Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Козловская, Любовь Игоревна

• Козловская, Любовь Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козловская, Любовь Игоревна

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

I. Краткая характеристика рода Flavivirus.

1. Таксономическое положение рассматриваемых вирусов.

2. Краткая молекулярно-биологическая характеристика.

II. Белок Е.

1. Структура белка Е.

2. Изменение конформации белка Е при низком значении pH.

3. Проникновение вирионов в клетку.

III. Рецепторные молекулы для представителен рода Flavivirus.

1. Молекулы,клеточной адгезии (cell adhesion molecules, CAMs).

2. Высокоаффинный ламинин-связывающий белок (ВЛБ).

3. Другие молекулы клеточной/поверхности как возможные рецепторы для представителей рода Flavivirus.

IV. Гликозаминогликаны (ГАГ).

1. Краткая характеристика.

2. Стратегии вирусов по использованию гликозаминогликанов клетки.

3. Взаимодействие представителей рода Flavivirus с ГАГ.

4. Получение и свойства ГАГ-связывающих вариантов.

Материалы и методы.

Использованные в работе вирусы.

Культура клеток.

Животные.

Иммунные сыворотки.

Олигонукл еотиды.

Заражение культуры клеток.

Титрование инфекционного вируса методом бляшек под агаровым покрытием.

Окраска бляшек под агаровым покрытием с помощью генциан виолета.

Титрование вируса на мышах.

Клонирование вируса методом бляшек.

Концентрирование ВКЭ из культуральной жидкости инфицированных клеток.

Гемагглютинация (ГА).

Чувствительность ГА к действию детергентов.

Ракетный иммуноэлектрофорез.

Сорбция вируса на гепарин-сефарозе.

Выделение РНК.

Обратная транскрипция.

Полимеразная цепная реакция.

Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле.

Препаративный электрофорез и выделение продукта ПЦР из легкоплавкой агарозы

Определение нуклеотидной последовательности.

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

Моделирование белковых структур.

Моделирование молекулярной динамики (МД).

Метод построения и оценки корреляционных карт движений элементов вторичной структуры эктодомена белка Е.

Результаты.

I. Варианты с ГАГ-связывающим фенотипом в природной популяции ВКЭ.

1.Описание свойств коллекционных штаммов ВКЭ.

2. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для штаммов

СофьинКГГ и 80к, а также клона 18А штамма Абсеттаров.

II. Изучение влияния структуры белка Е на свойства вариантов одного штамма ВКЭ.

1. Выбор модели для исследования.

2. Сорбция вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ на гепарин-сефарозе.

3. Моделирование и анализ молекулярной динамики белка Е для вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ.

4. Температурная устойчивость вирионов вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ.

5. ГА вариантов штамма ЭК-328 ВКЭ и её устойчивость к детергентам.

Обсуждение.

1. Существование вариантов с различной аффинностью к ГАГ в природной популяции ВКЭ.

2. Корреляционной карты движений димера поверхностного белка вириона Е ВКЭ и разработка подхода к её оценке.

3. Мутации, приводящие к повышению заряда белка Е ВКЭ, и ГАГ-связывающий фенотип.

4. Изучение влияния структуры эктодомена белка Е на свойства вариантов штамма ВКЭ.

5. Анализ молекулярной динамики белка Е ВКЭ для вирусов, принадлежащих к различным подтипам.

Выводы.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гликозаминогликан-связывающие варианты вируса клещевого энцефалита»

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является переносимым клещами представителем рода Flavivirus, вызывающим тяжёлые заболевания человека, характеризующиеся поражением центральной нервной системы (ЦНС).

Гликозаминогликаны (ГАГ) - линейная полисахаридная молекула, которая экспрессируется на поверхности почти всех клеток млекопитающих, а также у организмов различных типов, таких как хордовые и членистоногие. Эти молекулы играют важную роль во взаимодействии клетки с внеклеточным матриксом, межклеточном сигналинге как рецепторы, и ко-рецепторы. Различные по структуре вириона и схеме репликации вирусы используют ГАГ как молекулы связывания с поверхностью клетки и/или молекулы, проникновения в клетку, однако в большинстве случаев эти молекулы не являются уникальными рецепторами.

Ранее на примере ВКЭ было показано, что флавивирусы используют два типа рецепторов на поверхности клеток-мишеней: малочисленный высокоаффинный и многочисленный низкоаффинный. Существует несколько типов молекул, претендующих на роль низкоаффинного рецептора: интегрины, высокоаффинный ламинин-связывающйй белок, гепарансульфат гликозаминогликаны (ГС-ГАГ) и другие.

Ранее для некоторых семейств вирусов, включая флавивирусы, были описаны варианты с повышенной аффинностью к ГАГ. Эти варианты объединяла высокая степень аттенуации для животных.

Описанные ранее лабораторные варианты флавивирусов, включая ВКЭ, с повышенной аффинностью к ГАГ, были получены при адаптации вируса к клеткам ВНК-21, SW-13, Neuro-2 или к клещам разных видов. Эти ГАГ-связывающие варианты обладали специфическими свойствами, основными из которых являлись мелкобляшечный фенотип в культуре клеток почки свиньи и низкая нейроинвазивность. Все варианты в процессе адаптации приобрели мутации, повышающие заряд поверхностного гликопротеина вириона Е. Влияние на структуру белка Е подобных мутаций, изменяющих взаимодействие вирионов с рецептором, не изучалось, также как и существование ГАГ-связывающих вариантов в природной-популяции флавивирусов, в том числе и в.популяции ВКЭ. .

Структура эктодомена молекулы белка оболочки Б ВКЭ была впервые получена Rey с соавторами (1995), затем был проведён-рентгеноструктурный анализ частичных или полных структур для других представителей рода Flavivirus. Изучение свойств молекулы белка не проводилось, в том? числе и моделированием молекулярной динамики in silico. Подобное изучение характеристик структуры белка может быть крайне полезно при создании, новых лекарственных соединений, так как позволит учесть дополнительные параметры для рационштьного дизайна препаратов:

Цель и задачи работы: Целью данной работы являлось изучение влияния аминокислотных замен, повышающих заряд молекулы поверхностного гликопротеина Е ВКЭ, на аффинность к клеточным ГАГ, структуру белка Е и биологические характеристики вируса.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Охарактеризовать свойства и аффинность к ГАГ набора штаммов ВКЭ, выделенных в разных частях России и стран Балтии.

2. С использованием нескольких штаммов ВКЭ с различной аффинностью к ГАГ определить, каждая ли мутация, повышающая заряд поверхностного гликопротеина Е, приводит к образованию варианта с ГАГ-связывающим, фенотипом.

3. На основе набора вариантов штамма ЭК-328, полученных при адаптации к клещам и переадаптации к клеткам млекопитающих, изучить влияние некоторых мутаций на структуру белка Е, аффинность к ГАГ и другие свойства вируса.

Научная новизна

Впервые показано, что циркулирующие в природе варианты ВКЭ могут значительно различаться по аффинности связывания с ГАГ клетки.

Впервые выявлен и охарактеризован вариант с ГАГ-связывающим фенотипом среди природных изолятов ВКЭ, характеризующийся комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкой бляшкой- в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности (ГА) и. неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе (РИЭФ).

Впервые проведено моделирование пространственной^ структуры эктодомена поверхностного белка Е представителей всех трёх подтипов-ВКЭ.

Впервые in silico изучено поведение аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е и его связь с аминокислотной последовательностью белка. Показано, что одна аминокислотная мутация может привести к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков в эктодомене гликопротеина Е.

Впервые показано, что не любая аминокислотная замена, повышающая заряд поверхностного гликопротеина вириона, приводит к образованию вариантов с ГАГ-связывающим фенотипом.

Впервые показано, что данные, полученные при анализе молекулярной динамики (МД) эктодомена поверхностного белка вириона, позволяют предсказывать стабильность вирионов.

Впервые изучены молекулярные механизмы разной чувствительности ГА к детергентам и сниженной устойчивости вирионов ВКЭ к длительному температурному воздействию.

Научно-практическая ценность

Получена принципиально новая информация о конформационной стабильности эктодомена поверхностного гликопротеина Е представителей рода Flavivirus.

Апробирован новый подход к изучению свойств вирионов на основе анализа результатов МД эктодомена белка оболочки.

Предложен новый подход к оценке относительной подвижности элементов вторичной структуры в молекулах белков in silico на основе численного описания подвижности аминокислотных остатков.

• Выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к значительному изменению относительной подвижности аминокислотных остатков эктодомена белка Е, что необходимо учитывать при разработке препаратов для лечения клещевого энцефалита на основе ингибиторов слияния и других соединений, действие которых основано на связывании с поверхностным гликопротеином вириона. Также было выявлено, что одиночные аминокислотные мутации могут приводить к резкому изменению свойств вириона, в том числе его устойчивости к внешним воздействиям, что важно при разработке вакцинных препаратов.

Определены нуклеотидные последовательности белков оболочки Е для ряда штаммов, изолированных в разных частях России и стран Балтии, и депонированы в , международной базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, Ms GU121963, GU121964, GU121965, GU121966, GU125720, GU125721, GU125722, GU121967, GU125719).

Обзор литературы I. Краткая характеристика рода Flavivirus

Семейство Flaviviridae состоит из трёх родов Flavivirus, Pestivirus, Hepacivirus. Многие представители рода Flavivirus вызывают тяжёлые заболевания человека: вирус клещевого энцефалита, вирус жёлтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус Западного Нила, четыре серотипа вируса Денге и другие.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Козловская, Любовь Игоревна

Выводы

1. Циркулирующие в природе варианты, вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) значительно различаются по аффинности связывания с гликозаминогликанами (ГАГ) поверхности клетки. ГАГ-связывающий фенотип характеризуется комплексом специфических свойств: повышенной сорбцией на гепарин-сефарозе, мелкобляшечным фенотипом в культуре клеток почки свиньи, низкой нейроинвазивностью при высокой нейровирулентности, отсутствием или снижением гемагглютинирующей активности и неспособностью формировать преципитат вирионов с антителами в ракетном иммуноэлектрофорезе.

2. Не любая аминокислотная замена, повышающая заряд молекулы белка Е, приводит к повышению аффинности взаимодействия с ГАГ клетки и проявлению комплекса специфических свойств.

3. Одним из факторов, определяющих аффинность связывания вирионов вариантов ВКЭ с гепарансульфат ГАГ, является относительная подвижность аминокислотных остатков эктодомена белка Е.

4. Корреляционные карты, описывающие относительную подвижность аминокислотных остатков эктодоменов белков оболочки Е ВКЭ, могут значительно отличаться друг от друга. Варианты ВКЭ, значительно различающиеся по аминокислотной последовательности эктодомена белка Е (принадлежащие к различным подтипам), могут обладать сходными корреляционными картами, и варианты вируса, различающиеся только одной аминокислотной заменой в белке Е, могут значительно отличаться по подвижности его молекулы.

5. Конформационная подвижность эктодомена гликопротеина оболочки Е вносит существенный вклад в определение стабильности вирионов (устойчивость к длительному температурному воздействию и устойчивость гемагглютинирующей активности к детергентам).

Благодарности

Я, искренне благодарна «д. б.н. Г.Г. Каргановой за научное руководство; неустанное внимание и поддержку.

Выражаю глубокую благодарность дирекции ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (академику РАМН С.Г. Дроздову и профессору М.И. Михайлову) за предоставленную возможность выполнения данной работы. Я выражаю искреннюю благодарность к.б.н. Медведкиной O.A. за неоценимую помощь на пути к официальной защите диссертации.

Благодарю сотрудников кафедры органической химии Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова Осолодкина Д.И. за непосредственное' участие в настоящей работе и к.х.н. Палюлина В.А за внимание, ей посвященное.

Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН: к.б.н. Романову Л.Ю., Шевцову A.C., Рогову Ю.В., к.б.н. Гмыль JI.B., к.м.н.

Дживанян Т.И.], Блинову P.C., Морозову Т.П. за непосредственную помощь и участие в данной работе, к.б.н. Гмыль А.П. за поддержку, ценные советы и плодотворные научные дискуссии, к.м.н. Ливанову Г.П. за предоставление необходимых для настоящей работы материалов.

Я благодарна официальным оппонентам д.б.н. Калининой Н.О. и д.б.н. Гамбарян A.C., а также рецензенту к.б.н. Воровичу М.Ф. за внимательное прочтение работы и ценные замечания.

Я благодарна всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении исследований.

Я благодарю своих родителей, Козловского И.Ф. и Козловскую И.А., за помощь, внимание и любовь на каждой ступени моего пути к созданию этой работы.

Я благодарю своих друзей, особенно Селиванова A.B., за ненавящивую поддержку во время создания данной работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козловская, Любовь Игоревна, 2010 год

1. Грицун Т.С., Ляпустин В.Н., Шаталов А.Г., Лашкевич В.А. 1990. Множественные формы белка NS1 как основного компонента невирионного («растворимого») антигена вируса клещевого энцефалита. Вопр. вирусол. № 6, стр. 471-474.

2. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Королев М.Б. 1986. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum. Вопр. вирусол. №1, стр. 92-96.

3. Дживанян Т.И., Чунихин С.П., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. 1975. Изменчивость вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку при пассажах через клещей и позвоночных животных. Материалы IX симпозиума «Экология вирусов», г. Душанбе, стр. 22-24.

4. Дживанян Т.И., Батикова М., Грешикова М., Чунихин С.П. 1981. Различия штаммов вируса клещевого энцефалита по чувствительности их гемагглютининов к действию детергентов. Вопр. вирусол. №2, стр.237-240.

5. Карганова Г.Г. 1991. Зависимые от хозяина варианты вируса клещевого энцефалита и особенности их репродукции в клетках млекопитающих. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности вирусология.

6. Ляпустин В.Н., Чунихин С.П., Решетников И.Н., Лашкевич В.А. 1987. Изменения синтеза вирионного антигена вируса клещевого энцефалита после пассирования через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Вопр. вирусол. №4, стр. 451-456.

7. Протопопова Е.В., Коновалова С.Н. и Локтев В.Б. 1997. Выделение клеточного рецептора для вируса клещевого энцефалита при помощи анти-идиотипических антител. Вопр. виру con. №2, стр. 264-268.

8. Чунихин С.П. и Дживанян Т.И. 1977. «Экологические маркеры» арбовирусов. ДС-маркер вируса клещевого энцефалита. Вестник АМН СССР. №5, стр. 17-21.

9. Чунихин С.П1., Решетников И.Н., Ляпустин В:Н. 1986. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих. Мед. паразптол. и паразит, болезни. №6, стр. 58-61.

10. Чунихин С.П., Дживанян Т. И., Баннова Г.Г., Бабенко Л.В: 1975. Экспериментальное изучение роли иксодовых клещей в изменчивости вируса клещевого энцефалита по ДС-признаку. Мед. паразитом, и паразит, болезни. № 3, стр. 344-347.

11. Alberts В., Bray D., Lewis J., Raff М., Roberts К., Walter P. 2008: Molecular biology of the cell, fifth ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, USA.

12. Allison S.L, Stiasny K., Stadler К., Mandl C.W., Heinz F.X. 1999. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. J.Virol. 73, p. 5605-5612.

13. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz С., Heinz F.X. 1995. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH. J. Virol. 69(2), p. 695-700.

14. Alonso A., Goni F.M., Buckley J.T. 2000. Lipids favoring inverted phase enhance the ability of aerolysin to permeabilize liposome bilayers. Biochemistry. 39, p. 14019-14024.

15. Ammendolia M.G., Pietrantoni A., Tinari A., Yalenti P., Superti F. 2007. Bovine lactoferrin inhibits echovirus endocytic pathway by interacting with viral structural polypeptides. Antiviral. Res. 73(3), p. 151-60.

16. Andreo U., Maillard P., Kalinina O., Walic M., Meurs E., Martinot M., Marcellin P., Budkovvska A. 2007. Lipoprotein lipase mediates hepatitis С virus (HCY) cell entry and inhibits HCV infection. Cell. Microbiol. 9, p. 2445-2456.

17. Baranowski E., Ruiz-Jarabo C.M., Sevilla N., Andreu D., Beck E., Domingo, E. 2000. Cell recognition by foot-and-mouth disease virus that lacks the RGD integrin-binding motif: flexibility in aphtliovirus receptor usage. J. Virol. 74, p. 1641-1647.

18. Baranowski E., Sevilla N., Verdaguer N., Ruiz-Jarabo C.M., Beck E., Domingo E. 1998'. Multiple virulence determinants of foot-and-mouth disease virus in cell culture. J. Virol. 12, p.6362-6372.

19. Barker W.C., Mazumde, R., Vasudeva, S., Sagripant, J.L., Wu C.H. 2009. Sequence signatures in envelope protein may determine whether flaviviruses produce hemorrhagic or encephalitic syndromes. Virus Genes. 39(1), p. 1-9.

20. Barrett C.P., Hall B.A., Noble M.E.M. 2004. Dynamite: A Simple Way to Gain Insight into Protein Motions. Acta Cryst. 60(12-1), p.2280-2287.

21. Barth H., Schafer С., Adah M.I., Zhang F., Linhardt R.J., Toyoda H., Kinoshita-Toyoda A., Toida Т., Van Kuppevelt Т.Н., Depla E., Yon Weizsäcker F., Blum H.E., Baumert T.F. 2003.

22. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J. Biol. Chem. 278, p. 41003-41012.

23. Barth H., Schnober E.K., Zhang F., Linhardt R.J., Depla E., Boson B., Cosset F.L., Patel A.H., Blum H.E., Baumert T.F. 2006. Viral and cellular determinants of the hepatitis G virus envelope-heparan sulfate interaction. J. Virol. 80, p. 10579-10590.

24. Basu, A., Beyene, A., Meyer, K., Ray, R. 2004. The hypervariable region 1 of the E2 glycoprotein of hepatitis C virus binds to glycosaminoglycans, but this binding does not lead to infection in a pseudotype system. J. Virol. 78, p. 4478- 4486.

25. Basu A., Kanda T., Beyene A., Saito K., Meyer K., Ray R. 2007. Sulfated homologues of heparin inhibit hepatitis C virus entry into mammalian cells. J. Virol. 81, p. 3933-3941.

26. Bernard K.A., Klimstra W.B., Johnston R. E. 2000. Mutations in the E2 glycoprotein of Venezuelan equine encephalitis virus confer heparan sulfate interaction, low morbidity, and rapid clearance from blood of mice. Virology. 276, p. 93-103.

27. Bressanelli S., Stiasny K., Allison S.L., Stura E.A., Duquerroy S., Lescar J., Heinz F.X., Rey

28. F.A. 2004. Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation. EMBOJ. 23, p. 728-738.

29. Burke D.S., Monath T.P. 2001. Flaviviruses. In D. M. Knipe, P. M. Howley et al. (eds.), Fields-virology, 4th ed. Lippincott- Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. p. 1042-1150.

30. Burlone M.E., Budkowska A. 2009. Hepatitis C virus cell entry: role of lipoproteins and cellular receptors. J. Gen. Virol. 90, p. 1055-1070.

31. Byrnes A.P., Griffin D.E. 1998. Binding of Sindbis virus to cell surface heparan sulfate. J. Virol 72(9), p. 7349-7356.

32. Calisher C.H., Gould E.A. 2003. Taxonomy of the virus family Flaviviridae. Adv. Vir. res. 59, p. 1-19.

33. Callens N., Ciczora Y., Bartosch B., Vu-Dac N., Cosset F.L., Pawlotsky J.M., Penin F., Dubuisson J. 2005. Basic residues in hypervariable region 1 of hepatitis C virus envelope glycoprotein e2 contribute to virus entry. J. Virol. 79, p. 15331-15341.

34. Cardosa M.J., Porterfield J.S., Gordon S. 1983. Complement receptor mediates enhanced Flavivirus replication in macrophages. J. Exp. Med. 158, p. 258-263.

35. Case D.A., Darden T.A., Cheatham III T.E., Simmerling C.L., Wang J., Duke R.E., Luo R., Crowley M., Walker R.C., Zhang W., Merz K.M., Wang B., Hayik S., Roitberg A., Seabra

36. Castle E., Nowak T., Leidner U., Wengler G. 1985. Sequence analysis of the viral core protein and the membrane-associated proteins VI and NV2 of the flavivirus West Nile virus and of the genome sequence for these proteins. Virology. 145, p. 227-236.

37. Chen Y.C., Wang S.Y., King C.C. 1999. Bacterial lipopolysaccharide inhibits DEN infection of primary human monocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependent mechanism. J. Virol. 73, p. 2650-2657.44.