Антибактериальное, в том числе антимикобактериальное, действие экзогенного кардиолипина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Микулович, Юлия Львовна

• Микулович, Юлия Львовна
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Микулович, Юлия Львовна

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

3.1. Структура клеточной оболочки Mycobacterium tuberculosis и фосфолипидный состав микобактерий.

3.2. Структура клеточной оболочки Escherichia coli и фосфолипидный состав бактерий.

3.3. Кардиолипин.

3.3.1. Исторический очерк.

3.3.2. Локализация.

3.3.3. Структура и свойства.

3.3.4. Метаболизм в прокариотических клетках.

3.3.4.1. Биосинтез.

3.3.4.2. Катаболизм.

3.3.5. Неравномерное распределение в бактериальных мембранах с образованием доменов.

3.3.6. Взаимодействие с бактериальными мембраносвязанными белками в различных процессах клеточного цикла.

3.3.6.1. Репликация ДНК.

3.3.6.2. Деление клетки.

3.3.6.3. Транспорт белков и других веществ.

3.3.6.4. Дыхание клетки.

3.3.6.5. Образование спор.

3.3.7. Ингибирующее действие на ферменты.

3.4. Основные группы антибиотиков, их мишени и механизмы действия.

3.4.1. Ингибиторы репликации ДНК.

3.4.2. Ингибиторы синтеза РНК.

3.4.3. Ингибиторы синтеза клеточной стенки.

3.4.4. Ингибиторы синтеза белков.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Характеристика полученных липосом на основе кардиолипина и исследование их стабильности при хранении.

4.2. Влияние липосом из кардиолипина на рост чувствительного к противотуберкулезным препаратам лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv.

4.3. Влияние липосомального кардиолипина на рост резистентных штаммов М. tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

4.4. Действие экзогенного липосомального кардиолипина на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium.

4.5. Анализ эндогенных фосфолипидов Mycobacterium tuberculosis H37Rv в разных фазах роста (логарифмической, ранней и поздней стационарной).

4.6. Выявление механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина.

4.6.1. Исследование стабильности липосом из кардиолипина в условиях роста

М. tuberculosis.

4.6.2. Получение лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной кислоты и исследование их влияния на рост М. tuberculosis H37Rv.

4.6.2.1. Получение лизопроизводных кардиолипина.

4.6.2.2. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D.

4.6.2.3. Определение критических концентраций мицеллообразования кардиолипина и продуктов его деструкции.

4.6.2.4. Изучение влияния лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной и линолевой кислот на рост М. tuberculosis H37Rv.

4.6.3. Установление возможных механизмов бактерицидного действия экзогенного липосомального кардиолипина на Е. coli.

4.6.3.1. Выявление мишеней кардиолипина.

4.6.3.2. Влияние кардиолипина на реакции, катализируемые топоизомеразой I и ДНК-гиразой из Е. coli, in vitro.■.

4.6.3.3. Оценка содержания супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli в присутствии липосомального кардиолипина.

4.6.4. Исследование жизнеспособности клеток Е. coli и М. tuberculosis при культивировании с летальными концентрациями кардиолипина в присутствии антиоксидантов.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5.1. Материалы и оборудование.

5.2. Методы.

5.2.1. Получение липосом.

5.2.2. Определение степени окисления кардиолипина.

5.2.3. Идентификация продуктов деструкции кардиолипина методами ТСХ и MALDI-TOF масс-спектрометрии после его инкубации в бульоне Дюбо.

5.2.4. Получение лизо- и бислизокардиолипина.

5.2.5. Получение фосфатидной кислоты полусинтезом с использованием фосфолипазы D.

5.2.6. Определение критических концентраций мицеллообразования липидов.

5.2.7. Исследования па Mycobacterium tuberculosis.

5.2.7.1. Получение стандартизованной по генотипу, лекарственной чувствительности, фазе роста и колониеобразующим единицам культуры чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью.

5.2.7.2. Влияние экзогенного липосомального кардиолипина на рост чувствительного к противотуберкулезным препаратам и резистентных штаммов М. tuberculosis.

5.2.7.2.1. Культивирование М. tuberculosis в авоматизированной системе

ВАСТЕС MGIT 960.

5.2.7.2.2. Оценка роста М. tuberculosis методом ПЦР в реальном времени.

5.2.7.2.3. Определение жизнеспособности М. tuberculosis культуральным методом (подсчет КОЕ).

5.2.7.2.4. Оценка жизнеспособности М. tuberculosis микроскопией с окразкой мазков по методу Мурохаши.

5.2.7.2.5. Определение жизнеспособности М. tuberculosis методом ПЦР с обратной транскрипцией по количеству мРНК.

5.2.7.2.6. Регистрация роста М. tuberculosis в присутствии липосомального кардиолипина и антиоксиданта.

5.2.7.3. Оценка роста М. tuberculosis H37R.V при культивировании с лизо- и бислизокардиолипином, фосфатидной и линолевой кислотами.

5.2.7.4. Анализ эндогенных фосфолипидов М. tuberculosis H37Rv в разных фазах роста.

5.2.7.4.1. Культивирование М. tuberculosis H37Rv.

5.2.7.4.2. Экстракция липидов из клеток М. tuberculosis H37Rv, находящихся в разных фазах роста.

5.2.7.4.3. Количественный анализ фосфолипидов в полученных экстрактах липидов.

5.2.7.4.3.1. Определение липидного фосфора модифицированным методом Бартлета.

5.2.7.4.3.2. Определение содержания фосфолипидов денситометрией.

5.2.8. Определение жизнеспособности стрептококков и стафилококков при культивировании с липосомальным кардиолипином методом подсчета КОЕ.

5.2.9. Исследования на Escherichia coli.

5.2.9.1. Оценка жизнеспособности Escherichia coli при культивировании с липосомальным кардиолипином в отсутствие и в присутствии антиоксидантов.

5.2.9.2. Изучение ДНК-репарационного SOS-ответа Е. coli при инкубации с кардиолипином.

5.2.9.3. Изучение влияния кардиолипина на скорость трансляции белков Е. coli.

5.2.9.4. Влияние липосомального кардиолипина на активность ДНК-топоизомераз I и II типа из Е. coli.Ill

5.2.9.4.1. Получение суперскрученной ДНК из Е. coli для реакций с топоизомеразой I и ДНК-гиразой.

5.2.9.4.2. Получение релаксированной ДНК для реакции с ДНК-гиразой в присутствии АТФ.

5.2.9.4.3. Реакция релаксации суперскрученной ДНК, катализируемая топоизомеразой I.

5.2.9.4.4. Реакция релаксации суперскрученной ДНК, катализируемая ДНК-гиразой в отсутствие АТФ.

5.2.9.4.5. Реакция суперскручивания релаксированной ДНК, катализируемая ДНК-гиразой в присутствии АТФ.

5.2.9.4.6. Исследование накопления ДНК с одно- и двухцепочечньми разрывами под действием кардиолипина на топоизомеразу I и ДНК-гиразу.

5.2.9.5. Люцигенин-активируемая хемилюминесценция клеток Е. coli в присутствии кардиолипина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антибактериальное, в том числе антимикобактериальное, действие экзогенного кардиолипина»

Актуальность темы. Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество антибиотиков, борьба с туберкулезом (ТБ) до сих пор не окончена. Это связано со способностью возбудителя ТБ - Mycobacterium tuberculosis (МБТ) - переходить в дормантное (некультивируемое состояние), формируя латентную инфекцию, и приобретать резистентность к противотуберкулезным препаратам (ПТП). Эти факторы осложняют диагностику заболевания и его лечение. Схема терапии ТБ включает в себя прием одновременно нескольких ПТП в течение длительного периода времени, что сопровождается появлением у пациентов побочных эффектов. Кроме того, многие ПТП токсичны для организма человека, а лечение больных, зараженных резистентными штаммами МБТ, оказывается малоэффективным. Ввиду указанных выше недостатков ПТП актуальной является разработка принципиально новых лекарственных препаратов на основе природных наноразмерных липидных структур - липосом, которые легко захватываются фагоцитирующими клетками человека, в том числе макрофагами, в которых размножаются микобактерии туберкулеза [1, 2]. Таким образом, с помощью липосом можно осуществить направленный транспорт лекарственных препаратов. Кроме того, минимальные ингибирующие концентрации (МИК) липосомальных форм ПТП в несколько раз меньше МИК традиционных форм препаратов [3, 4]. Как правило, липосомы с включенными в них препаратами получают на основе фосфатдилихолина (ФХ), который присутствует также в плазматической мембране фагоцитирующих клеток человека.

Ранние работы нашей лаборатории были посвящены изучению влияния «пустых» (не содержащих антибиотик) липосом различного липидного состава (из ФХ, кардиолипина (KJI), гликосфинголипидов) на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv [5]. Было показано, что сами липосомы из КЛ обладают ингибирующим действием на рост этого микроорганизма. В связи с полученными результатами важным представлялось изучение действия липосомального KJI на различные штаммы М. tuberculosis с перспективой создания новых форм лекарственных препаратов для лечения туберкулеза путем инкапскулирования в липосомы на основе KJI известных на сегодняшний день ПТП.

Цель работы - изучение антибактериальной активности экзогенного липосомального KJI в отношении различных бактерий, в том числе М. tuberculosis, и установление возможных механизмов бактерицидного действия KJI.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

• получение и характеристика липосом на основе КЛ - липида природного происхождения, выделенного из сердца быка;

• оценка влияния липосомального KJI на рост чувствительного к ПТП лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv;

• исследование действия липосом из KJ1 на рост резистентных к ПТП клинических штаммов М. tuberculosis (с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ));

• изучение влияния липосомального KJI на рост грамотрицательных и грамположительных бактерий, не относящихся к роду Mycobacterium',

• исследование стабильности липосом на основе KJI в условиях роста М. tuberculosis (степень окисления липида, деструкция);

• выявление мишеней и механизма бактерицидного действия экзогенного липосомального KJ1 на Е. coli.

Научная новизна работы. Впервые исследовано влияние липосом из KJ1 на рост бактерий: Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli. Установлено бактерицидное действие KJI на чувствительный к ПТП штамм М. tuberculosis H37Rv и штаммы М. tuberculosis с МЛУ и ШЛУ (МИК = 335 мкМ), а также на E.coli (МИК = 500 мкМ) и Streptococcus pneumoniae (МИК = 100 мкМ).

Изучена стабильность препарата КЛ в виде липосом (степень окисления липида и образование продуктов его деструкции). Обнаружено несущественное окисление КЛ в течение 30 ч при комнатной температуре и в процессе инкубации КЛ в среде роста М. tuberculosis (бульоне Дюбо). В последнем случае установлен факт деструкции КЛ с образованием лизокардиолипина (лКЛ), бислизокардиолипина (ллКЛ), фосфатидной (ФК) и линолевой кислот (ЛК), идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS.

Впервые обнаружено многофакторное воздействие экзогенного липосомального КЛ на различные системы клеток Е. coli: ингибирование реакций, катализируемых ДНК-топоизомеразой II типа (ДНК-гираза), in vitro; индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа, повышение содержания в клетках супероксид анион-радикалов (САР).

Предложена схема бактерицидного действия липосом из КЛ на Е. coli, основанного на повреждении ДНК бактерий вторичными активными формами кислорода.

Практическая значимость работы. Установлен бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении ряда микроорганизмов и прежде всего М. tuberculosis. Самым существенным является то, что такой активностью КЛ обладает в отношении не только чувствительного к ПТП штамма М. tuberculosis, но и штаммов с МЛУ и ШЛУ. Это открывает реальные возможности создания новых эффективных липосомальных форм ПТП на основе кардиолипина для лечения резистентных форм туберкулеза: включение в липосомы из КЛ известных на сегодняшний день ПТП может снизить концентрацию используемой активной субстанции, благодаря чему уменьшится токсичность препарата, и повысить эффективность действия липосомальной формы препарата на патогенные штаммы, нечувствительные к антибиотикам.

Основные положения, выносимые на защиту:

• характеристика полученных липосом из KJI;

• бактерицидный эффект экзогенного липосомального КЛ в отношении лабораторного штамма М. tuberculosis H37Rv, чувствительного к ПТП, а также штаммов с МЛУ и ШЛУ в концентрациях выше 335 мкМ.

• действие липосом из КЛ на рост грамположительных бактерий, вызывающих инфекции верхних дыхательных путей, - Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae - и грамотрицательных на примере Escherichia coli. Антибактериальная активность KJI в отношении Str. pneumoniae и Е. coli',

• деструкция липосомального КЛ в условиях роста М. tuberculosis с образованием лКЛ, ллКЛ, ФК и ЛК. Получение продуктов деструкции, их выделение и очистка. Использование полученных липидов для изучения их влияния на рост М. tuberculosis H37Rv;

• выявление механизма действия экзогенного липосомального КЛ на Е. coli: а) индукция системы ДНК-репарационного SOS-ответа при культивировании Е. coli с липосомами из КЛ, отсутствие влияния липосомального КЛ на скорость трансляции белков, б) установление причин повреждения ДНК под действием летальных концентраций КЛ.

Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Россия, г. Москва, 2010); European Respiratory Society Annual Congress (Испания, г. Барселона, 2010); I и II международных научно-практических конференциях «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Россия, г. Москва, 2010; респ. Татарстан, г. Казань, 2012); VI и VII Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, г. Москва, 2011 и 2013); международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Россия, г. Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 оригинальные статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 8 тезисов в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 178 источников. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками и содержит 13 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Микулович, Юлия Львовна

7. ВЫВОДЫ

1. Впервые обнаружено бактерицидное действие экзогенного липосомального кардиолипина на чувствительный к противотуберкулезным препаратам штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv и резистентные штаммы Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а также Streptococcus pneumoniae и Escherichia coli.

2. Показано, что в условиях роста М. tuberculosis происходит незначительное окисление липосомального KJI и его деструкция с образованием ряда продуктов (лизо- и бислизокардиолипин, фосфатидная и линолевая кислоты), идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS, которые в индивидуальном виде существенно не влияют на рост микобактерий.

3. Обнаружены индукция ДНК-репарационного SOS-ответа в клетках Е. coli, культивируемых с липосомами из кардиолипина, что свидетельствует о повреждении ДНК, и отсутствие влияния кардиолипина на скорость трансляции белков.

4. Показаны ингибирование кардиолипином реакций, катализируемых топоизомеразой I и ДНК-гиразой Е. coli, in vitro и отсутствие стабилизации кардиолипином переходных комплексов фермент-расщепленная ДНК (в отличие от камптотецина и фторхинолонов).

5. Выявлено повышенное содержание супероксид анион-радикалов в клетках Е. coli под действием летальных концентраций экзогенного липосомального KJI. Обнаружено снижение бактерицидного эффекта кардиолипина на МБТ и Е. coli в присутствии антиоксидантов, что подтверждает гипотезу гибели клеток от окислительного повреждения активными формами кислорода. На основании этих данных предложен механизм бактерицидного действия экзогенного KJI на клетки Е. coli.

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах

1. Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Жогина Ю. А., Смирнова Д. И., Микулович Ю. Л., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Влияние экзогенного кардиолипина на рост и жизнеспособность Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro // Доклады Академии наук. — 2010. — Т. 434, № 5. — С. 705-708.

2. Смирнова Т. Г., Микулович Ю. Л., Андреевская С. Н., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Лизопроизводные кардиолипина подавляют жизнеспособность чувствительного и резистентного штаммов Mycobacterium tuberculosis II Биофармацевтический журнал. — 2011. — Т. 3, № 2. — С. 19-27.

3. Микулович Ю. Л., Сорокоумова Г. М., Селищева А. А., Швец В. И. Ингибирующее действие экзогенного кардиолипина на бактериальные ДНК-топоизомеразы I и II типа in vitro П Вестник МИТХТ. — 2012. — Т. 7, № 4. — С. 58-63.

Тезисы докладов международных конференций:

1. Микулович Ю. Л., Смирнова Д. И., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Жогина Ю. А., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Влияние липосом из кардиолипина на рост и выживаемость Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro // Сборник материалов Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». — Москва, 15-17 марта 2010. — С. 453-454.

2. Alia Selishcheva, Larisa Chemousova, Sofia Andreevskaya, Tatyana Smirnova, Galina Sorokoumova, Julia Mikulovich, Darya Smirnova, Julia Zhogina and Vitaliy Shvets. The influence of cardiolipin liposomes on growth and survival of Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro II Abstracts of European Respiratory Society Annual Congress. — Barcelona, 18-22 September, 2010. — P. 89.

3. Микулович Ю. Л., Андреевская С. Н., Юсипов Р. Ш., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Анализ липидного состава Mycobacterium tuberculosis H37Rv на разных стадиях роста // Сборник материалов I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». — Москва, 17-19 ноября 2010. — С. 66.

4. Микулович Ю. Л. Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Влияние липосом из кардиолипина на рост и жизнеспособность резистентного штамма Mycobacterium tuberculosis in vitro II Сборник материалов I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». — Москва, 17-19 ноября 2010. — С. 67.

5. Микулович Ю. Л., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Сорокоумова Г. М., Черноусова Л. Н., Селищева А. А., Швец В. И. Ингибирующее действие лизофосфатидилхолина и продуктов гидролиза кардиолипина на рост Mycobacterium tuberculosis H37Rv in vitro // Сборник материалов VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — Москва, 21-25 марта 2011. — Т. 1. — С. 83-84.

6. Микулович Ю. Л, Гиляров Д. А., Сорокоумова Г. М., Селищева А. А., Швец В. И., Северинов К. В. Влияние липосомального кардиолипина на рост и жизнеспособность грамположительных и грамотрицательных бактерий // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». — Москва, 20-22 марта 2012. — С. 243-245.

7. Микулович Ю. Л., Сорокоумова Г. М., Селищева А. А., Швец В. И. Бактерицидное действие экзогенного кардиолипина в отношении Escherichia coli in vitro и его возможные мишени // Сборник материалов III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». — Казань, 22-24 ноября 2012. — С. 66.

8. Микулович Ю. Л., Сорокоумова Г. М., Селищева А. А., Швец В. \s И. Механизм бактерицидного действия липосомального кардиолипина на клетки Escherichia coli И Сборник материалов VII Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — Москва, 19-22 марта 2013. — Т. 1. — С. 103-104.

118

9. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор работы выражает глубокую признательность всем, кто участвовал в данной работе: научным руководителям к.х.н., доц. Г. М. Сорокоумовой и д.х.н., в.н.с. А. А. Селищевой за их активную помощь в разработке стратегии исследований и интерпретации полученных результатов, за поддержку и просто человеческое внимание; коллективу ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН: зав. отделом микробиологии д.б.н. Л. Н. Черноусовой, к.м.н. Т. Г. Смирновой, к. м. н. С. Н. Андреевской - за проведение экспериментов с М. tuberculosis и помощь в обработке и описании результатов исследований. заведующему лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов ФГБУН Института биологии гена РАН д.б.н. К. В. Северинову, а также к.б.н. Д. А. Гилярову - за предоставление автору возможности проведения экспериментов с Escherichia coli (исследование кардиолипина на рост клеток Е. coli; реакции, катализируемые топоизомеразой I и ДНК-гиразой; индукцию ДНК-репарационного SOS-ответа с использованием штамма Е. coli CSH50 XsfiA::lacZ), заинтересованность и помощь в работе; д.х.н. П. В. Сергиева и к.х.н. И. А. Остермана (химический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова) за исследование кардиолипина на скорость трансляции и индукцию ДНК-репарационного SOS-ответа с помощью двух штаммов-репортеров Е. соНна основе репортерного гена голубого флуоресцентного белка CER, созданных И. А. Остерманом; д.б.н. К. Н. Новикова (биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова) за помощь в проведении исследований методом хемилюминесценции; к.б.н. Е. А. Воропаевой и к.б.н. А. Л. Байраковой (ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора) за исследования влияния кардолипина на рост грамположительных бактерий, вызывающих инфекции верхних дыхательных путей (стрептококки и стафилококки).

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск и разработка новых нетоксичных противотуберкулезных препаратов (ПТП) является актуальной задачей в связи с тем, что существующие ПТП могут вызывать образование резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis. В результате проведенных нами исследований впервые показано, что экзогенно добавленный липосомальный кардиолипин, который является природным липидом, обладает бактерицидньм действием в отношении не только чувствительного к противотуберкулезным препаратам, но резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, а также на Escherichia coli и Streptococcus pneumoniae.

При культивирования медленнорастущих клеток М. tuberculosis H37Rv с кардиолипином уже на 2-ые сутки обнаружена деструкция липида с образованием лизо- и бислизокардиолипина, фосфатидной и линолевой кислот, идентифицированных методами ТСХ и MALDI-TOF MS. Бактерицидный эффект кардиолипина можно было бы объяснить действием продуктов его деструкции, однако в исследованиях с М. tuberculosis H37Rv показано, что в индивидуальном виде перечисленные выше производные кардиолипина либо не влияли на рост микобактерий, либо ингибировали его в более высоких или тех же концентрациях, что и кардиолипин. Несмотря на то, что кардиолипин вызывал гибель клеток уже на 2-ые сутки его инкубации с микобактериями согласно данным метода ОТ-ПЦР, было установлено, что деструкция липида к этому моменту была незначительна и количество нативного кардиолипина составляло 81,3%. Это позволило отвергнуть гипотезу об антибактериальном действии продуктов деструкции кардиолипина и остановиться на предположении о действии самого кардиолипина. Вторую гипотезу проверяли на быстрорастущих клетках Е. coli, в отношении которых кардиолипин также обладал антибактериальной активностью. Было показано, что бактерицидное действие экзогенного липосомального кардиолипина на Е. coli обусловлено повреждением ДНК клеток, вследствие чего происходила индукция ДНК-репарационного SOS-ответа, обнаруженная в данной работе. Поиск источников повреждения ДНК показал, что установленное нами ингибирование кардиолипином реакций, катализируемых ДНК-топоизомеразой I и ДНК-гиразой, не является причиной образования двухцепочечных разрывов ДНК (повреждение ДНК), поскольку мы не обнаружили стабилизацию кардиолипином переходных комплексов фермент - расщепленная ДНК, что наблюдается при действии камптотецина на топоизомеразу I и фторхинолонов - на ДНК-гиразу. Однако методом люцигенин-активируемой хемилюминесценции нами было установлено увеличение концентрации супероксид анион-радикалов (САР) при действии кардиолипина на клетки Е. coli. САР являются короткоживущими первичными активными формами кислорода, которые, по литературным данным [158], сами не повреждают ДНК, но могут взаимодействовать с Fe-S кластерами в составе железо-серных белков, вызывая их дестабилизацию с высвобождением железа (II), которое может участвовать в реакции Фентона с образованием гидроксильных радикалов, относящихся к вторичным активным формам кислорода. Гидроксильные радикалы являются очень токсичными и могут вызывать повреждения ДНК, белков и липидов. Таким образом, мы полагаем, что увеличение концентрации супероксид анион-радикалов при действии кардиолипина на клетки Е. coli может способствовать образованию вторичных активных форм кислорода, в частности гидроксильных радикалов, которые и повреждают ДНК бактерий, что в итоге заканчивается гибелью клеток. На основании изложенного выше, нами предложена схема бактерицидного действия кардиолипина на Е. coli.

В пользу оксидативного повреждения клеток за счет действия вторичных активных форм кислорода при инкубации бактерий с кардиолипином свидетельствовало и то, что в присутствии антиоксидантов бактерицидный эффект кардиолипина в отношении М. tuberculosis H37Rv и Е. coli снижался. Антибактериальная активность кардиолипина в отношении как чувствительного, так и резистентных штаммов М. tuberculosis указывала на общий механизм его действия на микобактерии туберкулеза, по-видимому, за счет оксидативного повреждения активными формами кислорода.

Полученные результаты открывают реальные возможности создания новых эффективных липосомальных форм противотуберкулезных препаратов на основе кардиолипина для лечения резистентных форм туберкулеза. Предполагается, что загрузка активной субстанции (ПТП) в липосомы из кардиолипина может снизить концентрацию используемой активной субстанции и повысить эффективность бактерицидного действия липосомальной формы препарата на патогенные штаммы, нечувствительные к антибиотикам.

115

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Микулович, Юлия Львовна, 2013 год

1. Bermudez, L. Е. Use of liposome preparation to treat mycobacterial infections / L. E. Bermudez //Immunobiology. — 1994. —Vol. 191. —P. 578.

2. Kwon, H. H. Distribution and characterization of ß-lactamases of mycobacteria and related organisms / H. H. Kwon, H. Tomioka, H. Saito // Tubercle and Lung Disease. — 1995. — Vol. 76.—P. 141.

3. Туберкулез. Информационный бюллетень № 104 Электронный ресурс. // Всемирная организация здравоохранения. — 2013. — март. — Режим доступа: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs 104/ru/index.html.

4. Nguyen, L. Mycobacterial subversion of chemotherapeutic reagents and host defense tactics: challenges in tuberculosis drug development / L. Nguyen, J. Pieters // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. —2009. — Vol. 49. — P. 427.

5. Guenin-Macé, L. Lipids of pathogenic mycobacteria: contributions to virulence and host immune suppression / L. Guenin-Macé, R. Siméone, С. Demangel // Transboundary and Emerging Diseases. — 2009. — Vol. 56. — P. 255.

6. Dhariwal, K. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354 / K. R. Dhariwal, A. Chander, T.A. Venkitasubramanian //Microbios. — 1976. — Vol. 16. — P. 169.

7. Barksdale, L. Mycobacterium / L. Barksdale, K.-S. Kim // Bacterid Rev. — 1977. — Vol. 41. — P. 217.

8. Sartain, M. J. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB" / M. J. Sartain, D. L. Dick, C. D. Rithner, D. C. Crick, J. T. Belisle // J Lipid Res. 2011. — Vol. 52. — P. 861.

9. Glauert, A. M. The topography of the bacterial cell wall / A.M. Glauert, M. J. Thornley // Annu Rev Microbiol. — 1969. — Vol. 23. — P. 159.

10. Kamio, Y. Outer membrane of Salmonella typhimurium: accessibility of phospholipid head groups to phospholipase c and cyanogen bromide activated dextran in the external medium / Y. Kamio, H. Nikaido // Biochemistry. — 1976. — Vol. 15. — P. 2561.

11. Raetz, C. R. Lipopolysaccharide endotoxins / C. R. Raetz, C. Whitfield // Annu Rev Biochem. — 2002. — Vol. 71. — P. 635-700.

12. Sankaran, K. Lipid modification of bacterial prolipoprotein. Transfer of diacylglyceryl moiety from phosphatidylglycerol / K. Sankaran, H. C. Wu // J Biol Chem. — 1994. — Vol. 269. — P. 19701.

13. Miyadai, H. Effects of lipoprotein overproduction on the induction of DegP (HtrA) involved in quality control in the Escherichia coli periplasm / H. Miyadai, K. Tanaka-Masuda, S. Matsuyama, H. Tokuda // J Biol Chem. — 2004. — Vol. 279. — P. 39807.

14. Cowan, S. W. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins / S. W. Cowan, T. Schirmer, G. Rummel, M. Steiert, R. Ghosh, R. A. Pauptit, J. N. Jansonius, J. P. Rosenbusch // Nature. — 1992. — Vol. 358. — P. 727.

15. Schirmer, T. Structural basis for sugar translocation through maltoporin channels at 3.1 A resolution / T. Schirmer, T. A. Keller, Y. F. Wang, J. P. Rosenbusch // Science. — 1995. — Vol. 267. —P. 512.

16. Arora, A. Refolded outer membrane protein A of Escherichia coli forms ion channels with two conductance states in planar lipid bilayers / A. Arora, D. Rinehart, G. Szabo, L. K. Tamm // J Biol Chem. — 2000. — Vol. 275. — P. 1594.

17. Vollmer, W. Peptidoglycan structure and architecture / W. Vollmer, D. Blanot, M. A. de Pedro // FEMS Microbiol Rev. — 2008. — Vol. 32. — P. 149.

18. Braun, V. Covalent lipoprotein from the outer membrane of Escherichia coli / V. Braun // Biochim Biophys Acta. — 1975. — Vol. 415. — P. 335.

19. Erhmann, M. The periplasm / M. Erhmann. — Washington : ASM Press, 2007. — 415 p.

20. Raetz, C. R. Biosynthesis and function of phospholipids in Escherichia coli / C. R. Raetz, W. Dowhan // J Biol Chem. — 1990. — Vol. 265. — P. 1235.

21. Silhavy, T. J. The bacterial cell envelope / T. J. Silhavy, D. Kahne, S. Walker // Cold Spring Harb Perspect Biol. — 2010. — Vol. 2 : a000414.

22. Hirschberg, C. B. Mechanism of enzymatic synthesis of cardiolipin in Escherichia coli / C. B. Hirschberg, E. P. Kennedy // Proc Natl Acad Sei USA. — 1972. — Vol. 69. — P. 648.

23. Pluschke, G. Function of phospholipids in Escherichia coli. Characterization of a mutant deficient in cardiolipin synthesis / G. Pluschke, Y. Hirota, P. Overath // J Biol Chem. — 1978. — Vol. 253. —P. 5048.

24. Ohta, A. Molecular cloning of the els gene responsible for cardiolipin synthesis in Escherichia coli and phenotypic consequences of its amplification / A. Ohta, T. Obara, Y. Asami, I. Shibuya // J Bacteriol. — 1985. — Vol. 163. — P. 506.

25. Lewis, R. N. A. H. The physicochemical properties of cardiolipin bilayers and cardiolipin-containing lipid membranes / R. N. A. H. Lewis, R. N. McElhaney // Bioch Biophys Acta. — 2009. — Vol. 1788. — P. 2069.

26. Lange, C. Specific roles of protein-phospholipid interactions, in the yeast cytochrome bcl complex structure / C. Lange, J. H. Nett, B. L. Trumpower, C. Hunte // EMBO J. — 2001. — Vol. 20. —P. 6591.

27. McAuley, K. E. Structural details of an interaction between cardiolipin and an integral membrane protein / K. E. McAuley, P. K. Fyfe, J. P. Ridge, N. W. Isaacs, R. J. Cogdell, M. R. Jones // Proc Natl Acad Sei USA. — 1999. — Vol. 96. — P. 14706.

28. Schlame, M. Cardiolipin synthesis for the assembly of bacterial and mitochondrial membranes / M. Schlame // J Lipid Res. — 2008. — Vol. 49. — P. 1607.

29. Allegrini, P. R. Cardiolipin conformation and dynamics in bilayer membranes as seen by deuterium magnetic resonance / P. R. Allegrini, G. Pluschke, J. Seelig // Biochemistry. — 1984, —Vol. 23. —P. 6452.

30. Powell, G. L. Polymorphic phase behavior of cardiolipin derivatives studied by 31P-NMR and X-ray diffraction / G. L. Powell, D. Marsh // Biochemistry. — 1985. — Vol. 24. — P. 2902.

31. Nichols-Smith, S. Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes / S. Nichols-Smith, S.-Y. Teh, T. L. Kuhl // Biochim Biophys Acta. — 2004. — Vol. 1663.1. P. 82.

32. Domenech, O. Thermodynamic and structural study of the main phospholipids components comprising the mitochondrial inner membrane / O. Domenech, F. Sanz, M. T. Montero, J. Hernandez-Borell // Biochim Biophys Acta. — 2006. — Vol. 1758. — P. 213.

33. Chen, Q. P. Effect of cardiolipin on proton permeability of phospholipid liposomes: the role of hydration at the lipid-water interface / Q. P. Chen, Q. T. Li // Arch Biochem Biophys. — 2001.1. Vol. 389. —P. 201.

34. Short, S. A. Metabolism of phosphatidylglycerol, lysophosphatidyl-glycerol and cardiolipin of Staphylococcus aureus / S. A. Short, D. C. White // J Bacteriol. — 1971. — Vol. 108. — P. 219.

35. Koch, H. U. The role of lipoteichoic acid biosynthesis in membrane lipid metabolism of growing Staphylococcus aureus / H. U. Koch, R. Haas, W. Fischer // Eur J Biochem. — 1984. — Vol. 138. —P. 357.

36. Kanemasa, Y. Alteration of the phospholipid composition of Staphylococcus aureus cultures in medium containing NaCl / Y. Kanemasa, T. Yioshioka, H. Hayashi // Biochim Biophys Acta. — 1972. —Vol. 280. —P. 444.

37. Kawai, F. Cardiolipin enrichment in spore membranes and its involvement in germination of Bacillus subtilis Marburg / F. Kawai, H. Hara, H. Takamatsu, K. Watabe, K. Matsumoto // Genes Genet Syst. — 2006. — Vol. 81. — P. 69.

38. Heber, S. Genetic regulation of cardiolipin synthase in Escherichia coli / S. Heber, B. E. Tropp // Biochim Biophys Acta. — 1991. — Vol. 1129. — P. 1.

39. Hiraoka, S. Amplification and substantial purification of cardiolipin synthase of Escherichia coli / S. Hiraoka, K. Nukui, N. Uetake, A. Ohta, I. Shibuya // J Biochem. — 1991. — Vol. 110.— P. 443.

40. Huijbregts, R. P. H. Topology and transport of membrane lipids in bacteria / R. P. H. Huijbregts, A. I. P. M. de Kroon, B. de Kruijff // Biochim Biophys Acta. — 2000. — Vol. 1469. — P. 43.

41. Côtes, K. Lipolytic enzymes in Mycobacterium tuberculosis / K. Côtes, J. C. Bakala N'Goma, R. Dhouib, I. Douchet, D. Maurin, F. Carrière, S. Canaan // Appl Microbil Biotechnol. — 2008. — Vol. 78, —P. 741.

42. Raja, M. Phosphatidic acid plays a special role in stabilizing and folding of the tetrameric potassium channel KcsA / M. Raja, R. E. J. Spelbrink, B. de Kruijff, J. A. Killian // FEBS Letters. —2007, —Vol. 581. —P. 5715.

43. Karnovsky, M. J. The concept of lipid domains in membranes / M. J. Kamovsky, A. M. Kleinfeld, R. L. Hoover, R. D. Klausner // J Cell Biol. — 1982. — Vol. 94. — P. 1.

44. Brasitus, T. A. Thermotropic transitions in rat intestinal plasma membranes studied by differential scanning calorimetry and fluorescence polarization / T. A. Brasitus, A. R. Tall, D. Schachter // Biochemistry. — 1980. — Vol. 19. — P. 1256.

45. Metcalf, T. N. Lateral diffusion of phospholipids in the plasma membrane of soybean protoplasts: evidence for membrane lipid domains / T. N. Metcalf, J. L. Wang, M. Schindler // Proc Natl Acad Sci USA. — 1986. — Vol. 83. — P. 95.

46. Christensen, H. Lipid domains of mycobacteria studied with fluorescent molecular probes / H. Christensen, N. J. Garton, R. W. Horobin, D. E. Minnikin, M. R. Barer // Mol Microbiol. — 1999. —Vol. 31. —P. 1561.

47. Mileykovskaya, E. Visualization of phospholipid domains in Escherichia coli by using the cardiolipin-specific fluorescent dye 10-N-nonyl acridine orange / E. Mileykovskaya, W. Dowhan // J Bacteriol. — 2000. — Vol. 182. — P. 1172.

48. Chang, S.-C. Isolation and characterization of the gene (CLS1) encoding cardiolipin synthase in Saccharomyces cerevisiae / S.-C. Chang, P. N. Heacock, E. Mileykovskaya, D. R. Voelker, W. Dowhan // J Biol Chem. — 1998. — Vol. 273. — P. 14933.

49. Petit, J.-M. 10-N-nonyl acridine orange interacts with cardiolipin and allows the quantification of this phospholipid in isolated mitochondria / J.-M. Petit, A. Maftah, M.-H. Ratinaud, R. Julien // Eur J Biochem. — 1992. — Vol. 209. — P. 267.

50. Mileykovskaya, E. Cardiolipin membrane domains in prokaryotes and eukaryotes / E. Mileykovskaya, W. Dowhan // Biochim Biophys Acta. — 2009. — Vol. 1788. — P. 2084.

51. Kawai, F. Cardiolipin domains in Bacillus subtilis Marburg membranes / F. Kawai, M. Shoda, R. Harashima, Y. Sadaie, H. Hara, K. Matsumoto // J Bacteriol. — 2004. — Vol. 186. — P. 1475.

52. Sekimizu, K. Interactions between DNA replication-related proteins and phospholipid vesicles in vitro / Sekimizu K. // Chem Phys Lipids. — 1994. — Vol. 73. — P. 223.

53. Yamamoto, K. Modulation of Mycobacterium tuberculosis DnaA protein-adenine-nucleotide interactions by acidic phospholipids / K. Yamamoto, S. Muniruzzaman, M. Rajagopalan, M. V. Madiraju // Biochem J. — 2002. — Vol. 363. — P. 305.

54. Wickner, W. A holoenzyme form of deoxyribonucleic acid polymerase III / W. Wickner, A. Romberg // J Biol Chem. — 1974. — Vol. 249. — P. 6244.

55. Mileykovskaya, E. Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo / E. Mileykovskaya, I. Fishov, X. Fu, B. D. Corbin, W. Margolin, W. Dowhan // J Biol Chem. — 2003. — Vol. 278. — P. 22193.

56. Gold, V. A. M. The action of cardiolipin on the bacterial translocon / V. A. M. Gold, A. Robson, H. Bao, T. Romantsov, F. Duong, I. Collinson // Proc Natl Acad Sci USA. — 2010. — Vol. 107. —P. 10044.

57. Charalambous, K. Lipid bilayer composition influences small multidrug transporters / K. Charalambous, D. Miller, P. Curnow, P. J. Booth // BMC Biochem. — 2008. — Vol. 9. — P.31.

58. Alvis, S. J. Interactions of anionic phospholipids and phosphatidylethanolamine with the potassium channel KcsA / S. J. Alvis, I. M. Williamson, J. M. East, A. G. Lee // Biophys J.2003. — Vol. 85. — P. 3828.

59. Mizushima, T. Inhibition of Escherichia coli DNA topoisomerase I activity by phospholipids / T. Mizushima, S. Natori, K. Sekimizu // Biochem J. — 1992. — Vol. 285. — P. 503.

60. Minami, N. Regulatory role of cardiolipin in the activity of an ATP-dependent protease, Lon, from Escherichia coli / N. Minami, T. Yasuda, Y. Ishii, K. Fujimori, F. Amano // J Biochem. — 2011.—Vol. 149. —P. 519.

61. Bramhill, D. A model for initiation at origins of DNA replication / D. Bramhill, A. Kornberg // Cell. — 1988. — Vol. 54. — P. 915.

62. Qin, M. H. Characterization of the functional replication origin of Mycobacterium tuberculosis / M. H. Qin, M. V. Madiraju, M. Rajagopalan // Gene. — 1999. — Vol. 233. — P. 121.

63. Makise, M. Molecular mechanism for functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids: identification of important amino acids / M. Makise, S. Mima, T. Tsuchiya, T. Mizuhshima // J Biol Chem. — 2001. — Vol. 276. — P. 7450.

64. Hu, Z. Recruitment of MinC, an inhibitor of Z-ring formation, to the membrane in Escherichia coli: role of MinD and MinE / Z. Hu, C. Saez, J. Lutkenhaus // J Bacterid. — 2003. — Vol. 185. — P. 196.

65. Slayden, R. A. Identification of cell cycle regulators in Mycobacterium tuberculosis by inhibition of septum formation and global transcriptional analysis / R. A. Slayden, D. L. Knudson, J. T. Belisle // Microbiol. — 2006. — Vol. 152. — P. 1789.

66. Kusters, R. Negatively charged phospholipids restore prePhoE translocation across phosphatidylglyceroldepleted Escherichia coli inner membranes / R. Kusters, W. Dowhan, B. de Kruijff // J Biol Chem. — 1991. — Vol. 266. — P. 8659.

67. Yankovskaya, V. Architecture of succinate dehydrogenase and reactive oxygen species generation / V. Yankovskaya, R. Horsefield, S. Tornroth, C. Luna-Chavez, H. Miyoshi, C. Léger, В. Byrne, G. Cecchini, S. Iwata // Science. — 2003. — Vol. 299. — P. 700.

68. Jormakka, M. Molecular basis of proton motive force generation: structure of formate dehydrogenase-N / M. Jormakka, S. Tornroth, B. Byrne, S. Iwata // Science. — 2002. — Vol. 295, —P. 1863.

69. Haines, T. H. Cardiolipin: a proton trap for oxidative phosphorylation / T. H. Haines, N. A. Dencher // FEBS Letters. — 2002. — Vol. 528. — P. 35.

70. Бугреев, Д. В. Структура и механизм действия ДНК-топоизомераз IA-типа / Д. В. Бугреев, Г. А. Невинский // Успехи биологической химии. — 2009. — Т. 49. — С. 129.

71. Drlica,К. Quinolone-mediated bacterial death / К. Drlica, M.Malik, R. J. Kerns, X.Zhao // Antimicrob Agents Chemother. — 2008. — Vol. 52. — P. 385.

72. Floss, H. G. Rifamycin-mode of action, resistance, and biosynthesis / H. G. Floss, T. W. Yu // Chem. Rev. — 2005. — Vol. 105. — P. 621.

73. Tomasz, A. The mechanism of the irreversible antimicrobial effects of penicillins: how the beta-lactam antibiotics kill and lyse bacteria / A. Tomasz // Annu Rev Microbiol. — 1979. — Vol. 33.1. P. 113.

74. Vakulenko, S. B. Versatility of aminoglycosides and prospects for their future / S. B. Vakulenko, S. Mobashery // Clin Microbiol Rev. — 2003. — Vol. 16. — P. 430.

75. Kohanski, M. A. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics / M. A. Kohanski, D. J. Dwyer, B. Hayete, C. A. Lawrence, J. J. Collins // Cell. — 2007. — Vol. 130. —P. 797.

76. Liu, Y. Cell death from antibiotics without the involvement of reactive oxygen species / Y. Liu, J. A. Imlay // Science. — 2013. — Vol. 339. — P. 1210.

77. Keren, I. Killing by bactericidal antibiotics does not depend on reactive oxygen species / I. Keren, Y. Wu, J. Inocencio, L. R. Mulcahy, K. Lewis // Science. — 2013. — Vol. 339. — P. 1213.

78. Espeli, O. Untangling intracellular DNA topology / O. Espeli, K. J. Marians // Mol Microbiol. — 2004. —Vol. 52. — P. 925.

79. Chen, C. R. DNA gyrase and topoisomerase IV on the bacterial chromosome: quinolone-induced

80. DNA cleavage / C. R. Chen, M. Malik, M. Snyder, K. Drlica // J Mol Biol. — 1996. — Vol. 258.1. P. 627.

81. Kohanski, M. A. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks / M. A. Kohanski, D. J. Dwyer, J. J. Collins // Nat Rev Microbiol. — 2010. — Vol. 8. — P. 423.

82. Gellert, M. DNA gyrase: an enzyme that introduces superhelical turns into DNA / M. Gellert, K. Mizuuchi, M. H. O'Dea, H. A. Nash // Proc Natl Acad Sci USA. —1976. — Vol. 73. — P. 3872.

83. Belland, R. J. Neisseria gonorrhoeae acquires mutations in analogous regions of gyrA and parC in fluoroquinolone-resistant isolates / Belland RJ, Morrison SG, Ison C, Huang WM. // Mol Microbiol. — 1994. — Vol. 14. — P. 371.

84. Critchlow, S. E. DNA cleavage is not required for the binding of quinolone drugs to the DNA gyrase-DNA complex / S. E. Critchlow, A. Maxwell // Biochemistry. —1996. — Vol. 35. — P. 7387.

85. Marians, K. J. Mechanism of quinolone action. A drug-induced structural perturbation of the DNA precedes strand cleavage by topoisomerase IV / K. J. Marians, H. Hiasa // J Biol Chem. — 1997. — Vol. 272. — P. 9401.

86. Kampranis, S. C. The DNA gyrase-quinolone complex. ATP hydrolysis and the mechanism of DNA cleavage / S. C. Kampranis, A.Maxwell // J Biol Chem. — 1998. — Vol.273. — P. 22615.

87. Heddle, J. Quinolone-binding pocket of DNA gyrase: role of GyrB / J. Heddle, A. Maxwell // Antimicrob Agents Chemother. — 2002. — Vol. 46. — P. 1805.

88. Goss, W. A. Mechanism of action of nalidixic acid on Escherichia coli. II. Inhibition of deoxyribonucleic acid synthesis / W. A. Goss, W. H. Deitz, T. M. Cook // J Bacterid. — 1965. — Vol. 89. — P. 1068.

89. Courcelle, J. RecA-dependent recovery of arrested DNA replication forks / J. Courcelle, P. C. Hanawalt // Annu Rev Genet. — 2003. — Vol. 37. — P. 611.

90. Wang, X. Contribution of reactive oxygen species to pathways of quinolone-mediated bacterial cell death / X. Wang, X. Zhao, M. Malik, K. Drlica // J Antimicrob Chemother. — 2010. — Vol. 65. — P. 520.

91. Dukan, S. Protein oxidation in response to increased transcriptional or translational errors / S. Dukan, A. Farewell, M. Ballesteros, F. Taddei, M. Radman, T. Nystrom // Proc Natl Acad Sci USA. — 2000. — Vol. 97. — P. 5746.

92. Campbell, E. A. Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase / E. A. Campbell, N. Korzheva, A. Mustaev, K. Murakami, S. Nair, A. Goldfarb, S. A. Darst // Cell. — 2001. — Vol. 104. — P. 901.

93. Losick, R. RNA polymerase / R. Losick, M. Chamberlin; edited by R. Losick, M. Chamberlin. — N. Y: Cold Spring Harbor Laboratory, 1976. — 899 p.

94. McClure, W. R. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis / W. R. McClure, C. L. Cech // J Biol Chem. — 1978. — Vol. 253. — P. 8949.

95. Artsimovitch, I. A new class of bacterial RNA polymerase inhibitor affects nucleotide addition / I. Artsimovitch, C. Chu, A. S. Lynch, R. Landick // Science. — 2003. — Vol. 302. — P. 650.

96. Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance / W. Wehrli // Rev Infect Dis. — 1983. — Vol. 5. — Suppl 3, P. S407.

97. Burman, W. J. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of the rifamycin antibacterials / W.J. Burman, K. Gallicano, C. Peloquin // Clin Pharmacokinet. — 2001. — Vol. 40. — P. 327.

98. Hobby, G. L. The action of rifampin alone and in combination with other antituberculous drugs / G. L. Hobby, T. F. Lenert // Am Rev Respir Dis. — 1970. — Vol. 102. — P. 462.

99. Scrutton, M. C. Divalent metal ion catalysis of the oxidation of rifamycin SV to rifamycin S. / M. C. Scrutton // FEBS Lett. — 1977. — Vol. 78. — P. 216.

100. Bugg, T. D. Intracellular steps of bacterial cell wall peptidoglycan biosynthesis: enzymology, antibiotics, and antibiotic resistance / T. D. Bugg, C. T. Walsh // Nat Prod Rep. — 1992. — Vol. 9. —P. 199.

101. Park J. T. How bacteria consume their own exoskeletons (turnover and recycling of cell wall peptidoglycan) / J. T. Park, T. Uehara // Microbiol Mol Biol Rev. — 2008. — Vol. 72. — P. 211.

102. Wise, E. M., Jr. Penicillin: its basic site of action as an inhibitor of a peptide cross-linking reaction in cell wall mucopeptide synthesis / E. M. Wise, Jr; J. T. Park // Proc Natl Acad Sci USA.— 1965. — Vol. 54. — P. 75.

103. Josephine, H. R. The perfect penicillin? Inhibition of a bacterial DD-peptidase by peptidoglycan-mimetic beta-lactams / H. R. Josephine, I. Kumar, R. F. Pratt // J Am Chem Soc. — 2004. — Vol. 126, —P. 8122.

104. Kahne, D. Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics / D. Kahne, C. Leimkuhler, W. Lu, C. Walsh // Chem Rev. — 2005. — Vol. 105. — P. 425.

105. Ge, M. Vancomycin derivatives that inhibit peptidoglycan biosynthesis without binding D-Ala-D-Ala / M. Ge, Z. Chen, H. R. Onishi, J. Kohler, L. L. Silver, R. Kerns, S. Fukuzawa, C. Thompson, D. Kahne // Science. — 1999. — Vol. 284. — P. 507.

106. Uehara, T. LytM-domain factors are required for daughter cell separation and rapid ampicillin-induced lysis in Escherichia coli / T. Uehara, T. Dinh, T. G. Bernhardt // J Bacteriol. — 2009. — Vol. 191. —P. 5094.

107. Moreillon, P. Two bactericidal targets for penicillin in pneumococci: autolysis-dependent and autolysis-independent killing mechanisms / P. Moreillon, Z. Markiewicz, S. Nachman,

108. A. Tomasz // Antimicrob Agents Chemother. — 1990. — Vol. 34. — P. 33.

109. Hoch, J. A. Two-component and phosphorelay signal transduction / J. A. Hoch // Curr Opin Microbiol. — 2000. — Vol. 3. — P. 165.

110. Novak,R. Emergence of vancomycin tolerance in Streptococcus pneumoniae / R.Novak,

111. B. Henriques, E. Charpentier, S.Normark, E. Tuomanen // Nature. — 1999. — Vol. 399. — P. 590.

112. Novak, R. Signal transduction by a death signal peptide: uncovering the mechanism of bacterial killing by penicillin / R. Novak, E. Charpentier, J. S. Braun, E. Tuomanen // Mol Cell. — 2000. — Vol. 5. — P. 49.

113. Brunskill, E. W. Identification and molecular characterization of a putative regulatory locus that affects autolysis in Staphylococcus aureus / E. W. Brunskill, K. W. Bayles // J Bacteriol. — 1996. —Vol. 178. —P. 611.

114. Brunskill, E. W. Identification of LytSR-regulated genes from Staphylococcus aureus / E. W. Brunskill, K. W. Bayles // J Bacteriol. — 1996. — Vol. 178. — P. 5810.

115. Groicher, K. H. The Staphylococcus aureus IrgAB operon modulates murein hydrolase activity and penicillin tolerance / K. H. Groicher, B. A. Firek, D. F. Fujimoto, K. W. Bayles // J Bacterid. — 2000. — Vol. 182. — P. 1794.

116. Spratt, B. G. Distinct penicillin binding proteins involved in the division, elongation, and shape of Escherichia coli K12 / B. G. Spratt // Proc Natl Acad Sci USA. — 1975. — Vol. 72. — P. 2999.

117. Lewin, C. S. 4-quinolones and the SOS response / C. S. Lewin, B. M. Howard, N. T. Ratcliffe, J. T. Smith // J Med Microbiol. — 1989. — Vol. 29. — P. 139.

118. Goehring, N. W. Diverse paths to midcell: assembly of the bacterial cell division machinery / N. W. Goehring, J. Beckwith // Curr Biol. — 2005. — Vol. 15. — P. 514.

119. Miller, C. SOS response induction by P-lactams and bacterial defense against antibiotic lethality / C. Miller, L. E. Thomsen, C. Gaggero, R. Mosseri, H. Ingmer, S. N. Cohen // Science. — 2004.1. Vol. 305.—P. 1629.

120. Vincent, S. Lytic effect of two fluoroquinolones, ofloxacin and pefloxacin, on Escherichia coli W7 and its consequences on peptidoglycan composition / S. Vincent, B. Glauner, L. Gutmann // Antimicrob Agents Chemother. — 1991. — Vol. 35. — P. 1381.

121. Garrett, R. A. The ribosome: structure, function, antibiotics, and cellular interactions / R. A. Garrett; edited by R. A. Garrett, S. R. Douthwait, A. Lilijas, A. T. Matheson, P. B. Moore, H. F. Noller. — Washington, DC : ASM Press, 2000. — 586 p.

122. Nissen, P. The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis / P. Nissen, J. Hansen, N. Ban, P. B. Moore, T. A. Steitz // Science. — 2000. — Vol. 289. — P. 920.

123. Vannuffel, P. Mechanism of action of streptogramins and macrolides / P. Vannuffel, C. Cocito // Drugs. — 1996. — Vol. 51. — Suppl 1. P. 20.

124. Tenson, T. The mechanism of action of macrolides, lincosamides and streptogramin B reveals the nascent peptide exit path in the ribosome / T. Tenson, M. Lovmar, M. Ehrenberg // J Mol Biol. — 2003. — Vol. 330. — P. 1005.

125. Chopra, I. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance /1. Chopra, M. Roberts // Microbiol Mol Biol Rev. — 2001.1. Vol. 65, —P. 232.

126. Davis, B. D. Mechanism of bactericidal action of aminoglycosides / B. D. Davis // Microbiol Rev. — 1987. — Vol. 51. — P. 341.

127. Pape, T. Conformational switch in the decoding region of 16S rRNA during aminoacyl-tRNA selection on the ribosome / T. Pape, W. Wintermeyer, M. V. Rodnina // Nat Struct Biol. — 2000.1. Vol. 7. —P. 104.

128. Rahal, J. J., Jr. Bactericidal and bacteriostatic action of chloramphenicol against memingeal pathogens / J. J. Rahal, Jr; M. S. Simberkoff // Antimicrob Agents Chemother. — 1979. — Vol. 16. —P. 13.

129. Arrow, A. S. Streptomycin accumulation by Bacillus subtilis requires both a membrane potential and cytochrome aaj / A. S. Arrow, H. W. Taber // Antimicrob Agents Chemother. — 1986. — Vol. 29. —P. 141.

130. Hancock, R. Uptake of 14C-streptomycin by some microorganisms and its relation to their streptomycin sensitivity / R. Hancock // J Gen Microbiol. — 1962. — Vol. 28. — P. 493.

131. Bryan, L. E. Mechanism of aminoglycoside antibiotic resistance in anaerobic bacteria: Clostridium perfringens and Bacteroides fragilis / L. E. Bryan, S. K. Kowand, H. M. Van Den Elzen // Antimicrob Agents Chemother. — 1979. — Vol. 15. — P. 7.

132. Anand, N. Damage by streptomycin to the cell membrane of Escherichia coli / N. Anand, B. D. Davis //Nature. — 1960. — Vol. 185. — P. 22.

133. Ruiz, N. Sensing external stress: watchdogs of the Escherichia coli cell envelope / N. Ruiz, T. J. Silhavy // Curr Opin Microbiol. — 2005. — Vol. 8. — P. 122.

134. Malpica, R. Identification of a quinone-sensitive redox switch in the ArcB sensor kinase / R. Malpica, B. Franco, C. Rodriguez, O. Kwon, D. Georgellis // Proc Natl Acad Sei USA. — 2004, —Vol. 101. —P. 13318.

135. Kohanski, M. A. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death / M. A. Kohanski, D. J. Dwyer, J. Wierzbowski, G. Cottarel, J. J. Collins // Cell. — 2008. — Vol. 135. — P. 679.

136. Imlay, J. A. How oxygen damages microbes: oxygen tolerance and obligate anaerobiosis / J. A. Imlay // Adv Microb Physiol. — 2002. — Vol. 46. — P. 111.

137. Gusarov, I. Endogenous nitric oxide protects bacteria against a wide spectrum of antibiotics / I. Gusarov, K. Shatalin, M. Starodubtseva, E. Nudler // Science. — 2009. — Vol. 325. — P. 1380.

138. N. D. Savage, R. Nisinic, F. Dieli, Т. H. Ottenhoff, M. Fraziano. // Proc Natl Acad Sci USA.2012. — Vol. 109. — P. E1360.

139. Bligh, E. C. A rapid method of total lipid extraction and purification / E. C. Bligh, W. J. Dyer // Can J Biochem Physiol — 1959. — Vol. 37. — P. 911.

140. Svetashev, V. I. A simplified technique for thin-layer microchro-matography on lipids / V. I. Svetashev, V. E. Vaskovsky // J Cromatogr. — 1972. — Vol. 67. — P. 376.

141. Dhariwal, K. R. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354 / K. R. Dhariwal, A. Chander, T. A. Venkita-subramanian // Microbios. — 1976. — Vol. 16. — P. 169.

142. Болдырев, И. А. Синтез и свойства новых флуоресцентных зондов на основе кардио-липина / И. А. Болдырев, Ю. Б. Павлова, Ю. Г. Молотковский // Биоорганическая химия.2009. — Т. 35. — С. 239.

143. Бергельсон, Л. Д. Препаративная биохимия липидов / Л. Д. Бергельсон, Э. В. Дятловицкая, Ю. Г. Молотковский, С. Г. Батраков, Л. И. Барсуков, Н. В. Проказова. — М.: Наука, 1981. ~~ 256 с.

144. Kondo, Е. Further studies on the lethal effect of long-chain fatty acids on mycobacteria / E. Kondo, K. Kanai // Jpn J Med Sci Biol. — 1976. — Vol. 29. — P. 25.

145. Kondo, E. Mechanism of bactericidal activity of lysolecithin and its biological implication / E. Kondo, K. Kanai // Jpn J Med Sci Biol. — 1985. — Vol. 38. — P. 181.

146. Greenlee, L. Chemiluminescence induced by operation of iron-flavoproteins / L. Greenlee, I. Fridovich, P. Handler // Biochemistry. — 1962. — Vol. 1. — P. 779.

147. MacDonald, R. C. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles / R. C. MacDonald, R. I. MacDonald, В. P. M. Menco, K. Takeshita, N. K. Subarrao, L. Hu // Biochim. Biophys. Acta. — 1991. — Vol. 1061. — P. 297.

148. Сорокоумова, Г. M. Фосфолипиды. Методы их выделения, обнаружения и изучения физико-химических свойств липидных дисперсий в воде : учебное пособие по биоорганической химии / Г. М. Сорокоумова, А. А. Селищева, А. П. Каплун. — М. : МИТХТ, 2000. — 68 с.

149. Pryor, W. A. Chemical methods for detection of lipid hydroperoxides / W. A. Pryor, A. Castle // Methods in enzymology. — 1984. — Vol. 105. — P. 293.

150. Приказ Минздрава РФ от 21.03.2003 № 109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». — М., 2003. — 347 с.

151. Андреевская, С. Н. Изучение ex vivo роста в макрофагах штаммов Mycobacterium tuberculosis разных генотипических кластеров / С. Н. Андреевская, JI. Н. Черноусова, Т. Г. Смирнова // Проблемы туберкулеза и болезни легких. — 2006. — № 12. — С. 43.

152. Murohashi, Т. Cytochemical studies on the differentiation of living and dead acid-fast bacilli / T. Murohashi, K. Yoshida // Acta Tuberc Scand. — 1957. — Vol. 34. — P. 208.