Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Обозова, Татьяна Анатольевна

• Обозова, Татьяна Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Обозова, Татьяна Анатольевна

I. Список сокращений

II. Введение

III. Обзор литературы

1. Механизмы длительного выживания микобактерий

М. tuberculosis

2. Модели персистенции М. tuberculosis in vitro

2.1. Модель - «без перемешивания»

2.2. Модель - «с перемешиванием»

2.3. Модель - «стационарная фаза роста»

3. Пути получения энергии М. tuberculosis при персистенции in vitro

4. Экспрессия генов «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro

5. Экспрессия генов, не входящих в состав «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro

6. Экспрессия генов, кодирующих сигма - факторы М. tuberculosis при персистенции in vitro

7. Определение жизнеспособности М. tuberculosis

8. Особенности фенотипических методов определения жизнеспособности М. tuberculosis

8.1. Определение жизнеспособности М. tuberculosis с использованием репортерных микобактериофагов, несущих ген люциферазы

8.2. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня рРНК

8.3. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня мРНК

IV. Материалы и методы 32 1. Штаммы микобактерий и условия их культивирования (модели персистенции in vitro)

2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий

3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК)

4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК)

5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразпой цепной реакции

6. Применение внутреннего калибровочного стандарта для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях

7. Подбор праймеров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

8. Условия проведения реакции обратной транскрипции

9. Условия проведения ПЦР реакции

10. Характеристика количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

11. Детекция продуктов амплификации

12. Програмное обеспечение экспериментальной работы

V. Результаты и обсуждение

1. Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции

2. Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis

2.1 Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем

2.2 Внутренние калибровочные стандарты (ВКС)

2.3 Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

2.3.1. Определение чувствительности количественных ПЦР систем

2.3.2. Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем

2.4 Многопраймерная реакция обратной транскрипции 4g

2.5. Использование ВКС для количественного определения исследуемой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах

2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем ^ ^

2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровоч- ^ ного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем

2 б Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате

2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК

2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК

Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. tuberculosis на моделях in vitro

3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете па количество геном - эквивалента

4. Исследование генов dnaK, sigH и flpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis

5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis 66 Исследование генетических маркеров персистеигция М. tuberculosis на моделях in vitro

6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистеиции in vitro

7. Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистенции на моделях in vitro

8. Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к рифампицину и метронидазолу

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro»

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (Покровский В.В., 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.

Несмотря на проводимую в ряде стран массовую иммунизацию против туберкулеза, заболеваемость туберкулезом продолжает расти. Разрастающаяся эпидемия туберкулеза в мире обусловлена несколькими факторами:

- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Cal-mette Guerin) (Bloom В. R., 2002);

- демографические сдвиги;

- интенсивная миграция населения;

- распространение штаммов микобактерий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (Бастиан И. и Порталь Ф., 2003);

- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Покровский В.В., 2003);

- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (Voskuil M.I. et al., 2003).

Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М. tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активности. В этом состоянии микобактерии не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (Герасимов В.Н. и соавторы,

2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобак-терий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобак-терий в метаболически неактивном нерепликативном состоянии (Wayne L.G. et al., 1998).

Для изучения феномена персистепции М. tuberculosis были разработаны модели персистепции in vitro, простые в исполнении и использовании, а также исключающие действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма па присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причии создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистенции in vivo.

Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные М. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистенции - гены М. tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.

Необходимо отметить, что к началу данной работы о проблеме персистенции М. tuberculosis было опубликовано много работ, но основные исследования проводились с использованием микробиологических методов, а генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий в состояние персистенции, были мало исследованы (Герасимов В.Н. и соавт., 2003; Дорожкова И.Р. и соавт., 1995; Прозоровский C.B. и соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано с изменением уровней экспрессии определенной группы специфических генов (Boon C.et al., 2001; Wayne L.G. et al., 2000).

Задача быстрого определения жизнеспособности популяции М. tuberculosis поставлена в мировой науке давно и продолжает оставаться актуальной (Hellyer Т.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является основой для создания методов определения лекарственной устойчивости, а также методов, позволяющих в короткие сроки тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов с использованием референс - штаммов М. tuberculosis.

Консолидация новейших исследований в области генетики М. tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистеиция) отличается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию антимикобактериальных препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (Хоменко А.Г., 1996; Wayne L.G. et al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериальной популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фепотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра антимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.

Существенным недостатком практического применения данного подхода является низкое содержание специфических мРНК в культуре микобактерий.

В связи с этим цель данной работы состояла в исследовании индуцибельных генов в качестве маркеров жизнеспособности М tuberculosis и подборе такой системы ген - индуктор, использование которой позволит увеличить исходное количество специфической мРНК в клетке и тем самым сделает детекцию лабильной мишени более точной.

Цель исследования:

• Определить генетические маркеры, адекватные для оценки жизнеспособности и персистенции М. tuberculosis, на моделях in vitro.

Задачи исследования:

1. Разработать количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для изучения экспрессии генов М. tuberculosis, выбранных для исследования в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции in vitro.

2. Исследовать возможность использования генетических маркеров для оценки жизнеспособности М. tuberculosis как показателя действия антибактериальных препаратов.

3. Исследовать возможность использования генетических маркеров для характеристики разных стадий персистенции на моделях in vitro.

4. Исследовать дифференциальную экспрессию генов М. bovis BCG, ассоциированных с персистенцией, на разных стадиях персистенции на моделях in vitro, оценить их в качестве адекватных генетических маркеров персистенции in vitro.

5. Исследовать корреляцию между уровнем экспрессии генетических маркеров персистенции и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к антибактериальным препаратам.

Научная новизна работы

- разработан оригинальный методический подход, основанный на количественном определении уровня специфических мРНК и созданы количественные ПЦР и ОТ-ПЦР для изучения дифференциальной экспрессии генов dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr.flpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, IS6110 M. tuberculosis при нахождении микобактерий в разных физиологических состояниях in vitro',

- впервые установлено, что уровень мРНК гена dnaK может быть использован для экспресс - определения степени устойчивости штаммов М. tuberculosis к ри-фампицину и изониазиду;

- впервые определен профиль специфических мРНК генов sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623 на разных стадиях персистенции М. bovis BCG на моделях in vitro. Согласно установленным нами критериям, гены Rv2623, sigF, dosR являются наиболее адекватными генетическими маркерами персистенции микобак-терий на моделях in vitro;

- впервые предложен маркер разных стадий персистенции микобактерий на моделях in vitro (уровень 16S рРНК). Использование этого маркера позволяет: 1) определить минимальный уровень метаболической активности популяции микобактерий на моделях in vitro; 2) проводить сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro.

Практическая значимость работы

Выявлены генетические маркеры жизнеспособности и персистенции М. tuberculosis на моделях in vitro, которыми являются гены - dnaK и Rv2623, sigF, dosR, соответственно. Уровень мРНК гена dnaK может быть использован как универсальный показатель жизнеспособности, при действии антибиотиков. Белковые продукты генов Rv2623, sigF, dosR, могут быть кандидатами для производства специфических реагентов для определения латентных форм туберкулеза.

III. Обзор литературы

Известно, что популяция возбудителя туберкулеза неоднородна по составу и ряду биологических свойств: микроорганизмы различаются по морфологии, скорости роста и размножения, особенностям обменных процессов, жизнеспособностью (Дорожкова И.Р. и соавторы, 1990). Эти обстоятельства обуславливают различную чувствительность микобактерий к антибиотикам и способствуют развитию приспособительных реакций, позволяющих избежать бактерицидного действия лекарственных препаратов (Wayne L.G. et al., 2001).

Известно, что 75% населения России инфицировано М. tuberculosis, при этом туберкулезная инфекция находится в латентном состоянии и представляет собой резервуар опасного заболевания (Голубчикова В.Т. и соавторы, 1997; Козлова М.К. и соавторы, 1997; www.tuberculosis.ru). Считается, что большинство новых случаев заболевания туберкулезом возникает в результате реактивации латентной инфекции - инфицированные М. tuberculosis лица имеют риск эндогенной реактивации туберкулеза (Voscuil M.I.et al., 2004).

Персистенция микобактерий возможна в результате трансформации в L -формы, ультрамелкие и фильтрующиеся формы (часто называемые зернистыми) (Мишин В.Ю., 2003). Их особенность состоит в том, что даже под действием антибиотиков они способны длительное время сохранять жизнеспособность и при соответствующих условиях вновь «оживать» и размножаться (Хоменко А.Г., 1999).

Под действием ряда факторов, неблагоприятно действующих на бактериальную клетку (антибиотики, ферменты, антитела и др.), происходит L- трансформация бактерий, приводящая к постоянной или временной утрате клеточной стенки. В результате изменения антигенных свойств, снижения вирулентности и ряда других факторов L - формы приобретают способность длительно находиться (персистиро-вать) в организме хозяина. Утрата клеточной стенки делает L - формы нечувствительными к антибиотикам, антителам и различным химиопрепаратам, мишеныо которых является клеточная стенка микобактерий. Нестабильные L - формы способны реверсировать в исходные формы бактерий, имеющие клеточную стенку. Имеются также стабильиые L - формы бактерий, отсутствие клеточной стенки и неспособность реверсировать которых в классические формы бактерий закреплены генетически (Прозоровский C.B., 1981).

Внимание исследователей привлекает вопрос о возможном участии L-форм в хроническом процессе туберкулезной инфекции. При исследовании частоты и динамики выделения L-форм микобактерий туберкулеза у больных с рецидивами туберкулеза легких обнаружено, что L-формы микобактерий туберкулеза выявляются у 40,6 % исследованных больных. В 73,1 % случаев L - формы микобактерий были нестабильными и реверсировали после 1-3 пассажей in vitro в типичную бактериальную форму возбудителя (Чернушепко Е.Ф., 2000). Несмотря на достаточно длительный период в изучении способности микобактерий к длительному выживанию в организме человека до сих пор в литературе встречается некоторая путаница в терминологии.

Морфология измененных форм микобактерий характеризуется высокой степенью полиморфизма (Герасимов В.Н. и соавт., 2003). Зернистые формы микобактерий имеют округлую форму различных размеров: от мелкозернистых форм (0,1 -0,2 микрона в диаметре) до крупных круглых образований (0,6 - 0,8 микрон в диаметре). Часть популяции зернистых форм микобактерий находится в спороподоб-ном (вегетативном) состоянии (Герасимов В.Н. и соавт., 2003). Возможно, что нахождение части популяции микобактерий в спороподобном состоянии обуславливает латентное состояние микобактериальной инфекции (Voskuil M.I. et al., 2003). Эта форма морфологически отличается от L - форм более мелкими размерами и наличием плотной (многослойной) клеточной стенки (Voskuil МЛ. et al., 2004).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Обозова, Татьяна Анатольевна

VI. Выводы

1. Разработаны оригинальные количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для исследования экспрессии генов М. tuberculosis: dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, IS6110 с целью определения возможности использования этих генов в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции микобактерий на моделях in vitro.

2. Среди исследованных генов выбран термо - индуцибельный ген dnaK в качестве маркера, оптимального для оценки степени жизнеспособности культуры М. tuberculosis как показателя действия рифампицина и изониазида.

3. Впервые определена возможность применения генов sigH, dnaK, jbpB для экспресс - определения жизнеспособности М. tuberculosis при действии рифампи-цином в течение 24 часов.

4. Впервые установлена возможность использования уровня 16S рРНК в качестве маркера разных стадий персистенции микобактерий на моделях in vitro, что позволяет:

- проводить сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro-,

- определить стадию «глубокой» персистенции популяции микобактерий на моделях in vitro, которая характеризуется стабильным минимальным уровнем метаболической активности и является наиболее адекватной для исследования процессов, обеспечивающих выживание микобактерий в течение длительного времени.

5. Установлено, что гены sigF, dosR и Rv2623 могут быть использованы в качестве маркеров персистенции микобактерий на моделях in vitro.

На основании сравнительного изучения организации геномов М. bovis BCG и M. tuberculosis было сделано заключение о высокой степени гомологии геномов этих микроорганизмов (S.Cole et al., 1998). С учетом морфологических, гистопато-логических особенностей, особенностей клинического течения заболевания, M bovis (BCG) отнесена к комплексу М. tuberculosis. Эти факты позволили исследователям использовать M bovis BCG в качестве безопасной лабораторной модели. В частности, некоторые авторы использовали М. bovis BCG для изучения экспрессии генов и продукции белков, ассоциированных с персистенцией микобактерий на моделях in vitro (С.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999). Анализ работ и выводы авторов позволяют сделать заключение о том, что некоторые вопросы, касающиеся генетических механизмов длительного выживания микобактерий в модельных условиях in vitro могут быть изучены с использованием штамма M bovis BCG в качестве модельного, с последующей экстраполяцией результатов для М. tuberculosis. Это особенно актуально в том случае, если постановка эксперимента включает необходимость получения больших объемов культуры М. tuberculosis (более 5-10 мл.), но при этом должна соответствовать нормам безопасности, соблюдение которых является обязательным при работе с патогенными микроорганизмами. Выбор М. bovis BCG в качестве модельного штамма был обусловлен необходимостью работать с большими объемами культуры микобактерий (200 мл.) при изучении динамики экспрессии генов микобактерий на поздних стадиях персистенции в моделях in vitro, где низкий уровень метаболической активности популяции микобактерий не позволяет получить достаточное количество мишени для проведения количественной ОТ-ПЦР с использованием малого количества клеточного материала.

Очевидно, что при изучении некоторых иммунологических, эпидемиологических и биохимических аспектов жизнедеятельности M tuberculosis, нельзя использовать М. bovis BCG в качестве модельного штамма. Причина этого заключается в существовании ряда генетических различий между этими микроорганизмами, определяющих разницу в антигенных свойствах и некоторых стадиях биохимических процессов.

В этой связи, в своей работе мы использовали только те гены, идентичность которых доказана как для М. tuberculosis, так и М. bovis BCG (C.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999).

Выращивание культур M. tuberculosis и M. bovis BCG проводили в жидкой питательной среде Middlebrook 7НВ Broth («Difco», №0713-17) в различных модельных условиях, определенных целями данной работы:

• Аэробные условия роста М. tuberculosis и М. bovis BCG

Выращивание культур М. tuberculosis и М. bovis BCG проводили в колбах объемом 200 мл с объемом среды 100 мл. Культуру микобактерий выращивали до логарифмической фазы роста (OD58o= 0,5) и разводили до OD580= 0,005 в конечном объеме свежей ростовой среды.

• Модель Wayne «без перемешивания» («Wayne dormancy model without stirring»).

Культуру M. bovis BCG выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом пластиковом матраце (объемом 25 мл фирмы "Linbro") при 37°С без перемешивания. Получаемая таким образом анаэробная культура соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model without string» (Wayne L.G. et al, 2001):

• Модель «поздней стационарной фазы» («Wayne old stationary phase model»)

Культуру M. bovis BCG выращивали в 100 мл среды в колбе объемом 200мл. при 37°С без перемешивания в течение 240 дней.

• Модель Wayne «с перемешиванием» («Wayne dormancy model with stirring»)

Культуру M. tuberculosis выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом матраце (объемом 25 мл) с медленным перемешиванием (40 об./мин.). Получаемая таким образом анаэробная культура микобактерий соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model with string») (Wayne LG. et al., 2001).

Выращивание культуры M. tuberculosis в условиях модели «Wayne dormancy model with stirring» проводилось в National Jewish Center, Денвер, Колорадо, США).

Выращенную микобактериальную культуру разливали по 1 мл в пробирки (1,5 мл типа Эппендорф), центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 5 минут при комнатной температуре, супернатант удаляли.

Осадок микобактерий хранили при - 70°С до момента использования.

2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий.

Middlebrook-бульон (1 литр): Н20 - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл.

Middlebrook - агар (1 литр): Н2О - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл, агар -3,75 г.

3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК).

Центрифугировали 1 мл пробы при 5 000 об./мин. в течение 5 мин. К осадку клеток добавляли 1 мл 0,5 % раствора Tween 80. Встряхивали на вортексе до получения гомогенной взвеси. Центрифугировали при 10 000 об./мин. - 30 сек. Супернатант удаляли. К осадку клеток добавляли 100 мкл стеклянной дроби (Glass Beads 0,1 мм диаметром, обработанных НС1 - рН = 2). Добавляли 100 мкл холодного ли-зирующего буфера (100 мМ Li С1 ; 10 мМ трис рН = 7,8; 10 тМ ЭДТА; додецил -сульфат Na - 1% ). Встряхивали на вортексе при максимальной скорости в течение 4 мин. Однократно заморозили (- 70°С) в течение 20 мин. Добавляли еще 200 мкл того же буфера, встряхнули на вортексе 10 сек. Добавляли 750 мкл смеси - фенол: хлороформ: изоамиловый спирт - 25: 24:1 (ICN Biomedical Inc.) перемешали переворачиванием 5-6 раз. Инкубировали в ледяной бане 15 мин. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4°С. Переносили водную фазу в чистую пробирку и добавили равный объем изопропанола. Выдерживали при - 70°С в течение 2 часов. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4°С. Осторожно удаляли супернатант. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5-6 раз. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 5 мин. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5-6 раз. Центрифугировали при 12

ООО об./мин. - 5 мин. Максимально удаляли супернатант, не затрагивая осадка. Подсушивали открытые пробирки на столе 15 мин. при комнатной температуре. Элюировали осадок в 100 мкл деионизированной воды.

4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК).

Препараты тотальных РНК получали так же, как и тотальных НК до этапа элю-ции. Затем в каждую пробирку добавляли 30 мкл смеси: из расчета 2 ед. фермента ДНК-азы I («Fermentas») - 2 мкл, 40 ед. ингибитора РНК - аз (Rnasin, Ribonuclease Ingibitor «Fermentas») - 1 мкл, 10 x реакционный буфер - 3 мкл, 24 мкл деионизо-ванной Н20. Перемешивали на вортексе 10 сек, центрифугировали 2500 об./мин. -10 сек. Инкубировали при 37°С - 15 мин. Потом добавляли 20 мкл 0,5 мМ раствора ЭДТА. Перемешивали пипетированием и ставили в термостат для инактивации ДНК-азы при 65°С в течение 10 мин. Полученные пробы хранили при - 70°С.

В опытах по выделению тотальной РНК использовали осадки содержащие от 106 до 109 клеток. Использованный протокол выделения позволял получать в среднем 5 - 8 нг тотальной РНК в расчете на 106 клеток.

5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием ПЦР и ОТ-ПЦР.

Принцип конструирования ДНК-ВКС заключается в получении вектора со встроенной генетической последовательностью специфического гена, содержащего неспецифическую вставку размером 80 - 120 н.п. (Рис. 3).

80 -120 н.п. рВЮ22

80-12« н.п. . рВК322 специфическая последовательность дли посадки нары праймеров неспецифическая нуклеотидная последовательность промотеры фагов 8Р6 и Т7.

ДНК-ИКС

РНК - транскрипт

Рисунок 3. Принцип конструирования внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС и РНК-ВКС).

Генетические конструкции для наработки специфических ДНК - и РНК - ВКС были получены в Центре Биоинженерии РАН. Препараты ДНК - ВКС ( специфические ДНК - фрагменты) и РНК - ВКС (специфические РНК - транскрипты) предоставлены нам в готовом для использования виде.

6. Применение ВКС для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях.

Принцип определения количества исследуемой генетической мишени в реакции ПЦР и ОТ-ПЦР состоял в титровании продуктов амплификации исследуемой мишени относительно известного количества внутреннего калибровочного стандарта (ВКС). Точно определить число копий мишени возможно в том случае, если полосы свечения продуктов амплификации мишени и ВКС совпадают по интенсивности на электрофорезе. В разработанных нами количественных ПЦР и ОТ-ПЦР системах такой подход позволил детектировать двукратное изменение количества исследуемой мишени (Рис. 4).

ДНК - ВКС (360 н.п.) мишень - ген dnaK (247 н.п.)

Рисунок. 4. Двукратное титрование мишени - гена dnaK относительно ВКС. Количество ДНК - ВКС - 80 копий в каждой ПЦР реакции; количество мишени соответственно: 1 - 160; 2 - 80; 3 - 40; 4 - 20 копий ДНК; 5 - маркер молекулярных масс.

Приведены результаты одного из многих однотипных экспериментов.

В данном примере количество исследуемой мишени определяли, учитывая, что интенсивность сигналов на электрофореграмме от продуктов амплификации ДНК - ВКС и исследуемой мишени совпадала в треке №2 и соответствовала 80 - и копиям ДНК мишени.

7. Подбор праймеров для исследования экспрессии генов М. tuberculosis.

На каждый ген М tubérculo sis было подобрано по 2 - 3 пары праймеров. В результате работы на каждый ген отобрана одна оптимальная пара праймеров по критерию наибольшей чувствительности ПЦР систем (Таб.2).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Обозова, Татьяна Анатольевна, 2006 год

1. Богаделышкова И.В., Перельман М.И. Антибактериальная терапия туберкулеза легких. -М- 1997.- 80с.

2. Вишневская Е.Б., А.П.Бобченок, Н.Н.Мельникова, Б.И.Вишневский. Идентификация L форм микобактерий туберкулезного комплекса с применением полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Проблемы туберкулеза. - 2001. - №4. - С.38 - 40.

3. Владимирский М.А. Методы молекулярной биологии в диагностике туберкулеза. 2003.- №3. - С.20 - 31.

4. Власов В.В., Филипенко M.JL, Никонова A.B., Норкипа О.В., Краснов В.А., Ку-рунов Ю.Н., Киншт В.Н., Попов А.Н. Применение молекулярно биологических методов в диагностике туберкулеза. 2000.- №4.- С. 16 - 24.

5. Герасимов В.Н., С.Ф.Бикетов, Е.А.Голов, В.Д.Потапов, И.В.Бахтеева, О.Г.Николаева. Особенности тонкой структуры микобактерий туберкулеза, культивированных в макрофагах мыши. Проблемы туберкулеза. 2003. - №7. - С.52 -58.

6. Дорожкова И.Р., З.С.Земскова, В.П.Круду. L трансформация микобактерий в свете современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире. Проблемы туберкулеза. - 1995. - №7. - С.30 - 33.

7. Мишин В.Ю. Современные режимы химиотерапии туберкулеза легких, вызванного лекарственно чувствительными и лекарственно - резистентными микобакте-риями // РМЖ.- 2003.- №21.- С.23.

8. Морозова Т.И., В.И. Завалев, E.H. Моклецов, A.B. Абузов. Микробиологические исследования при туберкулезе и пути их совершенствования. VII съезд фтизиатров. Москва. 2003.

9. Прозоровский С. В. Роль L форм в персистенции патогенных бактерий. Вестник Академии Медицинских Наук. - 1985.- №3,- С.З - 9.

10. Прозоровский С. В., Л.Н.Кац, Г.Я.Каган. L формы бактерий. - М.- 1981.-161с.

11. Степаншина В.Н., Панферцев Е.А., Митрофанова Г.Н., Коробова О.В.,Степаншин Ю.Г., Шемякин И.Г.,Медведева WM.il Проблемы Туберкулеза.-2000.-№1 .-С.32-36.

12. Хейфец Л.Б. Современные подходы к выявлению лекарственной устойчивости у больных туберкулезом. VII съезд фтизиатров. Москва. 2003.

13. Туберкулез. Руководство для врачей // Под редакцией Хомеико А.Г. М. -1996.-493 с.

14. Хоменко А.Г., Чуканов В.И. Туберкулез возвращается // Медицина и жизнь,-1999. нояб. - дек. - С.14 - 21.

15. Четверин А.Б., Е.В.Четверина. Преодоление проблем ПЦР диагностики с помощью метода молекулярных колоний. Молекулярная медицина.- 2002.- №4. - С.20 -31.

16. Belasco, J. G., G. Nilsson, A. von Gabain, and S. N. Cohen. The stability of colt gene transcripts is dependent on determinants localized to specific mRNA segments // Cell. -1986.- Vol.46. -P.245 251.

17. Brown David H., Beth A.Miles and Bruce S.Zwilling. Growth of Mycobacterium tuberculosis in BCG Resistant and - Susceptible Mice: Establishment of Latency and Reactivation // Infection and Immunity.-1995.-Vol.63.- P.2243 - 2247.

18. Boon Calvin, Rong Li, Robert Qi, and Thomas Dick. Proteins of Mycobacterium bo-vis BCG induced in Wayne dormancy model // J. Bacteriol. -2001. Vol.183.- P.2672 -2676.

19. Boon Calvin and Thomas Dick. Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy // J.Bacteriol. 2000. - Vol.184.- P.6760 - 6767.

20. Butcher, P.D., Mangan, J.A., Monahan, M., Intracellular gene expression analysis of RNA from mycobacteria in macrophages using RT-PCR // Methods Mol. Biol.- 1998. -Vol. 101.- P. 285 -306.

21. Collins С. H., J. M.Grange, and M. D.Yates. // Tuberculosis bacteriology ¡organization and practice // Butterworth Heinemann, Oxford, England. 1997.- P. 98-110.

22. Chaves, F., Alonso-Sanz, M., Rebollo, M.J., Tercero, J.C., Jimenez, M.S., Noriega, A.R. rpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis //Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2004. - Vol.2 - P. 765-770.

23. Cole, S.T. Comparative mycobacterial genomics // Curr. Opin. Microbiol. 1998. -Vol.1.-P.567-571.

24. Tuberculosis and Tubercle Bacillus. Edited by Stewart T.Cole et al. 2005. - ASM Press, Washington,D.C.

25. Cox, J. S., B. Chen, M. McNeil, and W. R. Jacobs, Jr. Complex lipid determines tissue-specific replication of Mycobacterium tuberculosis in mice // Nature. -1999. -Vol.402.-P.79-83.

26. Adam F.Cunningham and Claire L.Spreadbury. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen depletion: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton a-crystallin homolog//J.Bacteriol. 1997. - Vol.180. - P.801- 808.

27. DeMario J., Zhang J, C.Ko, Bishai WR. Mycobacteria tuberculosis sigF is part of a gene cluster with similarities to the Bacillus sigF and sigB operon // Tubercl.Lung Dis.-1997.-Vol.78.-P.3 -12.

28. DeMario J., Y.Zhang, C.Ko, D.B. Joung, and W.R.Bishai. A stationary phase stress response sigma facrtors from Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl.Acad.Sci USA. -1996. - Vol.93.- P.2790 - 2794.

29. DesJardin, L. E., Y. Chen, M. D. Perkins, L. Teixiera, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Microbial markers as surrogates for response to chemotherapy of tuberculosis // Am. J. Respir. Cril. Care Med.- 1996. Vol.155. - P.255.

30. DesJardin, L. E., M. D. Perkins, L. Teixeira, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Alkaline decontamination of sputum specimens adversely affects stability of mycobacterial mRNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P.2435 - 2439.

31. Dye, C., Scheele, S., Dolin, R, Pathania, V., Raviglione, M.C. Global burden of tuberculosis. Estimated incidence, prevalence and mortality by country // JAMA. 1999. -Vol.282. - P.677 - 686.

32. Eisenach, K. D., M. D. Sifford, M. D. Cave, J. H. Bates, and J. T. Crawford. Detection of Mycobaclerium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction //Am. Rev. Respir. Dis.- 1991. Vol.144.- 1160- 1163.

33. Ellner, J. J., A. R. Hinman, S. W. Dooley, M. A. FischI, K. A. Sepkowitz, M. J. Goldberger, T. M. Shinnick, M. D. Iseman, and W. R. Jacobs. Tuberculosis symposium: emerging problems and promise // J. Infect. Dis. -1993. Vol.168. - P.537 - 551.

34. Gabain Von, A, J. G. Belasco, J. L. Schottel, A- C. Y. Chang, and S. N. Cohen. Decay of mRNA in Escherichia coli: investigation of the fate of specific segments of transcripts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol.80. - P.653 - 657.

35. Gomez J.E. and J.D. McKinney. Mycobacterium tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance // Tuberculosis. 2004. - Vol.84. - P.29 - 44.

36. Gamboa, F., J. M. Manterola, B. Vinado, L. Mates, M. Gimenez, J. Lonca, J. R. Manzano, C. Rodrigo, P. J. Cardona, E. Padilla, J. Dominguez, and V. Ausina. Direct detection of Mycobaclerium tuberculosis complex in nonrespiratory specimens by Gen-Probe

37. Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol.35. - P.307 - 310.

38. Goble, M., M. D. Iseman, L. A. Madsen, D. Waite, L. Ackerson, and C. R. Hors-burgh. Treatment of 171 patients with pulmonary tuberculosis resistant to isoniazid and rifampin//N. Engl. J. Med. 1993. Vol.328.-P.527-532.

39. Haiford, W. P., V. C. Falco, B. M. Gebbhardt, and D. J. J. Carr. The inherent quantitative capacity of the reverse transcription-polymerase chain reaction // Anal. Biochem. -1999.-Vol.266.-P.181 191.

40. Hellyer, T. J., L. E. DesJardin, G. L. Hehman, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. - P.290 - 295.

41. Hu Yanmin, Coates ARM. Transcription of two sigma 70 gomologue genes sigA and sigB in stationary phase Mycobacterium tuberculosis //J.Bacteriol. 1998. - Vol.181. -P.469 - 476.

42. Hu Yanmin, Antony R.M.Coates, Danis A.Mitchison. Sterilizing activities of fluoroquinolones against rifampin tolerant population of Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2003. - Vol.47. - P.653 - 657.

43. Jou, N.-T., R. B. Yoshimori, G. R. Mason, J. S. Louie, and M. R. Liebling. Singletube, nested, reverse transcriptase PCR for detection of viable Mycobacierium tuberculosis //Clin. Microbiol. -1997.- Vol.35. P.l 161 - 1165.

44. Kaprelyants A.S., J.C.Gottschal, and D.B.Kell. Dormancy in nonsporulating bacteria // FEMS Microbiol. Rev.- 2000. Vol.104. - P.271 - 286.

45. Kobzik, L., Schoen, F.J. The lung. In: Cotran, R.S., Kumar, V.K., Robbins, S.L., Schoen, F.J. (Eds.), Pathologic Basis of Disease // Saunders, Philadelphia, PA. 1994.-Vol.12-P.673 - 735.

46. Lovannisci, D. M., and E. S. Winn-Deen. Ligalion amplification and fluorescence detection of Mycobaclerium tuberculosis DNA // Mol. Cell. Probes. 1993. - Vol.7. - P.35.

47. Lim A., M.Eleuterio, B.Hutter, B.Murugasu-Oei, and T.Dick. Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium bovis BCG //J.Bacteriol. 1999. - Vol.181. - P.2252- 2256.

48. Manabe Yukari C., Jong Min Chen, Chiew G. Ko, Ping Chen, and William Bishai.

49. Conditional Sigma Factor Expression, Using the Inducible Acetamidase Promotor, Reveals that the M. tuberculosis sig F Gene Modulaters Expression of the 16-Kilodalton Alopha-Crystallin Homologue // J.Bacteriol. 2003. - Vol.181. - P. 7629 -7633.

50. Mangan, J. A., K. M. Sole, D. A. Mitchison, and P. D. Butcher. Aneffective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria // Nucleic Acids Res. -1997. Vol.25. - P.675 - 676.

51. Manganelli R., E .Dubnau, S.Tyagi, F. R .Kramer and I .Smith Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis II Molecular Microbiology.-1999.- Vol.31.-P. 715 724.

52. Martin Casabona, N., D. Xairo Mimo, T. Gonzalez, J. Rossello, and L. Arcalis. Rapid method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis by using DNA probes // J. Clin. Microbiol. -1997. - Vol.35. - P.2521 - 2525.

53. Mitchison, D. A. Basic mechanisms of chemotherapy // Chest. 1979. - Vol.3. -P.771.

54. Mitchison, D. A. Understanding the chemotherapy of tuberculosis current problems // J. Antimicrob. Chemother. - 1992. - Vol.29. - P.477 - 493.

55. Miyamoto, J., H. Koga, S. Kohno, T. Tashiro, and K. Hara. New drug susceptibility test for Mycobacterium tuberculosis using the hybridization protection assay // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P.1323 - 1326.

56. Moore, D. F., J. L Curry, C. A. Knot, and V. Jonas. Amplification of rRNA for assessment of treatment response of pulmonary tuberculosis patients during antimicrobial therapy // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P. 1745 - 1749.

57. Mshana, R. N., G. Tadesse, G. Abate, and H. Miorner. Use of 4,5 dimethylthiazol -2,5 -diphenyl tetrazolium bromide for rapid detection of rifampin - resistant Mycobacterium tuberculosa/}. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P. 1214 - 1219.

58. Musser, J. M. Antimicrobial agent resistance in mycob.iclcria: molecular genetic insights II Clin. Microbiol. Rev.- 1995. Vol.8. - P.496 - 514.

59. Michel T.M., C.Ko, and W.R.Bishai. Exposure to antibiotics induces expression of the Mycobacterium tuberculosis sigF gene: implication for chemotherapy against mycobacterial persistors //Antimicrob.Agents Chemother. 1999. - Vol.43. - P.218 - 225.

60. Smeulders Marjan J., Jacquie Keep, Richard A.Speight, and Huw D. Williams. Adaptation of Mycobacterium smegmatis to Stationary Phase // Journal of Bacteriology. -1999.-Vol.181.-P. 270-283.

61. Voscuil Martin I. Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency // Tuberculosis. 2004. - Vol.84. - P.138 - 143.

62. Voscuil Martin I., K.C.Visconti, G.K.Schoolnik. Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy // Tuberculosis. 2004. -Vol.84. - P.218 - 227.

63. Mariani, R, Cappelli, G., Riccardi, G„ Colizzi, V. Mycobacterium tuberculosis H37Rv comparative gene expression analysis in synthetic medium and human macrophage// Gene. 2000. - Vol.253. - P.281 - 291.

64. Mahairas, G. G., P. J. Sabo, M. J. Hiekey, D. C. Singh, and C. K. Stover. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis //J. Bacteriol. 1996. - Vol.178. - P.1274 - 1282.

65. Marino, M., T. Hoffmann, R. Schmid, H. Mobitz, and D. Jahn. Changes in protein synthesis during the adaptation of Bacillus subtilis to anaerobic growth conditions // Microbiology. 2000. - Vol.146. - P.97 - 105.

66. Monahan, I. M., J. Betts, D. K. Banerjee, and P. D. Butcher. Differential expression of mycobacterial proteins following phagocytosis by macrophages // Microbiology. -2001,- Vol.147. -P.459 471.

67. Naderi A., Ahmed A. A., Barbosa-Morais N. L., Aparicio S., Brenton J. D. and Caldas C. Expression microarray reproducibility is improved by optimising purification steps in RNA amplification and labeling II BMC Genomics. 2004. - Vol.5. - P.9 - 18.

68. Niranjala Muttucumary D.G., Gretta Roberts, Jason Hinds, Richard A. Stabler, Tanya

69. Parish. Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a nonereplicating state // Tuberculosis. 2004. -Vol.84. - P.239 - 246.

70. Narberhaus, F. Negative regulation of bacterial heat shock genes // Mol. Microbiol. -1999.-Vol. 31. P.l - 8.

71. Parrish, N.M., Dick, J.D., Bishai, W.R. Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis //Trends Microbiol. 1998. - Vol.6. - P. 107 - 112.

72. Patel, B.K., Banerjee, D.K., Butcher, P.D. Determination of Mycobacterium leprae viability by polymerase chain reaction amplification of 71-kDa heat-shock protein mRNA // J. Infect. Dis. 1993. - Vol.168. - P.799 - 800.

73. Raviglione, M. C., D. E. Snider, and A. Kochi. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic // JAMA. 1995. - Vol.273. - P.220 -226.

74. Ratledge Colin and Jeremy Dale «Mycobacteria Molecular Biology and Virulence»// Blackwell Science Ltd Websiet.- 1999: wwvv.blackwell-science.com.

75. Scanga Charles A., V.P. Mohan, Heather Joseph, Keming Yu, John Chan, and JoAnne L.Flynn. Reactivation of Latent Tuberculosis: Variations on the Cornell Murine Model // Infection and Immunity. 1999. - Vol.67.- P. 4531-4538.

76. Smith Clare V. and James C. Sacchettini. TB drug discovery: addressing issues of persistence and resistance // Current Opinion in Structual Biology. 2003.- Vol.13.- P. 658-664.

77. Shinnick, T. M, and R. C. Good. Diagnostic mycobacteriology laboratory practices // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol.21. - P.291 - 299.

78. Schukkink, B. van Gemen, and P. R. Klatser. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification // Antimicrob.Agents Chemother. 1994. - Vol.38. - P. 1959 -1965.

79. Sherman, D. R., M. Voskuil, D. Schnappinger, R. Liao, M. I. Harrell, and L G. K. Schoolnik. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding alpha-crystallin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. - Vol.98. - P.7534 - 7539.

80. Sudre, P., G. ten Dam, and A. Kochi. Tuberculosis: a global overview of the situation today // Bull. W. H. O. 1992. - Vol.70. - P. 149 -154.

81. Taniguchi, H., H. Aramaki, Y. Nikaido, Y. Mizuguchi, M. Nakamura, T. Koga, and S. Yoshida. Rifampin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis II FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol.144. - P. 103 -108.

82. Telenti, A., P. Imboden, F. Marchasi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, and T. Bodmer. Detection of rifampin resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis II Lancet. 1993. - Vol.341. - P.647 - 650.

83. Tenover, F. C., J. T. Crawford, R. E. Huebner, L. J. Geiter, C. R. Horsburgh, Jr., and R. C. Good. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? // J.Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. - P.767 - 770.

84. Van der Vliet, G. M. E, R. A. F. Schukkink, B. van Gemen, P. Schepers, and P. R. Klatser. Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) for the identification of mycobacteria// J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol.139. - P.2423 - 2429.

85. Van der Vliet, G.M., Schepers, P., Schukkink, R.A., Van Gemen, B., Klatser, P.R. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - Vol.38. - P.1959 - 1965.

86. Wayne L.G., Lin K-Y. Glyoxylate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions // Infect.Immun. 1982. - Vol.37. -P. 1042 - 49.

87. Wayne L.G., and L.G.Hayes. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence // Infect. Immun. 1996. - Vol.64 - P.2062 - 2069.

88. Wayne L.G., Hayes LG. Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis II Tuberc.Lung.Dis. 1998. - Vol.79. - P. 127 - 132.

89. Wayne L.G. and Sohaskey C.D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis II Annu. Rev. Microbiol. 2001. - Vol.55. - P.139 - 163.

90. Watterson, S. A., S. M. Wilson, M. D. Yates, and F. A. Drobniewski. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis / /J. Clin. Microbiol. 1998.-Vol.36.-P.1969- 1973.

91. Wiker, H. G., and M. Harboe. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobaclerium tuberculosis II Microbiol. Rev.- 1992. Vol.56. - P.648 - 661.

92. Yuan Y., D.D.Grane, C.E. Barry. Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: Function of the mycobacterial a-crystallin homolog // J.Bacteriol. 1996. - Vol.178. - P.4484 - 4492.

93. Zhang, Y., B. Heym, B. Alien, D. Young, and S. Cole. The catalase-peroxidase geneand isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis // Nature. 1992. - Vol. 358. -P.591 - 593.