Генамплификационное тестирование донорской крови на патогены: технологии, системы и стандарты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, доктор биологических наук Ёлов, Андрей Александрович

• Ёлов, Андрей Александрович
• доктор биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации доктор биологических наук Ёлов, Андрей Александрович

1. Введение и общая характеристика работы.

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цель и задачи работы.

1.3. Научная новизна работы.

1.4. Практическая ценность работы.

1.5. Основные положения, выносимые на защиту.

2. ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННАЯ ДИАГНОСТИКА: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ, ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ (литературный обзор).

2.1. Проблема вирусной безопасности донорской крови и ее компонентов.

2.2. Генамплификационные методы анализа, их возможности и основные проблемы.

2.2.1. Полимеразные цепные реакции и другие генамплификационные методы.

2.2.2. Способы преодоления ложноположительных результатов ПЦР.

2.2.3. Анализ индивидуальных особенностей генома - генотипирование

2.3. Методы детекции продуктов генамплификации.

2.3.1. Метод гель-электрофореза.

2.3.2. ПЦР с «горячим стартом».

2.3.3. Гибридизационная детекция в растворе.

2.3.3.1. Измерение гибридизационной защиты хемилюминесцентных меток зонда- НРА (hybridization protection assay).

2.3.3.2. Экзонуклеазная активность Taq-полимеразы (система TaiqMan).

2.3.3.3. Молекулярные бакены и праймеры-скорпионы.

2.3.3.4. Система двух зондов с передачей энергии.

2.3.3.5. Зажигаемые зонды (light-up probes).

2.3.4. Гибридизационная детекция на твердой фазе.

2.4. ПЦР в реальном времени.

2.5. ПЦР с внутренним стандартом и ее применение для количественных и диагностических анализов.

2.5.1. Внутренние стандарты конкурентного типа.

2.5.2. Внутренние стандарты неконкурентного типа. Значение внутренних стандартов при ПЦР в реальном времени.

2.6. Обработка крови и другого клинического материала для генамплификационных анализов.

2.6.1. Методы обработки .сыворотки и плазмы крови для получения суммы ДНК и РНК для ПЦР-анализа.

2.6.2. Упрощенные методы получения препаратов ДНК для ПЦР-анализа

2.7. Международные стандарты для генамплификационных анализов. Деятельность БоОАТ.

2.7.1. ИАТ-стандарты на РНК ВИЧ.

2.7.2. ИАТ-стандарт для ДНК НВУ.

2.7.3. ЫАТ-стандарт для РНК вируса гепатита С.

2.7.4. ЫАТ-стандарт для ДНК парвовируса В19.

2.7.5. Новые цели БоСАТ. Перспективы развития международных КАТ-стандартов.

2.8. Краткие итоги мирового опыта генотестирования донорской крови и ее компонентов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4. ГЕНАМПЛИФИКАЦИОННОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ПАТОГЕНЫ: ТЕХНОЛОГИИ, СИСТЕМЫ И СТАНДАРТЫ результаты и их обсуждение).

4.1. Основные задачи работы.

4.2. Обработка проб крови, ее компонентов и белковых препаратов для генотестирования вирусных и бактериальных ДНК и РНК.

4.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов и других клеток с использованием протеиназы К и термического лизиса с сорбентом.

4.2.2. Методы, применяемые для выделения вирусных ДНК и РНК из сыворотки и плазмы крови: метод фенольной депротеинизации и метод сорбции на силикагеле.

4.2.3. Однопробирочный метод для одновременного выделения суммы

РНК и ДНК.

4.2.4. Получение суммы ДНК и кДНК биопробы без изоляции РНК.

4.3. Применение внутренних стандартов как способ преодоления ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

4.3.1. Конструирование внутренних стандартов методом направленного соединения фрагментов ДНК. Первый опыт количественной ПЦР.

4.3.2. О возможном применении простых методов для конструирования внутренних стандартов конкурентного типа.

4.3.3. Внутренние стандарты для практического генотестирования гемотрансмиссивных вирусов и других патогенов.

4.2.4. Калибровка внутренних стандартов.

4.4. Оптимизация компоновки реагентов для ПЦР-анализа, обеспечивающей их сохранность и удобство постановки анализа.

4.4.1. Двухрастворная компоновка реагентов для ПЦР и обратной транскрипции.

4.4.2. «Сухие» тест-системы для ПЦР и другие варианты компоновки тест-систем для пользователей.

4.5. Характеристика разработанных и применяемых наборов генодиагностических реагентов.

4.5.1. Наборы реагентов для обработки биопроб.

4.5.2. Наборы реагентов для обнаружения возбудителей инфекций.

4.5.2.1. Тест-системы для обнаружения вируса гепатита В.

4.5.2.2. Тест-система (набор реагентов) для определения вируса гепатита С (НСУ) в плазме крови путем двукратной РНК-ПЦР.

4.5.2.3. Тест-системы для определения ДНК и РНК ВИЧ.

4.5.2.4. Тест-системы (набор реагентов) для определения ДНК цитомегаловируса методом двукратной ПЦР.

4.5.2.5. Тест-система (набор реагентов) для определения бледной трепонемы методом РНК-ПЦР.

4.5.2.6. Комплект тест-систем для определения возбудителей урогенитальных и других инфекций методом ПЦР.

4.5.4. Тест-системы для генотипирования.

4.6. Проба флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Детекция продуктов ПЦР в закрытой системе как наиболее перспективный способ преодоления ложноположительных результатов.

4.6.1. Конструирование зондов для флуориметической детекции продуктов ПЦР.

4.6.2. Зонд для флуоресцентной детекции ДНК гепатита В с использованием экзонуклеазной активности Taq-пoлимepaзы (система типа ТацМап).

4.6.3. Пара зондов для детекции ДНК вируса гепатита В с внутренним стандартом. ЭАВСУЬ как эффективный нефлуоресцирующий тушитель

4.6.4. Варианты зонда - молекулярного бакена и праймера-скорпиона.

4.6.5. Амплификоны как основной источник ложноположительных результатов ПЦР-анализов. О простом приеме ухода от контаминаций и перспективности детекции продуктов ПЦР в закрытой системе.

4.7. О результатах применения разработанных методов и тест-систем при генотестировании крови доноров и пациентов.

4.7.1. Первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-ИАТ-тестирования донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С

4.7.2. Генотестирование серопозитивных донаций крови.

О возможной реабилитации доноров и пациентов на основе результатов генодиагностики.

4.7.3. О вирусоносительстве среди больных гемофилией.

4.7.4. Оценка распространения носительства цитомегаловируса среди кадровых доноров СПК КЗ г.Москвы.

4.7.5. Проблема бактериальной безопасности донорской крови.

4.7.5.1. Об отсутствии бледной трепонемы в крови серопозитивных

4.7.5.2. Обнаружение бактерий в крови методом ПЦР на универсальной последовательность гена рибосомальной РНК.

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Ёлов, Андрей Александрович

6. выводы

1. Разработан комплекс технологий, основанный на универсальном методе выделения вирусных ДНК и РНК из плазмы крови, полимеразной цепной реакции на основе оригинальных компоновок реагентов и анализа продуктов в обычном агарозном геле, позволяющий уже сегодня внедрить генотестирование в службе крови России.

2. Впервые в России и среди первых работ в мире было установлено, что при генамплификационном обнаружении патогенов внутренние стандарты конкурентного типа позволяют выявить как ложноотрицательные, так и ложноположительные результаты.

3. Предложен способ устранения ложноположительных результатов в условиях высокого фона контаминаций путем перехода на систему «смещенных» праймеров. Одновременно подтверждено, что контаминации продуктами ПЦР являются основными источниками ложноположительных результатов.

4. Запатентован (патенты РФ № 2134871, приоритет 01.12. 98, № 2164532, приоритет 11.07.00) универсальный однопробирочный метод выделения суммы РНК и ДНК из плазмы крови и других биоматериалов типа жидкости или суспензии.

5. Запатентован (патент РФ № 2164532, приоритет 11.07.00) двухрастворный вариант компоновки реагентов для ПЦР, обеспечивающий длительную сохранность этих реагентов.

6. Разработаны перечисленные ниже тест-системы для выявления патогенов: наборы реагентов для обработки биопроб однопробирочным методом, термическим лизисом с сорбентом и методом сорбции на силикагеле; наборы реагентов для обнаружения вирусов гепатитов В и С, ВИЧ в форме РНК и ДНК, цитомегаловируса и герпеса, бледной трепонемы и комплект тест-систем для обнаружения урогенитальных и других бактериальных инфекций. Две из перечисленных тест-систем зарегистрированы в Минздраве РФ.

7. Разработана тест-система для генотипирования 8,2-аллелей альфа-1-антитрипсина. На примере последней впервые показана возможность детектирования в одной ПЦР-смеси нуклеотидных замен в двух точках при одновременной контрольной ПЦР на маркерном фрагменте.

8. Осуществлен первый российский опыт ручного и полуавтоматического минипул-ПЦР-тестирования плазмы донорской крови на ВИЧ и вирусы гепатитов В и С. Среди 8849 серонегативных доноров СПК КЗ г.Москвы обнаружено 2 носителя вируса гепатита В (0,023%), а среди 3514 первичных доноров СПК ФУ «Медбиоэкстрем» - 3 носителя вируса гепатита В (0,085%) и 12 носителей вируса гепатита С (0,34%). Результаты соответствуют среднемировым для аналогичных небольших банков крови.

9. Предложен способ контроля бактериальной контаминации крови генамплификационным методом на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности.

10. На основе собственного опыта генотестирования и литературных данных донорской крови показано, что:

- дополнительное к иммуноферментному анализу генотестирование донорской крови актуально и необходимо, о чем свидетельствуют неоднократные доказанные случаи трансфузионной передачи вирусов и бактерий;

- достоверность результатов генамплификационных тест-систем собственного изготовления ("¡п-Ьоизе") сравнима с коммерческими и обеспечивается необходимым в любом случае регулярным контролем всего процесса по международным стандартам или их аналогам.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕДАЦИИ

1. С учетом мирового опыта применения международных стандартов и эталонных образцов для объективного контроля и самоконтроля эффективности и чувствительности генамлификационных анализов следует рекомендовать разработку, производство и официальное утверждение в России национальных аналогов таких стандартов, прокалиброванных по международным. Такие стандарты должны быть созданы в первую очередь для важнейших гемотрансмиссивных патогенов (ВИЧ, вирусы гепатитов В и С, бледная трепонема), а также для других патогенов, и быть доступными для всех лабораторий. Результаты генотестирования панелей таких стандартов следует считать главным критерием для лицензирования тест-систем и лабораторий.

2. Международный опыт и результаты данной работы позволяют рекомендовать (в том числе и в официальном порядке) реабилитацию компонентов и продуктов крови, а также потенциально-инфицированных лиц как инфекционно безопасных, если их генотестирование с внутренним контролем дало отрицательный результат. Тот же результат для производственных пулов, полученный при введении в анализ материала из большого объема (10-100 мл), следует считать основанием для их допуска в переработку даже в случае попадания в них скомпрометированных донаций. При этом необходимо пока сохранить индивидуальное отведение от донорства по результатам иммунотестирования.

3. Приступить к параллельному ЫАТ-тестированию донорской крови, ее компонентов и в первую очередь - концентратов тромбоцитов на бактериальную контаминацию посредством ПЦР на общей для всех бактерий нуклеотидной последовательности.

4. Рекомендовать генамплификационное обследование всех лиц, состоящих на учете как инфицированные ВИЧ, вирусами гепатитов или другими патогенами, и при строго доказанных отрицательных результатах признать их инфекционно-безопасными со снятием всех необоснованных ограничений.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Ёлов, Андрей Александрович, 2003 год

1.П., Шувалова Т.М, Афонин Н.И. Ещё раз к вопросу о спорных и нерешенных проблемах трансфузионного сифилиса. - Вестник службы крови России 1999, № 2, с.21-24.

2. Гарезина О.В., Гончар В.А., Кайтанджан Е.И. Трансфузионные вирусные гепатиты у больных гемофилиями. . Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы, 2002, т.6, № 1, с. 125.

3. Лысов Ю.П., Флорентьев В.Л., Хорлин А.А., Храпко К.Р., Шик В.В. и Мирзабеков А.Д. Доклады АН СССР^1988, т.303, с. 1508-1511.

4. Митрохин С.Д. Микробиологическая диагностика инфекций кровяного русла на современном этапе развития клинической микробиологии. Инфекции и антимикробная терапия 2002, т.4, № 1, с.27-29

5. Федоров Е.Н., Петухова И.И., Суханов Ю.С., Ёлов А.А., Федоров Н.А. ПЦР-детекция ДНК и РНК Treponema pallidum в крови серопозитивных доноров. — Вестник службы крови России 2001, № 3, с.42-46.

6. Федоров Н.А. Все ли люди, зарегистрированные в центрах СПИД как ВИЧ-инфицированные, содержат этот вирус в крови? Вестник службы крови России, 2000, №4, с.9-11.

7. Шибата Д.К. В кн.: Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Москва, «Мир», 1999, с.422.

8. AABB: Statement of the American Association of Blood Banks before the blood products advisory committee. September 15, 2000. http://www.aabb.org/pressroom/pressreleases/prbpacsyph091400.htm

9. Allain J., Reddy R., Candotti D., Sarcodie F., Nel T. Genomic detection of HIV & HCV by TMA in high prevalence areas of Sub Saharian Africa. // Transfusion, 2000, v.40 Supplement, S26-030E, p. 9S.

10. Alvarez M., Oyonarte S., Rodriguez P.M. and Hernandez J.M. Estimated risk of transfusion-transmittted viral infections in Spain. Transfusion 2002, v.42, p.994-998.

11. AuBuchon J.P., Birkmeyer J.D., Busch M.R. Safety of the blood supply in the United States: opportunities and controversies. // Ann. Intern. Med. 1997, v. 127, p. 904-909.

12. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.H., P.M.E.Wertheim van Dillen, J. Van der Nordaa. Rapid and simple method of purification of nucleic acids. J. Clinical Microbiol. 1990, v.28, No.3, p.495-503.

13. Bootman J.S., Kitchin P.A.: An international collaborative study tu assess set of reference reagents for HIV-1 PCR. Journal of Virological Methods 1992, v.37, p.32-42

14. Burg J.L., Grover C.M., Pouletty P. And Boothroyd J.C. Direct and sensitive detection of a pathogenic protozoan, Toxoplasma gondii, by a polymerase chain reaction. J. of Clin. Microbiol. 1989, v.27, No.8, p. 1787-1792.

15. Bustin S.A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology 2000, v.25, p.169-193.

16. Cardoso M.D.S. SoGAT XI. Draft minutes of the 11th meeting of 12 May 2000, p.3.

17. Cavanagh G., Dunn A., Chapman C.E. and Metcalfe P. HPA genotyping by PCR sequence specific priming (PCR-SSP): a streamline method for rapidroutine investigations. -Transfusionmedicine 1997,7:41-45

18. Celi F., Zenilman M.E. and Shuldner A.R. A rapid and versatile method to synthesize internal standards for competitive PCR. — Nucleic Acids Research 1993, v.21, No.4, p. 1047.

19. Centurion-Lara A., Castro C., Shaffer J.M., van Voorhis W.C., Marra C.M. and Lukehart S.A. Detection of Treponema pallidum by a sensitive reverse transcriptase PCR. -Journal of Clinical Microbiology 1997, v.35, No.6, p.1348-1352.

20. Chomczynski P. and Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol - chloroform extraction. - Analyt. Biochem. 1987, v.162, p.156-159.

21. Cone R.W., Hobson A.S. and Huang M.W. Coamplified positive control detects inhibition of the polymerase chain reaction in diagnostic laboratory. J. Clin. Microbiol. 1992, v. 30, No. 12, p.3185-3189.

22. Davis C., Holmes H. and Heath A. 4th statistical analyses of HIV-1 RNA working reagents PWS-1 (99/634), PWS-2 (99/636) and PWS-3 (99/766). NIBSC, January 1999 to Summer 2001.

23. Deggerdal A. and Larsen F. Rapid isolation of PCR-Ready DNA from blood, bone marrow and cultured cells, based on paramagnetic beads. BioTechniques 1997, v.22, No.3, p.554-557.

24. Ehrlich H.A., ed. PCR technoplogy. Stockton Press, New York, 1989.

25. Drosten C., Weber M., Seifried E and Roth W.K. Evaluation of a new PCR assay with competitive internal control sequence for blood donor screening Transfusion 2000, v.40, p.718-724.

26. Drosten C., Seifried E. and Roth W.K. TaqMan 5'-nuclease human immunodefifciency virus type 1 PCR assay with phage-packaged competitive internal control for high-throughput blood donor screening. J. of Clin. Microbiol. 2001, v.39, No. 12, p.4302-4308.

27. Elfath M., Luka J., Tahhan R., and Morriarty R. Detection of CMV by polymerase chain reaction (PCR) in seropositive blood donors. Transfusions 1996, v.36 suppl., p.34S, abstract SI34

28. French' D.J., Archard C.L., Brown T., McDowell D.G. HyBeacon™ probes: a new tool for DNA sequence detection and allele discrimination Molecular and cellular probes 2001, v.15, No.6, pp. 363-374

29. Gajardo R. SoGAT XI. Draft minutes of the 11th meeting of 12 May 2000, p.2.

30. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K. and Bunn F.H. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantification by the polymerase chain reaction. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990, v.87, p.2725-2729.

31. Gluck, D., Maurer, C., Kubanek, B., Petersen N. Seroconversion of HIV, HCV,and HBV in blood donors in 1996-risk of virus transmission by blood products in Germany. Infusionsther Transfusionsmed, 1998, v. 25, p. 82-84.

32. Grabnitz F., Halperin E., Resnick L. Und Bieger W.P. Sensitiver und spezifischer Nachweis von Treponema pallidum mit der Polymerase-Kettenreaktion. Klinisches Labor 1992, v.38, p.537-543.

33. Greenlee D.J., Fan H., Lawless K., Harrison C.R. and Gulley M.I. Quantitation of CMV by real-time PCR in transfusable RBC units. Transfusion 2002, v.42, p.403-408.

34. Greisen K., Loeffelholz M., Purohit A. and Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J. of Clin. Microbiol. 1994, v.32, No.2, p.335-351.

35. Guatelli J.C., Whitefield M.A., Kwoh D.Y., Barringen D.J., Richman D.D. and Gingeras T.R. Isothermal self-sustained in vitro replication of nucleic acids like retroviral infection. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1990, v.87, p. 1874-1878.

36. Gubbe K.: PCR a new tool for improved plasma safety. — Symposium organized by "Baxter- Hyland- Immuno", Vienna, Ausrtia, September, 1998.

37. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Seventh edition. Molecular Probes, Inc., 1999.

38. Higuchi R., Dollinger G., Walsh P.S. and Griffith R. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 1992, v. 10, p.413-417.

39. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., and Watson, R. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 1993, v.l 1, p.1026-1030.

40. Hitzler W. E., Runkel S.: Routine HCV PCR screening of blood donations to identify early HCV infection in blood donors lacking antibodies to HCV. Transfusion 2001, v.41, p.333-337

41. Hnatyszyn H. J., Podack E.R., Young A.K., Seivright R., Spruill G., Kraus G. The use of real-time PCR and fluorogenic probes for rapid and accurate genotyping of newborn mice Molecular and Cellular Probes 2001, v.15, No.3, p. 169-17555