Т.Г. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме / Т.Г. Сарычева, Г. И. Козинец // Клин. лаб. Диагностика. -2001. №5. - С.З - 8.

47. Смолина Е.В. Фосфофруктокиназа при старении эритроцитов: Автореф. дис. канд. биол. наук /Е.В. Смолина. Ленинград, 1984-23с.

48. Титов С.А. Современные представления о механизмах старения / С.А. Титов, В.Н. Крутько // Физиология человека. 1996. - №2. -С.118 -123.

49. Титова Н.М. Лактатдегидрогеназа при старении эритроцитов: Автореф. дис. канд. биол. наук / Н.М. Титова. Ленинград, 1984. -24с.

50. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович. М.: Агар, 1999.- 512с.

51. Черняк Н.Б. Биохимические процессы при созревании и старении эритроцитов / Н.Б. Черняк // Нормальное кроветворение и его регуляция / Под ред. Н.А. Федорова. М.: Медицина, 1976. - С. 159- 186.

52. Чертков И.Л. Взлеты и падения клеточной гематологии за три четверти века / И.Л. Чертков, Н.И. Дризе // Гематол. и трансфузиол.-2001. №3. - С.10 - 14.

53. Adediran S.A. Sigmoid kinetics of human erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase / S.A. Adediran // Arch. Biochem. Biophys. -1988.-Vol.262.-P.354-459.

54. Adediran S.A. Kinetic properties of normal human erythrocyte glucose-6-phospate dehydrogenase dimmers / S.A. Adediran // Biochimie. -1991. -Vol.73.-P.1211- 1218.

55. Adediran S.A. Kinetic and thermodynamic properties of two electrophoretically similar genetic variants of human erythrocyte glucose-6-phoaphate dehydrogenase/ S.A. Adediran // Biochimie. -1996.-Vol.78.-P.165- 170.

56. Akintonwa D.A. Theoretical mechanistic basis of oxidants of methaemoglobin formation / D.A. Akintonwa // Med. Hypotheses. -2000. Vol.54.-P.312-320.

57. Ando K. Membrane proteins of human erythrocytes are modified by advanced glycation end products during aging in the circulation / K. Ando, M. Beppu, K. Kikugawa, R. Nagai // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. - Vol.258(l). - P.123 - 127.

58. Ando K. Increased release of free Fe ions in human erythrocytes during aging in the circulation / K. Ando, K. Ogawa, S. Misaki, K. Kikugawa// Free Radic. Res. 2002. - Vol.36(10). - P. 1079 - 84.

59. Babalola A.O.G. Genetic variants of human erythrocyte glucoses-phosphate dehydrogenase / A.O.G. Babalola, J.S. Beetlestne, L. Luzzatto//J. Biol. Chem. 1976. - Vol.251. -P.2993 - 3002.

60. Barber J.R. Membrane protein carboxyl increases with human erythrocyte age / J.R. Barber, S. Clarke // J. Biol. Chem. 1983. -Vol.258.-P. 1189- 1196.

61. Bartosh G. Ageing of the erythrocyte. On the possible causes of inactivation of red cell enzymes / G. Bartosh // Mech. Ageing and Develop. 1980. - Vol.13. - P.379 - 385.

62. Bautista J.M. Human glucose-6-phosphate dehydrogenase lysine 205 is dispensable for substrate binding but essential for catalysis / J.M.

63. Bautista, P.J. Mason, L. Luzzatto // FEBS Let. 1995. - Vol.366. -P.61 - 64.

64. Baylor S.M. Measurement and interpretation of cytoplasmic Ca2+ signal from calcium-indicator dyes / S.M. Baylor, S. Hollingworth, T.J. Greenwalt // New Physiol. Sci. 2000. - Vol. 15. - P. 19 - 26.

65. Beal M.F. Oxidatively modified proteins in aging and disease / M.F. Beal/ Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol.32. - P.797 - 803.

66. Beckman K.B. The free radical theory of aging matures / K.B. Beckman, B.N. Ames // Physiol. Rev. 1998. - Vol.78. - P.547 - 581.

67. Ben-Bosat A., Purification and properties of glucose-6-phosphate dehydrogenase (NADP/NAD) and 6-phosphogluconate dehydrogenase (NADP/NAD) from Pseudomonas С / A. Ben-Bosat, I. Goldberg // Biochem. Biophys. Acta. 1980. - Vol.611. - P. 1 -10.

68. Beppu M. Binding of anti-band 3 autoantibody to oxidatively damaged erythrocytes / M. Beppu, A. Mizukami, M. Nagoya, K. Kikugawa // J. Biol. Chem. 1990. - Vol.265. - P.3226 - 3233.

69. Berlett B.S., Protein oxidation in aging disease and oxidative stress / B.S. Berlett, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1997. - Vol.272. - P.20313 -20316.

70. Bettinger T. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cell / T. Bettinger, G. Cangoli, J.O. Vorabi // Nucleic. Acids. Res. 2001. - Vol.29. - P.3882 -3891.

71. Beutler E. Red cell metabolism. A manual of biochemical methods / E. Beutler. Orlando: Grune&Station,1975. - 300p.

72. Beutler E. Characteristics and significance of the reverse glucoses-phosphate dehydrogenase reaction / E. Beutler, W. Kuhl // J. Lab. Clin. Med. 1986. - Vol. 107. - P.502 - 507.

73. Beutler E. G6PD deficiency / E. Beutler // Blood. 1994. - Vol.84. -P.3613 -3636.

74. Beutler E. G6PD population genetics and clinical manifistations / E. Beutler // Blood Rev. 1996. - Vol.10. - P.45 - 52.

75. Braund S. Activation of rabbit blood platelets / S. Braund, C.Bon, T.L. Mouniez // FEBS Lett. 2000. - Vol.471. - P. 12 - 16.

76. Carrard G. Impairment of proteasome structure and function in aging / G. Carrard, A.L. Bulteau, I. Petropoulos, B. Friguet / Int. J. Biochem. -2002.-Vol.34.-P. 1461 -1474.

77. Chang W-Y. Protein oxidation and turnover / W-Y. Chang, G-G. Chou, Y.J. Len // J. Biol. Sci. 2000. - Vol.7. - P.357 - 363.

78. Chapel S. Changes in erythropoietin pharmacokinetics following busulfan-induced bone marrow ablation in sheep: evidence for bonemarrow as a major erythropoietin elimination pathway / S. Chapel // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. - Vol.298. - P.820 - 824.

79. Cheng M.L. Glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient cells show an increased propensity for oxidant-induced senescence / M.-L. Cheng, H.-Y. Ho, Y.-H. Wu, T.-Y. Chiu / Free Radic. Biol. Med. 2004. - Vol.3 6-P.580-591.

80. Ciftci M. Purification and characterization of glucose-6-phosphate dehydrogenase from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) erythrocytes / M. Ciftci, A. Ciltas, O. Erdogan // Vet. Med. 2004. - Vol.49. - P.327 -333.

81. Cimino F. Gene regulation by reactive oxygen species / F. Cimino, F. Esposito, R. Ammendola // Curr. Top. Cell. Regul. 1997. - Vol.35. -P.123 -148.

82. Clark M.R. Senescence of red blood cells: progress and problems /M.R. Clark // Physiol. Rev. 1988. - Vol.68. - P.503 - 554.

83. Cohen P. The molecular weight and subunit structure of glucose-6-phosphate dehydrogenase from human erythrocyte / P. Cohen, M.A. Rosemeyer // FEBS Lett. 1968. - Vol.1. - P. 147 - 149.

84. Comporti M. Iron release, oxidative stress and erythrocyte ageing / M. Comporti, C. Signorini, G. Buonocore, L. Ciccoli // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol.32(7). - P.568 - 576.

85. Corsi D. Alteration of a-spectrin ubiquitination due to age-dependent changes in the erythrocyte membrane / D. Corsi, M. Paiardini, R. Crinelli// Eur. J. Biochem. 1999. - Vol.261. - P.775 - 783.

86. Cosgrove M.S. On the mechanism of the reaction catalyzed by glucose-6-phospate dehydrogenase / M.S. Cosgrove, C. Naylor, S. Paludan, M.J. Adams // Biochemistry. 1998. - Vol.37. - P.2759 - 2767.

87. Dale G.L. Quantitation of immunoglobulin associated with senescent erythrocytes from the rabbit / G.L. Dale, R.B. Daniels // Blood. 1991. -Vol.77.-P.1096-1099.

88. Daniel R.M. The denaturation and degradation of stable enzymes at hing temperatures / R.M. Daniel, M. Dines, H.H. Petach // Biochem. J. -1996,- Vol. 317.-P.l 11.

89. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals / K.G.A Davies // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. -P.9895 - 9901.

90. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. II. Modification of amino acids / K.J.A. Davies, M.E. Delsignore, S.W. Lin// J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.9902 - 9907.

91. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. III. Modification of secondary and tertiary structure / K.J.A. Davies, M.E. Delsignore // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.9908 - 9913.

92. Davies К J. A. Protein damage and degradation by oxygen radicals. IV. Degradation of denatured protein / K.J.A. Davies, S.W. Lin, R.E. Pacifici//J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.9914 - 9920.

93. Davies K.J.A. Oxygen radicals stimulate intracellular proteolysis and lipid peroxidation by independent mechanisms in erythocytes / K.J.A. Davies, A.L. Goldberg // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.8220 -8226.

94. Davies K.J.A. Proteins damaged by oxygen radicals are rapidly degraded in extracts of red blood cells / K.J.A. Davies, A.L. Goldberg // J. Biol. Chem. 1987. - Vol.262. - P.8227-8234.

95. Deutsch J. Glucose-6-phosphate dehydrogenase / J. Deutsch // Methods of enzymatic analysis / eds. H.U. Bergmeyer, J. Bergmeyer. -Verlagsgerellschaff, VCH, 1990. P.190 - 196.

96. Friguet B. Modification of glucose-6-phosphate dehydrogenase by 4-hydroxy-2-nonenal / B. Friguet, E.R. Stsdtman, L.I. Szweda // J. Biol. Chem. 1994. - Vol.269. - P.21639 - 21643.

97. Gershon D. Enzyme alterations in aging / D. Gershon, G. Glass, L.L. Allison // Biol. Cell. 1982. - Vol. 45. - P.391 - 393.

98. Giannerini F. Responses of thiols to an oxidant chellenge: differences between blood and tissues in the rat / F. Giannerini, D. Giustarini, L. Lusini // Chem. Biol. Intract. 2001. - Vol. 134(1). - P.73 - 85.

99. Goi G. Erythrocyte membrane alterations during ageing affect (3-d-glucuronidase and neutral sialidase in elderly subjects / G. Goi, R. Cazzola, C. Tringali, L. Massaccesi / Exp. Geront. 2005. - Vol.40. - P. 219-225.

100. Gordillo E. Possible involvement of histidine residues in the loss of enzymatic activity of rat liver malic enzyme during aging / E. Gordillo, A. Ayala, J. Bautista, A. Machado // J. Biol. Chem. 1988. - Vol.263. -P.8053 - 8057.

101. Grimes A.J. Human red cell metabolism / A.J. Grimes London: Blackwell Sci. Public, 1986. - 384p.

102. Grosh A.K. Glycolysis and the Pasteur effect in rat reticulocytes / A.K. Grosh, H.A. Sloviter // J. Biol. Chem. 1981. - Vol.248. - P.3035-3040.

103. Hadengue A.L. Erythrocyte disaggregation shear stress, sialic acid and cell aging in humans / A.L. Hadengue // Hypertension. 1998. -Vol.32.-P.324 -330.

104. Halliwell B. Free radicals in biology and medicine / B. Halliwell, M.C. Gutteridge. Oxford University Press, 2003. - 936P.

105. Harman D. Free radical theory of aging. Increasing the functional life span / D. Harman // Ann. NY. Acad. Sci. 1994. - Vol.717. - P. 1 -15.

106. Hochstein P. Association of lipid peroxidation and polymerization of membrane proteins with erythrocyte aging / P. Hochstein, S. K. Jain // Fed. Proc. 1981. -Vol.40(2). - P. 183-8.

107. Houben A. Alteration of enzymes in ageing human fibroblasts in culture / A. Houben, M. Raes, A. Houbion, J. Remacle // Mech. Ageing Dev. 1984. - Vol. 1-2. -P.35 - 45.

108. Huisman M. Derivated fetal haemoglobin as a marker for red cell age in the human fetus reflecting stimulated or impaired red blood cell production / M. Huisman, D. Busch, D. Burkholder // Prenat. Diagn. -2001. -Vol.21. -P.523 528.

109. Ingley E. HS1 interacts with Lyn and is critical for erythropoietin-induced differentiation of erythroid cells / E. Ingley, M.K. Sarna, J.G. Beaumont // J. Biol. Chem. 2000. - Vol.275. - P.7887 - 7893.

110. Ingrosso D. Protein methylation as a marker of aspartate damage in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient erythrocytes / D. Ingrosso, A. Cimmino, S. D'Angelo // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol.269. -P.2032 -2039.

111. Jain S.K. Polymerization of membrane components in aging red blood cells / S.K. Jain, P. Hochstein, T. Grune // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980. - Vol.92. - P.247 - 254.

112. Jain S.K. Calcium potentiates the peroxidation of erythrocyte membrane lipids / S.K. Jain, S.B. Shohet // Biochim. Biophys. Acta. -1981. Vol.642(l). -P.46-54.

113. Jain S.K. Evidence for membrane lipid peroxidation during the in vivo aging of human erythrocytes / S.K. Jain // Biochem. Biophys. Acta. -1988.-Vol.937.-P.205-210.

114. Jakubowska-Solarska B. Sialic acids of young and old red blood cells in healthy subjects / B. Jakubowska-Solarska, J. Solski // Med. Sci. Monit. 2000. - Vol.6(5). - P.871 - 874.

115. Jindal H.K. Specific loss of protein kinase activities in senescent erythrocytes / H.K. Jindal, Z. Ai, P. Gascard, C. Horton // Blood. -1996.-Vol.88.-P.1479- 1487.

116. Jollow D.J. Oxidative stress, glucose-6-phosphate dehydrogenase and the red cell / D.J. Jollow, D.C. McMillan // Adv. Exp. Med. Biol. -2001.-Vol.500.-P.595 -605.

117. Junqueira V.B.S. Aging and oxidative stress / V.B.S. Junqueira, S.B.M. Barros, S.S. Chan, L. Rodrigues // Mol. Asp. Med. 2004. -Vol.25. -P.5- 16.

118. Jurado E. Kinetic models of activity for (3 galactosidases: influence of pH, ionic concentration and temperature / E. Jurado, F. Camacho, G. Luzon, J.M. Vicaria // Enzyme Microb. Technol. - 2004. - Vol.34. -P.33 -40.

119. Kahler S.G. Intracellular glucose-6-phosphate dehydrogenase does not monomerize in human erythrocytes / S.G. Kahler, H.N. Kirkman // J. Biol. Chem.- 1983. Vol.258. -P.717-718.

120. Kale M. Lipid peroxidative damage on pyrethroid exposure and alterations in antioxidant status in rat erythrocytes: possible involvment of reactive oxygen species / M. Kale // Toxicol. Lett. 1999. -Vol.105.-P.197-205.

121. Kay J.J. Human erythrocyte aging: cellular and molecular biology / J.J. Kay, S.F. Schulter, G. Bosnian // Transfus. Med. Rev. 1991. -Vol.5.-P.173 -195.

122. Kiefer C.R. Oxidation and erythrocyte senescence / C.R. Kiefer, L.M. Snyder // Curr. Opin. Hematol. 2000. - Vol.7(2). - P. 113 - 116.

123. Kirkman H.N. Regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in intact cells / H.N. Kirkman, W. Wilson, E. Clemons // J. Lab. Clin. Med. 1980. - Vol.101. - P.882 - 899.

124. Kirkman H.N. Regulation of glucose-6-phosphate dehydrogenase in human erythrocytes / H.N. Kirkman, G.F. Gaetani // J. Biol. Chem. -1986. Vol.261. - P.4033 - 4038.

125. Knight J.A. The process and theories of aging / J.A. Knight // Ann. Clin. Lab. Sci. 1995. - Vol.25. - P.l - 12.

126. Kletzien R.F. Glucose-6-phosphate dehydrogenase: a „housekeeping" enzyme subject to tissue-specific regulation by hormones, nutrients andoxidant stess / R.F. Kletzien, P.K.W. Harris, L.A. Foellmi // FASEB J. -1994.-Vol.8.-P.174-181.

127. Komatsu N. Erythropoeiesis and signal transduction: basic and clinical aspects / N. Komatsu // Rincho Ketsueki. 2001. - Vol.42. -P.393 -396.

128. Kotaka M. Structural studies of glucose -6-phosphate and NADP+ binding to human glucose-6-phosphate dehydrogenase / M. Kotaka, S. Gover, L. Vandeputte-Rutten // Acta Crystal. 2005. - Vol.61. - P.495 -504.

129. Lasch P. Hydrogen peroxide-induced structural alterations of RNase A / P. Lasch, T. Petras, O. Ullrich, J. Backmann // J. Biol. Chem. -2001.- Vol.276. P.9492 - 9502.

130. Lee E. Marked anemic hypoxia deteriorates cerebral hemodynamics and metabolism during massive intracerebral hemorrhage / E. Lee, Y. Hung, K.P. Min // J. Neurol. Sci. 2001. - Vol.190. - P.3 -10.

131. Levine R.L. Oxidative modification of proteins during aging / R.L. Levine, E.R. Stadtman / Exp. Geront. -2001. Vol.36. - P. 1495 - 1502.

132. Levine R.L. Carbonyl modified proteins in cellular regulation, aging and disease / R.L. Levine / Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol.32. -P.790-796.

133. Linton S. Protein oxidation and ageing / S. Linton, MJ. Davies, R.T. Dean / Exp. Geront. -2001. Vol.36. - P. 1503 - 1518.

134. Marshall A.J. Pulmonary artery NADPH-oxidase is activated in hypoxic pulmonary vasoconstriction / A.J. Marshall, A.J. Mamary, B.E. Verhoeven // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 1996. - Vol.15. - P.633 -644.

135. McMillan D.C. Favism: effect of divicine on rat erythrocyte sulfhydryl status, hexose monophosphate shunt activity, morphology andmembrane skeletal prteins / M.C. McMillan // Toxicol. Sci. 2001. -Vol.62.-P.353 -359.

136. Miclet E. NMR spectroscopic analysis of the first two steps of the pentose phosphate pathway elucidates the role of 6-phosphogluconolactonase / E. Miclet, V. Stoven, P.A. Michels //J. Biol. Chem. 2001. - Vol.276. - P.34840 - 34846.

137. Minetti G. Cell age-related monovalent cations content and density changes in stored human erythrocytes / G. Minetti, R. Jaenicki, C. Ioppolo // Biochem. Biophys. Acta. 2001. - Vol.1527. - P. 149 - 155.

138. Minetti G. Differential sorting of tyrosin kinases and phosphotyrosin phosphotases acting on band 3 during vesiculation of human erythrocytes/ G. Minetti, A. Ciana, C. Balduini // Biochem. J. 2004. -Vol.377.-P.489-497.

139. Naylor C.E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase mutations causing enzyme deficiency in a model of the tertiary structure of the human enzyme / C.E. Naylor, P. Rowland, A.K. Basak, S. Gover // Blood. -1996. Vol.87. - P.2974 - 2982.

140. Notaro R. Human mutations in glucose-6-phosphate dehydrogenase reflect evolutinary history / R. Notaro, A. Afolayan, L. Luzzatto // FASEB J. 2000. - Vol. 14. - P.485 - 494.

141. Oztiirk 0. Age-related changes of antioxidant enzyme activities, glutathione status and lipid peroxidant in rat erythrocytes after heat stress / O. Oztiirk, S. Gumiislii / Life Sci. 2004. - Vol.75. - P.1551 -1565.

142. Parfrey P. Anaemia in chronic renal disease / P. Parfrey, S. Leavitt, I. Vives // Nephrol. Dial. Transplant. 2001. - Vol.16. - P.41 - 45.

143. Persico M.G. Isolation of human glucose-6-phosphate dehydrogenase cDNA clones: primary structure of the protein and unusual 5 non-coding region / M.G. Persico, G. Vigliett, G. Martini, D. Toniolo // Nucleic Acids Res. 1986. - Vol.14. - P.2511 - 2522.

144. Phillips M.C. The effects of cell ageing on metabolism in rainbow trout (Oncorhynchys mykiss) red blod cells / M.C. Phillips, C.D. Moyes, B.L. Tufts // J. Exp. Biol. 2000. - Vol.203. - P. 1039 - 1045.

145. Picart C. Actin protofilament orientation at the erythrocyte membrane / C. Picart, D.E. Discher, K.A. Hall // Biophys. J. 1999. - Vol.77. -P. 865-878.

146. Piccinini G. Oxidation state of glutathione and membrane proteins in human red cells of different age / G. Piccinini, C. Minetti, A. Balduini // Mech. Ageing Dev. 1995. - Vol.78(l). -P.15 - 26.

147. Piccinini G. Oxidation state of glutathione and membrane proteins in human red cells of different age / G. Piccinini, C. Minetti, A. Balduini // Mech. Ageing Dev. 1995.-Vol.78. -P.78 - 81.

148. Piomelli S. Mechanism of red blood cell aging: relationship of cell density and cell age / S. Piomelli, C. Seaman // Am. J. Hematol. -1993,- Vol.42. -P.46- 52.

149. Preiano B.S. Expression and functional characterization of isoforms 4 of the plasma membrane calcium pump /B.S. Preiano, D. Guerini // Biochem. 1996. - Vol.35. - P.7946 - 7953.

150. Racca A. Senescent erythrocytes: modification of rheologic properties, antigenic expression and interaction with monocytes / A. Racca, C. Biondi, S. Galizzi, RJ. Rasia // Medicina. 1999. - Vol.59(l). - P.33 -37.

151. Rapoport S. The mechanism of maturation dependent breakdown of mitochondria in reticulocytes / S. Rapoport, W. Dubiel, M. Muller // Acta Biol. Med. Germ. - 1981. - Vol.40. - P. 1277 - 1283.

152. Rettig M.P. Evaluation of biochemical chenges during in vivo erythrocyte senescence in the dog / M.P. Rettig, P.S. Low, J.A. Gimm, N. Mohandas II Blood.- 1999. Vol.93. - P.376 - 384.

153. Romero P.J The role of calcium metabolism in human re cell ageing: a proposal / P.J. Romero, E.A. Romero // Blood Cell Mol. Dis. 1999. -Vol.25(l). -P.9- 19.

154. Rossi F.G. Kinetic and thermodynamic aspects of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity and synthesis / F.G. Rossi, M.Z. Ribeiro, A. Converti, M. Vitolo / Enz. Microb. Tech. 2003. - Vol.32. - P.107 -113.

155. Rovira A. Stable in vivo expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and rescue of G6PD deficiency in stem cells by gene transfer / A. Rovira, M. De Angioletti, O. Camacho-Vanegas, D. Liu // Blood. 2000. - Vol.96. - P.4111 - 4117.

156. Salati L.M. Dietary regulation of expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase / L.M. Salati, B. Amir-Ahmady // Annu. Rev. Netr. -2001.-Vol.21.-P.121 -140.

157. Salvador A. Quantitative evolutionary design of glucose-6-phosphate dehydrogenase expression in human erythrocytes / A. Salvador, M.A. Savageau//PNAS. -2003. Vol.100. -P.14463 - 14468.

158. Salvemini F. Enhanced glutathione levels and oxidoresistance mediated by increased glucose-6-phosphate dehydrogenase expression / F. Salvemini, A. Franse, A. Iervolino, S. Filosa // J. Biol. Chem. 1999. -Vol.274.-P.2750 -2757.

159. Scott M.D. NADPH, not glutathione, status modulates oxidant sensitivity in normal and glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient erythrocytes / M.D. Scott, L. Zuo, B.H. Lubin, D. Chiu // Blood. -1991. Vol.77. - P.2059 - 2064.

160. Sharpless N.E. Telomeres, stem cells, senescence, and cancer / N.E. Sharpless, R.A. DePinho // J. Clin. Invest. 2004. - Vol.113. - P. 160 -168.

161. Siems W. Balance of glucose utilization in rabbit reticulocytes / W. Siems, M. Muller, R. Dumdey // Acta Boil. Med. Germ. 1981. -Vol.40.-P.703-706.

162. Siems W. Quantification of pathways of glucose utilization and balance of energy metabolism of rabbit reticulocytes / W. Siems, M. Muller, R. Dumdey // Eur. J. Biochem. 1982. - Vol.124. - P.567 - 576.

163. Stadtman E.R. Metal-catalyzed oxidation of proteins / E.R. Stadtman, C.N. Oliver // J. Biol. Chem. 1991. - Vol.266. - P.2005 - 2008.

164. Szweda L.I. Iron-catalyzed oxidative modification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides / L.I.

165. Szweda, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1992. - Vol.267. - P.3096 -3100.

166. Szweda L.I. Inactivation of glucose-6-phospliate dehydrogenase by 4-hydrozy-2-nonenal / L.I. Szweda, K. Uchida, L. Tsai, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. 1993.- Vol.268. - P.3342 - 3347.

167. Tain W-N. Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity for cell growth / W-N. Tain, L.D. Braunstain, J. Pang, K.M. Stuhlmeier // J. Biol. Chem. 1998. - Vol.273. - P.10609 - 10617.

168. Tang Т.К. Amino acid conservation and clinical severity of human glucose-6-phosphate dehydrogenase mutation / Т.К. Tang, M-J. Hwang// J. Biomed. Sci. 1999. - Vol.6. - P. 106 - 114.

169. Thomas T.M. The effects of temperature on the Kinetics and stability of mesophilic and thermophilic 3 phosphoglycerate kinases / T.M. Thomas, R.K. Scopes // Biochem. J. - 1998. - Vol.330. - P.1087 -1095.

170. Tian W-N. Importance of glucose-6-phospate dehydrogenase activity in cell death / W-N. Tian, L.D. Braunstein, K. Apse, J. Pang // Am. J. Physiol. 1999.-Vol.276.-P.1121 - 1131.

171. Turner B.M. The age related loss of activity of four enzymes in the human erythrocyte / B.M. Turner, R.A. Fisher, H. Harris // Clin. Chim. Acta. 1974. - Vol.50. - P.85 - 95.

172. Ulusu N.N. Kinetic properties of glucose-6-phospate dehydrogenase from lamb kidney cortex / N.N. Ulusu, B. Tandogan, F.E. Tezcan // Biochimie. 2005. - Vol.87. - P. 187 - 190.

173. Ursini M.V. Enchanced expression of glucose-6-phospate dehydrogenase in human cells sustaining oxidative stress / M.V. Ursini, A. Parrella, G. Rosa, S. Salzano // Biochem. J. 1997. - Vol.323. -P.801 - 802.

174. Van Dyke B.R. Haemoglobin: mechanism for the generation of hydroxyl radicals / B.R. Van Dyke, P. Saltman, F.T. Frey // Free Radic. Biol. & Med. 1996. - Vol. 78. - P.985 - 989.

175. Waugh R.E. Rheologic properties of senescent erythrocyte: loss of surface area and volume with red blood cell age / R.E. Waugh, M. Narla, C.W. Jackson, T.J. Mueller // Blood. 1992. - Vol.79. -P.1351 -1358.

176. Wilhelm J. Production of hydrogen peroxide by alveolar macrophages from rats exposed to subacute and chronic hypoxia / J. Wilhelm, B. Sojkova, J. Herget // Physiol. Res. 1995. - Vol.45. - P. 185 - 191.

177. Yeh G.C. Modulation of glucose-6-phospate dehydrogenase activity and expression is associated with aryl hydrocarbon resistance in vitro / G.C. Yeh, P.J. Daschner, J. Lopaczynska // J. Biol. Chem. 2001. -Vol.276. -P.34708- 34713.

178. Yilmaz H. Purification of glucose-6-phosphate dehydrogenase from chiken erythrocytes. Investigation of some kinetic properties / H. Yilmaz, M. Ciftci, S. Beydemir, E. Bakan // Prep. Biochem. Biotech. -2002.-Vol.32.-P.287-301.

179. Yuregir G.T. Studies on red cell glucose-6-phosphate dehydrogenase, evaluation of reference values / G.T. Yuregir, K. Aksoy, A.I. Arpaci, I. Unlukurt // Ann. Clin. Biochem. 1994. - Vol.31. - P.50 - 55.