Гетерологическая продукция, пространственная структура, динамика и функционально значимые взаимодействия с ионами металлов внутриклеточных доменов рецепторов семейства TLR тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лушпа Владислав Александрович

• Лушпа Владислав Александрович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Лушпа Владислав Александрович

Оглавление

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи работы

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследований

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Степень достоверности и апробация результатов

Структура и объем работы

Благодарности

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Толл-подобные рецепторы

1.1.1. Структурная организация TLR

1.1.2. Участие TLR во внутриклеточном сигналинге

1.1.2.1. Лиганды и локализация

1.1.2.2. Адаптерные белки и передача сигнала TLR

1.2. Роль ионов металлов в процессах внутриклеточной сигнализации

1.2.1. Общие сведения

1.2.2. Кальций

1.2.3. Магний

1.2.4. Марганец

1.2.5. Цинк

1.2.6. Железо

1.2.7. Кобальт и никель

1.2.8. Медь

1.3. Заключение по литературному обзору

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Получение и приготовление белковых образцов

2.1.1. Гель-электрофорез

2.1.2. Сборка экспрессионных плазмид

2.1.3. Подбор оптимальных условий бактериальной экспрессии

2.1.3.1. Отбор экспериментальных проб

2.1.3.2. Тест растворимости

2.1.3.3. Тест локализации

2.1.3.4. Лизис клеток

2.1.3.5. Документирование гелей, количественная оценка выхода белка и анализ данных

2.1.3.6. Рациональный дизайн эксперимента и построение моделей отклика

поверхности

2.1.4. Очистка белков после продукции в клетках E. coli

2.1.4.1. Протокол очистки TLR1tir

2.1.4.2. Протокол очистки TLR2tir

2.1.4.3. Протокол очистки TLR3tir

2.1.4.4. Протокол очистки TLR5tir

2.1.4.5. Протокол очистки TLR7tir

2.1.4.6. Протокол очистки TLR8tir

2.1.4.7. Определение концентрации белкового образца

2.2. Методы исследования структуры TLRtir

2.2.1. КД-спектрометрия

2.2.2. ЯМР-спектрометрия

2.2.2.1. Спектроскопия ЯМР

2.2.2.2. Отнесение сигналов и предсказание вторичной структуры

2.2.2.3. Анализ и расчет пространственной структуры

2.2.2.4. Измерение концентрации белка при помощи спектроскопии ЯМР

2.2.2.5. Измерение параметров релаксации ЯМР

2.2.2.6. Анализ данных ЯМР-релаксации

2.2.2.7. Измерение вращательной диффузии

2.2.2.8. Анализ пертурбации химического сдвига

2.2.2.9. Статистический анализ интенсивности сигналов

2.3. Исследование металлсвязывающей активности

2.3.1. Динамическое рассеяние света

2.3.2. ЯМР-спектроскопия

Глава 3. Рациональный подбор и оптимизация параметров экспрессии TLR1-10tir

3.1. Влияние штамма и бактериальной среды на продукцию целевого белка

3.2. Влияние ионной силы и детергента лизис-буфера на выходы растворимой фракции целевого белка

3.3. Влияние температуры, концентрации индуктора и времени культивации на выходы растворимой фракции целевого белка

3.3.1. Подбор параметров культивации TLR1tir

3.3.2. Разработка рациональной методики подбора условий экспрессии

3.3.3. Построение ландшафта экспрессии для TLR2tir

3.3.4. Рациональный поиск оптимальных параметров продукции H6-TLR3-10tir

3.3.5. Эффект ИПТГ, температуры и времени культивации

3.3.6. Поиск конструкций для культивации TLRtir с малыми выходами

3.4. Итоги Главы

Глава 4. Разработка и оптимизация протоколов очистки TLR1-10tir

4.1. Оптимизация протокола очистки TLR1tir

4.2. Разработка и оптимизация протокола очистки TLR2tir

4.3. Разработка протокола очистки TLR3tir

4.4. Разработка протокола очистки TLR5/8tir

4.5. Разработка протокола очистки TLR7tir

4.6. Разработка протокола очистки TLR4/6/9/10tir

4.7. Подтверждение вторичной структуры TLRtir

4.7.1. Данные КД для TLRtir

4.7.2. Подтверждение возможности изучения пространственной структуры методом ЯМР

4.8. Итоги Главы

Глава 5. Исследование пространственной структуры TLR1tir

5.1. Отнесение сигналов в спектрах ЯМР TLR1tir

5.2. Пространственная структура TLR1tir

5.3. Анализ параметров ЯМР-релаксации

5.4. Определение интерфейса димеризации TLR1tir

5.5. Исследование взаимодействия TLR1TIR и TLR2tir

5.6. Сравнение ЯМР и РСА структур TLR1tir

5.7. Итоги Главы

Глава 6. Металлсвязывающая активность TLR1tir и TLR2tir

6.1. Влияние ионов дивалентных металлов на структуру TLR1tir

6.2. Определение константы диссоциации комплекса TLR1tir/Zü2+

6.3. Роль цистеинов при связывании ионов цинка с TLR1tir

6.4. Роль остатка С667 TLR1tir в функционировании рецептора

6.5. Изучение цинк-связывающей активности TLR2tir

6.6. Роль цистеинов в активации TLR2

6.7. Итоги Главы

Заключение

Выводы

Список сокращений

Список литературы

Приложение к диссертации

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Гетерологическая продукция, пространственная структура, динамика и функционально значимые взаимодействия с ионами металлов внутриклеточных доменов рецепторов семейства TLR»

Введение Актуальность темы исследования

Одной из важнейших задач современной биологии является выяснение механизмов работы различных белков на уровне пространственной структуры. Такие данные необходимы для рациональной инженерии белков с заданными свойствами, для разработки новых лекарственных средств направленного действия. Особое место в этой связи занимают мембранные белки, а именно клеточные рецепторы, которые участвуют во множестве процессов жизнедеятельности клетки. На сегодняшний день мембранные белки составляют примерно половину мишеней для лекарственных средств [1].

Среди мембранных белков выделяют битопные мембранные белки. Особенностью данных молекул является трансмембранный домен, состоящий из одной а-спирали. К широко распространенным примерам таких белков можно отнести рецепторные тирозинкиназы: рецепторы инсулина, эпителиального фактора роста, фактора роста фибробластов и гормона роста. Одним из важнейших классов мембранных белков являются Толл-подобные рецепторы (ТЪЯ).

Толл-подобные рецепторы являются ключевыми участниками системы врожденного иммунного ответа [2, 3]. В организме человека встречается 10 белков данного семейства, называемых TLR1-10. Активация данных рецепторов приводит к развитию врожденного иммунного ответа и воспаления. Известно, что TLR в той или иной степени участвуют в инфекционных, аутоиммунных и нейродегенеративных заболеваниях [4]. Широкое применение против инфекционных заболеваний получили агонисты TLR, как для активации, так и для остановки иммунного ответа. В качестве примера можно привести использование агониста TLR4 монофосфорил липид - А в вакцинах против вируса гепатита В, ветряной оспы, рака, вируса папилломы человека и других [5]. Около 30 соединений, использующих в качестве мишеней TLR, проходят или уже прошли различные фазы клинических испытаний [4]. Последнее свидетельствует о перспективности разработки лекарственных средств, действующих на рецепторы TLR.

TLR свойственна типичная архитектура мембранного белка 1 типа - рецепторы состоят из объемных вне- и внутриклеточных доменов и трансмембранного домена, представляющего одну а-спираль. Известно, что рецепторы функционируют в виде гомо- и гетеродимеров. Несмотря на кажущуюся ясность в области исследований TLR, осталось много неотвеченных вопросов,

включая структуру внутриклеточных доменов TLR и механизм их участия в запуске внутриклеточной сигнализации при передаче сигнала активации иммунного ответа.

Данная работа посвящена исследованию внутриклеточных доменов TLR, начиная от их продукции в клетках E. coli и заканчивая структурными исследованиями белковых молекул и механизмов их функционирования.

Степень разработанности темы исследования

На сегодняшний день накоплено большое количество информации о рецепторах TLR, структурах их доменов, локализации и функциональной значимости [2, 3]. Известно, что внеклеточные домены в ответ на распознавание PAMP (патоген ассоциированных молекулярных комплексов) приводят к димеризации рецептора, взаимодействию с внутриклеточными адаптерными молекулами и запуску сигнального каскада. Согласно литературным данным, в 2021 году были опубликованы структуры TLR3 и TLR7 без внутриклеточных доменов [6]. Также в 2023 году были представлены структуры трансмембранных доменов пяти представителей семейства [7]. На протяжении последних 25 лет были получены структуры всех внеклеточных доменов TLR в комплексах с лигандами (кроме TLR10), структуры и четырех внутриклеточных доменов (TLR1/2/4/10) в кристаллической форме.

Лекарственные средства на основе агонистов TLR, взаимодействующих с внеклеточным доменом рецептора набирают все большую популярность в исследованиях. Однако структурные основы взаимодействий TLR внутри клетки в процессе передачи сигнала все еще не изучены должным образом: нет данных об активации рецептора на структурном уровне внутри клетки, не описаны интерфейсы димеризации TLRtir (toll-interleukin-1 receptor (TIR) homology domain, домен, гомологичный толл-интерлейкиновому рецептору) всех членов семейства, за исключением TLR10. Неразрешенной проблемой также является механизм запуска внутриклеточного каскада передачи сигнала при димеризации рецептора. В литературе можно найти множество противоречивых данных как о механизмах запуска внутриклеточного каскада рецептора, так и о взаимодействии с различными адаптерными молекулами [2, 8, 9].

Таким образом, наблюдается недостаток информации в области изучения внутриклеточных доменов TLR, их структурной организации и механизмов функционирования на уровне пространственной структуры.

Цель и задачи работы

Целью данной работы является исследование структуры и внутримолекулярной подвижности TLRtir в растворе и их роли в процессе активации рецептора. Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Разработка рационального подхода для поиска оптимальных условий продукции внутриклеточных доменов белков TLR1-10tir в растворимом виде в клетках E. coli;

2) Разработка протоколов очистки исследуемых белков, позволяющих получать миллиграммовые количества изотопно-меченых вариантов TLRtir;

3) Исследование пространственной структуры и внутримолекулярной динамики TLRtir в растворе;

4) Исследование взаимодействия TLRtir с ионами металлов.

Научная новизна работы

1) Разработана методика рационального подбора условий продукции TLR1-10tir в клетках E. coli: подобраны и оптимизированы параметры продукции белка для достижения максимальных выходов растворимой фракции для TLR1-10tir. Данная методика может быть применена для подбора условий продукции других белковых молекул в клетках E. coli;

2) Разработаны протоколы очистки для TLR1/2/3/7tir, позволяющие получать миллиграммовые количества образцов в мономерной форме для проведения структурных исследований методами ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА); остальные белки получены в форме олигомеров, что делает их потенциальными объектами для структурных исследований методом криоэлектронной микроскопии (криоЭМ);

3) Впервые получена структура внутриклеточного домена TLR1 в растворе, выявлены отличия от структуры, полученной методом РСА; описана внутримолекулярная подвижность молекулы и ее склонность к димеризации с повышением концентрации образца;

4) Выявлено обратимое образование комплекса TLR1TiR:Zn2+ с константой диссоциации 4.5 нМ. Методами точечного мутагенеза и компьютерного моделирования локализованы возможные сайты связывания ионов цинка. Выявлено образование комплекса TLR2TiR:Zn2+ c константой диссоциации 6 нМ. При этом ни одна из точечных мутаций по цистеинам не

способна полностью ингибировать связывание ионов цинка. Замена всех четырех остатков цистеинов практически полностью ингибирует образование комплекса TLR2iiR:Zn2+; 5) Выявлено, что остатки С667 в TLR1, С673 и С713 в TLR2 являются ключевыми при функционировании рецептора TLR1-TLR2: мутации по данным цистеинам нарушают лиганд-индуцированную активацию рецептора. При этом замена С667 в TLR1 и C713 в TLR2 приводит к полному ингибированию передачи сигнала через NF-kB путь.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы обусловлена:

1) получением информации об оптимальных параметрах продукции TLR1-10tir человека в клетках E. coli и способах их очистки для дальнейших структурных исследований;

2) получением данных о структуре, динамике и склонности к олигомеризации TLRItir в растворе;

3) получением информации о взаимодействии двухвалентных ионов металлов с TLRItir и TLR2 в растворе и локализации их сайтов связывания;

4) установлением биологической роли аминокислотных остатков C667 TLR1 и C673, C713 TLR2 в процессе активации гетерокомплекса TLR1-TLR2.

Практическая значимость работы обусловлена:

1) разработкой методики рационального поиска оптимальных значений продукции водорастворимых белков;

2) возможностью использования полученных данных о структуре и очистке TLR1-10tir, данных точечного мутагенеза в различных исследованиях, связанных с TLR, в том числе и структурных;

3) возможностью использования полученной структуры TLRItir и данных о биологической роли цистеинов 667 TLR1 и 673, 713 TLR2 для скрининга лекарственных соединений в поисках терапии ряда заболеваний, связанных с активацией TLR.

Методология и методы исследований

Разработанные в рамках диссертации подходы для рационального подбора условий продукции белков основаны на современных представлениях о рациональном дизайне

эксперимента и включают в себя современные способы его реализации. Также в данной работе широко применялись методы получения образцов белков, которые включают в себя создание экспрессионных конструкций методами генной инженерии; получение рекомбинантных белков в клетках E. coli, в том числе с введением изотопных меток; выделение и очистка белков с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии (МХАХ), ионообменной и гельфильтрационной хроматографий и различных биологических и биохимических методов, используемых при получении белковых образцов. Также в данной работе использовались методы исследования пространственной структуры и взаимодействий биологических молекул: гетероядерная спектроскопия ЯМР высокого разрешения, динамическое рассеяние света (ДРС), РСА, спектрофотометрия в видимом и ближнем ультрафиолетовом диапазонах. Подробные протоколы используемых методик приведены в главе "Материалы и методы исследований".

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана методика оптимизации параметров гетерологической продукции белков на основе принципов рационального дизайна. Методика позволяет по минимальному количеству экспериментальных точек определить оптимальные параметры культивации культуры клеток. На основе разработанной методики подобраны оптимальные условия продукции TLR1-10tir, выбраны перспективные объекты для дальнейших исследований;

2. Разработаны системы очистки для внутриклеточных доменов TLR1-3/5-8 позволяющие получить образцы белков, пригодных для проведения дальнейших исследований. Протоколы очистки внутриклеточных доменов TLR1/2/3/7 позволяют получать образцы в мономерной форме для проведения структурных исследований методами ЯМР и РСА;

3. Определена пространственная структура внутриклеточного домена TLR1 в растворе. Структура представляет собой упорядоченную глобулу, состоящую из ß-листа, образованного 5 антипараллельными ß-тяжами, окруженного 5 а-спиралями. Выявлены отличия ЯМР-структуры белка от конформации, полученной методом РСА, возникающие вследствие образования при кристаллизации ненативных дисульфидных связей;

4. Выявлено наличие во внутриклеточном домене TLR1 высокоаффинного сайта связывания ионов цинка с константой диссоциации 4.5 нМ. По данным мутагенеза, сайт включает в себя остатки С686 и С667. Связывание цинка осуществляется в двух режимах, при этом С686 важен для одного из режимов, в то время как С667 - для обоих. Сопряженное с олигомеризацией белка высокоаффинное связывание Zn2+ с константой диссоциации 6 нМ было показано также для TLR2tir. Ни одна из точечных мутаций по цистеинам не способна

полностью ингибировать связывание ионов цинка. Полученные результаты указывают на участие всех цистеинов ТЬК^тж в связывании ионов цинка;

5. Остатки С667 в TLR1, С673 и С713 в TLR2 являются ключевым при функционировании рецептора TLR1-TLR2: мутации по данным цистеинам нарушают лиганд-индуцированную активацию рецептора.

Личный вклад автора

Автор данной работы принимал участие в определении целей и задач исследования, занимался планированием и проведением основной части экспериментов с их анализом и обработкой. Автор работы принимал участие в теоретическом анализе и разработке стратегии исследования. Автор представлял полученные результаты исследования на конференциях российского и международного уровней.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты диссертации получили апробацию на 10 международных и всероссийских конференциях. Материалы диссертации были представлены на международной зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" ИБХ РАН в 2018, 2019, 2021, 2022 годах, 64 Всероссийской научной конференции МФТИ в 2022 году, на международной конференции Biomembranes-2018 в 2018 году, на международных конференциях «FEBS-2021» и «FEBS-2018» в Любляне (Словения) и Праге (Чехия), на VII съезде биохимиков, молекулярных биологов и физиологов России в 2022 годуи на 13 и 14 международных мультиконференциях «Биоинформатика регуляции и структуры генов / системная биология» («БГРС/СБ», «BGRS/SB») в 2022 и 2024 годах.

По результатам диссертации опубликовано 15 работ, из них 3 - в журналах, индексируемых в международных базах Web of Science и SCOPUS, 12 - в сборниках статей и научных трудов конференций.

Научные статьи в рецензируемых журналах 1. Goncharuk MV, Lushpa VA, Goncharuk SA, Arseniev AS, Mineev KS. Sampling the cultivation parameter space for the bacterial production of TLR1 intracellular domain reveals the multiple optima. Protein Expr Purif. 2021 May; 181:105832. doi: 10.1016/j.pep.2021.105832;

2. Lushpa VA, Goncharuk MV, Lin C, Zalevsky AO, Talyzina IA, Luginina AP, Vakhrameev DD, Shevtsov MB, Goncharuk SA, Arseniev AS, Borshchevskiy VI, Wang X, Mineev KS. Modulation of Toll-like receptor 1 intracellular domain structure and activity by Zn2+ ions. Commun Biol. 2021 Aug 24;4(1):1003. doi: 10.1038/s42003-021-02532-0;

3. Lushpa VA, Goncharuk MV, Talyzina IA, Arseniev AS, Bocharov EV, Mineev KS, Goncharuk SA. TIR domains of TLR family-from the cell culture to the protein sample for structural studies. PLoS One. 2024 Jul 5;19(7):e0304997. doi: 10.1371/journal.pone.0304997.

Тезисы конференций

1. The influence of zinc ions on the spatial organization and activation of TIR-domains of the Tolllike receptors/ Лушпа В.А., Гончарук М.В., Залевский А.О., Талызина И.А., Лугинина А.П., Вахрамеев Д.Д., Шевцов М.Б., Гончарук С.А., Арсеньев А.С., Борщевский В.И., Минеев К.С./ Международная конференция по биоинформатике геномной регуляции и структурной/системной биологии BGRS/SB-2024, 2024г - C. 610-611 (doi: 10.18699/bgrs2024-3.1 -44);

2. Changes in the structure and dynamics of the intracellular domain of Toll-like receptors 1 under the action of Zn2+ / Лушпа В.А., Гончарук М.В., Залевский А.О., Талызина И.А., Лугинина А.П., Вахрамеев Д.Д., Шевцов М.Б., Гончарук С.А., Арсеньев А.С., Борщевский В.И., Минеев К.С./ Международная конференция по биоинформатике геномной регуляции и структурной/системной биологии BGRS/SB-2022, 2022г - C. 300-301 (doi: 10.18699/SBB-2022-169);

3. Sampling the parameter space for heterologous bacterial production of intracellular domain of TLR1 reveals multiple optima / Гончарук М.В., Лушпа В.А., Гончарук С.А., Минеев К.С. // / Международная конференция по биоинформатике геномной регуляции и структурной/системной биологии BGRS/SB-2022, 2022 г. - C. 286 (doi: 10.18699/SBB-2022-160);

4. Structure of Toll-like receptors: the input from solution NMR spectroscopy / Mineev K., Goncharuk S., Goncharuk M., Lushpa V., Kornilov F., Shabalkina A., Talyzina I., Zalevsky A., Lin C., Wang X., Volynsky P., Arseniev A., Luginina A., Vakhrameev D., Borshchevskiy V. // Международная конференция по биоинформатике геномной регуляции и структурной/системной биологии BGRS/SB-2022, 2022 г. - C. 303-304 (doi: 10.18699/SBB-2022-171);

5. Влияние ионов цинка 2+ на структуру и активность внутриклеточного домена толлподобного рецептора 1/ Лушпа В.А., Гончарук М.В., Залевский А.О., Талызина И.А., Лугинина А.П., Вахрамеев Д.Д., Шевцов М.Б., Гончарук С.А., Арсеньев А.С.,

Борщевский В.И., Минеев К.С. // VII съезд биохимиков, молекулярных биологов и физиологов России, 2022 г.;

6. Модуляция структуры и активности внутриклеточного домена Toll-подобного рецептора 1 ионами Zn2+ / Лушпа В.А., Гончарук М.В., Залевский А.О., Талызина И.А., Лугинина А.П., Вахрамеев Д.Д., Шевцов М.Б., Гончарук С.А., Арсеньев А.С., Борщевский В.И., Минеев К.С. // Сборник тезисов XXXIV зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 2022 г., -С.25;

7. Структурные и функциональные сведения о связывании цинка внутриклеточным доменом толл-подобного рецептора 1/ Лушпа В.А., Гончарук М.В., Залевский А.О., Талызина И.А., Лугинина А.П., Вахрамеев Д.Д., Шевцов М.Б., Гончарук С.А., Арсеньев А.С., Борщевский В.И., Минеев К.С. // Труды 64-й Всероссийской научной конференции МФТИ, 2021 г. - 180с.;

8. Structure and dynamics of the intracellular domain of toll-like receptor 1: the basis for Zn2+ modulating the receptor signaling / Lushpa V., Goncharuk M., Lin C., Talyzina I., Luginina A., Vakhrameev D., Shevtsov M., Goncharuk S., Arseniev A., Borshchevskiy V., Wang X., Mineev K. // FEBS Open Bio — 2021 (doi: 10.1002/2211-5463.13205);

9. Бактериальная экспрессия, очистка и структурные исследования цитоплазматического домена белка TLR1/ Лушпа В.А., Гончарук М.В., Гончарук С.А., Минеев К.С., Арсеньев А.С. // Сборник тезисов XXXI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 2019 г., -С.49;

10. Бактериальный синтез и очистка фрагментов белков семейства TLR, содержащих трансмембранный и цитоплазматический домены / Лушпа В.А., Гончарук М.В., Гончарук С.А. // Сборник тезисов XXX зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 2018 г., -С.43;

11. Bacterial synthesis, purification and structural study of the Toll-like receptor 1 cytoplasmic domain / Lushpa V., Goncharuk M., Goncharuk S., Mineev K., Arseniev A. // FEBS Open Bio Vol. 8, 2018, C. - 424 (doi: 10.1002/2211-5463.12446);

12. Production and structural study of the toll-like receptor 1 cytoplasmic domain / Lushpa VA, Goncharuk MV, Goncharuk SA, Mineev KS, Arseniev AS // BIOMEMBRANES 2018, 2018, C. 94-95 (doi: 10.1007/s10863-018-9775-7).

Работа выполнена в г. Москва в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Российской академии наук на базе Лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии в рамках госбюджетной темы НИР № 0101-2019-0015 «Структура, динамика, механизмы действия и биологическая функция белков и пептидов», а также грантов РНФ 14-1400573, 22-14-00020, и гранта РФФИ 20-34-70024.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из списка сокращений, введения, шести глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы из 240 наименований и дополнительных материалов. Общий объем диссертации составляет 215 страниц, включая 78 рисунков и 36 таблиц. Из них объем Приложения к диссертации составляет 42 страницы, включая 24 рисунка и 11 таблиц.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, Константину Сергеевичу Минееву, за обучение экспериментальным и теоретическим методам ЯМР в области структурной биологии, за руководство исследованиями, описанными в работе и возможность их осуществления.

Автор благодарит научного консультанта работы, Гончарук Марину Валерьевну, за консультации и помощь в планировании и проведении исследований, связанных с получением рекомбинантных белков для проведения структурных исследований.

Автор благодарит Гончарука Сергея Александровича за участие в исследованиях и помощь при планировании генно-инженерных работ по теме исследования.

Автор благодарит Талызину Ирину Александровну за проведение экспериментов по

очистке и ДРС образца TLR2тIR.

Автор приносит благодарность Борщевскому Валентину Ивановичу и его лаборатории за помощь в проведении структурных исследований, в частности исследований структуры TLR1тIR методами РСА.

Автор благодарит Залевского Артура Олеговича за данные по компьютерному моделированию взаимодействия белков с ионами металлов.

Автор приносит благодарность Wang X и его лаборатории за помощь в проведении функциональных тестов активации рецепторов.

Автор приносит глубокую благодарность коллективу лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН, кафедре физико-химической биологии и биотехнологии МФТИ (НИУ), преподавательскому составу МФТИ (НИУ) и УНЦ ИБХ РАН за обучение практическим и теоретическим навыкам ведения экспериментов.

Также автор благодарит своих родственников и друзей за поддержку во время обучения в аспирантуре и при написании диссертации, а именно: Бондаренко Светлану Анатольевну, Лушпу Ирину Валентиновну, Лушпу Александра Васильевича и Кота Эрика Федоровича.

Глава 1. Литературный обзор 1.1. Толл-подобные рецепторы

Толл-подобные рецепторы являются важными участниками системы врожденного иммунного ответа. В организмах млекопитающих обнаружено 13 таких рецепторов, 10 из которых (TLR1-10) встречаются у человека. Данные рецепторы можно разделить на две группы: по типу лиганда и клеточному расположению [2]. Первая группа состоит из TLR1/2/4/5/6 и отвечает за связывание бактериальных соединений - липидов, липопептидов, липосахаридов и белков [3, 10, 11]. Данные белки вместе с TLR10 расположены на клеточной мембране. Вторая группа, состоящая из TLR3/7/8/9, отвечает за распознавание РНК и локализована в эндосомах.

Согласно филогенетическому анализу, TLR разделяют на 6 подсемейств [12]: TLR1/3/4/5/7 и 11. Подсемейство TLR1 объединяет в себе TLR1/2/6 и 10. В подсемейство TLR7 входят белки TLR7/8/9. В подсемейство TLR11 входят TLR11/12 и 13. Остальные 3 рецептора (TLR3, TLR4, TLR5) образуют одноименные подсемейства с одним представителем.

Известно, что в активном состоянии TLR ассоциируют с образованием гомо- и гетеро-димеров [2]. Связывание димера TLR с молекулой патогена приводит к запуску сигнальных каскадов с активацией транскрипционных факторов КР-кВ и регуляторного фактора интерферонов. Последнее приводит к развитию иммунного ответа с синтезом противовоспалительных цитокинов и интерферонов первого типа.

1.1.1. Структурная организация TLR

Пространственная структура белков семейства TLR изучалась с помощью РСА, криоЭМ и спектроскопии ЯМР. Было выявлено, что толл-подобные рецепторы являются трансмембранными белками первого типа: они состоят из N-концевого внеклеточного домена, трансмембранной а-спирали и С-концевого внутриклеточного домена.

Наибольшими размерами обладает внеклеточный домен, включающий в себя около 500800 аминокислотных остатков (Рис. 1, 2). Он состоит из повторяющихся мотивов - лейцин-богатых повторов (LRR), количество которых варьируется от 7 до 28, в зависимости от рассматриваемого белка. LRR представляют собой следующую аминокислотную последовательность: LxxLxLxxNxL или LxxLxLxxNxxL. Под 'L' обозначается лейцин, изолейцин, валин или фенилаланин, а под 'N' - аспарагин, цистеин, серин или треонин.

Обозначение 'x' подразумевает под собой любую аминокислоту. Несколько LRR повторов формируют подковообразную пространственную структуру (рис. 1). Вогнутая часть состоит из параллельных ß-листов, которые соединяются с выпуклой частью петлями, ответственными за связывание внеклеточных доменов с их лигандами. N- и C-концы внеклеточного домена фланкированы концевыми кэпами (LRRNT и LRRNC), которые защищают два конца консервативного центрального сегмента. LRRNT-мотив представляет собой последовательность ß-шпилек, стабилизированных дисульфидными связями, а LRRNC-мотив состоит из двух а-спиралей, также стабилизированных двумя дисульфидными связями.

соо

Рисунок 1 - Внеклеточный домен TLR3. Синим цветом показаны ß-листы, красным - а-спирали. Зеленым и желтым цветом выделены 18 и 19 LRR-повторы. Боковые цепи указаны для аминокислотных остатков L в мотиве LxxLxLxxNxL. Взято и адаптировано из PDB 3CIY.

Для внеклеточных доменов TLR подсемейства TLR7 характерно наличие Z-петли между 14 и 15 LRR повторами. Данный элемент содержит в себе сайт щепления, необходимый для функционирования рецепторов: после щепления N- и С-концевые фрагменты внеклеточного домена связываются друг с другом и участвуют в связывании лиганда [13].

На сегодняшний день в базе данных PDB представлены структурные данные о всех внеклеточных доменах TLR, как в апо- состоянии, так и в комплексе с лигандами (кроме TLR10) (Рис. 2). Так, представлены структуры гетеродимера эктодоменов TLR1-TLR2 с липопептидом, TLR2-TLR6 с липопротеином, структура внеклеточного домена TLR3 в связке с фрагментом вирусной РНК, структура комплекса липосахарид-TLR4-MD-2, димера внеклеточного домена TLR5 в комплексе с флагеллином и структуры комплексов эктодоменов TLR8 с различными лигандами и другие [14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21].

Рисунок 2 - Внеклеточные домены TLR млекопитающих. Красным цветом обозначены а-спирали, синим - Р-листы, зеленым - лиганды рецепторов. Данные взяты и адаптированы из PDB: TLR1-TLR2 c Pam3CSL4 (PDB ГО: 2Z7X); TLR2-TLR2 с дипровоцимом ^В ГО: 6NIG); TLR2:TLR6 с Pam2CSL4 (PDB ID: 3А79); TLR3-TLR3 с дцРНК (PDB ID: 3CIY); TLR4-TLR4 в комплексе с MD-2 и с липополисахаридом (PDB ID: 3БХ1); TLR5-TLR5 с флагеллином (PDB ГО: 3V47); TLR7-TLR7 с гуанизином и одноцепочечной поли-и цепью (PDB ГО: 5GMF); TLR8-TLR8 с остатками оцРНК (PDB ГО: 4R07); TLR9-TLR9 с ДНК ^В ГО: 3WPC).

Следующим по уровню изученности является трансмембранный домен TLR. Данный участок белка представлен одиночной а-спиралью длиной порядка 40 аминокислотных остатков. На сегодняшний день определены структуры трансмембранных доменов для 4/7/9

методами ЯМР и для TLR3/7 методами криоЭМ в составе полноразмерного рецептора [7, 22] (Рис. 3). Анализ аминокислотных последовательностей и данных ЯМР показывает, что помимо трансмембранных доменов белки содержат протяженные гидрофобные участки в

цитоплазматической области, представляющие собой а-спирали. Функциональное тестирование на клетках в совокупности с биоинформатическим анализом показало важную роль обнаруженного региона в активации внутриклеточного сигналинга TLR [7]. Полученные регионы также могут отвечать за взаимодействие внутриклеточного домена с мембраной, тем самым влияя на функционирование рецептора [23].

Рисунок 3 - Известные структуры трансмембранных доменов TLR. Данные получены из PDB: TLR2 (PDB ID: 8AR0), TLR3 (PDB ID: 8AR1), TLR4 (PDB ID: 5NAM), TLR5 (PDB ID: 8AR2), TLR9 (PDB ID: 8AR3).

Хуже всего изучены внутриклеточные домены TLR. Опубликованные структуры TLR1/2/6/10tir были получены методом РСА [24, 25, 26] (Рис. 4). В случае TLR1 и 2 были получены кристаллы мономерных форм белка, а в случае TLR6 и 10 в виде димерных комплексов [24, 26], причем в случае TLR1 и TLR6 структуры стабилизированы ненативными дисульфидными связями, что может быть связано с недостаточным временем жизни хелатирующих агентов по сравнению со временем кристаллизации.

Изученные структуры внутриклеточных доменов схожи между собой: TIR-домен представляет собой структурированную глобулу, состоящую из 5 Р-тяжей, формирующих антипаралельный Р-лист, окруженный 5 а-спиралями. В пространственной структуре TLRtir особое место занимает BB-петля: считается, что она является участником передачи сигнала внутри клетки [27]. В силу своей гомологии с внутриклеточным доменом рецепторов IL (рецепторы интерлейкина, interleukin receptors), данный фрагмент имеет более распространенное название как TIR-домен (Toll/Interleukin 1 Receptor).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лушпа Владислав Александрович, 2024 год

/ - •

ю Е О-^ О-

О 2

СМ

ю см

1100 мкМ Т1_т . 1+100 мкМ Мп2*

ЯП-

• V- - ■ V* . 1.

. <

ю Е ^ о. о.

О 2 СМ 1Л

ю см

11 10 9 8 1Н, ррт

11 10 9 8 1Н, ррт

11 10 9 8 1Н, ррт

11 оо мкМ пт .. 1+юо мкМ со2;

».*

ю Е ^ о-о.

О

см т

1П

см

11 оо мкМ пт ..

1+100 мкМ Си2С

1 \ ■• X» *(<•, ¡ ■ « Е ' о.

Vе:.*.* ^ о.

О 2

■ см ю

• 1 * ш

■ см

11 10 9 8 1Н, ррт

11 10 9 8 1Н, ррт

11 оо мкМ пт •

1+100 мкМ Сс1^

" • А. * . 4 I

ю Е Ц о. ^ о.

О 2

см ю

ю см

1100 мкМ Т1_т |+100 мкМ гс\!*

*•»'•; Г*-» . ' •Т** .

. Г' I "

1

4

1

|+100 мкМ Со2*, |+100 мкМ Си2*

• ч.« .

ю Е ^ о. ^ о.

о 2 см ю

1П

см

11 10 9 8 1Н, ррт

|+100 мкМ СсП" 1+100 мкМ гп3'

ю Е г; о. ^ о.

о 2 см ю

ю см

г \ , . ю Е г; о. о.

-V - # 120 1514,

. ю см

* \

11 10 9 8 1Н, ррт 11 10 9 8 1Н, ррт 11 10 9 8 1Н, ррт Рисунок 39 - Наложение 1H,15N-HSQC спектров ЯМР до и после добавления ионов металлов в соотношении 1:1. В верхней части картинки представлены результаты для металлов, не взаимодействующих с TLR1тIR; в средней линии - металлы, приводящие к структурным изменениям по всем остаткам TLR1тIR; в нижней линии представлены металлы, приводящие к образованию новых форм рецептора. Для двух нижних строк также представлено наложение спектров для каждой пары металлов.

Для проверки гипотезы о замыкании SS-связи был проведен дополнительный эксперимент по окислению тиольных групп для последующего образования SS-мостика между остатками С667 и С686. Известно, что добавление GSH/GSSG (глутатион/глутатион дисульфид) приводит к образованию дисульфидных связей в белках [225]. При добавлении GSH/GSSG к образцу TLR1тIR также наблюдалось изменение в спектре образца, вызванное образованием внутримолекулярной дисульфидной связи (Рис. П11). Совпадение химических сдвигов в 1И-15К-HSQC спектрах TLR1тIR в присутствии Со2+/Си2+ и TLR1тIR с замкнутой дисульфидной связью,

полученной при добавлении GSH/GSSG показало, что кобальт и медь могут катализировать образование дисульфидной связи С667-С686 (Рис. 40) в присутствии восстановителя.

Рисунок 40 - Влияние ионов Zn2+ и Co2+ на формирование дисульфидной связи TLRItir. А

- наложение 1H,15N-HSQC спектров 100 мкМ TLRItir после обработки GSH/GSSG в течение ночи (синий цвет, цистеины замкнуты) и после добавления 50 мкМ ZnCh (красный цвет). Б -наложение 1H,15N-HSQC спектров 100 мкМ TLR1 tir после обработки GSH/GSSG в течение ночи (синий цвет, цистеины замкнуты) и после добавления 50 мкМ СоСЬ (красный цвет). Совпадение спектров приводит к заключению об образовании дисульфидной связи посредстсвом кобальта.

Можно было бы предположить, что связывание c Co2+/Cu2+ является

физиологически значимым при условии, что процесс образования дисульфидной связи происходит при физиологических концентрациях кобальта или меди. При этом механизм данного окисления остается неизвестным. Так, из литературных данных известно, что Си(П) катализирует окисление дисульфидов через окислительно-восстановительную реакцию, сопровождающуюся восстановлением меди до Си(1). Однако подобной реакции с Со(П) на данный момент не описано. Поэтому наиболее вероятным является вариант связывания металлов с которое приводит к образованию конформации белка, способствующей образованию

дисульфидной связи. Анализ данных ЯМР по титрованию Co2+/Cu2+ показывает, что

процесс окисления протекает в течение 1 -2 часов при добавлении эквимолярной концентрации соли металла к раствору белка. При этом связанное состояние TLR1тIR:Co2+/Cu2+ мало заселено: в спектре образца наблюдаются сигналы только от свободного состояния (с разомкнутой

связью) и от состояния с замкнутым дисульфидом. Это означает, что константы связывания Со2+ и Си2+ превышают 100 мкМ, иначе в спектрах наблюдались бы наравне с описанными

состояниями еще и сигналы комплекса с ионами Си/Со. В поставленных экспериментах

концентрация ионов металлов превышает на несколько порядков их концентрацию в цитоплазме клеток [67]. Таким образом, при физиологических концентрациях Си^/^^-связанные состояния TLR1тIR будут слабо представлены, а вызванное связыванием окисление будет протекать медленно с характерным временем, превышающим месяцы.

Рисунок 41 - 1H,15N-HSQC спектры 100 мкМ образца TLRItir при добавлении 0/50/100/200 мкМ ZnCl2.

К третьей группе металлов можно отнести Zn2+. При титровании ионами цинка наблюдалось образование новых форм белка, отличных от форм, полученных при добавлении ^2+ и Со2+ (Рис. 39-41). При увеличении отношения металл:белок более 1:1 в случае цинка наблюдалось уширение сигналов в спектрах, указывающие на образование олигомерных форм. В попытках улучшить качество спектров в ряд проверяемых металлов был добавлен Cd2+ в силу схожих с цинком координационных сфер [226]. Стоит отметить, что в случае титрования ионами Cd наблюдалось образование одной связанной формы, а в случае цинка - двух связанных форм белка. При этом увеличение концентраций кадмия в образце, как и в случае с ионами цинка,

приводило к олигомеризации и выпадению белка в осадок. Оказалось, что спектры титрования белка кадмием и цинком оказались одинаковыми по качеству: при добавлении данных металлов к белку происходило постепенное образование новых форм белка (появлялись дополнительные сигналы) и переход к олигомерному состоянию белка с уширением сигналов в спектрах ЯМР, в том числе за счет неспецифических взаимодействий. Учитывая токсичность данного металла и гораздо более низкие физиологические концентрации кадмия в цитоплазме клеток по сравнению с цинком [67], дальнейшее изучение роли связывания металлов было проведено для комплекса TLR1тIR:Zn2+.

Анализ спектров ЯМР показал, что связывание Zn2+ c TLR1тIR происходит в молярном соотношении 1:1 в соответствии с наклоном кривой изменения концентрации несвязанного белка (Рис. 42В). При этом в спектрах ЯМР наблюдается образование дополнительных двух наборов сигналов (обозначены как Zn1 и Zn2 (Рис. 42А), что наводит на мысль о существовании двух конкурирующих сайтов связывания ионов цинка. Однако, также возможно образование антипараллельного димера цитоплазматического домена TLR1 в присутствии ионов цинка. Таким образом, полученные данные могут быть интерпретированы следующими гипотезами:

1) наличие двух конкурирующих сайтов связывания;

2) образование олигомерной фракции белка;

3) образование ассиметричного гомодимера при связывании иона цинка.

Для анализа полученных гипотез были проведены эксперименты по определению гидродинамического радиуса комплекса Zn2+/TLR1тIR с помощью ДРС и ЯМР-релаксации (Рис. 42Г, Рис. П12). В отсутствие ионов цинка белок остается в мономерной форме при концентрациях до 100 мкМ. Гидродинамические радиусы TLR1 определяются с помощью ЯМР-релаксации и ДРС в диапазоне 2-2,2 нм, что соответствует глобулярному белку с массой 16-19 кДа (масса тЬЮтж составляет 19,2 кДа). Согласно ДРС, гидродинамический радиус TLR1тIR соответствует мономерной форме белка до эквимолярной концентрации цинка в растворе (Рис. 42Г). Однако при трехкратном избытке цинка средний гидродинамический радиус возрастал до 3,78 ± 0,05 нм (~94 кДа, что соответствует пентамеру белка). Данные ДРС согласуются с данными, полученными ЯМР: при избытке цинка по отношению к белку в спектре исчезают сигналы образца. С помощью экспериментов по измерению кросс-корелированной релаксации были рассчитаны времена корреляции вращательной диффузии в смеси TLR1/Zn 1:1: Тс варьируется в диапазоне 8,6-10,1 нс для двух наблюдаемых цинк-связанных состояний. Экспериментальные значения Тс сравнивали со значением, полученным с помощью программного обеспечения hydroNMR [218]. Молекулярный вес белка в присутствии цинка находится в диапазоне 18-22 кДа, что соответствует мономерной форме белка. Отсюда можно сделать вывод, что белок находится в мономерной форме до концентрации TLR1тIR/Zn 1:1 и олигомеризуется при избытке ионов

цинка. При этом Zn1 и Zn2 формы белка соответствуют мономерному состоянию молекулы. Согласно спектрам ЯМР по титрованию белка металлом, вся интенсивность начального кросс-пика TLR1тIR равномерно распределена между связанными состояниями, состояния с двумя связанными ионами цинка не обнаружено. Таким образом, два наблюдаемых состояния комплекса TLR1тIR соответствуют альтернативным способам или конкурирующим сайтам связывания белка.

6.2. Определение константы диссоциации комплекса TLR1TIR/Zn2+

Примечательно, что связывание Zn2+ и TLR1тIR носит обратимый характер: исходное состояние белка полностью восстанавливается при добавлении хелатирующего агента, такого как ЭДТА (этилендиаминтетраацетат). Основываясь на этих данных, был проведен анализ конкурентного связывания цинка между TLR1тIR и хелатирующими агентами. Был выбран набор хелатирующих агентов, для которых известна константа диссоциации с цинком. Спускаясь от более сильного хелатирующего агента к слабому, можно выявить конкуренцию между агентом и белком. Так было выявлено, что TLR1 не конкурирует с ЭДТА (рка = 13,6), но конкурирует с ЭГТА (эгтазовой кислотой) (рка = 9,2) [203]. Это позволило определить константу диссоциации комплекса TLR1тIR/Zn2+, которая составила 4,5 ± 0,5 нМ (Рис. 42Б). Известно, что концентрация свободного цинка в клетках может достигать 10-100 пМ в цитоплазме, однако общая концентрация цинка в клетке превышает 1 мМ [67]. В связи с этим различные белки конкурируют за Zn2+ как между собой, так и с низкомолекулярными соединениями, например цитрат, цистеин и глутатион [203]. Полученная константа диссоциации соответствует константам стабильности комплексов нескольких белков с мотивом "цинковые пальцы" с Zn2+ [227], что позволяет предположить, что связывание TLR1тIR с Zn имеет физиологический смысл. Примечательно, что Zn является вторичным мессенджером, участвующим в активности многих цитоплазматических белков [228]. Так, известно, что активация TLR4 зависит от концентрации свободных ионов Zn2+, хотя не известно о прямом взаимодействии с ионами цинка [138, 229, 230].

Таким образом, только ионы цинка связываются TLR1тIR специфически, обратимо и с наномолярной аффинностью, что соответствует физиологическому содержанию ионов цинка в клеточной цитоплазме.

50 100 300 Zrï", мкМ Zn2*, мкМ

Рисунок 42 - Взаимодействие TLRItir c ионами цинка. А - фрагменты спектров 1H,15N-HSQC

TLR1tir. Спектры регистрировали после добавления 0, 30, 60 и 90 мкМ ZnCh к 100 мкМ образцу

TLR1tir при 35°С и рН 7,4. Показаны сигналы индола NH W769 (синий) и два набора сигналов в

присутствии ионов металлов (зеленый и красный, обозначенные как Zn1 и Zn2). Б - результат

анализа конкурентного связывания цинка TLRItir и ЭГТА. Сплошные линии представляют

теоретические зависимости, предсказанные для концентрации несвязанного с Zn состояния

TLR1tir в зависимости от log(kd) при соответствующей концентрации ЭГТА. Пунктирные линии

представляют измеренную концентрацию не содержащего Zn TLRItir. Синяя область обозначает

пересечение пунктирной и сплошной линий и соответствует измеренному диапазону kd. Образец

содержал 100 мкМ TLRItir и 50 мкМ ZnCh. В - Концентрации Zn-несвязанного TLRItir (апо) и

двух Zn-связанных состояний (Zn1, Zn2) в зависимости от концентрации ZnCh в растворе.

Пунктирная линия представляет функцию y = 100- x, ожидаемую для связывания 1:1. Г -

гидродинамические радиусы TLR1tir, измеренные методом ДРС при концентрации 100 мкМ при

различных концентрациях ZnCh. Приведены p-значения согласно критерию Манна-Уитни.

Столбики погрешностей представляют стандартное отклонение.

6.3. Роль цистеинов при связывании ионов цинка с TLRItir

Низкое качество ЯМР-спектров в присутствии металла, а также неспособность цинк-связанной формы белка к кристаллизации не позволили локализовать сайт связывания TLRtir с цинком. В качестве альтернативы ЯМР было предложено использование метода рентгеноструктурной кристаллографии. Нашими коллегами из МФТИ были предприняты попытки кристаллизовать комплекс TLR1tir/Zü2+. Наилучшая дифракционная картина имела разрешение до 1,9 Â. Оказалось, что полученные кристаллы не имели в составе ионов цинка и наоборот, обладали окисленными остатками цистеина, как и кристаллическая структура TLRItir, полученная в отсутствие цинка. Это может быть связано со временем полужизни TCEP, равным 12-24 часам [231], когда кристалл выращивают в течение нескольких месяцев.

В силу невозможности определения сайта связывания иона цинка с молекулой TLRItir прямыми методами, было предложено провести анализ посредством точечного мутагенеза по цистеинам с заменой на аланины. Были синтезированы варианты C667A, C686A и C713A. Точечные мутанты титровали ионами цинка по той же схеме, что и дикий тип белка TLRItir. Для всех мутантов наблюдалось сохранение положения характерных кросс-пиков ЯМР (Рис. 43 и Рис. П13). По полученным данным мутация С707А не влияет на связывание цинка, а С667А полностью ингибирует связывание (Рис. 43). В случае замены С686А взаимодействие сохраняется. Однако наблюдается только одно связанное с цинком состояние вместо двух, как это было до введения мутации (Рис. 43). Таким образом, С667А является ключевым остатком, ответственным за координирование иона цинка и принимающим участие в обоих способах связывания цинка, что объясняет наблюдаемую конкуренцию между двумя модами связывания. При этом остаток С686 участвует в одном способе связывания, что может быть использовано при проведении структурных исследований взаимодействия цинка с TLRItir.

Рисунок 43 - Титрование ионами цинка точечных мутантов TLR1тIR. А - 1И-15К-И80С спектры TLR1тIR дикого типа и трех цистеиновых мутантов, записанных для 100 мкМ TLR1тIR при 30°С, рН 7,4 в присутствии 50 мкМ ZnCl2. Сигналы боковых цепей триптофана, использовавшихся для анализа, выделены пунктиром и представлены в левом углу каждого спектра в большем размере. Б - Фрагмент наложения спектров 1H-15N-HSQC (области с сигналом индола W769 МН) TLR1тIR и его мутантов С707А, С686А и С667А. Спектры регистрировали до (синий) и после (красный) добавления 50 мкМ ZnCl2 к 100 мкМ образцу TLR1тIR при 30°С и рН 7,4. Сигналы, соответствующие состоянию без Zn2+ и двум состояниям, связанным с Zn, TLR1тIR, обозначены как апо, Zn1 и Zn2 соответственно.

Для нахождения других остатков, координирующих цинк в составе комплекса, коллегами было проведено компьютерное моделирование. Поскольку ВВ-петля остается гибкой и ее конформации могут быть плохо изучены с помощью ЯМР, сначала был сгенерирован набор состояний ВВ-петли с помощью ROSETTA и проведен поиск потенциальных боковых цепей тЬЮтш, способных связываться с ионами цинка. В результате удалось выявить только боковую цепь Н669 в качестве возможного координатора ионов цинка. В качестве следующего шага был произведен расчет нескольких моделей с помощью молекулярной динамики с использованием силового поля, оптимизированного для изучения взаимодействий между цинком и молекулой белка [232]. Изначально цинк помещали вблизи атома серы С667 и анализировали полученную модель комплекса. Такая процедура обеспечила два различных режима связывания цинка, что коррелирует с экспериментальными данными ЯМР. Первый способ осуществляется через классический ССН-связывающий мотив [39], образованный С667, С686 и Н669 (Рис. 44). Этот режим предположительно соответствует состоянию Zn1, которое зависит от боковой цепи С686. Второй способ координации иона цинка включает в себя тиольную группу С667, карбонилы основной цепи L668 и/или R671 и кислород молекулы воды, который дополнительно стабилизирован водородными связями с основной цепью карбонилов других остатков петли (Рис. 44). Такая мода связывания скорее всего соответствует состоянию Zn2 в спектрах ЯМР. При этом оба способа координации цинка соответствуют различным конформациях ВВ-петли (Рис. 44). Первый режим обеспечивает "растянутую" конформацию петли, тогда как во втором состоянии она "компактная", и ее структура дополнительно стабилизирована водородной связью между боковой цепью R671 и основной цепью 1666. Помимо структуры, связывание цинка влияет на динамику ВВ-петли. Хотя среднеквадратичные отклонения атомных координат остаются неизменными для большей части TLR1тIR после связывания цинка, rmsd падает для нескольких остатков петли ВВ (Рис. П10). Более того, связывание Zn сужает общий конформационный ландшафт (количество возможных состояний) петли ВВ.

Рисунок 44 - Моделирование образования комплекса TLR1тIR с Zn2+. А - Модель Zn1 координации иона цинка, сформированного С667-Н669-С686. Б - крупный план координационной сферы для первого цинк-связанного состояния. В - сравнение двух конформаций ВВ-петли с "нативной" конформацией ВВ-петли в гомодимере TLR10тIR. Г -Модель координации Zn2, образованная С667 и кислородом 1668. Дополнительные координационные элементы представлены атомами кислорода R671 и воды, также координируемыми кислородами основной цепи остатков ВВ-петли. Д - крупный план координационной сферы второго режима связывания.

6.4. Роль остатка С667 TLR1TIR в функционировании рецептора

Для дальнейшего изучения физиологической роли образования комплекса цинка и TLR1тIR коллегами были проведены несколько функциональных тестов по методике, описанной в разделе "функциональное тестирование TLR1тIR. В первой серии экспериментов проводился анализ влияния концентрации ионов цинка на активацию рецептора, как при увеличении концентрации 2п2+ снаружи клеток, так и при ее уменьшении внутри. Снижение концентрации ионов цинка достигалось добавлением мембранопроницаемого цинк-хелатирующего агента К, К, К', №-тетракис(2-пиридинилметил)-1,2-этандиамин (ТРЕ^). Активность №^кВ контролировали при помощи SEAP. Результаты исследования показаны на Рис. 45А и Б. Было выявлено, что изменение концентрации ионов цинка снаружи клетки приводит к снижению активности рецептора TLR1-TLR2. Однако, стоит отметить, что увеличение концентрации ионов цинка

снаружи клетки приводит и к увеличению его концентрации и внутри клетки за счет ионного транспорта цинка (см. раздел 1.2.5). При добавлении ТРЕК вследствие его свойств посредством пассивной диффузии и/или градиенту концентрации попадает внутрь клетки, где связывает ионы цинка, тем самым снижая его концентрацию внутри клетки. Оказалось, что его добавление приводит к снижению активности рецептора TLR1-TLR2 (Рис. 45Б). Таким образом, цинк является важным фактором активности рецептора TLR1-TLR2, однако значимость

непосредственно образования экспериментом.

комплекса TLR1uR/Zn2+ не подтверждается данным

Рисунок 45 - Роль связывания цинка с TLR1 в активации рецептора. А, Б - активность NF-кВ, измеренная при стимуляции клеток HEK Blue 293, трансфицированных генами TLR1 и TLR2, с помощью Pam3CSK4 с добавлением в культуру либо 0-100 мкМ ZnCl2, либо 0-20 мкМ TPEN (число независимых экспериментов = 4). В - Активность NF-кВ, измеренная для мутантов TLR1 при стимуляции Pam3CSK4 (число независимых экспериментов = 3). Статистическая значимость указана следующим образом: * : p<0,05, ** : p < 0,01, *** : p < 0,001 и **** : p< 0,0001 по отношению к положительному контролю, # : p<0,05 и #### : p <0,0001 по отношению к экспериментам с отрицательным контролем. н означает, что изменения по отношению к

положительному контролю не являются значительными. Столбики погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.

Для подтверждения важности связывания ионов цинка непосредственно с TIR доменом TLR1 была проанализирована активность нескольких точечных аланиновых мутантов по остаткам, способным потенциально координировать ионы металлов: в области потенциального сайта посадки цинка на поверхности TLRItir и в области BB-петли (Рис. 45В). Из семи проанализированных мутантов только С667А приводил к потере лиганд-индуцированной активности рецептора TLR1-TLR2, когда остальные мутации не приводили к статистически значимым изменениям. Следует отметить, что мутация С667А практически синонимична с точки зрения гидрофобности боковой цепи [233], а боковая цепь С667 не участвует во внутримолекулярных водородных связях или других стабилизирующих взаимодействиях, за исключением контакта ароматического тиола с кольцом F637. Изменения, вызванные мутацией С667А, в спектрах ЯМР TLRItir менее выражены, чем вызванные С686А (Рис. 46) и расположены более компактно в пространственной структуре белка. Иными словами, замена С667А не влияет на пространственную структуру белка, вследствие чего наблюдаемый эффект не может быть вызван неправильной укладкой TLRItir. Эффект, вызванный мутацией С667А также вряд ли может быть вызван какой-либо окислительно-восстановительной реакцией в клетке, важной для активации рецептора. Известно, что среда цитоплазмы клеток восстановительная, и ранее не сообщалось о возможных ОВР в активации TLR. При этом только 15% площади С667 доступно растворителю в ЯМР-структуре TLRItir, что говорит о недоступности остатка для межмолекулярного взаимодействия. Таким образом, мутация С667А не влияет на структуру домена и характер взаимодействия с TLR2 и другими адаптерными белками. Полученные данные позволяют предположить, что С667 является ключевым остатком для функционирования рецептора TLR1-TLR2, и образование комплекса с цинком должно соответствовать функционально активной конформации рецептора.

6.5. Изучение цинк-связывающей активности TLR2tir

Результаты, полученные для TLR1тIR позволяют предположить, что взаимодействие с цинком может быть актуально и для так как данные рецепторы высокогомологичны и в

активной форме образуют функциональный гетеродимер. Поэтому было принято решение изучить взаимодействие с ионами цинка. Отправной точкой стало титрование

ионами цинка (Рис. 47). В процессе титрования по спектрам ЯМР наблюдалось уменьшение

интенсивности сигналов в спектрах 1H,15К-HSQC и образование осадка. По уменьшению интенсивности сигналов в спектрах при титровании удалось выяснить, что константа связывания дикого типа <10 мкМ. При добавлении сильного хелатирующего агента, например,

ЭДТА, наблюдалось частичное восстановление интенсивности сигналов в спектре (Рис. 47). Полученные результаты могут быть объяснены образованием олигомеров белка при связывании цинка с молекулами ^Я2тт. Дополнительные эксперименты по титрованию смеси 15М-меченого TLR1тIR и немеченого TLR2тIR ионами цинка, а также данные о константе связывания с

2и2+ позволили оценить константу связывания цинка с на уровне 20 ± 10 нМ (Рис. П14)

путем решения системы уравнений (раздел 2.3.2). Анализ аминокислотной последовательности белка и пространственной структуры выявили наличие 4-х цистеинов, которые могут потенциально взаимодействовать с ионами цинка.

Д>0.05 ррт □ Д< 0.02 ррт или нет данных

0.02 ррт < Д < 0.05 ррт Ц мутированный цистеин

Рисунок 46 - Изменение химических сдвигов мутантов TLR1тIR по сравнению с диким

типом белка в спектрах ЯМР. А - изменение химических сдвигов при внесении мутации

С667А, Б - С686А и В - С707А.

Для проверки гипотезы о влиянии цистеинов на связывание с Zn2+ было проведено титрование мутанта по всем цистеинам (4xCYS) (Рис. 47). Оказалось, что при введении

мутаций по всем цистеинам происходит практически полное ингибирование образования комплекса 4xCYS-Zn2+: константа диссоциации уменьшается до 150 ± 11 мкМ. При этом

не наблюдалось сильного спада концентрации белка в сравнении с (за счет осаждения

молекул). Снижение концентрации белка при титровании 4xCYS может свидетельствовать о наличии других а.о., вовлеченных в сайт связывания с цинком. Анализ пространственной структуры показывает наличие многочисленных аминокислотных остатков, которые

потенциально могут связывать ионы цинка (Рис. 48). Таким образом, цистеины в последовательности также отвечают за связывание цинка, как и в случае

Рисунок 47 - Взаимодействие TLR2тIR и его мутантов с ZnCh. Представлены кривые титрования для TLR2тIR С640А (А), С673А (Б), С713А (В), С750А (Г), дикого типа белка (Д) и мутанта по всем цистеинам - 4xCYS (Е). Ж - наложение фрагментов 1H,15N-HSQC спектров ЯМР TLR2тIR и его мутантов в области индольных КНз-групп триптофанов.

] Cys Щ His, Asp Q Glu, Туг, Arg, Ser, Lys, Thr Рисунок 48 - Возможные области взаимодействия Zn2+ с поверхностью TLR2tir. Указаны аминокислотные остатки, наиболее часто встречаемые в координационных сферах Zn2+ [234]. На пространственной структуре TLR2tir в желтый цвет окрашены аминокислтные остатки, соответствующие цистеинам, в красный - гистидинам и аспартатам, в светло-коричневый -глютаминовым кислотам, лизинам, тирозинам, серинам, треонинам и аргининам.

Для того, чтобы выявить, какие именно цистеины отвечают за связывание ионов цинка, были проведены эксперименты по титрованию ZnCl2 точечных аланиновых мутантов TLR2tir (Рис. 47). В процессе титрования, как и в случае TLR2tir WT наблюдалось образование опалесцирующего раствора с последующим выпадением осадка и уменьшением интенсивности сигналов для всех рассматриваемых конструкций TLR2tir. Для всех одноточечных мутантов в спектрах ЯMР не наблюдалось значимых изменений в спектрах по сравнению со спектром TLR2tir WT, что может свидетельствовать об отсутствии значимых изменений в структуре белка. При этом константы образования комплекса белок-Zn^, рассчитанные данным методом для точечных мутантов TLR2tir, оказываются ниже 10 мкM. Однако точная оценка констант не определяется в рамках эксперимента в силу высокой минимальной концентрации белка, которую необходимо поддерживать для регистрации спектров ЯMР. Также невозможен подход расчета константы методом, используемым в случае TLR1tir, в силу отсутствия сигналов связанной формы белка и более быстрым выпадением белка в осадок.

Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что предложенная методика позволяет только оценить сверху значения констант диссоциации мутантов TLR2tir с цинком. При этом более точная оценка для TLR2tir в экспериментах по конкурентному связыванию ионов цинка между TLR1tir и TLR2tir дает значения в нM диапазоне. Дополнительно выявлено, что TLR2tir агрегирует при добавлении цинка. Возможным решением является использование хелатора с подобной TLR1tir константой связывания: такая система белок-хелатирующий агент может находится в динамическом равновесии, что не будет приводить к существенному

выпадению белка в осадок. Поэтому был предложен эксперимент по титрованию эквимолярной смеси + NTA (170-200 мкМ) ионами цинка (Рис. 49). В случае КТЛ константа

диссоциации к= 4.4 нМ, что совпадает с константой для [203]. При использовании

хелатора вместо в экспериментах по конкурентному связыванию ионов цинка

упрощается постановка эксперимента. Во-первых, нет необходимости готовить белковые образцы что также занимает не только ресурсы на продукцию и очистку белка, но и

время. Во-вторых, в случае наблюдается связывание по двум сайтам связывания, а в

случае КТЛ - по одному. Отсюда упрощается система уравнений для поиска константы образования комплекса белок-металл (раздел 2.3.2). В-третьих, в качестве дополнительного контроля можно использовать 1Н спектры: при использовании хелатора можно наблюдать появление сигнала связанного КТЛ в регионе 3,62 ррт (Рис. 50А). В случае использования TLR1тIR разделить сигналы связанного от невозможно, так как сигналы от КН-

групп аминокислот и СН3-групп рассматриваемых белков находятся в одинаковых областях.

Апробацию метода по конкурентному связыванию ионов цинка в присутствии КТЛ провели на (Рис. 50Б). Измерение константы диссоциации показало схожие результаты

с данными, полученными ранее другим способом, и составили 5 ± 2 нМ против 4,5 ± 0,5 нМ. Так как метод показал схожие результаты, он был применен в случае WT и 4xCYS (Рис. 50Б).

Оказалось, что kd TLR2тIR = 6 ± 1 нМ, а в случае 4xCYS kd = 150 ± 10 мкМ. Таким образом, константа диссоциации оказалась близкой по значению к константе, ранее полученной

для а kd 4xCYS совпала с полученным ранее значением при титровании образца без

добавления хелатора. Данные значения констант подтверждают важную роль цистеинов в связывании ионов цинка. Поэтому далее были проведены эксперименты по титрованию одноточечных мутантов TLR2тIR в присутствии КТА (Рис. 49). Анализ полученных данных с учетом поправок на агрегацию белка со временем позволил существенно уточнить полученные ранее константы диссоциации. В случае мутации С640Л константа диссоциации составила 48 ± 4 нМ, для C673A - kd = 12 ± 1 нМ, в случае мутации С713 - kd = 11 ± 2 нМ и С750Л - kd

= 81 ±18 нМ (Рис. 49, 50). Все полученные значения констант оказались в наномолярном диапазоне, что соответствует физиологическим содержаниям цинка в клетке [67]. При этом наибольшее статистическое отличие от kd WT TLR2тIR наблюдалось для мутантов С640А и С750А.

апо "ШЧ2Т|К--разбавление Т1_Рг2Т|В-аро ЫТА

WT С640А

-- разбавление ЫТА С673А

200 150

< 100 ■

2 50

•I,

I

ч1-

I

ч{

ч

"к.

-к

50 100 150 [2п],мкМ

С713А

50 100 150 Рп],мкМ

С6750А

50 100 150 200 [гп],мкМ

С640/750А

200

150 ■

< 100

2 50

............

ч X n -, 1 ч ч \ ч \ \ 1 ч \ \ ч ч\ ч ч , VI

200

150 ■

50 100 150 [2п],мкМ

С640/673А

50 100 150 [7п],мкМ

С673/713А

50 100 150 200 [2п],мкМ

С713/750А

< 100 ■

2 50

50 100 150 [гп],мкМ

50 100 150 рп],мкМ

50 100 150 200 [гп],мкМ

4хСУЭ

200 Рп],мкМ

Рисунок 49 - Титрование TLR2тIR и его мутантов Zn2+ в присутствии NTA. На основании полученных данных рассчитана кривая титрования и определена константа образования комплекса

О0 О? О" О4

Рисунок 50 - Определение ка TLR2тIR:Zn2+. A - Фрагменты суперпозиции 1Н спектров ЯМР TLR2тIR WT. Представлены участки спектров, которые изменяются при титровании Zn2+: ЫЫН-сигналы ^Ят и сигнал комплекса NTЛ:Zn2+. Б - полученные значения констант взаимодействия различных вариантов с ионами цинка. Столбики ошибок обозначают

стандартные отклонения. Статистический анализ проводился на основе расчета ^статистики с дальнейшим определением р-значений (* - 0,05<р<0,01, ** - 0,01<р<0,001, *** - 0,001<р<0,0001, **** - р<0,0001; нс означает, что изменение не является статистически значимым по сравнению с WT). В - Пространственная структура [25]. Цистеины выделены красным

цветом. На снимке увеличены участки парного расположения цистеинов.

Полученные данные не позволяют однозначно ответить на вопрос, какие из цистеинов TLR2тIR важны для связывания ионов цинка, так как ни одна из введенных точечных мутаций не ингибировала полностью взаимодействие с ионами цинка. Поэтому следующим этапом было

проведение аналогичных экспериментов с двойными мутантами по остаткам цистеина. Выбор мутантов основывался на полученных данных по титрованию одноточечных мутантов и пространственной архитектуре белка. Во-первых, мутации по 640 и 750 цистеинам приводили к наибольшему снижению аффинности белка к металлу, в то время как пара С673 и С713 приводила к незначительным изменениям значения константы связывания цинка. Во-вторых, из анализа пространственной структуры цитоплазматического домена можно выделить пространственно сближенные пары цистеинов: С640 и С673, С713 и С750 (Рис. 51). Данные пары образуют конформации, похожие на функционально значимую пару С667-С686 в Таким

образом, дальнейшие эксперименты были проведены со следующими мутантами ^Я2тт: С640/750Л, С640/673Л, С673/713Л и С713/750Л (Рис. 49, 50).

Рисунок 51 - Положение цистеинов и их окружение в TLR2tir. Показаны боковые цепи аминокислот, обычно участвующих в образовании координационных сфер Zn2+. Красным цветом представлены цистеины, желтым - остатки His и Asp. Пространственная структура взята из статьи [25] (ID PDB: 1FYW).

Оказалось, что мутация С640/750А приводит к значительному снижению аффинности белка к ионам цинка по сравнению с аналогичными точечными вариантами (Рис 48Б). При этом мутация по пространственно сближенной паре цистеинов С640 и С673 приводила к снижению константы диссоциации по сравнению с С640А. В случае второй пары сближенных цистеинов, С713 и С750, замена на аланины не приводила к статистически значимым изменениям по сравнению с С750А. Стоит отметить, что в случае С640/С673 наблюдалось значительное выпадение в осадок белка при титровании цинком. Повышенное выпадение в осадок может служить доказательством снижения стабильности полученного варианта TLR2tir и искажать результаты измерения. При этом только в случае мутанта C640/C673A наблюдалось образование порядка десяти новых сигналов (—10-15% от сигналов в спектре, Рис. П15-П24), что может говорить о локальной перестройке структуры белка. В силу приведенных фактов, мутация C640/C673A была исключена из дальнейшего рассмотрения.

Обобщая полученные данные, можно заключить, что все цистеины важны для связывания ионов цинка: мутации по С673 и С713 в последовательности белка приводили к статистически значимым изменениям константы связывания белка с ионами металлов по сравнению с нативным а в случае мутаций С640А или С750Л наблюдалось значительное снижение константы диссоциации. При этом введение двойной мутации по 640 и 750 остаткам приводило к еще большему снижению связывания с ионами цинка. Полученные данные по связыванию ионов цинка и тот факт, что данные остатки находятся на противоположных сторонах молекулы, приводят к гипотезе наличия сайта связывания, образованного С640 и С750. При этом цинк выступает в качестве связующего агента между молекулами белка, приводя к олигомеризации 1ЪК2та.

Моделирование взаимодействия белка с ионами цинка с помощью AlfaFold 3 показало существование двух основных мест связывания цинка, включающих С640 и С750 (Рис. 52). Один из них основан С640 и Н696 - остатками одной молекулы белка, когда второй использует С750 одной молекулы и Н721 второй молекулы, вызывая олигомеризацию рецептора с последующим выпадением в осадок. Однако, результаты моделирования, полученные с помощью AlfaFold 3 не могут служить достоверным объяснением наблюдаемых результатов. Это может быть связано с низкой достоверностью предсказания связывания ионов цинка сложными системами, которые не похожи на цинковые пальцы, широко представленные в базе данных PDB, которая используется для обучения алгоритма.

Рисунок 52 - Моделирование сайта связывания ионов цинка TLR2tir. А - моделирование связывания цинка при мономерной форме TLR2tir. Б - модель комплекса антипараллельного димера TLR2tir с ионами цинка. Красным цветом окрашены цистеины, желтым - остатки His, Asp и Arg. Предсказание выполнено с помощью AlpfaFold 3 [219].

А

6.6. Роль цистеинов в активации TLR2

Аналогично TLRItir, для подтверждения роли связывания ионов цинка были проведены функциональные исследования активности одноточечных аланиновых мутантов по цистеинам для TLR2tir (Рис. 53). Так как TLR2 при активации димеризуется с TLR1 и TLR6, эксперименты были проведены на клетках HEK Blue 293, экспрессирующих рецепторы TLR1 и TLR2 в первом случае и TLR2 и TLR6 во втором случае. Активность NF-kB контролировали с помощью системы анализа репортерного гена секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы Phospha-Light (SEAP) после стимуляции рецептора его специфическим лигандом: Pam3CSK4 в случае TLR1-TLR2 и Pam2CSK4 в случае TLR2-TLR6. Оказалось, что для описанных рецепторных комплексов наблюдаются схожие результаты. С одной стороны, введение мутаций С640А и С750А не приводило к значимым снижениям активности рецептора, в то время как мутации по 673 и 713 цистеинам приводят к статистически достоверному снижению уровня активности рецептора по NF-kB зависимому пути (Рис. 53). При этом мутация С713А приводит к полному ингибированию работы рецептора, в то время как мутация по С673А приводит только к снижению его активности.

вектор Т1-К1/2 С640А С673А С713А С750А вектор Т1_К2/6 С640А С673А С713А С750А

Рисунок 53 - Роль цистеинов в активации TLR2. А - роль цистеинов ТЬК2 в активации TLR2. Б - влияние мутаций TLR2 на активацию рецептора Активность КР-кВ

измерена для мутантов при стимуляции Pam3CSK4/Pam2CSK4 (п = 4 независимых

эксперимента). Статистическая значимость указывается следующим образом: * - р<0,05, ** -р <0,01, *** - р <0,001 и **** - р <0,0001 по отношению к положительному контролю, ### -р <0,001, #### - р <0,0001 по отношению к экспериментам с отрицательным контролем. м означает, что изменения относительно положительного контроля несущественны. Столбики ошибок представляют собой стандартную ошибку среднего значения.

Поскольку мутации по С640 и С750 не оказывают ингибирующего эффекта на активность рецептора по КР-кВ пути, но снижают связывание с Zn2+, можно предположить, что

данное связывание может использоваться для других процессов. Известно, что добавление цинка

подавляет воспаление [235, 236, 237, 238, 239]. Таким образом, связывание ионов цинка с остатками С640 и С750 может являться вариантом контроля сигнальных путей ГЬЯ.

6.7. Итоги Главы 6

Результаты, полученные в Главе 6 указывают на особую роль ионов Zn2+ в функционировании рецептора ГЬЯ1-ГЬЯ2: изменение его концентрации приводит к ингибированию активности К-кВ.

Для ГЬЯ1т выявлены и локализованы сайты связывания цинка, причем один из них имеет функциональную значимость - при введении мутации по остатку С667 наблюдалась полная потеря способности связывать ионы цинка и нарушение активации иммунного ответа, опосредованного димером ГЬЯ1-ГЬЯ2.

Результаты мутагенеза ГЬЯ1тж также могут быть использованы для дальнейших структурных исследований методами РСА - мутация по С686 остатку приводит к образованию только одной связанной формы белка.

Для ГЬЯ2т выявлено обратимое связывание с ионами цинка. Показана важная роль остатков С673 и С713 на активацию рецептора: при введении мутаций по данным остаткам происходит статистически значимое снижение константы диссоциации ТГЯ2тж^п2+. При этом мутации по остаткам С640 и С750 приводят к более значимым изменениям константы диссоциации. Помимо этого, выявлено связывание ГЬЯ2т с ионами цинка в отсутствии цистеинов, что наводит на гипотезу о существовании независимого от цистеинов сайта связывания Zn2+.

В случае ГЬЯ2 была показана функциональная значимость С673 и С713. Мутации по данным цистеинам приводят к статистически достоверному снижению уровня активности рецептора по К№-кВ зависимому пути в случае сигналинга ГЬЯ1-ГЬЯ2 и ГЬЯ2-ГЬК.6.

Заключение

В данной работе усовершенствованы и применены различные методики исследования водорастворимых белков, начиная от клеточной продукции и заканчивая структурными методами исследования.

Во-первых, был проведен широкомасштабный скрининг условий продукции для TLR1тIR. На основе полученных данных была разработана методика оптимизации гетерологической продукции белков, основанная на принципах рационального дизайна с использованием трехпараметрической модели. Методика была успешно применена для остальных цитоплазматических доменов семейства TLR. В качестве оптимизируемых параметров выступали концентрация индуктора, время и температура послеиндукционной культивации белков. При необходимости методика позволяет увеличить количество исследуемых параметров. Применение предложенного подхода позволяет значительно сэкономить время на проведение исследований.

С помощью методов рационального дизайна для TLR1/2/3/7тIR удалось достигнуть высоких выходов целевых белков в растворимой форме. Для белков с низкими уровнями экспрессии проведены исследования по оптимизации выходов с использованием белка-партнера МВР-. С их помощью удалось получить значительные выходы в растворимой форме для TLR3/5/7/8тIR.

На основе полученных данных по экспрессии были проведены работы по разработке протоколов очистки TLR1-10тIR. Для TLR1/2/3/5/7тIR были получены очищенные белковые образцы, позволяющие проводить последующие исследования. По данным КД-спектрометрии TLR1/2/3/7тIR обладают правильной укладкой белка, а для TLR1/2/3тIR получены тестовые спектры ЯМР, что говорит о возможности их изучения данным методом.

В рамках работы была определена структура TLR1тIR в растворе. Выявлены существенные отличия от структуры белка, полученной методами РСА, в области ВВ-петли и Е-спирали, что связано с размыканием дисульфидной связи между остатками С667 и С686. Образование ненативной SS-связи в кристаллической структуре связано скорее всего с продолжительным временем кристаллизации образца и малым временем жизни хелатирующего агента. В цитоплазме клетки, в которой находится TLRтIR, всегда поддерживается определенный уровень концентрации глутатиона, ингибирующего образование SS-связей. Взаимное расположение цистеинов в молекуле TLR1тIR предполагает возможность существования сайта связывания ионов металлов, необходимых для активации рецепторов.

Проверка металл-связывающей активности TLR1тIR выявила существование комплекса только с Zn2+: для остальных металлов наблюдалось или отсутствие взаимодействия (№2+, Бе2+, Мп2+), или металл-опосредованное окисление цистеинов с образованием SS-связи между остатками С667 и С686 (Со2+, Си2+). Образование комплекса TLR1тIR:Zn + оказалось обратимым

с константой диссоциации порядка 4,5 нМ, что соответствует физиологическим концентрациям цинка в цитоплазме клеток. Было показано, что функционирование рецептора зависит от концентрации ионов цинка. Методами точечного мутагенеза и компьютерного моделирования были выявлены два конкурирующих сайта связывания цинка, причем остаток С667 участвовал в обоих режимах связывания иона. Функциональные тесты показали ключевую роль остатка С667 в функционировании рецептора TLR1-TLR2. Мутация в указанном положении приводила к полному ингибированию активности рецептора.

Так как активная форма рецептора является гетеродимером TLR1-TLR2, были проведены исследования цинк-связывающей активности TLR2тIR. Было выявлено образование комплекса TLR2тIR:Zn2+ с наномолярной константой связывания, причем важную роль в активации рецептора также играют цистеины. При введении мутаций по цистеинам наблюдалось статистически значимое снижение аффинности цинка к белку. Также была показана функциональная значимость С673 и С713. Мутации по данным цистеинам приводят к статистически достоверному снижению уровня активности рецептора по ]МГ-кВ зависимому пути в случае сигналинга TLR1-TLR2 и TLR2-TLR6.

Предложенные и использованные в данной работе методики могут расширить возможности для изучения водорастворимых белков на первых этапах работ по получению их образцов для дальнейших структурных исследований. Полученные структурные данные дополняют имеющуюся информацию о функционировании TLR и механизме их возможной активации. Результаты данной работы могут быть применены в последующих исследованиях активации TLR и помочь в поиске терапии многих заболеваний, связанных с функционированием толл-подобных рецепторов.

Выводы

1. Разработана методика трехпараметрической оптимизации гетерологической продукции белков на основе принципов рационального дизайна на примере TLR1-10tir. Получены оптимальные уровни экспрессии TLR1/2/3/7tir в растворимой форме. Для объектов с низкими выходами получены оптимальные выходы в конструкции с MBP-тагом. На основе полученных данных были разработаны системы очистки для TLR1/2/3/5/7/8tir, для 4-х из которых удалось получить образцы, пригодные для дальнейших структурных исследований;

2. Определена пространственная структура TLRItir в растворе. Структура представляет собой типичную укладку TIR-доменов, включающую в себя Р-лист, образованный 5 антипараллельными Р-тяжами, окруженный 5 а-спиралями. В ходе работы выявлены отличия ЯМР-структуры белка от конформации, полученной методом РСА, возникающие вследствие образования при кристаллизации ненативных дисульфидных связей;

3. Выявлено наличие в TLR1 tir высокоаффинного сайта связывания ионов цинка с константой диссоциации 4,5 нМ. По данным мутагенеза, во взаимодействии с цинком участвуют остатки С686 и С667. Связывание цинка осуществляется в двух режимах, при этом С686 важен для одного из режимов, в то время как С667 - для обоих. Сопряженное с олигомеризацией белка высокоаффинное связывание Zn2+ с константой диссоциации 6 нМ было показано также для TLR2tir. При этом ни одна из точечных мутаций по цистеинам не способна полностью ингибировать связывание ионов цинка. Замена всех четырех остатков цистеинов практически полностью ингибирует образование комплекса TLR2m:Zn2+. Полученные результаты указывают на участие всех цистеинов TLR2tir в связывании ионов цинка.

4. Выявлено, что остатки С667 в TLR1, С673 и С713 в TLR2 являются ключевыми при функционировании рецептора TLR1-TLR2: мутации по данным цистеинам нарушают лиганд-индуцированную активацию рецептора. При этом замена С667 в TLR1 и C713 в TLR2 приводит к полному ингибированию передачи сигнала через NF-kB путь.

Список сокращений

а.о. - аминокислотный остаток

АФК - активная форма кислорода

ВГС - вирус гепатита С

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВПГ- вирус простого герпеса,

ВЭБ - вирус Эпштейна Барра

ДК - дендритные клетки

дцРНК(ДНК) - двуцепочечная рибонуклеиновая кислота (дезоксирибонуклеиновая кислота)

криоЭМ - криоэлектронная микроскопия

МТ - metallothioneins; металлотионеины

МХАХ - Металл-хелатная аффинная хроматография

оцРНК(ДНК) - одноцепочечная рибонуклеиновая кислота (дезоксирибонуклеиновая кислота)

РСА - рентгеноструктурный анализ

ТМД - трансмембранный домен

ЦМВ - цитомегаловирус,

ЦОГ-2 - cyclooxygenase-2; циклооксигеназа-2

ЦПД - цитоплазматический домен

ЭГТА - этиленгликоль-бис (Р-аминоэтиловый эфир)-№, N, N', N'-тетрауксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - Эндоплазматический ретикулум

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

AP-1 - activating protein-1; активирующий белок-1

ASK1 - apoptosis signal kinase 1(сигнал апоптоза киназы 1)

BCAP - B-cell adaptor protein;

BCR - B cell receptor; В-клеточный рецептор;

CAMs - cell adhesion molecules; молекулы адгезии клеток

Cas-3/-6/-7 - CRISPR associated protein; CRISPR-ассоциированный белок

cGAS-STING - Cyclic GMP-AMP synthase; (циклическая GMP-AMP синтаза)

CNNM3 - Cyclin And CBS Domain Divalent Metal Cation Transport Mediator 3; Медиатор

транспорта двухвалентного катиона металла с доменом циклина и CBS 3;

CTR-1 - cooper transport protein; переносчик меди 1

Cyt C - Cytochrome c; цитохром С

DAG - diacylglycerol; диацилглицерол

DAMP - dangerous molecular patterns; опасные молекулярные паттерны DBH - dopamine P-hydroxylase; дофамин-Р-гидроксилаза

DMT-1 - divalent metal transporter 1; переносчик ионов двухвалентного металла () DTT - Dithi othreitol, дитиотреитол

EGF - epidermal growth factor; эпидермальный фактор роста;

EGFR - epidermal growth factor receptor; рецептор эпидермального фактора роста;

FasL - Fas ligand; лиганд Fas

GST- glutathione S-transferase; глутатион^-трансфераза

HIF-1a - Hypoxia-inducible factor alpha; Индуцируемый гипоксией фактор альфа HLA- Human Leukocyte Antigen; Лейкоцитарный антиген человека IL - Interleukin receptor, рецептор интерлейкина

iNOS - induced nitric oxide synthase; индуцированная синтаза оксида азота InsP - inositol-1,4,5-triphosphate; (инозитол-1,4,5-трифосфат) IP3- inositol triphosphate; инозитолтрифосфат.

IRAK - Interleukin-1 receptor associated kinase; киназа, связанная с рецептором интерлейкина-1 ITAM - Immunoreceptor tyrosine-based activation motif; Иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина1

GSH/GSSG - glutathione/glutatione disulfide, глутатион/глутатион дисульфид

JAK-STAT - Janus kinase -signal transducer and activator of transcription; Янус-киназа -

преобразователь сигналов и активатор транскрипции

JNK - c-Jun N-terminal kinases; N-концевая киназа с-Jun

LBP - Lipopolysaccharide binding protein - Липополисахарид-связывающий белок

Lck - lymphocyte-specific protein tyrosine kinase; специфическая для лимфоцитов

протеинтирозинкиназа

LPS-lipopolysaccharide, липополисахарид

LRR - Leucine rich repeat, лейцин богатый повтор

LRRNC - Leucine-rich repeat С-terminal domain, лейцин богатый повтор С-концевой домен LRRNT - Leucine-rich repeat N-terminal domain, лейцин богатый повтор N-концевой домен MagT1 - Magnesium Transporter 1; переносчик магния 1); MAL - MyD88 adapter-like - MyD88 подобный белок

MAPK - mitogen-activated protein kinase; митоген-активируемая протеинкиназа MBP- maltose-binding protein; мальтоза-связывающий белок

MCP-1 - monocytic chemoattractant protein-1; моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 MEK3- Mitogen-activated protein kinase; митоген-активируемая протеинкиназа Mrs2 - mitochondrial RNA splicing 2; сплайсинг митохондриальной РНК 2

mTOR - mammalian target of rapamycin; мишень рапамицина у млекопитающих;

MyD88 - Myeloid differentiation primary response gene (88) - белок первичного ответа миелоидной

дифференцировки-88

NF-kB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells; ядерный фактор каппа-легкая цепь-энхансер активированных В-клеток

NFAT - Nuclear factor of activated T-cells; ядерный фактор активированных Т-клеток NK- natural killer; природный убийца

NLRP3 - NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 34; белок 3, содержащий NOD-, LRR- и пириновый домен

NMDA - N-methyl-D-aspartate; N-methyl-D-aspartate OD- optical density; оптическая плотность

PAM - peptidylglycine-a-amidating monooxygenase; пептидилглицин-а-амидирующей монооксигеназы

PAMP - Pathogen-associated molecular patterns, патоген-ассоциированные молекулярные паттерны PARP - Poly(ADP-ribose) polymerases; Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы PI3K - phosphoinositide-3-kinase фосфоинозитид-3-киназа

PIP3 - phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate; фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат; PKC - protein kinase C; протеинкиназа С

PLC - phosphatidylinositol-specific phospholipase C; фосфатидилинозитол-специфическую фосфолипазу С

PLC-y - Phospholipase C Gamma; Фосфолипаза С Гамма PLCy - phospholipase C-y; фосфолипаза C-y;

Ptdlns(4,5)P2 - phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate; (фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат)

PTP - protein tyrosine kinase; протеинтирозинкиназа

rmsd - root mean square deviation, среднеквадратичное отклонение

SARM - Sterile alpha and armadillo motif-containing protein; стерильный белок, содержащий а- и броненосный мотив

SMOC - supramolecular organizing center; супрамолекулярный организующий центр

SOD2 - superoxide dismutase Mn; супероксиддисмутаза Mn,

STIM - Stromal Interaction Molecule; Молекула стромального взаимодействия

TAK1 - growth factor-P-activated kinase 1; фактор роста-Р-активируемая киназа 1

TANK - TRAF Family Member Associated NFKB Activator; Активатор NFkB, связанный с членом

семьи TRAF

TBK1 - TANK-binding kinase 1; TANK-связывающая киназа 1 TCEP - tris(2-carboxyethyl)phosphine; трис(2-карбоксиэтил)фосфин

TCR - T cell receptor; Т-клеточный рецептор

TfR1/2 - Transferrin receptor protein 1/2 рецептор трансферрина 1/2

TIR - Toll/Interleukin 1 receptor, Толл/интерлейкиновый рецептор 1

TIRAP - oll-interleukin 1 receptor (TIR) domain containing adaptor protein TIR-домен содержащий адаптерный белок

TLR - Toll-like receptor, Толл-подобный рецептор TNF - tumor necrosis factor; фактор некроза опухоли

TRAM - TRIF-related adapter molecule; TRIF-родственная адаптерная молекула

TRIF - TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-P; адаптерный белок, содержащий домен

TIR, индуцирующий интерферон-Р

TRPM6,7 - Transient Receptor Potential Cation Channel Subfamily M Member (Переходный рецептор Потенциал Катионный канал, Член подсемейства M 6 и 7 типов)

Список литературы

1. Computational analysis of membrane proteins: the largest class of drug targets / Y. Arinaminpathy, E. Khurana, D. M. Engelman, M. B. Gerstein // Drug Discovery Today. - 2009. -Vol. 14. - Computational analysis of membrane proteins. - № 23-24. - P. 1130-1135.

2. Fitzgerald, K. A. Toll-like Receptors and the Control of Immunity / K. A. Fitzgerald, J. C. Kagan // Cell. - 2020. - Vol. 180. - № 6. - P. 1044-1066.

3. Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity / R. Medzhitov // Nature Reviews Immunology. - 2001. - Vol. 1. - № 2. - P. 135-145.

4. Systemic clinical tumor regressions and potentiation of PD1 blockade with in situ vaccination / L. Hammerich, T. U. Marron, R. Upadhyay [et al.] // Nature Medicine. - 2019. - Vol. 25. - № 5. -P. 814-824.

5. The TLR4 Agonist Monophosphoryl Lipid A Drives Broad Resistance to Infection via Dynamic Reprogramming of Macrophage Metabolism / B. A. Fensterheim, J. D. Young, L. Luan [et al.] // The Journal of Immunology. - 2018. - Vol. 200. - № 11. - P. 3777-3789.

6. Cryo-EM structures of Toll-like receptors in complex with UNC93B1 / H. Ishida, J. Asami, Z. Zhang [et al.] // Nature Structural & Molecular Biology. - 2021. - Vol. 28. - № 2. - P. 173-180.

7. The architecture of transmembrane and cytoplasmic juxtamembrane regions of Toll-like receptors / F. D. Kornilov, A. V. Shabalkina, C. Lin [et al.] // Nature Communications. - 2023. -Vol. 14. - № 1. - P. 1503.

8. Kagan, J. C. Phosphoinositide-Mediated Adaptor Recruitment Controls Toll-like Receptor Signaling / J. C. Kagan, R. Medzhitov // Cell. - 2006. - Vol. 125. - № 5. - P. 943-955.

9. MyD88 TIR domain higher-order assembly interactions revealed by microcrystal electron diffraction and serial femtosecond crystallography / M. T. B. Clabbers, S. Holmes, T. W. Muusse [et al.] // Nature Communications. - 2021. - Vol. 12. - № 1. - P. 2578.

10. Kawasaki, T. Toll-Like Receptor Signaling Pathways / T. Kawasaki, T. Kawai. - Текст: электронный // Frontiers in Immunology. - 2014. - Т. 5. - URL: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fimmu.2014.00461/abstract (дата обращения: 06.06.2023).

11. Carpenter, S. Recent insights into the structure of Toll-like receptors and post-translational modifications of their associated signalling proteins / S. Carpenter, L. A. J. O'Neill // Biochemical Journal. - 2009. - Vol. 422. - № 1. - P. 1-10.

12. Evolutionary History of the Toll-Like Receptor Gene Family across Vertebrates / G. Liu, H. Zhang, C. Zhao, H. Zhang // Genome Biology and Evolution. - 2020. - Vol. 12. - № 1. - P. 3615-

3634.

13. Asami, J. Structural and functional understanding of the toll-like receptors / J. Asami, T. Shimizu // Protein Science. - 2021. - Vol. 30. - № 4. - P. 761-772.

14. Structural basis of CpG and inhibitory DNA recognition by Toll-like receptor 9 / U. Ohto, T. Shibata, H. Tanji [et al.] // Nature. - 2015. - Vol. 520. - № 7549. - P. 702-705.

15. Structural Basis of TLR2/TLR1 Activation by the Synthetic Agonist Diprovocim / L. Su, Y. Wang, J. Wang [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. - 2019. - Vol. 62. - № 6. - P. 2938-2949.

16. Structural Basis of TLR5-Flagellin Recognition and Signaling / S. Yoon, O. Kurnasov, V. Natarajan [et al.] // Science. - 2012. - Vol. 335. - № 6070. - P. 859-864.

17. Targeting the transmembrane domain 5 of latent membrane protein 1 using small molecule modulators / B. Zhang, Y. Wang, C. Lin [et al.] // European Journal of Medicinal Chemistry. - 2021. -Vol. 214. - P. 113210.

18. The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex / B. S. Park, D. H. Song, H. M. Kim [et al.] // Nature. - 2009. - Vol. 458. - № 7242. - P. 1191-1195.

19. Toll-like receptor 8 senses degradation products of single-stranded RNA / H. Tanji, U. Ohto, T. Shibata [et al.] // Nature Structural & Molecular Biology. - 2015. - Vol. 22. - № 2. - P. 109-115.

20. Crystal structure of the TLR1-TLR2 heterodimer induced by binding of a tri-acylated lipopeptide / M. S. Jin, S. E. Kim, J. Y. Heo [h gp.] // Cell. - 2007. - T. 130. - № 6. - C. 1071-1082.

21. Recognition of lipopeptide patterns by Toll-like receptor 2-Toll-like receptor 6 heterodimer / J. Y. Kang, X. Nan, M. S. Jin [h gp.] // Immunity. - 2009. - T. 31. - № 6. - C. 873-884.

22. Spatial structure of TLR4 transmembrane domain in bicelles provides the insight into the receptor activation mechanism / K. S. Mineev, S. A. Goncharuk, M. V. Goncharuk [h gp.] // Scientific Reports. - 2017. - T. 7. - № 1. - C. 6864.

23. Nishiya, T. Ligand-independent oligomerization of TLR4 regulated by a short hydrophobic region adjacent to the transmembrane domain / T. Nishiya, E. Kajita, S. Miwa // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2006. - Vol. 341. - № 4. - P. 1128-1134.

24. Jang, T. Crystal Structure of TIR Domain of TLR6 Reveals Novel Dimeric Interface of TIR-TIR Interaction for Toll-Like Receptor Signaling Pathway / T. Jang, H. H. Park // Journal of Molecular Biology. - 2014. - Vol. 426. - № 19. - P. 3305-3313.

25. Structural basis for signal transduction by the Toll/interleukin-1 receptor domains / Y. Xu, X. Tao, B. Shen [et al.] // Nature. - 2000. - Vol. 408. - № 6808. - P. 111-115.

26. The Crystal Structure of the Human Toll-like Receptor 10 Cytoplasmic Domain Reveals a Putative Signaling Dimer / T. Nyman, P. Stenmark, S. Flodin [et al.] // Journal of Biological Chemistry. - 2008. - Vol. 283. - № 18. - P. 11861-11865.

27. Structural Biology of Innate Immunity / Q. Yin, T.-M. Fu, J. Li, H. Wu // Annual Review of

Immunology. - 2015. - Vol. 33. - № 1. - P. 393-416.

28. Toll-like receptor 5 forms asymmetric dimers in the absence of flagellin / K. Zhou, R. Kanai, P. Lee [et al.] // Journal of Structural Biology. - 2012. - Vol. 177. - № 2. - P. 402-409.

29. Liu, G. Toll-like receptors and immune regulation: their direct and indirect modulation on regulatory CD4 + CD25 + T cells: Toll-like receptor modulation on regulatory CD4 + CD25 + T cells /

G. Liu, Y. Zhao // Immunology. - 2007. - Vol. 122. - Toll-like receptors and immune regulation. - № 2.

- P. 149-156.

30. Nishimura, M. Tissue-Specific mRNA Expression Profiles of Human Toll-Like Receptors and Related Genes / M. Nishimura, S. Naito // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2005. - Vol. 28. -№ 5. - P. 886-892.

31. Zarember, K. A. Tissue Expression of Human Toll-Like Receptors and Differential Regulation of Toll-Like Receptor mRNAs in Leukocytes in Response to Microbes, Their Products, and Cytokines / K. A. Zarember, P. J. Godowski // The Journal of Immunology. - 2002. - Vol. 168. - № 2. - P. 554561.

32. Kawai, T. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity / T. Kawai, S. Akira // Immunity. - 2011. - T. 34. - № 5. - C. 637-650.

33. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kB by Toll-like receptor 3 / L. Alexopoulou, A. C. Holt, R. Medzhitov, R. A. Flavell // Nature. - 2001. - Vol. 413. - № 6857. -P. 732-738.

34. Akira, S. Pathogen Recognition and Innate Immunity / S. Akira, S. Uematsu, O. Takeuchi // Cell.

- 2006. - Vol. 124. - № 4. - P. 783-801.

35. Detection of pathogenic intestinal bacteria by Toll-like receptor 5 on intestinal CD11c+ lamina propria cells / S. Uematsu, M. H. Jang, N. Chevrier [et al.] // Nature Immunology. - 2006. - Vol. 7. -№ 8. - P. 868-874.

36. Kawai, T. The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition / T. Kawai, S. Akira // International Immunology. - 2009. - Vol. 21. - № 4. - P. 317-337.

37. Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway / H. Hemmi, T. Kaisho, O. Takeuchi [et al.] // Nature Immunology. - 2002. - Vol. 3. - № 2. -P. 196-200.

38. Gilliet, M. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases / M. Gilliet, W. Cao, Y.-J. Liu // Nature Reviews Immunology. - 2008. - Vol. 8. - Plasmacytoid dendritic cells. - № 8. - P. 594-606.

39. Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8 / F. Heil,

H. Hemmi, H. Hochrein [et al.] // Science. - 2004. - Vol. 303. - № 5663. - P. 1526-1529.

40. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA / H. Hemmi, O. Takeuchi, T. Kawai [et al.] //

Nature. - 2000. - Vol. 408. - № 6813. - P. 740-745.

41. Malaria hemozoin is immunologically inert but radically enhances innate responses by presenting malaria DNA to Toll-like receptor 9 / P. Parroche, F. N. Lauw, N. Goutagny [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2007. - Vol. 104. - № 6. - P. 1919-1924.

42. Fore, F. TLR10 and Its Role in Immunity / F. Fore, M. Budipranama, R. A. Destiawan. - Text: electronic // Toll-like Receptors in Health and Disease : Handbook of Experimental Pharmacology / ed. V. Kumar. - Cham : Springer International Publishing, 2021. - Vol. 276. - P. 161-174. - URL: https://link.springer.com/10.1007/164_2021_541 (date accessed: 06.06.2023).

43. Lauw, F. Of mice and man: TLR11 (finally) finds profilin / F. Lauw, D. Caffrey, D. Golenbock // Trends in Immunology. - 2005. - Vol. 26. - Of mice and man. - № 10. - P. 509-511.

44. Balenga, N. A. Human TLR11 gene is repressed due to its probable interaction with profilin expressed in human / N. A. Balenga, N. A. Balenga // Medical Hypotheses. - 2007. - Vol. 68. - № 2. -P. 456.

45. O'Neill, L. A. J. The Toll-IL-1 receptor adaptor family grows to five members / L. A. J. O'Neill, K. A. Fitzgerald, A. G. Bowie // Trends in Immunology. - 2003. - Vol. 24. - № 6. - P. 286-289.

46. Role for B-cell adapter for PI3K (BCAP) as a signaling adapter linking Toll-like receptors (TLRs) to serine/threonine kinases PI3K/Akt / T. D. Troutman, W. Hu, S. Fulenchek [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - Vol. 109. - № 1. - P. 273-278.

47. Unresponsiveness of MyD88-Deficient Mice to Endotoxin / T. Kawai, O. Adachi, T. Ogawa [et al.] // Immunity. - 1999. - Vol. 11. - № 1. - P. 115-122.

48. Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins / O. Takeuchi, S. Sato, T. Horiuchi [и др.] // Journal of Immunology (Baltimore, Md.: 1950). - 2002. -Т. 169. - Cutting edge. - № 1. - С. 10-14.

49. A Dimer of the Toll-Like Receptor 4 Cytoplasmic Domain Provides a Specific Scaffold for the Recruitment of Signalling Adaptor Proteins / R. Nunez Miguel, J. Wong, J. F. Westoll [et al.] // PLoS ONE. - 2007. - Vol. 2. - № 8. - P. e788.

50. Protein kinase C5 binds TIRAP/Mal to participate in TLR signaling / M. Kubo-Murai, K. Hazeki, N. Sukenobu [et al.] // Molecular Immunology. - 2007. - Vol. 44. - № 9. - P. 2257-2264.

51. Tan, Y. Biochemical Isolation of the Myddosome from Murine Macrophages / Y. Tan, J. C. Kagan. - Текст : электронный // Innate Immune Activation : Methods in Molecular Biology / ред. D. De Nardo, C. M. De Nardo. - New York, NY : Springer New York, 2018. - Т. 1714. - С. 79-95. -URL: http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-7519-8_6 (дата обращения: 06.06.2023).

52. Structural basis for the multiple interactions of the MyD88 TIR domain in TLR4 signaling / H. Ohnishi, H. Tochio, Z. Kato [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. -Vol. 106. - № 25. - P. 10260-10265.

53. Gay, N. J. What the Myddosome structure tells us about the initiation of innate immunity / N. J. Gay, M. Gangloff, L. A. J. O'Neill // Trends in Immunology. - 2011. - Vol. 32. - № 3. - P. 104109.

54. Lin, S.-C. Helical assembly in the MyD88-IRAK4-IRAK2 complex in TLR/IL-1R signalling / S.-C. Lin, Y.-C. Lo, H. Wu // Nature. - 2010. - Vol. 465. - № 7300. - P. 885-890.

55. Crystal structure of Toll-like receptor adaptor MAL/TIRAP reveals the molecular basis for signal transduction and disease protection / E. Valkov, A. Stamp, F. DiMaio [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2011. - Vol. 108. - № 36. - P. 14879-14884.

56. Solution structure of the TLR adaptor MAL/TIRAP reveals an intact BB loop and supports MAL Cys91 glutathionylation for signaling / M. M. Hughes, P. Lavrencic, R. C. Coll [et al.]. - Text: electronic // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2017. - Vol. 114. - № 32. - URL: https://pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.1701868114 (date accessed: 06.06.2023).

57. IRAK4 Dimerization and trans -Autophosphorylation Are Induced by Myddosome Assembly / R. Ferrao, H. Zhou, Y. Shan [et al.] // Molecular Cell. - 2014. - Vol. 55. - № 6. - P. 891-903.

58. TRAF6 deficiency results in osteopetrosis and defective interleukin-1, CD40, and LPS signaling / M. A. Lomaga, W.-C. Yeh, I. Sarosi [et al.] // Genes & Development. - 1999. - Vol. 13. - № 8. -P. 1015-1024.

59. TRAF6 is a signal transducer for interleukin-1 / Z. Cao, J. Xiong, M. Takeuchi [et al.] // Nature.

- 1996. - Vol. 383. - № 6599. - P. 443-446.

60. Activation of the canonical IKK complex by K63/M1-linked hybrid ubiquitin chains / C. H. Emmerich, A. Ordureau, S. Strickson [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences.

- 2013. - Vol. 110. - № 38. - P. 15247-15252.