Клеточные механизмы иммунного ответа на вакцину BCG у мышей линии CBA/N-xid тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Линге, Ирина Андреевна

• Линге, Ирина Андреевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Линге, Ирина Андреевна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Туберкулез — особенности патогенеза и иммунного ответа.

1.2. Противотуберкулезные вакцины (BCG, и другие живые вакцины, субъединнчные вакцины).

1.3. Мутация Xid и ее роль в иммунном ответе и чувствительности к инфекциямЛ

1.4. Влияние мутации xid на функции клеток иммунной системы.

1.4.1. Роль мутации xid в днфференцировке и функционировании В-лимфоцитов.

1.4.2. Макрофаги, их функции и роль Btk.

1.4.3. Влнянне мутации xid на функции нейтрофилов.

1.4.4. Влнянне мутации xid на функции дендритных клеток.

1.4.5. Влияние мутации xid на проведение сигнала от TLRs.

1.5. Роль мутации xid в туберкулезной инфекции.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Микобактериальные культуры.

2.3. Заражением tuberculosis H37Rv.

2.4. Вакцинация мышей.

2.5. Определение количества микобактерий в органах зараженных животных.

2.6. Антигены.

2.7. Среды и растворы.

2.8. Получение суспензии клеток легкого.

2.9. Получение суспензии клеток регионарных лимфатических узлов.

2.10. Получение суспензии клеток селезенки.

2.11. Получение суснензин перитонеальных макрофагов.

2.12. Гистопатология.

2.13. Фагоцитоз микобактерий перитонеальными макрофагами.

2.14. Окраска клеток, содержащих микобактерии.

2.15. Получение Т-линий.

2.16. Антигсн-спсцифическин пролиферативный тест.

2.17. Получение костномозговых химер.

2.18. Перенос клеток эмбриональной нечени.

2.19. Анализ клеток методом проточной цитофлуориметрии.

2.20. Выделение суммарной РНК нз суспензии клеток.

2.21. Получение кДНК.

2.22. Определение продукции цитокинов и хемокинов клетками методом ПЦР в реальном времени.

2.23. Определение количества Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNy, методом IFNy secretion assay in vitro.

2.24. Определение количества Т-лимфоцтов, продуцирующих IFNy, методом ELISPOT in vitro.

2.25. Удаление нейтрофилов in vivo.

2.26. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1.1. Влияние мутации xid на клеточный состав органов до и после вакцинации.

3.1.2. Влияние мутации xid на клеточный состав органов зараженных животных.

3.2. Оценка числа Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFNy в легких вакцинированных мышей после заражения.

3.3. Зависимость эффективности вакцинации мышей CBA/N-xid от дозы вводимой BCG.

3.4. Роль В-лимфоцитов в формировании иммунного ответа на туберкулезную инфекцию.

3.4.1. Влияние переноса Т и В лимфоцитов мышей СВА мышам CBA/N на восстановление их способности к вакцинации.

3.4.2 Перенос В-клеток также восстанавливает способность к вакцинации мышей CBA/N.

3.4.3. Оценка способности мышей линии CBA/N формировать протективный иммунный ответ, при вакцинации соинкатом микобактерий.

3.5. Влияние мутации xid на функции макрофагов.

3.6. Оценка влияния мутации xid на способность макрофагов презентировать антиген Т-лимфоцитам.

3.7. Особенности миграции нейтрофилов мышей линий СВА и CBA/N-xid.

3.8. Оценка экспрессии генов хемокинов, участвующих в миграции нейтрофилов.

3.9. Эффект блокирования нейтрофилов у мышей CBA/N при вакцинации BCG на последующее заражение туберкулезом.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клеточные механизмы иммунного ответа на вакцину BCG у мышей линии CBA/N-xid»

Актуальность проблемы.

Туберкулез (ТБ) до сих пор является одним из самых распространенных инфекционных заболеваний и остается одной из основных причин гибели людей в мире, что делает проблему его изучения очень актуальной. При соблюдении баланса между собственными защитными реакциями и иммунным ответом хозяина Mycobacterium tuberculosis может, не вызывая реальной болезни, сохранять состояние латентности на протяжении всей жизни инфицированного индивида, что и происходит в 90% случаев [Kaufmann S. Н. Е. 2001, Russell D. G. 2007]. С другой стороны, у 10% инфицированных лиц рано или поздно происходит реактивация латентного туберкулеза. Считается, что возобновление активного размножения микобактерий происходит на фоне снижения иммунитета хозяина. Поскольку реактивация туберкулезного процесса часто сопровождается деструкцией легочной ткани и прорывом очагов в бронхи [Condos R., et al., 1998], возникают условия для воздушно-капельной передачи микобактерий новым хозяевам, что имеет первостепенное значение для выживания популяции возбудителя. Эволюционная стратегия паразитизма микобактерий, по-видимому, сочетает медленно текущий инфекционный процесс (обеспечивает длительную жизнь каждой отдельной бактериальной популяции) и неизбежную реактивацию некоторой небольшой доли латентных популяций (обеспечивает горизонтальную передачу). На сегодняшний момент такое сочетание представляет собой неразрешимую в медицинском аспекте проблему.

Основными средствами борьбы с туберкулезом является его профилактика и применение эффективных терапевтических препаратов. Несмотря на массовую вакцинацию детей В CG и тот факт, что в основном устранен дефицит противотуберкулезных препаратов первого ряда, по данным ВОЗ за 2004 г. в мире зарегистрировано 14,6 млн. больных ТБ, в том числе 8,9 млн. новых случаев. Смертность от ТБ составляет 1,5 - 2 млн. в год [WHO, 2004, Frieden T.R., et al., 2003]. Можно выделить три основные группы факторов, оказывающих неблагоприятное влияние либо на эпидемическую обстановку, либо на частоту перехода латентной инфекции в активную форму, либо сразу на оба параметра.

Во-первых, это социально-экономические факторы, среди которых выделяются существенное увеличение частоты миграции из неблагополучных по ТБ регионов, недостаток белкового питания, алкоголизм, бездомность и лекарственная иммуносупрессия [Corbett L., Raviglione М. 2005]. Во-вторых, - это широкое распространение и постоянно растущее разнообразие штаммов патогенных микобактерий, устойчивых к антибиотикам. К этой категории относятся штаммы, резистентные к одному - двум препаратам, к нескольким препаратам первого ряда (MDR-штаммы) и ко многим препаратам первого и второго ряда (XDR-штаммы) [Espinal М. A., et al., 2001, Migliori G. В., et al., 2007]. Наконец, в-третьих, на частоту ТБ с клиническими проявлениями существенно влияет пандемия ВИЧ-СПИД [Corbett Е. L., et al., 2003]; так, из 1,7 млн. умерших от ТБ в 2004 г. около 250 тыс. человек были инфицированы ВИЧ [WHO, 2004]. Таким образом, неблагоприятное влияние на ситуацию оказывают факторы, связанные как с паразитом, так и с хозяином, и все они имеют глобальное распространение и практически не поддаются эффективному контролю.

Для повышения эффективности борьбы с туберкулезом ведется работа в двух основных направлениях. Во-первых, разрабатываются новые лекарственные средства. Во-вторых, продолжаются попытки создать новые вакцины, которые могли бы снизить частоту заболеваемости туберкулезом. Тем не менее, вакцина BCG до сих пор остается единственной используемой на практике противотуберкулезной вакциной. Считается, что вакцинация BCG наиболее эффективна против туберкулезного менингита и детских форм милиарного туберкулеза. Важно отметить, что способность отвечать на вакцинацию BCG в различных популяциях людей неодинакова. Так, исследования, проведенные в Индии, показали, что массовая вакцинация детей BCG в одном из штатов была неэффективна

Bloom B.R., Fine P.E.M., 1994]. По-видимому, одной из важных возможных причин высокой вариабельности ответа на вакцинацию BCG могут быть генетически детерминированные различия ответа на вакцинацию в разных популяциях и у разных индивидов, но этот вопрос никогда подробно не изучался. Более того, до недавнего времени не было описано надежных экспериментальных моделей генетических вариаций ответа на вакцину BCG.

Первая подобная модель была предложена нашей лабораторией. Ранее было показано, что мыши линии CBA/N, наряду с некоторыми другими инбредными линиями, включая мышей СВА, имеют промежуточную чувствительность к туберкулезной инфекции [Niconenko B.V., et al., 1991]. Однако, у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv: среднее время выживания после заражения вакцинированных и невакцинированных мышей CBA/N одинаково [Niconenko B.V., et al., 1996]. Эти данные позволяют рассматривать мышей линии CBA/N как одну из возможных экспериментальных моделей для изучения генетических вариаций ответа на вакцину BGG. Мыши линии CBA/N отличаются от мышей СВА лишь точковой мутацией xid в гене btk, приводящей в первую очередь, к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов. Однако эти данные не давали ответа на вопрос о том, какие именно клеточные механизмы, влияющие на Т-зависимый ответ на вакцину, нарушаются при мутации с преимущественной экспрессией в B-лимфоцитах. В связи с этим изучение роли В-лимфоцитов в вакцинном процессе с одной стороны и исследование влияния генетических дефектов B-клеток на формирование Т-клеточного противотуберкулезного иммунитета является актуальной проблемой.

Цель исследования: Изучить особенности иммунного ответа и миграции лимфоидных клеток у мутантных мышей CBA/N и мышей конгенной линии СВА на моделях вакцинации BCG и последующего заражения М. tuberculosis.

Задачи:

1. Охарактеризовать соотношение клеток иммунной системы и продукцию цитокинов при вакцинации BCG и экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей CBA/N и СВА.

2. Доказать в экспериментах in vivo наличие связи между функционированием клеток иммунной системы и эффективностью вакцинации BCG методами адоптивного переноса.

3. Исследовать функциональную активность фагоцитов мышей линий CBA/N и СВА in vivo и in vitro.

4. Оценить роль лимфоцитов В-1 в иммунном ответе на BCG и индукции протективного противотуберкулезного иммунитета.

5. Исследовать роль нейтрофилов в индукции специфического иммунного ответа при вакцинации BCG мышей CBA/N.

Новизна.

1. Методом переноса клеток костного мозга мышей линии СВА облученным мышам CBA/N впервые показано, что отсутствие способности к вакцинации BCG мышей CBA/N-xid является следствием дефекта клеток иммунной системы.

2. Впервые выявлено, что у мышей CBA/N нарушено формирование Т-клеток с фенотипом CD4+, продуцирующих IFNy — основной эффекторный цитокин, активирующий бактерицидную активность макрофагов.

3. В опытах ш vivo впервые показано, что xid-мутация мышей CBA/N способствует тому, что в ответ на введение бактерий BCG нейтрофилы xid мигрируют быстрее и в большем количестве, чем нейтрофилы СВА.

4. Впервые в опытах in vivo продемонстрировано, что лимфоциты В-1, находящиеся в перитонеальной полости мышей СВА, но отсутствующие у мышей CBA/N-xid, тормозят приток нейтрофилов, а не стимулируют его.

5. В опытах in vitro впервые показано, что нейтрофилы мышей CBA/N обладают большей подвижностью, чем нейтрофилы мышей СВА.

6. Впервые исследована динамика экспрессии ключевых хемокинов, участвующих в привлечении нейтрофилов у мышей линии СВА и CBA/N. Показано, что в ответ на введение BCG экспрессия этих факторов носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов к месту введения вакцины.

7. Впервые в опытах in vivo показана негативная роль нейтрофилов при вакцинации BCG мышей CBA/N. Элиминация нейтрофилов за сутки до введения BCG восстанавливает способность к вакцинации у мышей CBA/N.

Практическая значимость. Работа носит экспериментальный характер и посвящена фундаментальной проблеме. Учитывая наличие у человека гена гомологичного xid и слабой изученности роли В-клеток в протективном иммунном ответе при туберкулёзе, полученные данные дают новые представления о механизмах формирования протективного противотуберкулезного иммунитета и о роли В-клеток в этом процессе. Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Линге, Ирина Андреевна

выводы.

1. Многократные отлнчня между мышами СВА и CBA/N по количеству продуцентов IFN-y в легких появляются только после заражения М. tuberculosis животных, но не на фазе вакцинации BCG.

2. Отсутствие ответа на вакцинацию BCG мышей линии CBA/N зависит преимущественно от функционирования клеток иммунной системы, поскольку перенос клеток костного мозга СВА облученным мышам CBA/N восстанавливает их ответ на вакцинацию BCG. Перенос клеток эмбриональной печени - предшественников В-лимфоцитов - от мышей СВА необлученным мышам CBA/N также компенсирует дефект вакцинации.

3. Макрофаги, полученные от мышей линий СВА и CBA/N, с одинаковой эффективностью фагоцитируют бактерии BCG. Различия между носителями аллелей мутантного и дикого типа не связаны с фагоцитозом.

4. В отличие от живой вакцины BCG, мыши CBA/N эффективно вакцинируются растворимыми антигенами микобактерий (соникатом), введенными с адъювантом.

5. При использовании в качестве АПК клеток перитонеального экссудата, нагруженных in vivo BCG, клетки мышей СВА эффективно представляют антигены микобактерий Т-клеткам, тогда как АПК от мышей CBA/N — нет.

6. При исследовании динамики миграции клеток в перитонеальную полость после введения BCG оказалось, что нейтрофилы мышей линии CBA/N-xid мигрируют быстрее и в большем количестве по сравнению с нейтрофилами СВА. Эти данные подтверждены в системе Transwcll.

7. Перенос клеток перитонеальной полости от мышей СВА мышам CBA/N приводит к полному выравниванию скорости миграции нсйтрофилов после введения BCG.

8. Динамика экспрессии ключевых хемокинов О-СЭР, хсг1 и КС, участвующих в привлечении нейтрофилов, у мышей СВА и СВАТЫ носит разнонаправленный характер и коррелирует с динамикой миграции нейтрофилов.

9. Удаление нейтрофилов у мышей СВА/Ы с помощью специфических антител за 1 сутки до введения ВСО приводит к достоверному повышению эффективности вакцинации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мыши CBA/N-xid отличаются от мышей конгенной линии СВА точечной миссенс-мутацией в гене btk [Berning А.К. et al., 1980]. Мутация приводит к нарушению дифференцировки В-лимфоцитов, снижению их общего числа, полному отсутствию у мутантов популяции клеток В-1, а также к нарушению гуморального иммунного ответа [Satterthwaite А. В., and Witte О. N., 1996, Satterthwaite А. В., et al., 1997]. Помимо В-клеток, киназа Btk синтезируется в макрофагах, нейтрофилах и ДК [Quek L.S. et al., 1998, Setoguchi R., 1998, Mukhopadhyay S., et al., 2002, Mangla A. et al., 2004], но мутация xid не слишком сильно отражается на их функциях. Ранее было показано, что у мышей CBA/N, в отличие от мышей СВА, после вакцинации BCG не возникает защиты против последующего заражения вирулентной М. tuberculosis. Более того, этот дефект не был связан со способностью В-клеток представлять микобактериальные антигены Т-клеткам [Nikonenko et al., 1996], поэтому оставалось непонятным, почему мутация, затрагивающая преимущественно В-клеточиый иммунитет влияет на Т-зависимый иммунный ответ на вакцину BCG. В данной работе мы оценили вклад различных популяций клеток иммунной системы, несущих ген btk, на формирование протективного иммунного ответа против М. tuberculosis после вакцинации BCG.

На первом этапе исследования мы проверили, действительно ли между мышами двух линий имеются различия по функциональным показателям, зависящим от активности Т-клеток. Исследование продукции ключевого в противотуберкулезном иммунитете цитокина IFN-y Т-лимфоццтами показало, что многократные отличия между мышами СВА и CBA/N по количеству продуцентов IFN-y в легких появляются только после заражения животных, но не на фазе вакцинации (Рис. 8). Отсюда следует вывод о влиянии мутации на формирование Т-клеточной иммунологической памяти. Дополнительно было показано, что дефект мышей линии CBA/N зависит только от функционирования клеток иммунной системы, а не от элементов стромы, поскольку перенос клеток костного мозга СВА облученным мышам CBA/N-xid восстанавливает их ответ на вакцинацию BCG (Рис. 11). Кроме того, перенос клеток ЭП (предшественников В-лимфоцитов) от мышей СВА необлученным мышам CBA/N также компенсирует дефект (Рис. 13). Таким образом, восстановление популяции В-лимфоцитов у мышей CBA/N приводит к тому, что они приобретают способность отвечать на вакцинацию BCG. Этот факт, однако, не объясняет, какую же роль играют В-клетки в формировании протективного иммунного ответа при вакцинации.

Следующим шагом стало изучение влияния мутации xid на функции других клеток иммунной системы, в частности, макрофагов. Мы установили, что макрофаги, полученные от мышей двух линий, с одинаковой эффективностью фагоцитируют бактерии BCG (Рис. 15). Убедившись, что различия между носителями аллелей мутантного и дикого типа не связаны с фагоцитозом, мы проверили, не отличаются ли макрофаги мышей двух линий по способности представлять микобактериальные антигены Т-клеткам. На этом этапе исследований был получен важный факт. Оказалось, что мыши CBA/N эффективно вакцинируются растворимыми антигенами микобактерий (соникатом), введенными с адъювантом (Рис. 14). Такое отличие между эффектом введения цельных микобактерий и растворимых антигенов, с одной стороны, заставило задуматься над проблемой процессинга BCG, а с другой стороны, потребовало переноса тест-системы в условия in vivo, поскольку опыты in vitro с В-клетками и макрофагами не выявили различий между мышами двух линий [Nikonenko et al., 1996].

Для получения АПК in vivo мышам двух линий вводили BCG в брюшную полость и через 2 часа забирали КПЭ и использовали их в качестве АПК для активации специфичных к соникату линий Т-клеток. Оказалось, что полученные таким методом АПК мышей СВА вполне эффективно представляют антигены микобактерий Т-клеткам, тогда как АПК от мышей CBA/N совершенно не способны их активировать (Рис. 17).

Простая проверка клеток экссудата на жизнеспособность показала, что АПК CBA/N, взятые через 2 часа после введения BCG, практически полностью погибли, тогда как АПК СВА, в основном, живы. Эти данные заставили предположить, что сверх быстро погибающие клетки - это нейтрофилы, которые почему-то преобладают в экссудате мышей CBA/N. Важно отметить, что нейтрофилы - это еще один тип клеток, в которых синтезируется киназа Btk.

При исследовании динамики миграции клеток в перитонеальную полость после введения BCG оказалось, что нейтрофилы мышей линии CBA/N-xid мигрируют быстрее и в большем количестве (Рис. 18). Более того, как раз через 2 часа после введения вакцины межлинейные различия достигают максимальных значений, и в экссудате мышей CBA/N преобладают нейтрофилы, а у мышей СВА — моноциты и лимфоциты. В связи с этим возникло и было проверено предположение, что лимфоциты В-1, которые есть у мышей СВА, но отсутствуют у мышей CBA/N, сами по себе, или взаимодействуя с макрофагами, являются фактором подавления миграции нейтрофилов. На это указывали и результаты опытов in vivo, в которых перенос клеток перитонеальной полости от мышей СВА мышам CBA/N приводил к полному выравниванию скорости миграции нейтрофилов после введения BCG (Рис. 19). В опытах in vitro по миграции нейтрофилов через мембрану в системе Transwell, мы показали, что нейтрофилы с мутацией xid значительно превосходят нейтрофилы дикого типа по скорости миграции (Рис. 20.). Таким образом, нам удалось установить, что разница в составе клеток, мигрирующих к месту введения вакцины BCG, объясняется особой подвижностью мутантных нейтрофилов. Учитывая, что киназа Btk принимает участие в сигнальных путях, связанных с движением клеток [Guinamard R. et al., 1998, Chen F. et al., 2000], наши результаты могут быть напрямую связаны с подобной активностью.

Тем не менее, в системе Transwell нам не удалось воспроизвести эффект подавления миграции нейтрофилов какими-либо клетками мышей СВА. Более того, оказалось, что присутствие в нижней камере тест-системы различных клеток мышей СВА лишь усиливает миграцию нейтрофилов (Рис. 20). Учитывая, что в опытах по переносу in vivo клетки СВА вполне эффективно отменяли ускоренную миграцию нейтрофилов CBA/N (Рис. 19), следует сделать вывод, что макрофаги и (или) лимфоциты дикого типа подавляют миграцию нейтрофилов опосредовано, возможно, воздействуя на клетки эпителия полостей или эндотелия сосудов.

Мы предполагаем, что у мышей CBA/N при вакцинации могут происходить следующие события. При вакцинации BCG к месту введения очень быстро мигрируют нейтрофилы и фагоцитируют значительную часть BCG. Однако сами нейтрофилы не являются эффективными АПК, поэтому создается эффект изоляции бактерий от профессиональных АПК - макрофагов. Это препятствует активации Т-клеток и формированию полноценного иммунного ответа на самых ранних фазах. Напротив, у мышей СВА значительная доля BCG попадает сразу в макрофаги, мигрирующие к месту введения без отставания от нейтрофилов.

Безусловно, и у мышей CBA/N макрофаги могут фагоцитировать нейтрофилы с содержащимися в них бактериями, однако этот путь не приводит к тем же последствиям, что прямой фагоцитоз BCG. Показано, что фагоцитоз апоптотических нейтрофилов, содержащих бактерии BCG, приводит к повышенному синтезу макрофагами PGE2 (простагландин Е2) и TGF-pi (transforming growth factor pi). В свою очередь, эти блокирующие воспаление факторы вызывают снижение собственной бактерицидной активности макрофагов (D'Avilla Н., et al., 2008). Кроме того, повышенный уровень PGE2 приводит к снижению Т-клеточного ответа [Hsueh et al., 1979, Hines et al., 1995]. Таким образом, большое число нейтрофилов, мигрирующих в место введения BCG, может не только изолировать бактерии от АПК, но и мешать активации макрофагов. Ключевым подтверждением отрицательной роли нейтрофилов при формировании ответа на вакцину BCG стали опыты по элиминации нейтрофилов in vivo. Удаление нейтрофилов путем введения блокирующих антител за сутки до вакцинации мышей CBA/N (Рис. 22) привело к достоверному повышению эффективности вакцинации BCG. что выразилось в 7-кратном снижении количества вирулентных микобактерий в легких и селезенке после заражения подопытных животных по сравнению с контрольными животными, которым вводились антитела другой специфичности (рис. 23).

Суммируя полученные результаты, мы можем утверждать, что неоднократно отмечавшаяся отрицательная роль нейтрофильного воспаления при внутриклеточных инфекциях [Eruslanov Е.В., et al., 2005, Keller С., et al., 2006], нашими результатами распространяется и на вакцинацию против этих инфекций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Линге, Ирина Андреевна, 2009 год

1. Никоненко Б.В., Хайдуков С.В., Литвинов И.С., Бочарова И.В., Апт А.С., 2001. Иммунологическая память у мышей линии СВА и CBA/N при вакцинации Mycobacterium bovis (BCG). БЭБиМ, 131(6): 649-651.

2. Almeida S.R., Aroeira L.S., Frymuller E., Dias M.A., Bogsan C.S., Lopes J.D., Mariano M., 2001. Mouse B-l cell-derived mononuclear phagocyte, a novel cellular component of acute non-specific inflammatory exudate. Int. Immunol, 13: 1193-1201.

3. Al-Qaoud K.M., Fleischer В., Hoerauf A., 1998. The Xid defect imarts susceptibility to experimental murine filariosis — assotiation with a lack of antibody and IL-10 production by В cells in response to phosphorylholine. Int Immunol, 10: 17-25.

4. Appelberg R, Castro A.G., Gomes S., Pedrosa J., Silva M.T., 1995. Susceptibility of beige mice to Mycobacterium avium: role of neutrophils. Infect. Immunol., 63: 3381-3387.

5. Armstrong J.A., Hart P.D., 1975. Phagosome-lysosome interactions in cultured macrophages infected with virulent tubercle bacilli. Reversal of the usual nonfusion pattern and observations on bacterial survival. J Exp Med, 142:1-16.

6. Banchereau J., and Steinman R. M., 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245.

7. Bean A.G., Roach D.R., Briscoe H., France M.P., Korner H., Sedgwick J.D.,

8. Britton W.J., 1999. Structural deficiencies in granuloma formation in TNF gene-targeted mice underlie the heightened susceptibility to aerosol Mycobacterium tuberculosis infection which is not compensated for by lymphotoxin. J Immunol, 162:3504-11.

9. Berning A.K., Eicher E. M., Paul W.E., Scher I., 1980. Mapping of the X-linked immune deficiency mutation(xid) of CBA/N mice. The Journal of Immunology 12Щ)-. 1875-1877.

10. Bloom B.R., Fine P.E.M., 1994. The BCG experience: implications for future vaccines against tuberculosis. In: Bloom B.R., ed. Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and control. Washington, DC: American Society for Microbiology, 531-557.

11. Brand L., Elhay M., Rosenkrands I., Lindblad E.B., Andersen P., 2000. ESAT-6 subunits vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect Immiin 68:791-795.

12. Brightbill H.D., Libraty D.H., Krutzik S.R., et al., 1999. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through Toll-like receptors. Science, 285:732-739.

13. Casali P. and Schettino E.W. 1996. Structure and function of natural antibodies. Curr. Top. Microbiol. Immunol210: 167-179.

14. Casanova J.L., Abel L., 2002. Genetic dissection of immunity to mycobacteria: the human model. Annu. Rev. Immunol. 20: 581-620.

15. Cataisson C., Pearson A.J., Tsien M.Z., et al., 2006. CXCR2 ligands and G-CSF mediate PKCalpha-induced intraepidermal inflammation. J Clin Invest. 116:2757-2766.

16. Chun J.-K., Lee T.J., Song J.W., Linton J.A., Kim D.S., 2008. Analysis of clinical presentation of Bruton Disease: a review of 20 years of accumulated data from pediatric patients at Severance hospital. Younsei Med Journal, 49(1): 28-36.

17. Conley M.E., Rohrer J., Rapalus L., Boylin E.C., Minegishi Y., 2000. Defects in early B-cell development: comparing the consequences of abnormalities in pre-BCR signaling in the human and the mouse. Immunol Rev., 178:75-90.

18. Constant S. L., Sant'Angelo D., Pasqualini T., Taylor T., Levin D., Flavell R., Bottomly K., 1995. Peptide and protein antigens require distinct antigen-presenting cell subsets for priming of CD4+ T cells. J. Immunol. 154: 4915.

19. Constant, S. L. 1999. B lymphocytes as antigen-presenting cells for CD4 T cell priming in vivo. J. Immunol. 162:5695.

20. Cooper A.M., Dalton D.K., Stewart T.A., Griffin J.P., Russell D.G., Orme I.M., 1993. Disseminated tuberculosis in interferon gamma genedisrupted mice. J Exp Med, 178:2243-7.

21. Cooper A.M., Magram J., Ferrante J., Orme I.M., 1997. Interleukin 12 (IL-12) is crucial to the development of protective immunity in mice intravenously infected with Mycobacterium tuberculosis. J Exp Med, 186:39-45.

22. Deininger, M. H., Meyermann, R. and Schluesener, H. J., 2002. The allograft inflammatory factor-1 family of proteins. FEBS Lett. 514: 115-121.

23. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol., 1997, 15:617-648.

24. Duin D., Medzhitov R., Shaw A. C., 2006. Triggering TLR signaling in vaccination. Trends in Immunology, 27(1): 49-55.

25. Dutton R. W., Bradley L. M., Swain S. L., 1998. T cell memory. Annu. Rev. Immunol. 16:201.

26. Ehlers M.W., Daffe M., 1998. Interactions between Mycobacterium tuberculosis and host cells: are mycobacterial sugars the key? Trends Microbiol', 6:328-35.

27. Ehlers S., 2003. Role of tumour necrosis factor (TNF) in host defence against tuberculosis: implications for immunotherapies targeting TNF. Ann Rheum Dis., 62(Suppl II): 1137-1142.

28. Epstein M. M., Rosa F. D., Jankovic D., Sher A., Matzinger P., 1995. Successful T cell priming in B cell deficient mice. J. Exp. Med. 182:915.

29. Ernst J.D., 1998. Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun-, 66:1277-1281.

30. Eruslanov E. B., Lyadova I. V., Kondratieva T. K., Majorov K. B., Scheglov I. V., Orlova M. O., Apt A. S. 2005. Neutrophil responses to Mycobacterium tuberculosis infection in genetically susceptible and resistant mice. Infect. Immun. 73, 1744-1753.

31. Eruslanov E.B., Lyadova I.V., Kondratieva T.K., Majorov K.B., Sheglov I.V., Orlova M.O., Apt A.S., 2005. Neutrophil response to Mycobacterium tuberculosis infection in genetically susceptible and resistant mice. Infect. Immunol., 73: 1744-1753.

32. Ferran G., Langen H., Naito M., Pieters J. 1999. A coat protein on phagosomes involved in the intracellular survival of mycobacteria. Cell. 97, 435-447.

33. Flynn J.L., Chan J., 2001. Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immunol., 19: 93 -129.

34. Fratazzi C., Arbeit R.D., Carini C., Balcewicz-Sablinska M.K., Keane J., Kornfeld H., Remold H.G., 1999. Macrophage apoptosis in mycobacterial infections. Journal of Leukocyte Biolol, 66:763-764.

35. Fremond C.M., et al., 2004. Fatal Mycobacterium tuberculosis infection despite adaptive immune response in the absence of MyD88. J. Clin. Invest., 114: 1790-1799.

36. Fulton S.A., Martin T.D., Redline R.W., Boom H.W., 2000. Pulmonary immune response during priming Mycobacterium ¿»ov/s-Calmette-Guerine bacillusninfection in C57B1/6 mice. Am J. Respir. Cell. Mol. Biol., 22: 333-343.

37. Geisel R. E., Sakamoto K., Russell D. G., Rhoades E. R. 2005. In vivo activity of released cell wall lipids of M. bovis BCG is due to trehalose mycolates. J. Immunol. 174, 5007-5015.

38. Gray P., Dunne A., Brikos C., Jefferies C.A., Doyle S.L., O'Neill L.A.J., 2006. MyD88 adapter-like (Mai) is phosphorylated by Bruton's tyrosine kinase during TLR2 and TLR4 signal transduction. Journal of Biol. Chem., 281(15): 10489-10495.

39. Gregory A.D., Hogue L.A., Ferkol T.W., Link D.C., 2007. Regulation of systemic and local neutrophil responses by G-CSF during pulmonary Pseudomonas aeruginosa infection. Blood, 109:3235-3243.

40. Guinamard R., Aspenstrom P., Fougereau M., Chavrier P., Guillemot J.-C., 1998. Tyrosine phosphorilation of the Wiskott-Aldrich syndrome protein by Lyn and Btk is regulated by CDC42. FEES Letters 434: 431-436.

41. Hanekom W.A., Abel B., Scriba T.J., 2007. Immunological protection against tuberculosis. SAMJ, 97(10): 973-977.

42. Hardy R.R., Hayakawa K., Parks D.R., Herzenberg L. A., 1983. Demonstration of B-cell maturation in X-linked immunodeficient mice by simultaneous three-colour immunofluorescence. Nature 306:270.

43. Hart P.D., Sutherland 1., 1977. BCG an vole bacillus vaccines in the prevention of tuberculosis in adolescence and early adult life. Br Med J, 2: 293-295.

44. Hata D., Kitaura J., Hartman S.E., Yokota T., Kawakami T., 1998. Bruton's tyrosine kinase-mediated Inteleukin-2 gene activation in mast cells. The Journal of Biol Chemistry, 273: 10979-10987.

45. Hayakawa K. And Hardy R.R., 2000. Development and function of B-l cells. Curr. Opin. in Immunology 12: 346-353.

46. Herrmann P., Schreier M.H., Bazin H., Zinkernagel R.M., Cerny A., 1988. Delayed type hypersensitivity (DTH) in anti-IgM-treated B cell-depleted mice: analysis of induction and effector phase. Immunobiology, 177: 382.

47. Herzenberg L.A., 2000. B1 cells: the lineage question revisited. Immunological reviews, 175: 9-22.

48. Hines M.E., Kreeger J.M., Herron A.J., 1995. Mycobacterial infections of animals: pathology and pathogenesis. Lab Anim Sci. 45: 334-351.

49. Hoerhauf A., Solbac W., Lohoff M., Rollinghoff M., 1994. The xid defect determines an improved clinical course of murine leishmaniasis in susceptible mice. Int Immunol., 6: 1117-1124.

50. Horng T., Barton G.M., Flavell R.A., Medzhitov R., 2002. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like recep-tors,1. Nature, 420: 329-333.

51. Hsueh W., Kuhn C., Needleman P., 1979. Relationship of prostaglandin secretion by rabbit alveolar macrophages to phagocytosis and lysosomal enzyme release. Biochem J. 184: 345-354.

52. Hunter R.L., Olsen M., Jagannath C., Actor J.K. 2006. Trehalose 6, 6'-dimycolate and lipid in the pathogenesis of caseating granulomas of tuberculosis in mice. Am. J. Pathol. 168, 1249-1261.

53. Huygen K, Content J, Denis O., 1996. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nature Med, 2:893-898.

54. Huygen K., 1998. DNA vaccines: application to tuberculosis. Int. J. Tuberc. LungDis., 2:971-978.

55. Islam T.C. and Smith C.I.E., 2000. The cellular phenotype condi-tions Btk for cell survival or apoptosis signaling. Immunol. Rev. 178: 49-63.

56. Jackson M., Phalen S.W., Lagranderie M., 1999. Persistence and protective efficacy of a Mycobacterium tuberculosis auxotroph vaccine. Infect. Immun., 67: 2867-2873.

57. Janeway C.A., Jr., and Medzhitov R., 2002. Innate immune recognition. Annu.Rev. Immunol. 20: 197—216.

58. Jefferies C.A., Doyle S., Brunner C., Dunne A., Brint E., Wietek C., Walch E., Wirth T., O'Neill A.J., 2003. Brutton's tyrosine kinase is a Toll/interleukinl

59. Receptor domain-binding protein that participates in nuclear factor kB by Tolllike receptor 4. The Journal of Biological Chemistry 278, 26258-26264.

60. Junqueira-Kipnis A.P., Kipnis A., Tamayo M.H., Harton M., Juarrero M.G., Basaraba R.J., Orme I.M., 2005. Interleukin-10 production by lung macrophages in CBA xid mutant mice infected with Mycobacterium tuberculosa Immunology, 115: 246-252.

61. Ke Z. and Yuan L., 2007. Role of different protein tyrosine kinases in fMLP-induced neutrophil transmigration. Immunobiology, 213: 13-23.

62. Keller C., Hoffmann R., Lang R., Brandau S., Hermann C., Ehlers S., 2006. Genetically determined susceptibility to tuberculosis in mice causally involves accelerated and enhanced recruitment of granulocytes. Infection and Immunity, 74: 4295-^1309.

63. Khan W.N., 2001. Regulation of B lymphocyte development and activation by Bruton's tyrosine kinase. Immunol Res., 23:147-156.

64. Knapp S., Hareng L., Rijneveld A.W., 2004. Activation of neutrophils and inhibition of the proinflammatory cytokine response by endogenous granulocyte colony-stimulating factor in murine pneumococcal pneumonia. J Infect Dis. 189:1506-1515.

65. Laskay T., van Zandbergen G., Solbach W. 2003. Neutrophil granulocytes -Trojan horses for Leishmania major and other intracellular microbes? Trends Microbiol. 11, 210-4.

66. Le Naour, F., Prenant, M., Francastel, C., Rubinstein, E., Uzan, G. and Boucheix, C., 1996. Transcriptional regulation of the human CD9 gene: characterization of the 5'-flanking region. Oncogene. 13: 481—486.

67. Levy L., Aizer F., Bejar C., Lutsky I., Mor N., 1984. Experimental mycobacterial infections of CBA/N mice. Isr J Med Sci., 20(7):598-602.

68. Lieschke G.J., Grail D., Hodgson G., 1994. Mice lacking granulocyte colony-stimulating factor have chronic neutropenia, granulocyte and macrophage progenitor cell deficiency, and impaired neutrophil mobilization. Blood. 84:1737-1746.

69. Lindvall J.M., Blomberg K.E.M., Berglof A., Yang Q„ Smith E.C.I., Islam T.C., 2004. Gene expression profile of B cells from Xid mice and Btk KO mice. Eur. J. Immunol. 34: 1981-1991.

70. Linton P.-J., Harbertson J., Bradley L. M., 2000. A Critical Role for B Cells in the Development of Memory CD4 Cells. The Journal of Immunology, 165: 5558-5565.

71. Linton P.J., Harbertson J., Bradley L.M., 2000. A critical role for B cell in the development of memory CD4 T cell. The Journal of Immunology, 165: 55585565.

72. Makinoshima H„ Glickman M. 2005. Regulation of Mycobacterium tuberculosis cell envelope composition and virulence by intramembrane proteolysis. Nature, 436, 406-409.

73. Manfredi A.A., Heltai S., Rovere P., et al., 1998. Mycobacterium tuberculosis exploits the CD95 /CD95 ligand system of cd T cells to cause apoptosis. Eur J Immunol, 28:1798-806.

74. Mangla A., Khare A., Vineeth V., Panday N.N., Ravindran B., Bal V., George A., Rath S., 2004. Pleiotropic consequences of Bruton tyrosine kinasedeficiency in myeloid lineages lead to poor inflammatory responses. Blood 104(4): 1191-1197.

75. Mano H., 1999. Tec family of protein-tyrosine kinase: an overview of their structure and function. Cytokine Growth Factor Rev. 10: 267-280.

76. Martineau A.R., Newton S.M., Wilkinson K.A., Kampmann B., Hall B.M., Nawrolly N., 2007. Neutrophil mediated innate imune resistance to mycobacteria. J. Clin. Invest. 117: 1988-1994.

77. Matsuzaki G., Vordermeier H. M., Hashimoto A., Nomoto K. Ivanyi J., 1999. The Role of B Cells in the Establishment of T Cell Response in Mice Infected with an Intracellular Bacteria, Listeria monocytogenes. Cellular Immunology 194, 178-185.

78. McCool T.L., Weiser J.N., 2004. Limited role of antibody in clearance of Streptococcus pneumoniae in a murine model of colonization. Infect Immun. 72(10):5807-5813.

79. Means T.K., Wang S., Lien E., Yoshimura A., Golenbock D.T., Fenton M.J., 1999. Human Toll-like receptors mediate cellular activation by Mycobacterium tuberculosis. J Immunol, 163:3920-3927.

80. Moore K.W., O'Garra A., de Waal Malefyt R., Vieira P., Mosmann T.R, 1993. Interleukin-10. Annu. Rev. Immunol., 11: 165-190.

81. Mukhopadhyay S., George A., Bal V., Ravindran B., Rath S., 1999. Brutton's tyrosine kinase deficiency in macrophages inhibits nitric oxide generation leading to enhancement of IL-12 production. The Journal of Immunology 163: 1786.

82. Murray P.J., Aldovini A. and Young R.A., 1996. Manipulation and potentiation of antimycobacterial immunity using recombinant bacilli Calmette-Guerin strains that secrete cytokines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:934-939.

83. Myers C.A., Serbina N., Klein E., Triebold K.J., Bloom B.R., Flynn J.L., 1999. Mice deficient in CD4 T cells have only transiently diminished levels of IFN-c, yet succumb to tuberculosis. J Immunol, 162:5407-16.

84. Narendran A., Ramsden D., Cumano A., Tanaka T., Wu G.E., Paige C.J., 1993. B cell developmental defects in X-linked immunodeficiency. Int Immunol, 5:139-44.

85. Nathan C., 2006. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immnol. 6: 172-182.

86. Nickonenko B. V., Averbakh M. M., Jr., Lavebratt C., Schurr E., Apt A. S. 2000. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tubercle Lung Dis. 80, 15-25.

87. Nickonenko B.V., Mezhlumova M.B., Apt A.S., Moroz A.M., 1990. Genetic regulation of the host response to infection with Mycobacterium bovis (BCG) sad. Mycobacterium tuberculosis 1137RV. Bull. Exp. Biol. Med., 11: 226-228.

88. Ochsenbein A.F., Fehr T., Lutz C., Suter M., Brombacher F., Hengartner H., Zinkernagel R.M., 1999. Control of early viral and bacterial distribution and disease by natural antibodies. Science, 286: 2156-2159.

89. Paciorkowski N., Porte P., Shultz L.D., Rajan T.V., 2000. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J Exp Med. 191(4):731-736.

90. Pedrosa J., Saunders B.M., Appelberg R., Orme I.M., Silva M.T., Cooper A.M., 2000. Neutrophils play a protective nonphagocytic role in systemic Mycobacterium tuberculosis infection of mice. Infect. Immunol., 68: 577-583.

91. Petro J.B., Castro I., Lowe J., Khan W. N., 2002. Brutton's tyrosine kinase targets NF-kB to the bcl-x promoter via a mechanism involving phospholipase C-y2 following B cell antigen receptor engagement. FEBS letters 532: 57-60.

92. Phillips J.A., Romball C.G., Hobbs M.V., Ernst D., Shulz L., Weigle W. O., 1996. CD4 T cell activation and tolerance induction in B cell knockout mice. J. Exp. Med. 183:1339.

93. Popi A.F., Lopes J.D., Mariano M., 2004. Interleukin-10 secreted by B-l cells modulates the phagocytic activity of murine macrophages in vitro. Immunology, 113: 348-354.

94. Pym A.S., Brodin P., Majlessi L., Brosch R., Demangel C., Williams A., Griffiths A.E., Marshal G., Leclerc C., Cole S.T., 2003. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med, 9: 533-539.

95. Qiu Y. and Kung Ii.-J., 2000. Signaling network of the Btk family kinases. Oncogene, 19: 5651-5661.

96. Quek L.S., Bolen J. Watson S.P., 1998. A role for Brutton's tyrosine kinase (BTK) in platelet activation by collagen. Curr Biol., 8: 1137-1140.

97. Radaeva T.V., Kondratieva E.V., Sosunov V.V., Majorov K.B., Apt A.S., 2008. A human-like TB in genetically susceptible mice followed by the true latency in a Cornell-like model. Tuberculosis (Edinb), 88(6):576-85.

98. Rawlings D. J., Saffran D. C., Tsukada S., Largaespada D. A., Grimaldi J. C., Cohen L., Mohr R. N., Bazan J. F., Howard M., Copeland N. G., Jenkins N. A., Witte O. N., 1993. Science 261, 358-361.

99. Riggs J., Howell K., Matechin B., Matlack R., Pennello A., Chiasson R., 2003. X-ehromosome-linked immune-deficient mice have Bib cells. Immunology 108: 440-451.

100. Romano M., Denis O., D'Souza S., 2004. Induction of in vivo functional Db-restricted cytolytic T cell activity against a putative phosphate transport receptor of Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol., 172:6913-6921.

101. Russell D. G. 2001. Mycobacterium tuberculosis: here today, and here tomorrow. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 569-577.

102. Russell D. G. 2007. Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat. Rev. Microbiol. 5: 39-47.

103. Salim K., Bottomley M. J., Querfurth E., Zvelebil M. J., Gout I., Scaife R., Margolis R. L., Gigg R., Smith C. I., Driscoll P. C., Waterfield M. D., and PanayotouG., 1996.EMBOJ. 15: 6241-6250.

104. Satterthwaite A. B., Cheroutre H., Khan W. N., Sideras P., and Witte O. N., 1997. Btk dosage determines sensitivity to B cell antigen receptor cross-linking. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94-13152.

105. Satterthwaite, A. B., and O. N. Witte. 1996. Lessons from human genetic variants in the study of B-cell differentiation. Curr. Opin. Immunol. 8:454.

106. Schmidt N.W., Thieu V.T., Mann B.A., Ahyi A-N., Kaplan M.H., 2006. Bruton's tyrosine kinase is required for TLR-induced IL-10 production. The Journal of Immunology, 177: 7203-7210.

107. Segal A. W., 2005. How neutrophils kill microbes. Ann. Rev. Immunol. 23, 197-223.

108. Seiler P., Aichele P., Raupach B., Odermatt B., Steinhoff U., and Kaufmann S. H., 2000. Rapid neutrophil response controls fast-replicating intracellular bacteria but not slow-replicating Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. 181:671-680.

109. Setoguchi R., Kinashi T., Sagara H., Hirosawa K., Takatsu K., 1998. Defective degranulation and calcium mobilization of bone-marrow derived mast cells from Xid and Btk deficient mice. Immunol. Lett. 64: 109-118.

110. Shahbazian L.M., Quinton L.J., Bagby G.J., Nelson S., Wang G., Zhang P., 2004. Escherichia coli pneumonia enhances granulopoiesis and the mobilization of myeloid progenitor cells into the systemic circulation. Crit Care Med., 32:1740-1746.

111. Skea D.L., Underdown B.J., 1991. Acquired resistance to Giardia muris in X-linked immunodeficient mice. Infect Immun., 59(5):1733-1738.

112. Skjot R.L.V., Oettinger T., Rosenkrands I., 2000. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect Immun., 68:214-220.

113. Souza C., Cooper A.M., Frank A.A., Mazzaccaro R.J., Bloom B.R., Orme I.M., 1997. An anti-inflammatory role for y5 T lymphocytes in acquired immunity to Mycobacterium tuberculosis. J Immunol, 158:1217-21.

114. Stewart G. R., Robertson B. D., Young D. B. 2003. Tuberculosis: a problem with persistence. Nat. Rev. Microbiol. 1, 97-105.

115. Sturgill-Koszycki S., Schaible U.E., Russell D.G., 1996. Mycobacterium containing phagosomes are accessible to early endosomes and reject a transitional state in normal phagosome biogenesis. EMBOJ, 15:6960-8.

116. Tanghe A., Lefevre P., Denis O., 1999. Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis DNA vaccines encoding putative phosphate transport receptors. J. Immunol., 162:1113-1119.

117. Teitelbaum R., Glatman-Freedman A., Chen B., Robbins J.B., Unanue E., Casadevall A., Bloom B.R., 1998. A mAb recognizing a surface antigen of Mycobacterium tuberculosis enhances host survival. Proc. Natl. Acad. Sei. 95: 15688-15693.

118. Thomas J. D., Sideras P., Smith C. I., Vorechovsky I., Chapman V., Paul W. E., 1993. Science 261, 355-358.

119. Uckun F.M., 1998. Bruton's tyrosine kinase (BTK) as a dual-function regulator of apoptosis. Biochem Pharmacol., 56(6):683-691.

120. Wardemann H., Boehm T„ Dear N., Carsetti R., et al., 2002. B-la B cells that link the innate and adaptive immune response are lacking in the absence of the spleen. J. Exp. Med., 195(6): 771-780.

121. Weill-Halle B., 1980. Routes and methods of administration: oral vaccination, p. 175-181. In S.R. Rosental (ed.), BCG Vaccine: Tuberculosis-Cancer. PSG Publishing, Littleton, Mass.

122. Zinkemagel R. M., Ehl S., Aichele P., Oehen S., Kundig T., Hengartner H., 1997. Antigen localization regulates immune responses in a dose- and time-dependent fashion: a geographical view of immune reactivity. Immunol. Rev.156:199.