Изменение структуры популяции переносимых клещами флавивирусов при адаптации к репродукции в различных системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Литов, Александр Геннадьевич

• Литов, Александр Геннадьевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Литов, Александр Геннадьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................7

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................................14

Глава 1. Распространение и патогенетическая характеристика ВКЭ и вируса Повассан................14

Глава 2. Молекулярно-биологическая характеристика представителей рода ¥1а\ттт................15

2.1. Свойства вириона.......................................................................................................................15

2.2. Структура генома.......................................................................................................................16

2.3. Белки и функциональные РНК флавивирусов.........................................................................17

2.4. Жизненный цикл и морфогенез вируса....................................................................................23

Глава 3. Таксономическое положение рассматриваемых вирусов.....................................................28

Глава 4. Популяции РНК-содержащих вирусов и концепция квазивида..........................................30

4.1. Основные положения теории квазивида..................................................................................31

4.2. Основные аспекты эволюции популяций РНК-содержащих вирусов..................................37

4.3. Критика концепции квазивида..................................................................................................46

4.4. Методы исследования популяций вирусов..............................................................................48

Глава 5. Опыты по изучению эволюции ВКЭ в различных системах................................................55

5.1. Гликозаминогликаны и ГАГ-связывающий фенотип вирусов..............................................55

5.2. Опыты по адаптации ВКЭ к различным системам.................................................................55

5.3. Связь ГАГ-связывающего фенотипа и замен в поверхностном гликопротеине Е...............58

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................................................61

Глава 1. Вирусы, животные и культуры клеток...................................................................................61

1.1. Использованные в работе вирусы.............................................................................................61

1.2. Полученные в ходе работы варианты вирусов и их номенклатура.......................................63

1.3. Культура клеток млекопитающих............................................................................................65

1.4. Культуры клеток клещей...........................................................................................................65

1.5. Животные, использованные в работе.......................................................................................66

Глава 2. Олигонуклеотиды.....................................................................................................................67

2.1. Олигонуклеотиды, использованные для амплификации фрагментов генома при секвенировании по Сэнгеру.............................................................................................................67

2.2. Олигонуклеотиды, использованные для амплификации фрагментов генома ВКЭ для последующего высокопроизводительного секвенирования.........................................................72

2.3. Другие олигонуклеотиды, использованные в работе.............................................................72

Глава 3. Молекулярно-биологические процедуры...............................................................................75

3.1 Выделение РНК...........................................................................................................................75

3.2. Обратная транскрипция.............................................................................................................75

3.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)......................................................................................75

3.4. Аналитический электрофорез в агарозном геле......................................................................75

3.5. Препаративный электрофорез...................................................................................................76

3.6. Выделение фрагментов ДНК из геля........................................................................................76

3.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК..........................................................77

3.8. Приготовление стандартов для ПЦР в реальном времени.....................................................77

3.9. ПЦР в реальном времени...........................................................................................................78

Глава 4. Высокопроизводительное секвенирование............................................................................78

4.1. Выделение РНК для высокопроизводительного секвенирования.........................................78

4.2. Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)....................................79

4.3. Промывка камеры при препаративном электрофорезе для подготовки к высокопроизводительному секвенированию.................................................................................79

4.4. Препаративный электрофорез и выделение ДНК из геля......................................................79

4.5. Тагментирование, индексирование, подготовка библиотек и высокопроизводительное секвенирование..................................................................................................................................80

4.6. Биоинформатическая обработка данных ВПС........................................................................80

Глава 5. Вирусологические и экспериментальные процедуры...........................................................81

5.1. Титрование инфекционного вируса в культуре клеток СПЭВ..............................................81

5.2. Титрование инфекционного вируса на мышах........................................................................81

5.3. Клонирование вируса методом бляшек...................................................................................82

5.4. Персистентная инфекция в культурах клеток клещей............................................................82

5.5. Размножение вируса в культуре клеток клещей.....................................................................82

5.6. Пассирование вируса в культуре клеток СПЭВ......................................................................82

РЕЗУЛЬТАТЫ.............................................................................................................................84

Глава 1. Характеристика вирусов, использованных в работе в качестве исходных вариантов......84

Глава 2. Изучение клонов, полученных из популяций вариантов штамма ЭК-328, адаптированных к персистентной инфекции в культурах клеток клещей........................................86

Глава 3. Высокопроизводительное секвенирование варианта М и варианта ЭК-328а....................96

Глава 4. Динамика накопления ЛПЗ при репродукции ВКЭ в культуре клеток СПЭВ...................98

Глава 5. Свойства вариантов ВКЭ, прошедших 6 пассажей в культуре клеток СПЭВ.................. 106

Глава 6. Свойства вариантов вируса Повассан на разных стадиях адаптации к культуре клеток СПЭВ...................................................................................................................................................... 120

ОБСУЖДЕНИЕ.........................................................................................................................126

Глава 1. Использованные в работе фенотипические маркёры.......................................................... 126

Глава 2. Исследование клонов ВКЭ, полученных из популяций вариантов штамма ЭК-328,

адаптированных к персистенции к культурам клеток клещей.........................................................127

Глава 3. Адаптация ВКЭ и вируса Повассан к культурам клеток и накопление ЛПЗ-мутантов .. 128

Глава 4. Динамика накопления ЛПЗ-ассоциированных ОВ в популяции ВКЭ при адаптации к культуре клеток СПЭВ......................................................................................................................... 130

Глава 5. Адаптация ВКЭ и вируса Повассан к репродукции в СПЭВ при различных температурных режимах....................................................................................................................... 132

Глава 6. Появление в популяции вариантов со стоп-кодонами при адаптации ВКЭ к культуре клеток СПЭВ.......................................................................................................................................... 133

Глава 7. Репликативная молекулярная память ВКЭ.......................................................................... 134

Глава 8. Гетерогенность популяции ВКЭ в сравнении с другими вирусами.................................. 136

Глава 9. Описанные в данной работе эксперименты в свете теории квазивида............................. 138

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..........................................................................................................................140

ВЫВОДЫ...................................................................................................................................142

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................143

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БОЕ - бляшкообразующие единицы

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ВПС - высокопроизводительное секвенирование

ГАГ - гликозаминогликаны

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дцРНК - двуцепочечная РНК

КЖ - культуральная жидкость

ЛД50 - пятидесятипроцентная летальная доза

ЛПЗ - локальный положительный заряд поверхностного гликопротеина Е

ЛПЗ-ассоциированные ОВ - однонуклеотидные вариации в геноме, которые приводят к появлению в популяции вариантов ВКЭ с заменой в белке Е, повышающей его локальный положительный заряд

нт - нуклеотид

НТО - нетранслируемая область ОВ - однонуклеотидные вариации ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция, проведённая в одной пробирке

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени РНК - рибонуклеиновая кислота

СПЭВ - культура клеток почки эмбриона свиньи сфРНК - субгеномная флавивирусная РНК ЦПД - цитопатическое действие. ЭПР - эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение структуры популяции переносимых клещами флавивирусов при адаптации к репродукции в различных системах»

Актуальность избранной темы

Изучение вопросов эволюции является одной из основных целей биологии. Знания о микроэволюционных процессах, протекающих в популяциях живых организмов, важны для понимания конкретных факторов, которые влияют на её судьбу в данных условиях. Вирусы представляют собой довольно удобную модель для изучения микроэволюции благодаря своему быстрому циклу размножения и возможности удобно оперировать огромным числом организмов одновременно.

В настоящий момент известно большое количество закономерностей в эволюции вирусов. Часть этих закономерностей является следствием особых свойств их популяции (очень большой размер) и репликативного аппарата (высокая частота ошибок при репликации). В то же время, множество особенностей эволюции вирусных популяций изучены недостаточно хорошо, слабо доказаны или доказаны лишь для ограниченного числа вирусов.

При изучении эволюции особый интерес представляют арбовирусы, то есть вирусы, процесс циркуляции в природе которых связан с трансмиссивной передачей. При этом вирус должен быть способен активно размножаться в таких довольно эволюционно далёких организмах, как позвоночные и членистоногие. Изучение микроэволюции арбовирусов позволяет определять факторы, позволяющие вирусу успешно репродуцироваться в различных хозяевах, и понять процессы, происходящие в вирусной популяции при чередовании хозяина. Это, в свою очередь, может позволить лучше понять процессы, обеспечивающие появление новых эпидемиологически важных вариантов вирусов. С практической точки зрения, знания об особенностях микроэволюции того или иного вируса должны учитываться при разработке и применении профилактических и лечебных антивирусных препаратов.

Использованные в данной работе вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) и вирус Повассан, относятся к роду Flavivirus и являются арбовирусами. Флавивирусы продемонстрировали способность к быстрому распространению на новых территориях [1], изменению патогенности для человека [1, 2] и способа передачи [3]. ВКЭ и вирус Повассан вызывают тяжёлые заболевания человека. Заболеваемость ВКЭ довольно высока и регистрируется практически на всём протяжении севера Евразии [4], а заболеваемость

вирусом Повассан, хотя и остаётся невысокой в абсолютных значениях, повысилась на 671% в течение последних 18 лет [5].

Степень разработанности избранной темы

Адаптация переносимых комарами флавивирусов к различным системам активно изучается, в то же время для переносимых клещами флавивирусов данная информация ограничена. Механизмы, лежащие в основе способности вируса активно репродуцироваться в далёких друг от друга хозяевах, до сих пор вызывают дискуссии среди специалистов. Одним из подходов к изучению селективного давления, оказываемого средой на популяцию вируса, является изучение свойств адаптированных к данной среде вариантов.

Ранее было показано, что адаптация ВКЭ к культурам клеток млекопитающих и пассирование вируса в клещах часто приводит к появлению вариантов с заменами в белке Е, повышающими локальный положительный заряд поверхностного гликопротеина Е [69]. В большинстве случаев такие замены приводят к образованию, так называемого, ГАГ-связывающего фенотипа: повышенной сорбции вируса на гликозаминогликанах (ГАГ) клетки, уменьшенному размеру бляшек при титровании вируса в культуре клеток и сниженной нейроинвазивности для лабораторных мышей [8, 10]. Варианты вируса с подобными свойствами были выделены из природы [10-12]. В то же время очевидно, что подобный фенотип может быть обусловлен заменами в других участках генома.

Стоит отметить, что во всех предыдущих исследованиях, посвящённых адаптации ВКЭ к любым объектам, описывались изменения свойств популяции ВКЭ и консенсусных последовательностей генома вируса, что недостаточно для понимания микроэволюционных процессов внутри популяции. Тщательной оценки гетерогенности вирусной популяции и целенаправленного исследования минорных вариантов так же не проводилось. Вирус Повассан, в целом, плохо изучен, и изменения в геноме данного вируса при адаптации его к культурам клеток ранее не изучалась.

Целью данной работы было изучение изменения генетической структуры популяции переносимых клещами флавивирусов при адаптации к репродукции в различных системах.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Получить варианты ВКЭ, адаптированные к персистенции в культурах клеток клещей ЖЕ/СТУМ19, НАЕ/СТУМ8.

2) Получить варианты ВКЭ и вируса Повассан, адаптированные к репродукции в культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при различных температурных режимах.

3) Изучить изменения фенотипа и генома вирусов, которые происходят при адаптации ВКЭ и вируса Повассан к культурам клеток 1ЯЕ/СТУМ19, НЛЕ/СТУМ8 и СПЭВ.

4) Изучить изменения структуры популяции полученных вариантов с помощью биологического клонирования и высокопроизводительного секвенирования.

Научная новизна

В данной работе впервые:

— С помощью высокопроизводительного секвенирования изучена генетическая структура популяции ВКЭ с выявлением однонуклеотидных вариаций с представленностью 1% и более.

— Изучена динамика накопления замен в белке Е ВКЭ при адаптации в культуре клеток и установлено, что на ранних этапах адаптации в популяции появляется множество вариантов с заменами, повышающими локальный положительный заряд белка.

— Показано, что адаптация вируса Повассан к культуре клеток приводит к отбору вариантов с заменами, повышающими локальный положительный заряд белка Е.

— Показано, что геномы молекулярной памяти могут присутствовать в популяции ВКЭ с уровнем представленности менее 1%.

— В неструктурных белках ВКЭ и вируса Повассан найдены замены, ассоциированные с адаптацией к разной температуре культивирования.

Теоретическая и практическая значимость

В данной работе на модели ВКЭ и вируса Повассан при помощи опытов по адаптации к различным системам был накоплен большой объём экспериментальных данных, которые существенно расширяют и дополняют современные представления о микроэволюции переносимых клещами флавивирусов. Полученные в ходе работы результаты:

• Установлено, что адаптация ВКЭ к персистентной инфекции в культурах клеток клещей ГОЕ/СТУМ19, НЛЕ/СТУМ8, а так же ВКЭ и ВП к культуре клеток СПЭВ происходит за счёт накопления в популяции вариантов, содержащих

аминокислотные замены в вирусном поверхностном гликопротеине Е, повышающие его локальный положительный заряд.

• При помощи высокопроизводительного секвенирования получены данные о генетической структуре популяции двух лабораторных вариантов ВКЭ, что позволило сравнить гетерогенность популяции лабораторных штаммов ВКЭ с гетерогенностью популяции ВКЭ в природных популяциях.

• Проведена оценка уровня представленности геномов молекулярной памяти в популяции ВКЭ, что важно для понимания механизмов появления новых вариантов вируса.

• При помощи высокопроизводительного секвенирования исследована динамика накопления однонуклеотидных гетерогенностей в белке Е при адаптации вируса к культуре клеток СПЭВ. Установлено, что в популяции ВКЭ на начальных этапах адаптации вируса к культуре клеток СПЭВ появляется широкий спектр вариантов вируса с аминокислотными заменами, повышающими локальный положительный заряд вирусного поверхностного гликопротеина Е.

• Показано, что при репродукции с низкой множественностью заражения в культуре клеток СПЭВ 12 пассажей ВКЭ недостаточно для того, чтобы популяция достигла равновесного состояния.

• Обнаружено, что адаптация флавивирусов ВКЭ и вируса Повассан к культуре клеток СПЭВ при различных температурных режимах приводит к накоплению мутантов с заменой в хеликазе N83, ассоциированной с пониженной температурой культивирования. Для ВКЭ обнаружена замена в белке репликативного комплекса №4А, ассоциированная с адаптацией к 37°С.

Практическая значимость работы. В данной работе было установлено, что в популяции вируса с низкой нейроинвазивностью варианты с высокой нейроинвазивностью могут присутствовать в течение длительного времени и иметь представленность менее 1%, но способны при соответствующих условиях к быстрому повышению представленности. Это может иметь большое значение при создании профилактических и лечебных препаратов. Полученные в результате работы нуклеотидные последовательности геномов исследованных вирусов были размещены в международной базе ОепБапк с номерами МН094241 и MG652438. Прочтения высокопроизводительного секвенирования были выложены в международной базе 8ЯА под номерами SRX4133420 - 8ЯХ4133445.

Результаты данной работы используются в лекционном материале курсов, читаемых в МГУ им. М.В. Ломоносова и Первом МГМУ им. И.М. Сеченова. Материалы литературного обзора данной работы были использованы для написания учебно-методического комплекса предмета «Микроэволюция РНК-содержащих вирусов».

Методология и методы исследования

В данной работе изучалась эволюция двух переносимых клещами флавивирусов: ВКЭ и вируса Повассан. Для определения вариантов вируса, имеющих преимущество при репродукции в конкретной системе, были применены две методики: последовательные пассажи вирусов в системе с низкой множественностью заражения (в случае культуры клеток млекопитающих СПЭВ) и адаптация к персистентной инфекции (в случае культур клеток клещей Hyalomma anatolicum HAE/CTVM8 и Ixodes ricinus IRE/CTVM19). Для получения достоверных данных, все эксперименты по адаптации выполнялись в нескольких повторностях.

Для характеристики полученных адаптированных вариантов использовался набор вирусологических и молекулярно-биологических методов. Фенотип полученных в работе вариантов определяли, используя следующие маркёры: диаметр бляшек под агаровым покрытием при титровании вируса в культуре клеток СПЭВ и нейроинвазивность для лабораторных мышей (линии BALB/c весом 13-16 г). Консенсусную последовательность генома полученных вариантов определяли с помощью секвенирования по Сенгеру.

Для более детального описания изменений в генетической структуре популяции вирусов в процессе адаптации применялись два метода: биологическое клонирование и высокопроизводительное секвенирование с последующим определением в популяции однонуклеотидных вариаций с представленностью более 1%. Биологическое клонирование осуществлялось методом бляшек в культуре клеток СПЭВ путём взятия столбиков агара над бляшкой на 6-10 день. Высокопроизводительное секвенирование проводилось на секвенаторах платформы Illumina. На начальных этапах пробоподготовки каждая из проб была разбита на две независимые повторности, которые в дальнейшем обрабатывались отдельно (включая секвенирование). Это позволило избежать ложноположительных результатов при определении однонуклеотидных вариаций.

Положения, выносимые на защиту

1. Длительная адаптация переносимых клещами флавивирусов ВКЭ и вируса Повассан к культуре клеток СПЭВ, а так же длительная персистенция ВКЭ в

культурах клеток клещей приводит к закреплению в популяции вариантов вируса с аминокислотными заменами, повышающими локальный положительный заряд вирусного поверхностного гликопротеина Е.

2. Большое количество разнообразных вариантов вируса с аминокислотными заменами, повышающими локальный положительный заряд вирусного поверхностного гликопротеина Е, появляется в популяции ВКЭ на начальных этапах адаптации вируса к культуре клеток СПЭВ. При дальнейшей адаптации большинство таких вариантов элиминируется из популяции, и закрепляется один доминирующий вариант.

3. Адаптация флавивирусов ВКЭ и вируса Повассан к культуре клеток СПЭВ при различных температурах приводит к накоплению вариантов с заменой в хеликазе N83, ассоциированной с пониженной температурой культивирования. Для ВКЭ обнаружена замена в белке репликативного комплекса NS4A, ассоциированная с адаптацией к 37°С.

4. Лабораторные варианты ВКЭ имеют количество однонуклеотидных вариаций в геноме схожее с таковым у вариантов ВКЭ из природных популяций.

5. В популяции ВКЭ малопредставленные варианты (с долей менее 1%) могут сохраняться в течение длительного времени. При определённых условиях такие варианты могут становиться мажорными и определять свойства вирусной популяции.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность положений, выносимых на защиту, и выводов диссертации подтверждается выполнением экспериментов в контролируемых условиях и использованием большого числа повторностей в экспериментах по адаптации вируса. Биоинформатическая обработка полученных данных высокопроизводительного секвенирования была проведена с учётом статистических критериев достоверности, а все пробы были дважды независимо секвенированы для предотвращения ошибок, связаных с секвенированием и проведением ферментативных реакций в процессе пробоподготовки к высокопроизводительному секвенированию.

По теме диссертации опубликованны три статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.02.02 - вирусология.

1. Litov A.G. Evaluation of the population heterogeneity of TBEV laboratory variants using high-throughput sequencing / Litov A.G., Deviatkin A.A., Goptar I.A., Dedkov V.G., Gmyl A.P., Markelov M.L., Shipulin G.A., Karganova G.G. // Journal of General Virology -2018. - V. 99 - p.240-245.

2. Shevtsova A.S. Lethal experimental tick-borne encephalitis infection: influence of two strains with similar virulence on the immune response / Shevtsova A.S., Motuzova O.V., Kuragina V.M., Akhmatova N.K., Gmyl L.V., Kondrat'eva Y.I., Kozlovskaya L.I., Rogova Y.V., Litov A.G., Romanova L.I., Karganova G.G. // Frontiers in Microbiology - 2017. - V. 7 -№ January - p.1-13.

3. Bel ova O.A. Properties of the tick-borne encephalitis virus population during persistent infection of ixodid ticks and tick cell lines / Belova O.A., Litov A.G., Kholodilov I.S., Kozlovskaya L.I., Bell-Sakyi L., Romanova L.I., Karganova G.G. // Ticks and Tick-borne Diseases - 2017. - V. 8 - № 6 - p.895-906.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: конференции, посвященной 60-летнему юбилею основания Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова (Москва, 2015); на международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2017» (Москва, 2017).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Распространение и патогенетическая характеристика ВКЭ и вируса Повассан

Флавивирусы распространены на всех континентах (кроме Антарктиды). Представители этого рода являются возбудителями тяжёлых заболеваний человека: энцефалитов, лихорадок и геморрагических лихорадок. На территории России встречаются целый ряд патогенных для человека флавивирусов: вирус клещевого энцефалита, вирус Повассан, вирус Омской гемморагической лихорадки, вирус Западного Нила [13].

Незавозные случаи заболевания, вызванного ВКЭ, регистрируются в 48 из 85 субъектов Российской Федерации. В 2014-2016 годах заболевамость ВКЭ составляла 2,53,5 тысячи случаев. На пике заболевамости в России в 1999 году было зарегистрировано 10 тыс. случаев [14]. Помимо России ВКЭ распространён на территориях стран Восточной и Центральной Европы, некоторых странах Азии. Он вызывает энцефалит у людей и некоторых животных. Заражение происходит при присасывании к человеку заражённого клеща или при употреблении в пищу молока заражённого животного. Вирус вызывает заболевание лишь у одного-двух из ста человек, на которых питался заражённый клещ. Основными переносчиком и резервуаром вируса являются клещи Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus [13]. Существуют очаги ВКЭ, где переносчиками являются другие виды клещей: Haemaphysalis spp, Ixodes ovatus [4].

Вирус Повассан распространён в Западной части США, Канады и на Дальнем Востоке России. У людей вызывает острый энцефалит с высокой долей неврологических осложнений и смертностью до 60% [13]. Число заболевших этим вирусом за всю историю наблюдений невелико, однако она повысилась на 671% в течение последних 18 лет [5]. Выделялся как из клещей Ixodes cookei, I. angustus, I. scapularis, Dermacentor variabilis, I. persulcatus, Haemaphysalis neumanni, H. consinna and D. silvarun, так и из комаров [13].

Ареалы ВКЭ и вируса Повассан перекрываются на Дальнем Востоке России. Исследования сывороток больных с диагнозом «клещевой энцефалит» в Приморском крае показало, что примерно 4,3% из них имели антитела к ВКЭ и вирусу Повассан

одновременно, что может говорить о том, что доля коинфекций этими вирусами довольно высока в данном регионе [15].

Глава 2. Молекулярно-биологическая характеристика представителей рода Flavivirus

2.1. Свойства вириона

Вирионы флавивирусов имеют липидную оболочку и представляют собой частицы диаметром 50 нм с электронно-плотным ядром диаметром примерно 30 нм. Зрелые частицы седиментируют при 170 - 210S и имеют плавучую плотность 1.19-1.23 г/см3 в зависимости от липидного состава, который определяется составом мембран клетки-хозяина [16].

Нуклеокапсид вируса формируется белком С. Различают зрелые вирусные частицы, в состав которых входят вирусные белки Е и М, и незрелые вирионы, в которых вместо белка M находиться его неразрезанный предшественник - prM. Для вируса денге и западного Нила описаны «частично зрелые вирионы» (см. рисунок 1), на поверхности которых не все белки prM процессированы [17]. Существует форма слияния, образующаяся при воздействии на вирион низких значений pH. Если вирион находиться в такой форме, но слияния не произошло, то он в дальнейшем будет неинфекционен. При обработке вирионов неионными детергентами возможно выделение отдельных нуклеокапсидов, которые состоят из геномной РНК и белка С [16]. Нуклеокапсид является аморфными, и это является одной из структурных особенностей вириона флавивирусов [17-21].

Рисунок 1. Криоэлектронная микрофотография двух различных образцов вируса Западного Нила. Незрелые вирионы обозначены красными стрелками, частично зрелые - зелёными, и полностью зрелые - синим. Чёрная планка показывает масштаб в 500 А° [17].

Структуры вирионов были решены для вирусов денге [18], Японского энцефалита [19], Зика [20] и западного Нила [17] и ВКЭ [21]. Установлено, что зрелые вирионы флавивирусов имеют гладкую поверхность (см. рисунок 1), [18], которая ограничена 90 димерами белка Е (в расположении голова-к хвосту), лежащими параллельно липидному бислою.

2.2. Структура генома

Геном флавивирусов представляет собой одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту (РНК) положительной полярности длиной примерно 11 тыс. оснований. На 5" конце вирусной РНК находится кэп первого типа (ш7ОрррЛшрК2). На 3" конце, в отличие от клеточных мРНК, отсутствует полиА. Геном кодирует одну открытую рамку считывания, фланкированную 5" и 3" нетранслируемыми областями (НТО) длиной -100 и 400-700 пар оснований, соответственно [16].

Последовательность нуклеотидов 5-НТО не является высоко консервативной среди флавивирусов, формирует схожие структуры у различных флавивирусов. Показано, что структуры 5 -НТО отвечают за инициацию синтеза РНК вируса в процессе репликации [22, 23].

Среди флавивирусов были найдены паттерны похожих структур и нуклеотидных последовательностей в 3-НТО. Для этой области генома показано участие в репликации и трансляции (в качестве энхансерного элемента) [16]. Показано формирование субгеномной флавивирусной РНК (сфРНК) из 3-НТО (см. далее) [24] . У некоторых вирусов внутри этой области находятся полиА последовательности [16]. Как в 5-НТО, так и в 3 -НТО имеются последовательности, отвечающие за циркуляризацию генома. Этот процесс является важным для репликации вируса [25].

Открытая рамка считывания транслируется с образованием полипротеина, который затем разрезается клеточными и вирусными протеазами на 10 белков. С N конца полипротеина выщепляются структурные белки С, ргМ и Е, далее находятся неструктурные белки вируса: N81, №2А, N823, N83, №4А и N85. Помимо белков, при процессинге выщепляются пептиды К и 2К [16].

2.3. Белки и функциональные РНК флавивирусов

2.3.1. Белок С

Капсидный белок С - это структурный белок весом примерно 11 кДа. Содержит много основных аминокислот [16], димеризуется [26] и формирует нуклеокапсид вируса. Для белков С различных флавивирусов показана возможность ингибирования системы РНК-интерференции [27], участие в индукции апоптоза [28].

Структура белка С в растворе была решена в 2003 году [29]. Данный белок формирует димеры. Установлено, что белок имеет 4 а-спирали, соединённые короткими петлями, и неструктурированный регион на N конце [26]. Значительная часть положительного заряда димеров белка сосредоточена на одной из поверхностей, которая, предположительно, взаимодействует с вирусной РНК. При этом неполярный регион димера, по-видимому, взаимодействует с мембраной [29].

Белок С фосфорилируется, что важно для его транспорта в ядро, так как влияет на взаимодействие белка с импортином А [30]. Предполагается, что фосфорилирование белка С на ранних стадиях инфекции предотвращает его связывание с вирусной РНК и олигомеризацию. На поздних стадиях инфекции происходит дефосфорилирование, что приводит к выходу белка С из ядра, а так же усилению его связывания с РНК и способности к олигомеризации [31].

2.3.2. Белок ргМ/ М

Белок ргМ является предшественником мембранного белка М. Это небольшой структурный белок флавивирусов. Он входит в состав вириона и разрезается при созревании фурин-подобной протеазой на фрагмент рг, который секретируется из клетки, и белок М, который остаётся в составе вириона. вконец белка флавивирусов содержит от одного до трёх сайтов гликозилирования по N типу (количество зависит от вируса) и шесть консервативных остатков цистеина [16]. Основной функцией белка ргМ является формирование правильной укладки поверхностного гликопротеина Е [32]. Вероятно, что данный белок так же принимает участие в индукции апоптоза [33].

2.3.3. Белок Е

Белок Е - мажорный белок оболочки вируса, имеющий вес примерно 53 кДа. Он ответственен за связывание с клеточными рецепторами и слияние мембран вириона и клетки. Во время инфекции к этому белку образуются нейтрализующие антитела [16]. Белок состоит из эктодомена, который заякорен в плазматической мембране стебелёк-якорным участком (см. рисунок 2).

Эктодомен

Якорь

Рисунок 2. Димер белока Е флавивирусов. С изменениями по [34].

Структура эктодомена белка Е была решена для многих флавивирусов. Эктодомен состоит из трёх доменов: центрального домена (I), димеризационного домена (II), С-концевого домена (III) (см. рисунок 3) [35].

Рисунок 3. Структура эктодомена белка Е ВКЭ [35]

В первый (центральный) домен входят аминокислотные остатки 1-51, 137-189 и 285-302 белка Е. Он представляет собой восьмитяжевую антипараллельную Р-бочку с дополнительной короткой белковой цепью. Ось Р-бочки располагается параллельно мембране вириона. Структуру домена поддерживают два дисульфидных мостика. Второй домен (димеризационный) построен аминокислотами 52-136 и 190-284 белка Е. Его основой служит антипараллельный Р-лист с двумя а-спиралями напротив одной из поверхностей этого листа. Данный домен содержит гидрофобную глицин-богатую последовательность (аминокислоты 98-113), высококонсервативную среди всех флавивирусов. Предполагается, что она является пептидом слияния. Третий домен сформирован аминокислотами 303-395. Он формирует иммуноглобулин-подобную укладку и прикрепляется к центральному домену участком из 15 аминокислот. Соединение стабилизируется дисульфидной связью [35].

2.3.4. Белок NS1

Неструктурный гликопротеин NS1 имеет массу 45-55 кДа. Он содержит 12

консервативных остатков цистеина, которые формируют дисульфидные связи.

Димеризуется после посттрансляционных модификаций, причём димеры являются очень

устойчивыми. Данный белок находиться не только в цитоплазме клетки, но и на

19

клеточной поверхности и даже секретируется из клеток. В процессе инфекции к данному белку могут образовываться антитела [16].

Белок N81 входит в репликативный комплекс. Помимо важной функции в репликации вируса [16] данный белок участвует в подавлении синтеза интерферона [36] и системы комплемента [37]. Кроме того, растворимая форма этого белка, по-видимому, помогает переносимым комарами флавивирусам преодолевать кишечный барьер комаров

[38].

Структура данного белка была решена для вируса денге, вируса западного Нила

[39] и вируса Зика [40]. Димер белка N81 построен вокруг центрального бета-слоевого домена. При этом каждый из мономеров состоит из трёх доменов. Небольшой димеризационный домен (аминокислоты 1-29), стабилизированный дисульфидной связью, имеет изгибающуюся в бета-рулет подобную укладку. Второй домен (аминокислоты 30180) выступает из первого. В нём находяться два сайта гликозилирования по №типу и один дисульфидный мостик. Между первым и вторым доменом имеется дисульфидная связь. Третий домен, формирующий бета-лестницу, сформирован из С-концевых аминокислотных остатков белка (181-352). Первый и часть второго доменов создают гидрофобный интерфейс, по-видимому, отвечающий за связь белка N81 с N843 в репликативном комплексе. Помимо этого, укладка одного из субдоменов второго домена напоминает укладку хеликазного домена клеточных белков КЮ-1 и MDA5. Димеры белка могут тримеризоваться, образуя гексамеры [39].

2.3.5. Белок Ш2Л

Неструктурный белок №2Л - небольшой (около 22 кДа) гидрофобный [16] многофункциональный мембранно-ассоциированный белок. В клетках NS2A локализуется совместно с вирусной двуцепочечной РНК и взаимодействует с N83 и N85 в репликативном комплексе [41]. Кроме того, данный белок участвует в сборке вирионов [42, 43], антагонизме интерферона [44, 45] и интерферон-независимой индукции клеточной смерти [46].

Кроме основных сайтов процессинга, в результате которых белок NS2A выщепляется из полипротеина, (разрезание в позициях №Ц№2Л и №2Л^82Б), существует альтернативный сайт ^К|Т), который находится в позиции 189-191 в белке NS2A. Белок, полученный в результате процессинга по данному сайту, обозначается как NS2Aa. Процессинг по этому сайту производится вирусной протеазой. Для вируса жёлтой

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Литов, Александр Геннадьевич, 2018 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Chancey C. The global ecology and epidemiology of west nile virus / Chancey C., Grinev A., Volkova E., Rios M. // BioMed Research International - 2015. - V. 2015 - P.1-20.

2. Wikan N. Zika virus: History of a newly emerging arbovirus / Wikan N., Smith D.R. // The Lancet Infectious Diseases - 2016. - V. 16 - № 7 - P.119-126.

3. Musso D. Potential Sexual Transmission of Zika Virus / Musso D., Roche C., Robin E., Nhan T., Teissier A. // Emerging Infectious Diseases - 2015. - V. 21 - № 2 - P.2013-2015.

4. Süss J. Tick-borne encephalitis 2010: epidemiology, risk areas, and virus strains in Europe and Asia-an overview / Süss J. // Ticks and tick-borne diseases - 2011. - V. 2 - № 1 - P.2-15.

5. Fatmi S.S. Powassan Virus — A New Reemerging Tick-Borne Disease / Fatmi S.S., Zehra R., Carpenter D.O. // Frontiers in Public Health - 2017. - V. 5 - № 342- P.1-12.

6. Romanova L.I. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation / Romanova L.I., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D. V., Lukashev A.N., Gmyl L. V., Rumyantsev A.A., Burenkova L.A., Lashkevich V.A., Karganova G.G. // Virology - 2007. - V. 362 - № 1 - P.75-84.

7. Labuda M. Change in phenotype of tick-borne encephalitis virus following passage in Ixodes ricinus ticks and associated aminoino acid substitution in the envelope protein / Labuda M., Jiang W.R., Kaluzova M., Kozuch O., Nuttall P.A., Weismann P., Eleckova E., Zuffova E., Gould E.A. // Virus Research - 1994. - V. 31 - P.305-315.

8. Mandl C.W. Adaptation of Tick-Borne Encephalitis Virus to BHK-21 Cells Results in the Formation of Multiple Heparan Sulfate Binding Sites in the Envelope Protein and Attenuation In Vivo / Mandl C.W., Kroschewski H., Allison S.L., Kofler R., Holzmann H., Meixner T., Heinz FX. - 2001. - V. 75 - № 12 - P.5627-5637.

9. Goto A. A BHK-21 cell culture-adapted tick-borne encephalitis virus mutant is attenuated for neuroinvasiveness / Goto A., Hayasaka D., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa H., Takashima I. // Vaccine - 2003. - V. 21 - № 25-26 - P.4043-4051.

10. Kozlovskaya L.I. GAG-binding variants of tick-borne encephalitis virus / Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.I., Rogova Y. V., Dzhivanian T.I., Lyapustin V.N., Pivanova G.P., Gmyl A.P., Palyulin V.A., Karganova G.G. // Virology - 2010. - V. 398 - № 2 -

P.262-272.

11. Khasnatinov M.A. Non-hemagglutinating flaviviruses: Molecular mechanisms for the emergence of new strains via adaptation to European ticks / Khasnatinov M.A., Ustanikova K., Frolova T.V., Pogodina V.V., Bochkova N.G., Levina L.S., Slovak M., Kazimirova M., Labuda M., Klempa B., Eleckova E., Gould E.A., Gritsun T.S. // PLoS ONE - 2009. - V. 4 - № 10 -P.1-11.

12. Погодина В.В. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания / Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.И., Левина Л.С., Карганова Г.Г., Рясова Р.А., Сергеева В.А., Лашкевич В.А. // Вопросы вирусологии - 1992. - Т. 37 - № 2 - С.103-107.

13. Gritsun T.S. Tick-borne flaviviruses / Gritsun T.S., Nuttall P. A, Gould E. A // Advances in virus research - 2003. - V. 61 - P. 317-71.

14. Чернохаева Л.Л. Современный ареал клещевого энцефалита в Российской Федерации / Чернохаева Л.Л., Холодилов И.С., Пакскина Н.Д. // Медицинская вирусология - 2016. - Т. 30 - № 1 - С.6-22.

15. Леонова Н.Г. Изучение роли вируса Повассан в этиологическои структуре клещевого энцефалита в Приморском крае / Леонова Н.Г., Исачкова Л.М., Баранов Н.И., Кругляк С П. // Вопросы вирусологии - 1980. - № 2 - P.173-176.

16. Lindenbach B.D. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication / под ред. D.M. Knipe, P.M. Howley. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers, 2007. - 1101-1151с.

17. Cherrier M.V. Structural basis for the preferential recognition of immature flaviviruses by a fusion-loop antibody / Cherrier M.V, Kaufmann B., Nybakken G.E., Lok S.-M., Warren J.T., Chen B.R., Nelson C., Kostyuchenko V., Holdaway H., Chipman P.R., Kuhn R.J., Diamond M.S., Rossmann M.G., Fremont D.H. // The EMBO journal - 2009. - V. 28 - № 20 - P.3269-3276.

18. Kuhn R.J. Structure of Dengue Virus : Implications for Flavivirus Organization , Maturation , and Fusion / Kuhn R.J., Zhang W., Rossmann M.G., Pletnev S. V, Corver J., Lenches E., Jones C.T., Mukhopadhyay S., Chipman P.R., Strauss E.G., Baker T.S., Strauss J.H., Lafayette W. // Cell - 2002. - V. 108 - P.717-725.

19. Wang X. Near-atomic structure of Japanese encephalitis virus reveals critical determinants of

144

virulence and stability / Wang X., Li S., Zhu L., Nian Q., Yuan S., Gao Q., Hu Z., Ye Q., Li X., Xie D., Shaw N., Wang J., Walter T.S., Huiskonen J.T., Fry E.E., Qin C., Stuart D.I., Rao Z. // Nature Communications - 2017. - V. 8 - № 14 - P. 1-8.

20. Sirohi D. The 3.8Â resolution cryo-EM structure of Zika Virus / Sirohi D., Chen Z., Sun L., Klose T., Pierson T.C., Rossmann M.G., Kuhn R.J. // Science - 2016. - V. 352 - № 6284 -P.467-470.

21. Füzik T. Structure of tick-borne encephalitis virus and its neutralization by a monoclonal antibody / Füzik T., Formanovâ P., Ruzek D., Yoshii K., Niedrig M., Plevka P. // Nature Communications - 2018. - V. 9 - № 1 - P.1-11.

22. Filomatori C. V RNA sequences and structures required for the recruitment and activity of the dengue virus polymerase / Filomatori C. V, Iglesias N.G., Villordo S.M., Alvarez D.E., Gamarnik A. V // The Journal of biological chemistry - 2011. - V. 286 - № 9 - P.6929-39.

23. Lodeiro M.F. Structural and Functional Studies of the Promoter Element for Dengue Virus RNA Replication / Lodeiro M.F., Filomatori C.V, Gamarnik A.V // Journal of Virology - 2009.

- V. 83 - № 2 - P.993-1008.

24. Pijlman G.P. A Highly Structured, Nuclease-Resistant, Noncoding RNA Produced by Flaviviruses Is Required for Pathogenicity / Pijlman G.P., Funk A., Kondratieva N., Leung J., Torres S., Aa L., Liu W.J., Palmenberg A.C., Shi P., Hall R.A., Khromykh A.A. // Cell Host and Microbe - 2008. - V. 4 - № 6 - P.579-591.

25. Alvarez D.E. Long-Range RNA-RNA Interactions Circularize the Dengue Virus Genome / Alvarez D.E., Lodeiro F., Luduen S.J., Gamarnik A. V - 2005. - V. 79 - № 11 - P.6631-6643.

26. Oliveira E.R.A. The flavivirus capsid protein: Structure, function and perspectives towards drug design / Oliveira E.R.A., Mohana-Borges R., Alencastro R.B. de, Horta B.A.C. // Virus Research - 2017. - V. 227 - P.115-123.

27. Samuel G.H. Yellow fever virus capsid protein is a potent suppressor of RNA silencing that binds double-stranded RNA / Samuel G.H., Wiley M.R., Badawi A., Adelman Z.N., Myles K.M. // PNAS - 2016. - V. 113 - № 48 - P.13863-13868.

28. Wang Y. CD8+ T Cells Mediate Recovery and Immunopathology in West Nile Virus Encephalitis / Wang Y., Lobigs M., Lee E., Mullbacher A. // Journal of Virology- 2003. - V. 77

- № 24 - P.13323-13334.

29. Jones C.T. Flavivirus Capsid Is a Dimeric Alpha-Helical Protein / Jones C.T., Ma L., Burgner J.W., Groesch T.D., Post C.B., Kuhn R.J. // Journal of Virology - 2003. - V. 77 - № 12

- P.7143-7149.

30. Bhuvanakantham R. Biochemical and Biophysical Research Communications Specific interaction of capsid protein and importin-a/b influences West Nile virus production / Bhuvanakantham R., Chong M., Ng M. // Biochemical and Biophysical Research Communications - 2009. - V. 389 - № 1 - P.63-69.

31. Cheong Y.K. Dephosphorylation of West Nile virus capsid protein enhances the processes of nucleocapsid assembly / Cheong Y.K., Ng M.-L. // Microbes and infection / Institut Pasteur -2011. - V. 13 - № 1 - P.76-84.

32. Allison S.L. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E / Allison S.L., Stiasny K., Stadler K., Mandl C.W., Heinz FX. // Journal of virology - 1999. - V. 73 - № 7 - P.5605-5612.

33. Brabant M. A flavivirus protein M-derived peptide directly permeabilizes mitochondrial membranes, triggers cell death and reduces human tumor growth in nude mice / Brabant M., Baux L., Casimir R., Briand J.P., Chaloin O., Porceddu M., Buron N., Chauvier D., Lassalle M., Lecoeur H., Langonne A., Dupont S., Deas O., Brenner C., Rebouillat D., Muller S., Borgne-Sanchez A., Jacotot E. // Apoptosis : an international journal on programmed cell death - 2009. -V. 14 - № 10 - P.1190-203.

34. Stiasny K. Molecular mechanisms of flavivirus membrane fusion / Stiasny K., Fritz R., Pangerl K., Heinz F.X. // Amino acids - 2011. - V. 41 - P.1159-1163.

35. Rey F.A. The envelope glycoprotein from tick-borne enchephalitis at 2 A resolution / Rey F.A., Heinz F X., Mandl C., Kunz C., Harrison S C. // Nature - 1995. - V. 975 - P.291-298.

36. Zhang H. West Nile Virus NS1 Antagonizes Interferon Beta Production by Targeting RIG-I and MDA5 / Zhang H., Ye H., Liu S., Deng C., Li X., Shi P., Zhang B. // Journal of virology -2017. - V. 91 - № 18 - P.1-17.

37. Conde J.N. The Complement System in Flavivirus Infections Pathogenic Effects of Complement / Conde J.N., Silva E.M., Barbosa A.S. // Frontiers in Microbiology - 2017. - V. 8

- P.1-7.

38. Liu J. Flavivirus NS1 protein in infected host sera enhances viral acquisition by mosquitoes / Liu J., Liu Y., Nie K., Du S., Qiu J., Pang X., Wang P., Cheng G. // Nat. Microbiol - 2016. - V.

146

1 - № 9 - P.1-28.

39. Akey D.L. Flavivirus NS1 crystal structures reveal a surface for membrane association and regions of interaction with the immune system / Akey D.L., Brown W.C., Dutta S., Konwerski J., Jose J., Jurkiw T.J., Delproposto J., Ogata C.M., Skiniotis G., Richard J., Smith J.L. // Science

- 2015. - V. 343 - № 6173 - P.881-885.

40. Xu X. Contribution of intertwined loop to membrane association revealed by Zika virus full-length NS1 structure / Xu X., Song H., Qi J., Liu Y., Wang H., Su C., Shi Y. // The EMBO journal - 2016. - V. 35 - № 20 - P.2170-2178.

41. Mackenzie J.M. Subcellular Localization and Some Biochemical Properties of the Flavivirus Kunjin Nonstructural Proteins NS2A and NS4A / Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. // Virology - 1998. - V. 215 - P.203-215.

42. Leung J.Y. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly / Leung J.Y., Pijlman G.P., Kondratieva N., Hyde J., Mackenzie J.M., Khromykh A. A. // Journal of Virology - 2008.

- V. 82 - № 10 - P.4731-41.

43. Kümmerer B.M. Mutations in the Yellow Fever Virus Nonstructural Protein NS2A Selectively Block Production of Infectious Particles / Kümmerer B.M., Rice C.M. // Journal of Virology - 2002. - V. 76 - № 10 - P.4773-4784.

44. Liu W.J. A Single Amino Acid Substitution in the West Nile Virus Nonstructural Protein NS2A Disables Its Ability To Inhibit Alpha/Beta Interferon Induction and Attenuates Virus Virulence in Mice / Liu W.J., Wang X.J., Clark D.C., Lobigs M., Hall R.A., Khromykh A.A. // Journal of Virology - 2006. - V. 80 - № 5 - P.2396-2404.

45. Muñoz-Jordan J.L. Inhibition of interferon signaling by dengue virus / Muñoz-Jordan J.L., Sánchez-Burgos G.G., Laurent-Rolle M., García-Sastre A. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America - 2003. - V. 100 - № 24 - P.14333-14338.

46. Melian E.B. West Nile virus NS2A protein facilitates virus-induced apoptosis independently of interferon response / Melian E.B., Edmonds J.H., Nagasaki T.K., Hinzman E., Floden N., Khromykh A. a // The Journal of General Virology - 2012 - V. 94 - № 2 - P.308-313.

47. Li X. Transmembrane Domains of NS2B Contribute to both Viral RNA Replication and Particle Formation in Japanese Encephalitis Virus / Li X., Deng C., Ye H., Zhang H., Zhang Q., Chen D., Zhang P., Shi P.-Y., Yuan Z.-M., Zhang B. // Journal of Virology - 2016. - V. 90 - №

147

12 - P.5735-5749.

48. Luo D. Crystal structure of the NS3 protease-helicase from dengue virus / Luo D., Xu T., Hunke C., Grüber G., Vasudevan S.G., Lescar J. // Journal of Virology - 2008. - V. 82 - № 1 -P.173-83.

49. Shiryaev S. A NS4A regulates the ATPase activity of the NS3 helicase: a novel cofactor role of the non-structural protein NS4A from West Nile virus / Shiryaev S.A., Chernov A.V., Aleshin A.E., Shiryaeva T.N., Strongin AY. // The Journal of general virology - 2009. - V. 90 - № 9 -P.2081-2085.

50. Yiang G.-T. The NS3 protease and helicase domains of Japanese encephalitis virus trigger cell death via caspase-dependent and -independent pathways / Yiang G.-T., Chen Y.-H., Chou P.-L., CHANG W.-J., WEI C.-W., YU Y.-L. // Molecular Medicine reports - 2013. - V. 7 -P.826-830.

51. Kakumani P.K. Dengue NS3, an RNAi suppressor, modulates the human miRNA pathways through its interacting partner / Kakumani P.K., Rajgokul K.S., Ponia S.S., Kaur I., Mahanty S., Medigeshi G.R., Banerjea A.C., Chopra A.P., Malhotra P., Mukherjee S.K., Bhatnagar R.K. // BioChem Jounal - 2015. - V. 471 - P.89-99.

52. Teo K.F. Internal proteolysis of the NS3 protein specified by dengue virus 2 / Teo K.F., Wright P.J. // Journal of General Virology - 1997. - V. 78 - № 2 - P.337-341.

53. McLean J.E. Flavivirus NS4A-induced autophagy protects cells against death and enhances virus replication / McLean J.E., Wudzinska A., Datan E., Quaglino D., Zakeri Z. // The Journal of biological chemistry - 2011. - V. 286 - № 25 - P.22147-59.

54. Zmurko J. Flaviviral NS4B, chameleon and jack-in-the-box roles in viral replication and pathogenesis, and a molecular target for antiviral intervention / Zmurko J., Neyts J., Dallmeier K. // Reviews in Medical Virology - 2015. - V. 25 - P.205-223.

55. Westaway E.G. Proteins C and NS4B of the flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus / Westaway E.G., Khromykh A.A., Kenney M.T., Mackenzie J.M., Jones M.K. // Virology - 1997. - Т. 234 - № 1 - С.31-41.

56. Preugschat F. Processing of nonstructural proteins NS4A and NS4B of dengue 2 virus in vitro and in vivo / Preugschat F., Strauss J.H. // Virology - 1991. - V. 185 - № 2 - P.689-697.

57. Egloff M.P. An RNA cap (nucleoside-2'-O-)-methyltransferase in the flavivirus RNA

polymerase NS5: Crystal structure and functional characterization / Egloff M.P., Benarroch D., Selisko B., Romette J.L., Canard B. // EMBO Journal - 2002. - V. 21 - № 11 - P.2757-2768.

58. Malet H. The flavivirus polymerase as a target for drug discovery / Malet H., Massé N., Selisko B., Romette J.L., Alvarez K., Guillemot J.C., Tolou H., Yap T.L., Vasudevan S.G., Lescar J., Canard B. // Antiviral Research - 2008. - V. 80 - № 1 - P.23-35.

59. Morozova O. V. Phosphorylation of tick-borne encephalitis virus NS5 protein / Morozova O.V., Tsekhanovskaya N.A., Maksimova T.G., Bachvalova V.N., Matveeva V.A., Kit Y.Y. // Virus research - 1997. - V. 49 - № 1 - P.9-15.

60. Chapman E.G. The Structural Basis of Pathogenic Subgenomic Flavivirus RNA (sfRNA) Production / Chapman E.G., Wilusz J., Nix J.C., Kieft J.S. // Science - 2014. - V. 344 - № 307 -P.307-309.

61. Chang R. Japanese encephalitis virus non-coding RNA inhibits activation of interferon by blocking nuclear translocation of interferon regulatory factor 3 / Chang R., Hsu T., Chen Y., Liu S., Tsai Y., Chen Y., Fan Y. // Veterinary Microbiology - 2013. - V. 166 - № 1-2 - P.11-21.

62. Schnettler E. Non-coding flavivirus RNA displays RNAi suppressor activity in insect and mammalian cells / Schnettler E., Sterken M.G., Leung J.Y., Metz S.W., Geertsema C. - 2012. -V. 86 - № 24 - P.13486-13500.

63. Moon S.L. A noncoding RNA produced by arthropod-borne flaviviruses inhibits the cellular exoribonuclease XRN1 and alters host mRNA stability / Moon S.L., Anderson J.R., Kumagai Y. // RNA - 2012. - V. 18 - № 11 - P.2029-2040.

64. Firth A.E. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting / Firth A.E., Atkins J.F. // Virology Journal - 2009. - V. 6 - № 14. - P. 1-6.

65. Melian E.B. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness / Melian E.B., Hinzman E., Nagasaki T., Firth A.E., Wills N.M., Nouwens A.S., Blitvich B.J., Leung J., Funk A., Atkins J.F., Hall R., Khromykh A.A. // Journal of Virology - 2010. - V. 84 - № 3 - P.1641-1647.

66. Faggioni G. Evidence of a humoral response to a novel protein WARF4 embedded in the West Nile virus NS4B gene encoded by an alternative open reading frame / Faggioni G., Ciammaruconi A., Santis R.D.E., Pomponi A., Scicluna M.T., Barbaro K., Masuelli L., Autorino G., Bei R., Lista F. // International Journal Of Molecular Medicine - 2009. - V. 23 - P.509-512.

149

67. Firth A.E. Evidence for ribosomal frameshifting and a novel overlapping gene in the genomes of insect-specific flaviviruses / Firth A.E., Blitvich B.J., Wills N.M., Miller C.L., Atkins J.F. // Virology - 2010. - V. 399 - № 1 - P.153-166.

68. Smit J.M. Flavivirus cell entry and membrane fusion / Smit J.M., Moesker B., Rodenhuis-Zybert I., Wilschut J. // Viruses - 2011. - V. 3 - № 2 - P.160-171.

69. Garcia-Blanco M.A. Flavivirus RNA transactions from viral entry to genome replication / Garcia-Blanco M.A., Vasudevan S.G., Bradrick S.S., Nicchitta C. // Antiviral Research - 2016. -V. 134 - P.244-249.

70. Speight G. Gene Mapping and Positive Identification of the Non-structural Proteins NS2A , NS2B , NS3 , NS4B and NS5 of the Flavivirus Kunjin and Their Cleavage Sites / Speight G., Cola G., Parker M.D., Westaway E.G. // Journal of General Virology - 1988. - V. 69 - P.23-34.

71. Grard G. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: new insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy / Grard G., Moureau G., Charrel R.N., Lemasson J.-J., Gonzalez J.-P., Gallian P., Gritsun T.S., Holmes E.C., Gould E. A, Lamballerie X. // Virology -2007. - V. 361 - № 1 - P.80-92.

72. Lee E. Mutagenesis of the signal sequence of yellow fever virus prM protein: enhancement of signalase cleavage in vitro is lethal for virus production / Lee E., Stocks C.E., Amberg S.M., Rice C M., Lobigs M. // Journal of virology - 2000. - V. 74 - № 1 - P.24-32.

73. Lin C. Cleavage at a Novel Site in the NS4A Region by the Yellow Fever Virus NS2B-3 Proteinase Is a Prerequisite for Processing at the Downstream 4A/4B Signalase Site / Lin C., Amberg S.M., Chambers T.J., Rice C M. // Journal of Virology - 1993. - V. 67 - № 4 - P.2327-2335.

74. Leblois H. Maturation of the dengue-2 virus NS1 protein in insect cells: effects of downstream NS2A sequences on baculovirus-expressed gene constructs / Leblois H., Young P R. // The Journal of General Virology - 1995. - V. 76 ( Pt 4) - P.979-984.

75. Falgout B. Evidence that flavivirus NS1-NS2A cleavage is mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum / Falgout B., Markoff L. // Journal of Virology -1995. - V. 69 - № 11 - P.7232-7243.

76. Klema V.J. Flaviviral Replication Complex: Coordination between RNA Synthesis and 5'-RNA Capping / Klema V.J., Padmanabhan R., Choi K.H. // Viruses - 2015. - V. 7 - P.4640-4656.

77. Filomatori C.V. A 5" RNA element promotes dengue virus RNA synthesis on a circular genome / Filomatori C.V., Lodeiro M.F., Alvarez D.E., Samsa M.M., Pietrasanta L., Gamarnik A. V. // Genes & Development - 2006. - № 20 - P.2238-2249.

78. Hodge K. Identification of a Conserved RNA-dependent RNA Polymerase (RdRp)-RNA Interface Required for Flaviviral Replication / Hodge K., Tunghirun C., Kamkaew M., Limjindaporn T., Yenchitsomanus P., Chimnaronk S. // The Journal of biological chemistry -2016. - V. 291 - № 33 - P.17437-17449.

79. Simmonds P. ICTV Virus Taxonomy Profile : Flaviviridae / Simmonds P., Becher P., Bukh J., Gould E.A., Meyers G., Monath T., Muerhoff S., Pletnev A., Rico-Hesse R., Smith D.B., Stapleton J.T., Consortium I.R. // Journal of General Virology - 2017. - V. 98 - P.2-3.

80. Moureau G. New Insights into Flavivirus Evolution , Taxonomy and Biogeographic History , Extended by Analysis of Canonical and Alternative Coding Sequences / Moureau G., Cook S., Lemey P., Nougairede A., Forrester L., Khasnatinov M., Charrel R.N., Firth A.E., Gould E.A., Lamballerie X. de // PloS one - 2015. - V. 10 - № 2 - P.1-30.

81. King A.M.Q. Family - Flaviviridae / под ред. A.M. King, M.J. Adams. Elsevier, 2012. -1003-1020с.

82. Moudy R.M. A Newly Emergent Genotype of West Nile Virus Is Transmitted Earlier and More Efficiently by Culex Mosquitoes / Moudy R.M., Meola M.A., Morin L.L., Ebel G.D., Kramer L.D. // The American Society of Tropical Medicine and Hygiene - 2007. - V. 77 - № 2 - P.365-370.

83. Bateson P. The evolution of evolutionary theory / Bateson P. // European Review - 2010. -V. 18 - № 3 - P.287-296.

84. Charlesworth B. Population genetics from 1966 to 2016 / Charlesworth B., Charlesworth D. // Heredity - 2017. - V. 118 - № 1 - P.2-9.

85. Casillas S. Molecular population genetics / Casillas S., Barbadilla A. // Genetics - 2017. - V. 205 - № 3 - P.1003-1035.

86. Eigen M.The Hypercycle / M. Eigen, E. P. Schuster - New York: Springer-Verlag, 1979.-92c.

87. Eigen M. Selforganization of matter and the evolution of biological macromolecules / Eigen M. // Die Naturwissenschaften - 1971. - V. 58 - № 10 - P.465-523.

88. Perales C. Mutant spectra in virus behavior / Perales C., Lorenzo-Redondo R., Lopez-Galindez C., Martinez M.A., Domingo E. // Future Virology - 2010. - V. 5 - № 6 - P.679-698.

89. Ojosnegros S. Competition-colonization dynamics in an RNA virus / Ojosnegros S., Beerenwinkel N., Antal T., Nowak M.A., Escarmis C., Domingo E. // PNAS - 2009. - V. 107 -№ 5 - P.2108-2112.

90. Domingo E. Viral Quasispecies Evolution / Domingo E., Sheldon J., Perales C. // Microbiology and Molecular Biology Reviews - 2012. - V. 76 - № 2 - P.159-216.

91. Quinones-Mateu M.E. HIV-1 fitness: implications for drug resistance, disease progression, and global epidemic evolution / Quinones-Mateu M.E., Arts E.J. // HIV sequence compendium -2001. - P.134-170.

92. Holland J.J. Quantitation of relative fitness and great adaptability of clonal populations of RNA viruses / Holland J.J., de la Torre J.C., Clarke D.K., Duarte E. // Journal of virology -1991. - V. 65 - № 6 - P.2960-2967.

93. Domingo E. Quasispecies: Concepts and Implications for Virology / E. Domingo / под ред. S. Rallison. - Heidelberg: Springer-Verlag Berlin, 2006.- 407c.

94. Eigen M. On the nature of virus quasispecies / Eigen M. // Trends in microbiology - 1996. -V. 4 - № 6 - P.216-218.

95. Eigen M. New concepts for dealing with the evolution of nucleic acids / Eigen M. // Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology - 1987. - V. 52 - P.307-320.

96. Burch C.L. Evolvability of an RNA virus is determined by its mutational neighbourhood / Burch C.L., Chao L. // Nature - 2000. - V. 406 - № 6796 - P.625-628.

97. Holmes E.C. Is the Quasispecies Concept Relevant to RNA Viruses? / Holmes E.C., Moya A. // Journal of Virology - 2002. - V. 76 - № 1 - P.460-462.

98. Wilke O. Quasispecies in Time-Dependent Environments In: Quasispecies: Concept and Implications for Virology Heidelburg: Springer-Verlag Berlin, 2006. - 33-51с.

99. Wilke C.O. Phenotypic mixing and hiding may contribute to memory in viral quasispecies / Wilke C.O., Novella I S. // BMC Microbiology - 2003. - V. 3 - P.1-10.

100. Sanjuan R. Mechanisms of viral mutation / Sanjuan R., Domingo-Calap P. // Cellular and Molecular Life Sciences - 2016. - V. 73 - № 23 - P.4433-4448.

101. Eckerle L.D. High Fidelity of Murine Hepatitis Virus Replication Is Decreased in nsp14 Exoribonuclease Mutants / Eckerle L.D., Lu X., Sperry S.M., Choi L., Denison M.R. // Journal of Virology - 2007. - V. 81 - № 22 - P.12135-12144.

102. Borderia A.V. Initial Fitness Recovery of HIV-1 Is Associated with Quasispecies Heterogeneity and Can Occur without Modifications in the Consensus Sequence / Borderia A. V., Lorenzo-redondo R., Pernas M., Borderia A.V, Domingo E., Lopez-Galindez C. // PloS one -2010. - V. 5 - № 4. - P.e10319.

103. Clarke D.K. The red queen reigns in the kingdom of RNA viruses / Clarke D.K., Duarte E.A., Elena S.F., Moya A., Domingo E., Holland J. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1994. - V. 91 - № 11 - P.4821-4824.

104. Duffy S. Rates of evolutionary change in viruses: patterns and determinants / Duffy S., Shackelton L.A., Holmes E C. // Nature reviews. Genetics - 2008. - V. 9 - P.267-276.

105. Clements J.E. Antigenic Variation In Lentiviral Diseases / Clements J.E., Gdovin S.L., Montelaro R.C., Narayant O. // Annual Review Immunology - 1988. - V. 6 - P.139-159.

106. Switzer W. Ancient co-speciation of simian foamy viruses and primates / Switzer W., Salemi M., Shanmugam V., Gao F., Cong M., Kuiken C., Bhullar V., Beer B.E., Vallet D., Gautier-Hion A., Tooze Z., Villinger F., Holmes E.C., Heneine W. // Nature - 2005. - V. 434 -- P.376-380.

107. Chen S.P. Molecular evolution and epidemiology of four serotypes of dengue virus in Thailand from 1973 to 2007. / Chen S.P. // Epidemiology and infection - 2013. - V. 141 - № 2 -P.419-424.

108. Jorba J. Calibration of Multiple Poliovirus Molecular Clocks Covering an Extended Evolutionary Range / Jorba J., Campagnoli R., De L., Kew O. // Journal of Virology - 2008. - V. 82 - № 9 - P.4429-4440.

109. Cattoli G. Evidence for differing evolutionary dynamics of A/H5N1 viruses among countries applying or not applying avian influenza vaccination in poultry / Cattoli G., Fusaro A., Monne I., Coven F., Joannis T., El-Hamid H.S.A., Hussein A.A., Cornelius C., Amarin N.M., Mancin M., Holmes E.C., Capua I. // Vaccine - 2011. - V. 29 - № 50 - P.9368-9375.

110. Uzcategui N.Y. Rate of evolution and molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus in Europe, including two isolations from the same focus 44 years apart / Uzcategui N.Y., Sironen T., Golovljova I., Jääskeläinen A.E., Välimaa H., Lundkvist A., Plyusnin A., Vaheri A.,

153

Vapalahti O. // The Journal of General Virology - 2012. - V. 93 - № 4 - P.786-796.

111. Zhao Z. Moderate mutation rate in the SARS coronavirus genome and its implications / Zhao Z., Li H., Wu X., Zhong Y., Zhang K., Zhang Y., Boerwinkle E., Fu Y. // BMC Evolutionary Biology - 2004. - V. 4 - № 21 - P.1-9.

112. Jenkins G.M. Rates of molecular evolution in RNA viruses: A quantitative phylogenetic analysis / Jenkins G.M., Rambaut A., Pybus O.G., Holmes E.C. // Journal of Molecular Evolution - 2002. - V. 54 - № 2 - P.156-165.

113. Li W.-H. Pseudogenes as a paradigm of neutral evolution / Li W.-H., Gojobori T., Nei M. // Nature - 1981. - V. 292 - P.237-239.

114. Ochman H. Calibrating bacterial evolution / Ochman H., Elwyn S., Moran N.A. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1999. - V. 96 - № 22 - P.12638-12643.

115. Sobrino F. Fixation of mutations in the viral genome during an outbreak of foot-and-mouth disease: heterogeneity and rate variations / Sobrino F., Palma E.L., Beck E., Dávila M., la Torre J.C. de, Negro P., Villanueva N., Ortín J., Domingo E. // Gene - 1986. - V. 50 - № 1-3 - P.149-159.

116. Zwart M.P. Matters of Size: Genetic Bottlenecks in Virus Infection and Their Potential Impact on Evolution / Zwart M.P., Elena S.F. // Annual Review of Virology - 2015. - V. 2 - № 1 - P.161-179.

117. Moya A. The Population Genetics And Evolutionary Epidemiology Of Rna Viruses / Moya A., Holmes E.C., González-candelas F. // Nature Reviews | Microbiology - 2004. - V. 2 -P.279-288.

118. Chao L. Fitness of RNA virus decreased by Muller's ratchet / Chao L. // Nature - 1990. -V. 348 - № 6300 - P.454-455.

119. Duarte E.A. Many-trillionfold amplification of single RNA virus particles fails to overcome the Muller's ratchet effect / Duarte E.A., Clarke D.K., Moya A., Elena S.F., Domingo E., Holland J. // Journal of virology - 1993. - V. 67 - № 6 - P.3620-3623.

120. Manzoni T.B. Defective (interfering) viral genomes re-explored: impact on antiviral immunity and virus persistence / Manzoni T.B., Lopez C.B. // Future Virology - 2018. - V. 13 -№ 7 - P.493-503.

121. Briones C. Minority Report: Hidden Memory Genomes in HIV-1 Quasispecies and Possible Clinical Implications / Briones C., Domingo E. // Aids Reviews - 2008. - V. 10 - № 2 - P.36-46.

122. Ruiz-Jarabo C.M. Memory in viral quasispecies / Ruiz-Jarabo C.M., Arias A., Baranowski E., Escarmis C., Domingo E. // Journal of Virology - 2000. - V. 74 - № 8 - P.3543-3547.

123. Ruiz-Jarabo C.M. Duration and fitness dependence of quasispecies memory / Ruiz-Jarabo C.M., Arias A., Molina-Paris C., Briones C., Baranowski E., Escarmis C., Domingo E. // Journal Of Molecular Biology - 2002. - V. 315 - № 3 - P.285-296.

124. Ruiz-Jarabo C.M. Synchronous loss of quasispecies memory in parallel viral lineages: A deterministic feature of viral quasispecies / Ruiz-Jarabo C.M., Miller E., Gomez-Mariano G., Domingo E. // Journal of Molecular Biology - 2003. - V. 333 - № 3 - P.553-563.

125. Briones C. Minority memory genomes can influence the evolution of HIV-1 quasispecies in vivo / Briones C., Vicente A. de, Molina-Paris C., Domingo E. // Gene - 2006. - V. 384 - № 12 - P.129-138.

126. Briones C. Memory in retroviral quasispecies: Experimental evidence and theoretical model for human immunodeficiency virus / Briones C., Domingo E., Molina-Paris C. // Journal of Molecular Biology - 2003. - V. 331 - № 1 - P.213-229.

127. Huang A.S. Defective Interfering Animal Viruses In: Comprehensive Virology. New York: Plenum Pres, 1977. Вып. 1 - 73-116с.

128. Aaskov J. Long-Term Transmission of Defective RNA Viruses in Humans and Aedes Mosquitoes / Aaskov J., Buzacott K., Thu H.M., Lowry K., Holmes E C. // Science - 2006. - V. 311 - № 236 - P.236-238.

129. Duarte E.A. Subclonal components of consensus fitness in an RNA virus clone / Duarte E.A., Novella I.S., Ledesma S., Clarke D.K., Moya A., Elena S.F., Domingo E., Holland J.J. // Journal of virology - 1994. - V. 68 - № 7 - P.4295-4301.

130. de la Torre J.C. RNA virus quasispecies populations can suppress vastly superior mutant progeny / de la Torre J.C., Holland J.J. // Journal of Virology - 1990. - V. 64 - № 12 - P.6278-81.

131. Garcia-Arriaza J. Evolutionary Transition toward Defective RNAs That Are Infectious by Complementation / Garcia-Arriaza J., Manrubia S.C., Toja M., Domingo E., Escarmis C. //

Journal of Virology - 2004. - V. 78 - № 21 - P.11678-11685.

132. Ojosnegros S. Viral genome segmentation can result from a trade-off between genetic content and particle stability / Ojosnegros S., García-Arriaza J., Escarmís C., Manrubia S.C., Perales C., Arias A., Mateu M.G., Domingo E. // PLoS Genetics - 2011. - V. 7 - № 3 - P.1-11.

133. Shi M. Divergent Viruses Discovered in Arthropods and Vertebrates Revise the Evolutionary History of the Flaviviridae and Related Viruses / Shi M., Lin X., Vasilakis N., Tian J., Li C., Chen L., Eastwood G., Diao X., Chen M.-H., Chen X., Qin X.-C., Widen S.G., Wood T.G., Tesh R.B., Xu J., Holmes E.C., Zhanga Y.-Z. // Journal of Virology - 2016. - V. 90 - № 2

- P.659-669.

134. Holmes E.C. The RNA Virus Quasispecies: Fact or Fiction? / Holmes E.C. // Journal of Molecular Biology - 2010. - V. 400 - № 3 - P.271-273.

135. Holmes E.C. Does hepatitis C virus really form quasispecies? / Holmes E.C. // Infection, Genetics and Evolution - 2010. - V. 10 - P.431-432.

136. Domingo E. Nucleotide Sequence Heterogeneity of an RNA Phage Population / Domingo E., Sabo D., Taniguchi T., Weissmann C. // Cell - 1978. - V. 13 - P.735-744.

137. Steinhauer D.A. Extreme heterogeneity in populations of vesicular stomatitis virus / Steinhauer D.A., de la Torre J.C., Meier E., Holland J.J. // Journal of Virology - 1989. - V. 63 -№ 5 - P.2072-2080.

138. Martelt L. Hepatitis C virus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes: quasispecies nature of HCV genome distribution / Martelt L., Martell M., Esteban J.I., Quer J., Genescá J., Weiner A., Esteban R., Guardia J., Gómez J. // Journal of Virology - 1992.

- V. 66 - № 5 - P.3225-3229.

139. Jenkins G.M. Evidence for the non-quasispecies evolution of RNA viruses / Jenkins G.M., Worobey M., Woelk C.H., Holmes E.C. // Molecular Biology and Evolution - 2001. - V. 18 -№ 6 - P.987-994.

140. Hemert F. Impact of the biased nucleotide composition of viral RNA genomes on RNA structure and codon usage / Hemert F., Kuyl A.C. van der, Berkhout B. // Journal of General Virology - 2016. - V. 97 - № 10 - P.2608-2619.

141. Burch C.L. Evolution by small steps and rugged landscapes in the RNA virus phi 6 / Burch C.L., Chao L. // Genetics - 1999. - V. 151 - № 3 - P.921-927.

142. Moreno E. Internal Disequilibria and Phenotypic Diversification during Replication of Hepatitis C Virus in a Noncoevolving Cellular Environment / Moreno E., Gallego I., Gregori J., Lucía-Sanz A., Soria M.E., Castro V., Beach N.M., Manrubia S., Quer J., Esteban J.I., Rice C.M., Gómez J., Gastaminza P., Domingo E., Perales C. // Journal of Virology - 2017. - V. 91 -№ 10 - P.e02505.

143. Flavell R.A. Site-directed Mutagenesis: Generation of an Extracistronic Mutation in Bacteriophage Qb RNA / Flavell R.A., Sabo D.L., Bandle E.F., Weissmann C. // Journal of Molecular Biology - 1974. - V. 89 - P.255-272.

144. Sanger F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1977. - V. 74 - № 12 -P.5463-5467.

145. Smith L.M. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis / Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B.H., Hood L.E. // Nature - 1986. - V. 321 - P.674-679.

146. Solmone M. Use of Massively Parallel Ultradeep Pyrosequencing to Characterize the Genetic Diversity of Hepatitis B Virus in Drug-Resistant and Drug-Naive Patients and to Detect Minor Variants in Reverse Transcriptase and Hepatitis B S Antigen / Solmone M., Vincenti D., Carlo M., Prosperi F., Bruselles A., Ippolito G., Capobianchi M.R. // Journal of Virology - 2009. - V. 83 - № 4 - P.1718-1726.

147. Arias A. Molecular intermediates of fitness gain of an RNA virus: Characterization of a mutant spectrum by biological and molecular cloning / Arias A., Lázaro E., Escarmis C., Domingo E. // Journal of General Virology - 2001. - V. 82 - P.1049-1060.

148. Meyerhans A. DNA recombination during PCR / Meyerhans A., Vartanian J., Wain-Hobson S. // Nucleic Acids Research - 1990. - V. 18 - № 7 - P.1687-1691.

149. Chumakov K.M. Correlation between amount of virus with altered nucleotide sequence and the monkey test for acceptability of oral poliovirus vaccine / Chumakov K.M., Powers L.B., Noonant K.E., Roninsont I.B., Levenbook I.S. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1991. - V. 88 - P.199-203.

150. Reuter J.A. High-Throughput Sequencing Technologies / Reuter J.A., Spacek D., Snyder M P. // Molecular Cell - 2016. - V. 58 - № 4 - P.586-597.

151. Levy S.E. Advancements in Next-Generation Sequencing / Levy S.E., Myers R.M. //

157

Annual review Genome Human Gnetics - 2016. - V. 17 - P.95-115.

152. Quail M.A. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent , Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers / Quail M.A., Smith M., Coupland P., Otto T.D., Harris S.R., Connor T.R., Bertoni A., Swerdlow H.P., Gu Y. // BMC genomics -2012. - V. 13 - № 341 - P.1-13.

153. Acevedo A. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses / Acevedo A., Andino R. // Nature Protocols - 2015. - V. 9 - № 7 - P.1760-1769.

154. Wright C.F. Beyond the Consensus : Dissecting Within-Host Viral Population Diversity of Foot-and-Mouth Disease Virus by Using Next-Generation Genome Sequencing / Wright C.F., Morelli M.J., Knowles N.J., Herzyk P., Paton D.J., Haydon D.T., King DP. // Journal of virology - 2011. - V. 85 - № 5 - P.2266-2275.

155. Koboldt D.C. VarScan : variant detection in massively parallel sequencing of individual and pooled samples / Koboldt D.C., Chen K., Wylie T., Larson D.E., Mclellan M.D., Mardis E.R., Weinstock G.M., Wilson R.K., Ding L. // Bioinformatics - 2009. - V. 25 - № 17 - P.2283-2285.

156. Verbist B.M.P. VirVarSeq: a low-frequency virus variant detection pipeline for Illumina sequencing using adaptive base-calling accuracy filtering / Verbist B.M.P., Thys K., Reumers J., Wetzels Y., Borght K., Talloen W., Aerssens J., Clement L., Thas O. // Bioinformatics - 2018. -V. 31 - № 1 - P.94-101.

157. Wilm A. LoFreq: A sequence-quality aware, ultra-sensitive variant caller for uncovering cell-population heterogeneity from high-throughput sequencing datasets / Wilm A., Aw P.P.K., Bertrand D., Yeo G.H.T., Ong S.H., Wong C.H., Khor C.C., Petric R., Hibberd M.L., Nagarajan N. // Nucleic Acids Research - 2012. - V. 40 - № 22 - P.11189-11201.

158. Yang X. V-Phaser 2: variant inference for viral populations / Yang X., Charlebois P., Macalalad A., Henn M.R., Zody M.C. // BMC genomics - 2013. - V. 14 - № 674 - P.1-10.

159. Zagordi O. ShoRAH: estimating the genetic diversity of a mixed sample from next-generation sequencing data / Zagordi O., Bhattacharya A., Eriksson N., Beerenwinkel N. // BMC Bioinformatics - 2011. - V. 12 - № 1 - P. 2-5.

160. Beerenwinkel N. Challenges and opportunities in estimating viral genetic diversity from next-generation sequencing data / Beerenwinkel N., Gunthard H.F., Roth V., Metzner K.J. // Frontiers in Microbiology - 2012. - V. 3 - P.1-16.

161. Prosperi M.C.F. Empirical validation of viral quasispecies assembly algorithms: State-of-the-art and challenges / Prosperi M.C.F., Yin L., Nolan D.J., Lowe A.D., Goodenow M.M., Salemi M. // Scientific Reports - 2013. - V. 3 - P.18-20.

162. Lee E. Mechanism of Virulence Attenuation of Glycosaminogly can-Binding Variants of Japanese Encephalitis Virus and Murray Valley Encephalitis Virus / Lee E., Lobigs M. // Journal of Virology - 2002. - V. 76 - № 10 - P.4901-4911.

163. Chiou S. Phenotypic changes in the Japanese encephalitis virus after one passage in Neuro-2a cells: Generation of attenuated strains of the virus / Chiou S., Chen W. // Vaccine - 2007. -V. 26 - P.15-23.

164. Bishop J.R. Heparan sulphate proteoglycans fine-tune mammalian physiology / Bishop J.R., Schuksz M., Esko J.D. // Nature - 2007. - Т. 446 - С.1030-1037.

165. Schneider-Schaulies J. Cellular receptors for viruses : links to tropism and pathogenesis / Schneider-Schaulies J. // Journal of General Virology - 2000. - V. 81 - P.1413-1429.

166. Chunikhin S.P. Viraemia in Clethrionomys Glareolus - a new ecologycal marker of tickborne encephalitis virus / Chunikhin S.P., Kurenkov V.B. // Acta Virologica - 1979. - V. 23 -P.257-260.

167. Дживанян Т.И. Дальнейшее изучение связи ДС-признака у вирусов комплекса клещевого энцефалита с видом переносчика / Дживанян Т.И., Лашкевич В.А., Чупринская М.В., Баннова Г.Г., Сарманова Е.С. // «Медицинская вирусология». Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР - 1974. - Т. XXII - № 2 - С.79-86.

168. Дживанян Т.И. Иммунохимические характеристики антигенов варианта вируса клещевого энцефалита, адаптированного к клещам Hyalomma plumbeum. / Дживанян Т.И., Чунихин С., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Королев М.Б. // Вопросы вирусологии - 1986. -№ 1 - С.92-96.

169. Дживанян Т.И. Изменение зависимых от хозяина характеристик вируса клещевого энцефалита при его адаптации к клещам и переадаптации к белым мышам. / Дживанян Т.И., Королев М.Б., Карганова Г.Г., Лисак В.М., Каштанова Г.М., Чупринская М.В. // Вопросы вирусологии - 1988. - № 5 - С.589-595.

170. Ponomareva E.P. Adaptation of tick-borne encephalitis virus from human brain to different cell cultures induces multiple genomic substitutions / Ponomareva E.P., Ternovoi V.A., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Gladysheva A. V, Shvalov A.N., Konovalova S.N.,

159

Chausov E.V., Loktev V.B. // Archives of Virology - 2017. - V. 162 - № 10 - P.3151-3156.

171. Ruzek D. Mutations in the NS2B and NS3 genes affect mouse neuroinvasiveness of a Western European field strain of tick-borne encephalitis virus / Ruzek D., Gritsun T.S., Forrester N.L., Gould E.A., Kopecky J., Golovchenko M., Rudenko N., Grubhoffer L. // Virology - 2008. - V. 374 - № 2 - P.249-255.

172. Sim S. Tracking Dengue Virus Intra-host Genetic Diversity during Human-to-Mosquito Transmission / Sim S., Aw P.P.K., Wilm A., Teoh G., Hue K.D.T., Nguyen N.M., Nagarajan N., Simmons C.P., Hibberd M L. // PLoS Neglected Tropical Diseases - 2015. - V. 9 - № 9 - P.1-21.

173. Bel ova O.A. Properties of the tick-borne encephalitis virus population during persistent infection of ixodid ticks and tick cell lines / Belova O.A., Litov A.G., Kholodilov I.S., Kozlovskaya L.I., Bell-Sakyi L., Romanova L.I., Karganova G.G. // Ticks and Tick-borne Diseases - 2017. - V. 8 - № 6 - P.895-906.

174. Bell-Sakyi L. Tick cell lines: tools for tick and tick-borne disease research / Bell-Sakyi L., Zweygarth E., Blouin E.F., Gould E.A., Jongejan F. // Trends in Parasitology - 2007. - V. 23 -№ 9 - P.450-457.

175. Bell-Sakyi L. Continuous cell lines from the tick Hyalomma anatolicum anatolicum / Bell-Sakyi L. // The Journal of Parasitology - 1991. - V. 77 - № 6 - P.1006-1008.

176. Bolger A.M. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data / Bolger A.M., Lohse M., Usadel B. // Bioinformatics - 2014. - V. 30 - № 15 - P.2114-2120.

177. Langmead B. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2 / Langmead B., Salzberg S. // Nature methods - 2013. - V. 9 - № 4 - P.357-359.

178. Li H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools / Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R. // Bioinformatics - 2009. -V. 25 - № 16 - P.2078-2079.

179. Топчий М.К. Руководство к практическим занятиям по вирусологии / М. К. Топчий, Н. П. Корнюшенко. - Киев: Издательство КиевскогоУниверситета, 1967.- 248c.

180. Белова О.А. Вирусологические и паразитологические аспекты оценки локального риска заражения в очаге клещевого энцефалита: диа канд. биологических наук: 03.02.02; 03.02.11. - Государственное Учреждение "Институт Полиомиелита и Вирусных

Энцефалитов имени М.П. Чумакова" РАМН, Москва, 2015 - 200с.

181. Chiba N. Pathogenicity of tick-borne encephalitis virus isolated in Hokkaido, Japan in mouse model / Chiba N., Iwasaki T., Mizutani T., Kariwa H., Kurata T., Takashima I. // Vaccine

- 1999. - V. 17 - № 7-8 - P.779-787.

182. Levy S.F. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking / Levy S.F., Blundell J R., Venkataram S., Petrov D.A., Fisher D.S., Sherlock G. // Nature - 2015. - V. 519 - P.1-9.

183. Singh V. Structural Modeling of the NS3 helicase of Tick-borne encephalitis virus and their virtual screening of potent drugs using molecular docking / Singh V., Somvanshi P. // Interdisciplinary Sciences: Computational Life Sciences - 2009. - V. 1 - № 3 - P.168-172.

184. Rumyantsev A.A. A Tick-Borne Langat Virus Mutant That Is Temperature Sensitive and Host Range Restricted in Neuroblastoma Cells and Lacks Neuroinvasiveness for Immunodeficient Mice / Rumyantsev A.A., Murphy B.R., Pletnev A.G. // Journal of Virology -2006. - V. 80 - № 3 - P. 1427-1439.

185. Hanley K.A. Paired Charge-to-Alanine Mutagenesis of Dengue Virus Type 4 NS5 Generates Mutants with Temperature-Sensitive, Host Range, and Mouse Attenuation Phenotypes / Hanley K.A., Lee J.J., Blaney J.E., Murphy B.R., Whitehead S.S. // Journal of Virology - 2002.

- V. 76 - № 2 - P.525-531.

186. Wicker J.A. A single amino acid substitution in the central portion of the West Nile virus NS4B protein confers a highly attenuated phenotype in mice. / Wicker J.A., Whiteman M.C., Beasley D.W.C., Davis C.T., Zhang S., Schneider B.S., Higgs S., Kinney R.M., Barrett A.D.T. // Virology - 2006. - V. 349 - № 2 - P.245-253.

187. Miller S. The non-structural protein 4A of dengue virus is an integral membrane protein inducing membrane alterations in a 2K-regulated manner. / Miller S., Kastner S., Krijnse-Locker J., Buhler S., Bartenschlager R. // The Journal of Biological Chemistry - 2007. - V. 282 - № 12

- P.8873-8882.

188. Zou J. Characterization of Dengue Virus NS4A and NS4B Protein Interaction / Zou J., Xie X., Wang Q., Dong H., Lee Y., Kang C., Yuan Z., Shi P. // Journal of Virology - 2015. - V. 89 -№ 7 - P.3455-3470.

189. Li D. Defective interfering viral particles in acute dengue infections / Li D., Lott W.B., Lowry K., Jones A., Thu H.M., Aaskov J. // PLoS ONE - 2011. - V. 6 - № 4 - P. 1-12.

190. Lopez-Ferber M. Defective or effective ? Mutualistic interactions between virus genotypes / Lopez-Ferber M., Simon O., Williams T., Caballero P. // Proceedings of Royal Society - 2003. -V. 270- № 1530 - P.2249-2255.

191. Chunikhin S.P., Dzhivanyan T.I. Ecological markers of arboviruses In: L. Kurstack (Ed.) Arctic and Tropical Arboviruses / New York: Academic Press, 1979. - 297-302с.

192. Романова Л.Ю. Изменение свойств популяции вируса клещевого энцефалита при смене хозяина: дис. канд. биологических наук: 03.00.06 - Государственное Учреждение "Институт Полиомиелита И Вирусных Энцефалитов имени М.П. Чумакова" РАМН, Москва, 2006 - 143с.

193. Batschelet E. The proportion of revertant and mutant phage in a growing population, as a function of mutation and growth rate / Batschelet E., Domingo E., Weissmann C. // Gene - 1976.

- V. 1 - № 1 - P.27-32.

194. Ciota A.T. Insights into arbovirus evolution and adaptation from experimental studies / Ciota A T., Kramer L.D. // Viruses - 2010. - V. 2 - № 12 - P.2594-2617.

195. Ciota A.T. Quantification of intrahost bottlenecks of West Nile virus in Culex pipiens mosquitoes using an artificial mutant swarm / Ciota A.T., Ehrbar D.J., Slyke G.A., Payne A.F., Willsey G.G., Viscio R.E., Kramer L.D. // Infection, Genetics and Evolution - 2009. - V. 6 - № 3 - P.247-253.

196. Asghar N. Deep sequencing analysis of tick-borne encephalitis virus from questing ticks at natural foci reveals similarities between quasispecies pools of the virus / Asghar N., Pettersson J.H.O., Dinnetz P., Andreassen A., Johansson M. // Journal of General Virology - 2017. - V. 98

- № 3 - P.413-421.

197. Jerzak G.V.S. The West Nile virus mutant spectrum is host-dependant and a determinant of mortality in mice. / Jerzak G.V.S., Bernard K., Kramer L.D., Shi P.Y., Ebel D. // Virology -2007. - V. 360 - № 2 - P.469-476.

198. Ehrbar D.J. High levels of local inter- and intra-host genetic variation of West Nile virus and evidence of fine-scale evolutionary pressures / Ehrbar D.J., Ngo K.A., Campbell S.R., Kramer L.D., Ciota A.T. // Infection, Genetics and Evolution - 2017. - V. 51 - P.219-226.

199. Acevedo A. Mutational and fitness landscapes of an RNA virus revealed through population sequencing / Acevedo A., Brodsky L., Andino R. // Nature - 2014. - V. 505 - № 7485 - P.686-690.

200. Leonard A.S. Deep Sequencing of Influenza A Virus from a Human Challenge Study Reveals a Selective Bottleneck and Only Limited Intrahost Genetic Diversification / Leonard A.S., McClain M.T., Smith G.J.D., Wentworth D., Halpin R.A., Lin X., Ransier A., Stockwell T.B., Das S., Gilbert A.S., Lambkin-Williams R., Ginsburg G.S., Woods C.W., Koelle K. // Journal of Virology - 2016. - V. 90 - № 24 - P.11247-11258.