"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Салина, Елена Геннадьевна

• Салина, Елена Геннадьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Салина, Елена Геннадьевна

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

11 СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ» - СТРАТЕГИЯ ВЫЖИВАНИЯ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ (СТРЕССОВЫХ) УСЛОВИЯХ?

1 1 1 Явление "некультивируемости" в бактериальных популяциях

1 1 2 Критерии состояния "некультивируемости"

1 1 3 Образование "некультивируемых" форм бактерий в различных условиях

1 2 РЕАКТИВАЦИЯ («ОЖИВЛЕНИЕ») НК ФОРМ БАКТЕРИЙ 21 1 3 «СОЦИАЛЬНОЕ» ПОВЕДЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ И

СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ»

1 4 ЛАТЕНТНОСТЬ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ 29 1 4 1 Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных 30 1 4 2 Модели получения покоящихся («некультивируемых») форм

Mycobacterium tuberculosis in vitro 33 1 5 БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ МИКОБАКТЕРИЙ

ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЛАТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА

1 б ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

21 Выращивание бактериальных культур

2 2 Подсчет общего числа клеток . . 49 2 3 Микроскопические исследования . . 49 2 4 Оценка культивируемости клеток 50 2 5 Реактивация «некультивируемых» клеток 50 2 б Приготовление клеточных экстрактов 51 2 7 Выделение мембран . 51 2 8 Определение концентрации белка . 51 2 9 Определение активностей внутриклеточных ферментов 52 2 10 Определение оксидазных и дегидрогеназных активностей . .52 211 Определение плавучей плотности клеток . 53 2 12 Выделение и очистка рнк . .53 2 13 Обратная пцр 54 2 14 Транскриптомный анализ . . . 55 2 15 Получение рекомбинантных белков Rpf . 55 2 16 Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций

2 17 Электрофорез белков Rpf в пааг

218 Иммуноблоттинг белков Rpf.

219Твердофазныйиммуноферментныйанализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 1 ПОЛУЧЕНИЕ НК ФОРМ БАКТЕРИЙ Р MYCOBACTERIUM 59 3 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НК ФОРМ М SMEGMATIS АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

И ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕ КЛЕТОК В СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ».

3 3 РОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА RPF В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕХОДА КЛЕТОК МИКОБАКТЕРИЙ В НК СОСТОЯНИЕ И ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕАКТИВАЦИИ

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика»

Известно, что при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды бактериальные клетки способны переходить в покоящееся состояние, сопровождающееся значительным снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Традиционно покоящееся состояние бактерий связывают с образованием специализированных структур (спор, цист и т.д.) Однако в последние годы была экспериментально установлена возможность перехода в покоящееся состояние и для неспорулирующих бактерий, происходящего без образования специализированных структур.

Особенный интерес представляет образование покоящихся форм неспорулирующими клетками микобактерий, и в частности, возбудителем туберкулеза бактерией Mycobacterium tuberculosis, в связи с предположением о том, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом бактерий в организме хозяина в покоящееся состояние. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - М. tuberculosis, но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что микобактерии туберкулеза, находясь в человеческом организме в латентном состоянии, в течение длительного времени сохраняют свою жизнеспособность, и как следствие, опасность развития заболевания, но детектировать их крайне сложно, поскольку они, очевидно, обладают свойством «некультивируемости», то есть неспособностью расти на стандартных лабораторных средах.

Предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Достаточно популярной моделью перехода клеток в покоящееся состояние считается так называемая модель Вейна, заключающаяся в длительной инкубации клеток М. tuberculosis в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода (Wayne, 1994), однако в случае такого экспериментального подхода у покоящихся клеток не наблюдается формирования «некультивируемого» (НК) фенотипа. Поэтому степень адекватности такой модели для имитации латентной туберкулезной инфекции остается под вопросом, поскольку латентное состояние клеток М. tuberculosis in vivo в первую очередь характеризуется потерей культивируемое™. Кроме того, данное покоящееся состояние, возможно, является лишь отражением адаптации клеток микобактерий, являющихся аэробами, к недостатку кислорода. Недавно в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся форм клеток М. tuberculosis, обладающих свойством «некультивируемости» (Shleeva et al., 2002), но этот процесс, также как и в модели Вейна, происходил в анаэробных условиях. Сложно сказать, насколько анаэробные условия отвечают реальным условиям, в которых туберкулезные бактерии находятся в тканях организма-хозяина после инфицирования. В частности, совсем недавно в литературе появилось экспериментальное свидетельство того, что при формировании гранулемы в легких инфицированных мышей бактерии М. tuberculosis не испытывают недостатка кислорода (Tsai et al., 2006). Поэтому разработка модели перехода бактерий М. tuberculosis в НК состояние именно в аэробных условиях, на наш взгляд, представляет большую важность.

Ранее сотрудниками нашей лаборатории была показана возможность перехода бактерии М. smegmatis, быстрорастущего непатогенного родственника М. tuberculosis, в покоящееся состояние при культивировании в длительной стационарной фазе в аэробных условиях (Shleeva et al., 2004). При этом такие покоящиеся клетки теряли способность расти на твердых питательных средах, то есть являлись «некультивируемыми», но могли быть ревертированы в активное состояние при участии белков Rpf (Shleeva et al., 2004). Мы предполагаем, что такие НК клетки М. smegmatis могут рассматриваться как модель латентной туберкулезной инфекции in vivo.

Однако, по существу, к моменту начала настоящего исследования было известно только о существовании самого феномена «некультивируемости» М. smegmatis, но детальная характеристика клеток в НК состоянии не была проведена, также оставалось неясным, какие факторы оказывают влияние на переход М. smegmatis в НК состояние, а также является ли этот процесс генетически программированным, активным, или же он связан с деградацией клеток и их последующей гибелью. Кроме того, необходимо выяснить, какие механизмы лежат в основе процесса реактивации покоящихся клеток микобактерий.

Возможность получения НК клеток М. smegmatis без ограничения концентрации кислорода вселяла надежду на то, что могут быть найдены такие условия культивирования, в которых будет возможно формирование НК фенотипа в аэробных условиях и для клеток М. tuberculosis.

В связи с чем были сформулированы следующие цели и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в биохимической характеристике НК форм микобактерий, а также изучении механизмов перехода бактерий в НК состояние и выявлении факторов, обеспечивающих их последующую реактивацию. В соответствии с целью работы были поставлены задачи:

1.Оптимизация метода получения in vitro «некультивируемых» форм бактерии Mycobacterium smegmatis - быстрорастущего непатогенного родственника Mycobacterium tuberculosis.

2 Разработка метода получения in vitro покоящихся («некультивируемых») форм бактерии М. tuberculosis в аэробных условиях.

3.Биохимическая характеристика клеток М. smegmatis в «некультивируемом» состоянии

4.Исследование изменения уровня экспрессии генов (транскриптомный анализ) при переходе М. smegmatis в «некультивируемое» состояние. б.Изучение механизмов функционирования белков семейства Rpf в процессе реактивации «некультивируемых» форм микобактерий.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Салина, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

1.Найдены условия для получения «некультивируемых» клеток М. smegmatis и М. tuberculosis при росте в длительной стационарной фазе в аэробных условиях.

2.«Некультивируемые» формы М. smegmatis характеризуются сниженным уровнем дыхательной активности и активности ряда ферментов, что является результатом торможения метаболических процессов и уменьшения концентрации внутриклеточных субстратов.

3.Переход клеток М. smegmatis в «некультивируемое» состояние сопровождается повышенным уровнем экспрессии ряда генов, продукты которых принимают участие в анаболических процессах, что позволяет рассматривать его как активный, генетически программируемый процесс.

4.Реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их литической активностью в отношении компонентов бактериальной клеточной стенки, а именно, их способностью гидролизовать (5-1-4-гликозидные связи пептидогликана.

5.Уровень продукции белков Rpf у микобактерий очень низок (менее 10 пг/мл супернатанта в стационарной фазе), что подтверждает предположение об их регуляторной роли.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Салина, Елена Геннадьевна, 2006 год

1. Беккер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига «Зинатне», 1981

2. Волошин С.А. Капрельянц А.С. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях. Биохимия. 2004. Т. 69, №11, С.1555-1564.

3. Воробьева Л.И., Никитенко Г.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Реактивация инактивированных ультрафиолетовым светом клеток Esherichia coli клеточными экстрактами пропионово-кислых бактерий. Микробиология, 1993, т.62, с.1135-1143

4. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. Микробиология, 2000, Т.69, №3, с. 383-388.

5. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д Ю., Митюшина Л.Л., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum. Микробиология, 2003, Т.72, №3, с. 328-337.

6. Мукамолова Г.В., Кормер С.С., Янопольская Н.Д., Капрельянц А.С. Исследование покоящихся клеток в культуре Micrococcus luteus , пребывающей в длительной стационарной фазе. Микробиология, 1995, Т.63, №3, с.341-346.

7. Мукамолова Г.В., Янг М, Келл Д.Б., Капрельянц А.С. Бактериальные феромоны и клеточное деление. Успехи биологической химиии. 1999. Т. 39. С. 225 254.

8. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Воробьева Е.А., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus. Микробиология, 1996, Т.65, №6, с. 782-789

9. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова ЕА. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов. Микробиология. 2000. Т. 69. С. 309-327.

10. Ю.Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий. Микробиология, 2004, Т. 73, №4, с.516-529.

11. Allen-Austin, D., Austin В., Colwell, R. (1984). Survival of Aeromonas salmonicida in river water. FEMS Microbiol.Lett. 21,143-146.

12. Amann, R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews. 59, 143-169.

13. Arana I., Muela A., Iriberri J., Egea L., Barcina I. (1992). Role of hydrogen peroxide in loss of culturability mediated by visible light in Escherichia coli in a freshwater ecosystem. Appl. Environ. Microbiol. 58(12): 3903-3907.

14. Atrih A., Foster S.J. (1999). The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie Van Leeuwenhoek. 75,299-307.

15. Barer M.R. and Harwood C.R. (1999) Bacterial viability and culturability. Advances in Microbial Physiology. 41, 93-137.

16. Barer M.R., Gribbon L.T., Harwood C.R., Nwoduh C.E. (1993). The viable but not culturable hypothesis and medical bacteriology. Rev. Med. Microbiol. 4,183-191.

17. Bateman A. and Bycroft M. The structure of a LysM domain from E. coll membrane-bound lytic murein transglycosylase D (MltD). (2000) J. Mot. Biol. 299(4):1113-1119.

18. Betts J. C., Lukey P. Т., Robb L. C., McAdam R. A., and Duncan K. (2002). Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. Mol. Microbiol. 43, 717-731.

19. Binnerup S. J., Jensen D. F., Thordal-Christensen H., Sorensen J. (1993). Detection of viable, but not-culturable Pseudomonas fluorescens DF57 in soil using a microcolony epifluorescence technique. FEMS Microbiol. Ecol. 12: 97-105.

20. Bloch H, Segal W. Biochemical differentiation of Mycobacterium tuberculosis grown in vivo and in vitro. (1956).JBacteriol. 72(2):132-141.

21. Bloomfield S.F., Stewart G.S., Dodd C.E., Booth I.R., Power E.G. (1998). The viable but non-culturable phenomenon explained? Microbiology 144:1-3.

22. Bogosian G., Sammons L.E., Morris P.J., O'Neil J.P., Heitkamp M.A., Weber D.B. (1996). Death of the Escherichia coli K-12 strain W3110 in soil and water. Appl. Environ. Microbiol. 62(11): 4114-4120.

23. Boon C., Dick T. (2002). Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy. J Bactenol. 184(24).6760-6767

24. Bovill R.A. and Mackey B.M. (1997). Resuscitation of 'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology. 143,1575-1581.

25. Bradford M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. (1976). Anal.Biochem, 72, 248-254.

26. Calcott P.H. and Postgate J.R. (1972). On substrate-accelerated death in Klebsiella aerogenes. J. Gen. Microbiol. 70,115-122.

27. Cohen-Gonsaud M.( Barthe P., Bagneris C., Henderson В., Ward J., Roumestand C. and Keep N.H (2005). The structure of a resuscitation-promoting factor domain from Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes. Nat Struct Mol Biol. 12, 270-273.

28. Cohen-Gonsaud M., Keep N.H., Davies A.P., Ward J., Henderson B. and Labesse G. (2004). Resuscitation-promoting factors possess a lysozyme-like domain. Trends Biochem Sci. 29, 7-10.

29. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Gamier Т., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E. (1998). Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393, 537-544.

30. Colwell R.R., Brayton P.,Herrington D., Tall В., Huq A., Levine M.M. (1996). Viable but nonculturable Vibrio cholerae 01 revert to a cultivable state in the human intestine. World J. Microbiol. Biotechnol. 12: 28-31.

31. Cooper A., Callahan J., Griffin J„ Roberts A., Orme I. (1995). Old mice are able to control low-dose aerogenic infections with Mycobacterium tuberculosis, infect.lmmun. 63, 3259-65.

32. Corper, H. J. Cohn, M. L. (1933). The viability and virulence of old cultures of tubercule bacille. Studies on twelve-year broth cultures maintained at incubator temperature. Am. Rev. Tuberc. 28, 856-874.

33. Cunningham A.F., Spreadbury C.L. (1998). Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallinhomolog. J Bacteriol. 180(4), 801-808.

34. Decross A.J. and Marshall B.J. (1993). The role of Helicobacter pylori in acid-peptic disease. Am. J. Med. Sci. 306: 381-392.

35. Dick Т., Lee B.H. Murugasu-Oei B. (1998). Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol Lett 163,159-164.

36. Domingue G.J., and Woody H.B. (1997) Bacterial persistence and expression of disease. Clin. Microbiol. Rev. 10, 320-344.

37. Edwards C. (2000). Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol. Biotechnol. 15, 211-223.

38. Engel H., Kazemier B. and Keck W. (1991). Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli. sequence analysis and controlled overexpression of the sit gene, which encodes the soluble lytic transglycosylase. J Bacteriol. 173, 6773 6782.

39. Ericsson M., Hanstorp D., Hagberg P., Enger J., Nystrom T. (2000). Sorting out bacterial viability with optical tweezers. J Bacteriol. 182: 5551-5555.

40. Evdokimova N.V., Dorofeev A.G., Panikov N.S. (1994). Dynamics of survival and transition to dormant state of nitrogen-starving bacteria Pseudomonas fluorescens. Microbiology (Rus.) 63(2): 195-204.

41. Flynn, J.L. and Chan J. (2001). Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immuno 19: 93129

42. Foster S.J. (1992) Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J Bacteriol. 174(2):464-70.

43. Gangadharam P.R.J. (1995). Mycobacterial dormancy. Tuber. Lung Dis. 76,477-479.

44. Garton N.J., Christensen H., Minnikin D.E., Adegbola R.A., Barer, M.R. (2002) Intracellular lipophilic inclusion in mycobacteria in vitro and in sputum. Microbiology, 148, 2951-2958.

45. Graham J.E., Clark-Curtiss J.E. (1999). Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selectivecapture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci USA. 96(20):11554-11559.

46. Grey B.E. and Steck T.R. (2001). The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection. Appl Environ Microbiol 67(9): 3866-72.

47. Grutter M.G., Weaver L.H., Matthews B.W. (1983). Goose lysozyme structure: an evolutionary link between hen and bacteriophage lysozymes? Nature. 303 (5920): 828-31.

48. Gupta S., Pandit S.B., Srinivasan N., Chatterji D. (2002) Proteomics analysis of carbon-starved Mycobacterium smegmatis: induction of Dps-like protein. Protein. Eng. 15(6), 503-512.

49. Hengge-Aronis R. (1993) Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in E coli. Cell. 72,165-168.

50. Hernandez-Pando R., Jeyanathan M., Mengistu G., Aguilar D., Orozco H., Harboe M., Rook G.A., Bjune G. (2000). Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosis in superficially normal lung tissue during latent infection. Lancet 356, 2133-2138.

51. Holtje J.V. From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli. (1995). Arch Microbiol. 164(4):243-54.

52. Honer zu Bentrup K., Russell D.G. (2001). Mycobacterial persistence: adaptation to a changing environment. Trends Microbiol. 9(12):597-605.

53. Hu J.C., Kornacker M.G., Hochschild A. (2000). Escherichia coli one- and two-hybrid systems for the analysis and identification of protein-protein interactions. Methods 20, 80-94.

54. Hu Y.M., Butcher P.D., Sole K., Mitchison D.A. Coates A.R.M. (1998). Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock. FEMS Microbiology Letters 158,139-145.

55. Hutter В., and Dick T. (1998). Increased alanine dehydrogenase activity during dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol. Lett. 167, 7-11.

56. Hutter В., and Dick T. (1999). Up-regulation of narX, encoding a putative "fused nitrate reductase" in anaerobic dormant Mycobacterium bovis BCG. FEMS Microbiol. Lett. 178, 63-69.

57. Ito S., Karnovsky M. (1969). J. Cell Biol. 39(1), 168-169.

58. Kaiser D. and Losick R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Ceil 73: 873885.

59. Kalmbach S., Manz W., Szewzyk U. (1997). Isolation of new bacterial species from drinking water biofilms and proof of their in situ dominance with highly specific 16S rRNA probes. Appl Environ Microbiol, 63(11), 4164-4170.

60. Kaprelyants A.S. and Kell D.B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. J Appl Bacteriol. 72, 410-422.

61. Kaprelyants A.S. and Kell D.B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol. 59, 3187-3196.

62. Kaprelyants A.S., and Kell D.B. (1996). Do bacteria need to communicate with each other for growth? Trends Microbiol. 4, 237-242.

63. Kaprelyants A.S., Gottschal J.C., Kell D. B. (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 104, 271-286.

64. Kaprelyants A.S., Mukamolova G.V. Kell D.B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Letf115, 347-352.

65. Karakousis P.C., Yoshimatsu Т., Lamichhane G., Woolwine S.C., Nuermberger E.L., Grosset J., Bishai, W.R. (2004). Dormancy phenotype displayed by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in mice. J. Exp. Med. 200, 647657.

66. Kell D.B., Kaprelyants A.S., Weichart D.H., Harwoo C.R., Barer, M.R. (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek 73,169-187.

67. Kell D.B., Mukamolova G.V., Finan C.L., Zhao H., Goodacre R., Kaprelyants A.S., Young M. (2003). Resuscitation of "uncultured" microorganisms. In: Microbal Diversity and Bioprospecting (A.T. Bull, ed.). Am Soc Microbiol, Washington, DC.

68. Kendall S.L., Movahedzadeh F., Rison S.C.G., Wernisch L., Parish Т., Duncan K., Betts J.C., Stoker N.G. (2004). The Mycobacterium tuberculosis dosSR two-component system is induced by multiple stresses. Tuberculosis 84, 247-255.

69. Khomenko A.G., and Golyshevskaya V.I. (1984). Filterable forms of Mycobacterium tuberculosis. Z Erkrank Atm-Org, 162,147-154.

70. Kjelleberg S., Albertson N„ Flardh K., Holmquist L., Jouper-Jaan A., Marouga R., Ostling J., Svenblad В., Weichart, D. (1993). How do non-differentiating bacteria adapt to starvation? Antonie Van Leeuwenhoek 63, 333-341.

71. Kolling G.L., Matthews K.R. (2001). Examination of recovery in vitro and in vivo of nonculturable Escherichia coli0157:H7. Appl Environ Microbiol. 67(9): 3928-33.

72. Kolter R., Siegele D. A., Tormo A. (1993). The stationary phase of the bacterial life cycle. Ann Rev Microbiol 47, 855-874.

73. Laemmli (J. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature, 227, 680-683.

74. Lange R. and Hengge-Aronis R. (1991). Identification of a central regulator of stationary phase gene expression in Escherichia coli. Mol Microbiol 5, 49-59.

75. Lee B.H., Murugasu-Oei В., Dick T. (1998). Upregulation of a histone-like protein in dormant Mycobacterium smegmatis. Mol. Gen. Genet. 260,475-479.

76. Lillebaek Т., Dirksen A., Baess I., Strunge В., Thomsen V.O., Andersen A.B. (2002). Molecular evidence of endogenous reactivation of Mycobacterium tuberculosis after 33 years of latent infection. J. Infect. Dis 185(3) 401-404.

77. Lim A., Eleuterio M., Hutter В., Murugasu-Oei В., Dick, T. (1999). Oxygen depletion-induced dormancy in Mycobacterium bovis BCG. J Bacteriol 181, 2252-2256.

78. Lorenz M.C., Fink G.R. (2001). The glyoxylate cycle is required for fungal virulence. Nature. 412(6842):83-6

79. Losick, R. and D. Kaiser (1997). Why and how bacteria communicate. Sci. Am. 276(2), 68-73.

80. MacDonell M.T. and Hood M. (1982). Isolation and characterization of ultramicrobacteria from a gulf coast estuary. Appl. Environ. Microbiol. 43, 566-571.

81. Magarinos В., Romalde J.L., Barja J.L., Toranzo A.E. (1994) Evidence of a dormant but infective state of the fish pathogen Pasteurella piscicida in seawater and sediment. Appl Environ Microbiol. 60(1), 180-6.

82. ЮЗ.Магу P., Chihib N.E., Charafeddine O., Defives C., Hornez J.P. (2002). Starvation survival and viable but nonculturable states in Aeromonas hydrophila. Microb. Ecol. 43(2), 250-258.

83. McCune R.M., Feldmann F.M., Lambert H.P., McDermott W. (1966). Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J. Exp. Med. 123, 445-468.

84. McMurray D.N., Collins F.M., Dannenberg A.M., Smith D.W. (1996). Pathogenesis of experimental tuberculosis in animal models. Curr. Top.Microbiol. Immunol. 215, 157179.

85. Mehta J. and Dutt A. (1995). Tuberculosis in the eldery. Infect.Med. 12,40-46.

86. HO.Moore J.E. (2000). Comparison of basal broth media for the optimal laboratory recovery of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Ir. J. Med. Sci. 169(3), 187189.

87. I.Morgan J.A., Clarke К J., Rhodes G., Pickup R.W. (1992). Non-culturable Aeromonas salmonicida in lake water. Microb Releases 1, 71-78.

88. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young, M. (2003). Adoption of the transiently non-culturable state a bacterial survival strategy? Adv. Microb. Physiol. 47, 65-129.

89. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Young D.I., Young M., Kell, D. В. (1998a). A bacterial cytokine. Proc. Natl. Acad .Sci. USA 95, 8916-8921.

90. Mukamo!ova G.V., Turapov O.A , Kazarian K., Telkov M„ Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. (2002b). The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol Microbiol. 46(3), 611-21.

91. Mukamolova G.V., Turapov O.A., Young D.I., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. (2002a) A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 46(3), 623-35.

92. Mukamolova G.V., Yanopolskaya N.D., Votyakova T.V., Popov V.I., Kaprelyants A.S., Kell D.B. (1995a). Biochemical changes accompanying the long-term starvation of Micrococcus luteus cells in spent growth medium. Arch. Microbiol. 163, 373-379.

93. Mukamolova G.V., Yanopolskaya, N.D., Kell, D.B., and Kaprelyants A.S. (1998b). On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek 73, 237-243.

94. Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Kell DB. (1995b). Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek. 67(3):289-95

95. Munoz-Elias E.J., McKinney J.D. (2005) Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence. Nat Med. 11(6), 638-44.

96. Munoz-Elias E.J., McKinney J.D. (2006) Carbon metabolism of intracellular bacteria. Cell Microbiol. 8(1), 10-22.

97. Muttucumaru D.G., Roberts G., Hinds J., Stabler R.A., Parish, T. (2004) Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a non-replicating state. Tuberculosis (Edinb.), 84, 239-246.

98. Newman G.R., Jasani В., Williams E.D. (1983) A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. Histochem J. 15(6), 543-55.

99. Nilsson H.O., Blom J., Abu-AI-Soud W., Ljungh A.A, Andersen L.P., Wadstrom T. (2002) Effect of cold starvation, acid stress, and nutrients on metabolic activity of Helicobacter pylori. Appl. Environ. Microbiol. 68(1), 11-19.

100. Nilsson L., Oliver J. D., Kjelleberg S. (1991). Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state. J Bacteriol. 173, 5054-5059.

101. Nystrom T. (2001). Not quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death. Arch Microbiol 176(3), 159-64.

102. Nystrom Т., Larsson C., Gustafsson L. (1996). Bacterial defense against aging: role of the Escherichia coli ArcA regulator in gene expression, readjusted energy flux and survival during stasis. EMBOJ. 15(13), 3219-3228.

103. Paidhungat M., Setlow P. (2000). Role of Ger proteins in nutrient and non-nutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 182(9), 2513-2519.

104. Parish Т., Smith D.A, Kendall S., Casali N. Bancroft G.J., Stoker N.G. (2003). Deletion of two-component regulatory systems increases the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 71,1134-1140.

105. Park H.D., Guinn K.M., Harrell M.I., Liao R., Voskuil M.I., Tompa M., Schoolnik G.K., Sherman D.R. (2003). Rv3133cIdosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol. 48, 833-843.

106. Parrish N.M., Dick J.D., Bishai W.R. (1998). Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. 6,107-112.

107. Postgate J. and Hunter, J. (1964). Accelerated death of Aerobacter aerogenes starved in the presence of growth-limiting substrate. J. Gen. Microbiol. 34,459-473.

108. Postgate J.R. (1976). Death in macrobes and microbes. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 26,1-18.

109. Primm T.P., Andersen S.J., Mizrahi V., Avarbock D., Rubin H., Barry, C.E., 3rd. (2000). The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long-term survival. J. Bacteriol. 182,4889-4898.

110. Rachman H., Strong M., Ulrichs Т., Grode L., Schuchhardt J., Mollenkopf H., Kosmiagi G.A., Eisenberg D., Kaufman S.H.E. (2006) Unique transcriptome signature of Mycobactenum tuberculosis in pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 72(2), 12331242.

111. Ray B. and Speck M. L. (1973). Freeze-injury in bacteria. CRC Crit Rev Clin Lab Sci 4(2), 161-213.

112. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. (1963) J Cell Biol. 17,208-12.

113. Rivers B. and Steck T.R. (2001). Viable but nonculturable uropathogenic bacteria are present in the mouse urinary tract following urinary tract infection and antibiotic therapy. Urol Res 29(1), 60-66.

114. Romalde J.L., Estes M.K., Szucs G., Atmar R.L., Woodley C.M., Metcalf T.G. (1994). In situ detection of hepatitis A virus in cell cultures and shellfish tissues. Appl Environ Microbiol. 60(6), 1921 -1926.

115. Rose A.S., Ellis A.E., Munro A.L. (1990). Evidence against dormancy in the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. FEMS Microbiol Lett 56, 105-7.

116. Roszak D.B., and Colwell, R.R. (1987). Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count. Appl. Environ. Microbiol. 53, 2889-2893.

117. Roszak, D.B., Grimes D.J., Colwell R.R. (1984). Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can. J. Microbiol. 30(3), 334-338.

118. Rothschild L.J. (2006). A microbiologicts explodes the myth of the unculturables. Nature. 443, 249

119. Rowbury R.J. (2001). Extracellular sensing components and extracellular induction component alarmones give early warning against stress in Escherichia coli. Adv. Microb. Physiol. 44, 215-257.

120. Sever J. and Youmans G. (1957). Enumeration of viable tubercle bacilli from the organs of nonimmunized and immunized mice. Am.Rev.Tuberc.Pulm.Dis. 101, 193202.

121. Sherman D.R., Voskuil M., Schnappinger D., Liao R., Harrell M.I., Schoolnik, G.K. (2001). Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding alpha -crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7534-7539.

122. Siegele D.A. and Kolter R. (1992). Life after log. J Bacteriol 174, 345-348.

123. Smeulders M.J., Keer J., Speight R.A., Williams, H.D. (1999). Adaptation of Mycobacterium smegmatis to stationary phase. J Bacteriol 181, 270-283.

124. Storz G. and Hengge-Aronis R., (2000). Bacterial Stress Responses. Washington, DC, American Society for Microbiology.

125. Sun Z. and Zhang Y. (1999). Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis H37Ra improves viability of aged cultures of this strain and allows small inocula to initiate growth. J Bacteriol 181, 7626-7628.

126. Sussman & Halvorson (1966). Spores, their dormancy and germination. Harper and Row, New York, NY

127. Thunnissen A.M., Isaacs N.W., Dijkstra B.W. (1995). The catalytic domain of a bacterial lytic transglycosylase defines a novel class of lysozymes. Proteins. 22(3), 245-258.

128. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F.L. (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl Environ Microbiol 56, 782-787.

129. Tufariello J.M., Jacobs W.R.J., Chan J. (2004). Individual Mycobacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo. Infect. Immun. 72, 515-526.

130. Velayati A.A., Bakayev V.V., Bahrmand A.R. (2002). Use of PCR and culture for detection of Mycobacterium tuberculosis in specimens from patients with normal and slow responses to chemotherapy. Scand. J. Infect. Dis. 34(3), 163-166.

131. Voskuil M. (2004). Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency. Tuberculosis 84,138-143.

132. Voskuil M.I., Schnappinger D., Visconti K.C., Harrell M.I., Dolganov G.M., Sherman D.R., and Schoolnik G.K. (2003). Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J. Exp. Med. 198, 705-713.

133. Voskuil M.I., Visconti K.C., Schoolnik G.K. (2004). Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy. Tuberculosis (Edinb.) 84, 218-227.

134. Votyakova T.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. (1994). Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase: the population effect. Appl Environ Microbiol 60, 3284-3291.

135. Wai S.N., Mizunoe Y., Takade A., Yoshida S. (2000). A comparison of solid and liquid media for resuscitation of starvation- and low-temperature-induced nonculturable cells of Aeromonas hydrophila. Arch Microbiol 173(4): 307-10.

136. Watson S.P., Clements M.O., Foster S.J., (1998). Characterizationof the starvation-survival response of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 180,1750-1758.

137. Wayne L.G. (1976). Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions. Am. Rev. Respir. Dis. 114, 807-811.

138. Wayne L.G. (1994). Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13, 908-914.

139. Wayne L.G. and Hayes L.G. (1996). An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through 2 stages of nonreplicating persistence. Infect Immun 64, 2062-2069.

140. Wayne L.G. and Hayes L.G. (1998). Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 79,127-132.

141. Wayne L.G. and Lin K.-Y. (1982). Glyoxalate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions. Infect. Immun. 37, 1042-1049.

142. Wayne L.G. and Sohaskey C.D. (2001). Nonrepeating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol 55,139-63.

143. Weichart D. and S Kjelleberg (1996). Stress resistance and recovery potential of culturable and viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus. Microbiology 142, 845853.

144. Weichart D., McDougald D., Jacobs D., Kjelleberg S. (1997) In situ analysis of nucleic acids in cold-induced nonculturable Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 63(7), 2754-2758.

145. Weichart D., Oliver J.D., Kjelleberg S. (1992). Low temperature induced nonculpability and killing of Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol. Lett. 79(1-3), 205-210.

146. Weichart D.H. and Kell D.B. (2001). Characterization of an autostimulatory substance produced by Escherichia coli. Microbiology 147:1875-1885.

147. Wheeler PR, Ratledge C. (1988). Use of carbon sources for lipid biosynthesis in Mycobacterium leprae: a comparison with other pathogenic mycobacteria. J Gen Microbiol. 134(8):2111-21.

148. Yamamura Y., Walter A., Bloch, H. (1960). Bacterial populations in experimental murine tuberculosis. 1. Studies in normal mice. J. Infect.Dis. 106, 211-222.

149. Young M., Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S. (2005) Mycobacterial dormancy and its relation to persistence. Mycobacterium: Molecular Microbiology London. Horizon Bioscience. 352 P.

150. Yuan Y., Crane D.D., and Barrylll C.E. (1996). Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: function of the mycobacterial alpha-crystallin homolog. J. Bacteriol. 178,4484-4492.

151. Yuan Y., Crane D.D., Simpson R.M., Zhu Y.Q., Hickey M.J., Sherman D.R., Barry, C.E. (1998). The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9578-9583.

152. Zhang Y., Yang Y., Woods A., Cotter R.J., Sun Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides. Biochem Biophys Res Commun 284: 542-547.

153. Благодарю всех друзей и коллег за поддержку и внимание к моей работе.