Стимуляция регенерации кожи с помощью клеточных пластов из мезенхимных стромальных клеток жировой ткани тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Александрушкина Наталья Андреевна

• Александрушкина Наталья Андреевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Александрушкина Наталья Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Принципы восстановления поврежденной ткани

1.2. Участие мезенхимных стромальных клеток в регенеративных процессах

1.2.1. Роль стромы в регенерации тканей

1.2.2. Определение МСК и механизмы их терапевтического действия

1.2.3. Происхождение и характеристика МСК

1.3. Реализация регенераторных эффектов МСК и тканеинженерных конструкций на их основе

1.3.1. Клеточная терапия на основе МСК

1.3.2. Секретом МСК как альтернатива клеточной терапии

1.3.3. Тканеинженерные конструкции на основе МСК

1.3.4. Технология клеточных пластов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и методы исследований in vitro

2.1.1. Выделение и культивирование клеток

2.1.2. Сборка тканеинженерных конструкций (клеточных пластов) из МСКЖТ

2.1.3. Получение образцов секретома МСКЖТ

2.1.4. Методы оценки активности секретома МСК

2.1.5. Определение концентраций ангиогенных факторов в секретоме МСК

2.1.6. Выделение РНК, РНК-секвенирование и анализ данных

2.2. Модели на животных и исследования in vivo

2.2.1. Модель глубокой шинированной раны с дефицитом мягких тканей у крысы

2.2.2. Сравнительное исследование эффективности МСК ЖТ в виде суспензии и в составе КП на модели острой шинированной раны

2.2.3. Модель пролежневого дефекта кожи у мыши

2.2.4. Сравнительное исследование эффективности МСК ЖТ в виде суспензии и в составе КП на модели пролежневого дефекта кожи

2.3. Методы оценки процесса ранозаживления в экспериментах in vivo

2.3.1. Макроскопическая оценка скорости заживления кожного дефекта

2.3.2. Оценка процессов роста и созревания грануляционной ткани

2.3.3. Оценка плотности кровеносных сосудов

2.3.4. Визуализация трансплантированных МСК ЖТ в составе КП и при введении в виде суспензии

2.4. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение и характеристика тканеинженерных конструкций в виде клеточных пластов из МСК жировой ткани

3.1.1. Оптимизация методики получения клеточных пластов из МСК жировой ткани

3.1.2. Гистологическая характеристика клеточных пластов из МСКЖТ

3.1.3. Оценка биологической активности секретома МСК ЖТ в составе КП

3.2. Исследование эффективности КП из МСК жировой ткани на модели восстановления глубокой шинированной раны кожи с дефицитом мягких тканей у крысы

3.2.1. Трансплантация МСК ЖТ ускоряет заживление глубокого шинированного дефекта кожи и подлежащих мягких тканей

3.2.2. Визуализация трансплантированных МСК ЖТ в образцах ткани

3.2.3. Трансплантация МСК ЖТ приводит к ускорению созревания грануляционной ткани и формирования рубца

3.3. Сравнительное исследование терапевтической эффективности МСК жировой ткани, клеточных пластов и секретома МСК на модели пролежневого дефекта кожи у мыши

3.3.1. Трансплантация КП из МСК ускоряет заживление пролежневого дефекта и приводит к полной регенерации кожи

3.3.2. Трансплантация КП из МСК активирует рост ГТ на ранних сроках раневого процесса

3.3.3. Васкуляризация ГТ при заживлении пролежня изменяется под действием секретома и КП из МСК

3.3.4. Оценка судьбы МСК после трансплантации в виде суспензии или клеточных пластов

3.4. Выяснение молекулярного механизма регенераторных эффектов КП из МСК ЖТ

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГСК - гематопоэтические стволовые клетки

ГТ - грануляционная ткань

ДКИ - доклинические исследования

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖТ - жировая ткань

ИФА - иммуноферментный анализ

КИ - клинические исследования

КМ - костный мозг

КП - клеточный пласт

МСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

РНК - рибонуклеиновая кислота

СВФ - стромально-васкулярная фракция

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФР - фактор(ы) роста

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭК - эндотелиальная клетка

а-ГМА - альфа-гладкомышечный актин

DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle Medium)

EBM - базальная среда роста для эндотелия (Endothelial Basal Medium)

FGF2 - фактор роста фибробластов 2 (fibroblast growth factor)

G-CSF - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

HIF - транскрипционные факторы, индуцируемые гипоксией (hypoxia-

inducible factors)

HGF - фактор роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor)

HUVEC - клетки эндотелия пупочной вены человека (human umbilical vein endothelial cells)

PDGF - тромбоцитарный фактор роста (platelet-derived growth factor) TIMPs - тканевые ингибиторы металлопротеиназ (tissue inhibitors of metalloproteinases)

TGF-ß - трансформирующий фактор роста ß (transforming growth factor ß) VEGF - фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стимуляция регенерации кожи с помощью клеточных пластов из мезенхимных стромальных клеток жировой ткани»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК), впервые выделенные А.Я. Фриденштейном в 1968 г. [1], к началу XXI века стали одним из наиболее активно исследуемых и перспективных источников клеток для терапевтического применения. Благоприятные эффекты клеточной терапии с использованием МСК были показаны в экспериментальных и клинических исследованиях (КИ) при широком спектре заболеваний. Исходно регенераторный потенциал МСК связывали с их мультипотентностью, т.е. способностью к дифференцировке в несколько типов клеток (адипоциты, хондроциты и остеобласты). В настоящее время большинство исследователей объясняют физиологические и терапевтические эффекты МСК их способностью паракринно, т.е. за счет секретируемых растворимых факторов, активировать или ускорять заживление поврежденной ткани. Продуцируемые МСК растворимые факторы, упоминаемые под общим названием «секретом», включают, в том числе, факторы роста (ФР) и цитокины, обладающие иммуномодулирующим, ангиогенным, нейропротекторным, а также антиапоптотическим действием [2, 3]. Несмотря на успешные доклинические исследования (ДКИ), во многих завершенных КИ клеточная терапия с использованием МСК показала эффективность значительно ниже ожиданий [4]. Большинство из них опиралось на введение МСК в виде суспензии, получаемой путем ферментативной обработки с целью снятия их с культуральной посуды или носителя. Оказалось, что открепление МСК с последующим инъекционным введением через шприц или катетер приводило к гибели >50% введенных клеток. Выжившие МСК оказывались не способны интегрироваться в ткань и в течение 2-3 недель в зоне введения практически не наблюдалось трансплантированных клеток [5, 6].

Альтернативой суспензионному введению стало использование тканеинженерных конструкций, которые, как правило, содержат

биосовместимую полимерную матрицу или заселяемый клетками носитель.

6

Конструкции такого рода могут быть трансплантированы на участки пораженной ткани или использованы для замещения части органа, обеспечивая длительное удержание жизнеспособных клеток и способствуя их интеграции in situ. Более близкими к нативной ткани по строению и составу являются так называемые клеточные пласты (КП) (англ. cell sheets) [7], которые представляют собой тканеинженерные конструкции из одного или нескольких типов клеток, объединенных наработанным ими внеклеточным матриксом (ВКМ). В отличие от конструкций на основе скаффолдов из биополимерных или синтетических компонентов, КП содержат ВКМ, депонируемый клетками, в том числе МСК, при долгом (7-14 суток) культивировании. В составе пластов из МСК могут удерживаться компоненты их секретома, в частности, заякоренные ФР и цитокины, а также внеклеточные везикулы, благодаря которым их терапевтический эффект усиливается не только за счет роста выживаемости трансплантированных клеток. Важно отметить, что в составе КП клетки формируют межклеточные контакты и получают широкий репертуар регуляторных сигналов, имитирующих окружение, необходимое для поддержания тонко настроенных физиологических функций МСК, в особенности, их паракринной активности, играющей ключевую роль при терапевтическом использовании.

На сегодняшний день эффективность КП продемонстрирована во многих экспериментальных и доклинических исследованиях. Наиболее часто используемыми (в том числе в виде зарегистрированных клеточных продуктов) являются КП из эпителиальных клеток для лечения поражений роговицы, пищевода и пародонта [8]. Применение КП на основе МСК, в свою очередь, только находит свою нишу в области восстановления поврежденных тканей, в основном, для реконструкции костных и хрящевых дефектов [9]. Нашим коллективом ранее было показано, что трансплантация КП из МСК на ишемизированные скелетные мышцы приводит к восстановлению их васкуляризации [10, 11].

В связи с этим, восстановление с помощью пластов из МСК поврежденных покровных тканей, например, глубоких ран кожи или хронических дефектов (пролежней и язв), представляется актуальной задачей биомедицины. Использование КП из МСК может повысить эффективность существующих протоколов лечения перечисленных состояний, относящихся к неудовлетворенным медицинским потребностям. Несмотря на очевидную применимость при упомянутых выше заболеваниях, в настоящий момент данные по использованию КП из МСК для лечения кожных дефектов ограничены небольшим количеством исследований [12, 13]. Единичные работы посвящены установлению механизмов, опосредующих эффекты КП из МСК, а также характеристике функционального статуса самих клеток в составе конструкций. Полученные в данной работе результаты расширяют представление об эффективности использования КП из МСК для восстановления повреждений кожи, а также вносят вклад в расшифровку механизма действия тканеинженерных конструкций на основе МСК взрослого организма.

Цель исследования. Оценить эффективность и изучить механизм, лежащий в основе регенераторного действия тканеинженерных конструкций в виде клеточных пластов из мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК ЖТ) при их использовании для стимуляции заживления дефектов кожи различной этиологии.

Задачи исследования.

1. Отработать способ получения клеточных пластов (КП) из МСК жировой ткани (МСК ЖТ) и охарактеризовать структуру полученных тканеинженерных конструкций.

2. Оценить эффективность трансплантации КП из МСК ЖТ для стимуляции ранозаживления на модели глубокого шинированного дефекта кожи у крысы.

3. Сравнить терапевтическую эффективность трансплантации МСК ЖТ в виде суспензии и в составе КП для стимуляции заживления пролежневых дефектов кожи у мыши.

4. Провести гистологическую оценку роста и ремоделирования грануляционной ткани, а также ее васкуляризации после трансплантации МСК ЖТ в виде КП или суспензии.

5. Проанализировать секреторный и транскриптомный профили МСК ЖТ в составе КП и определить возможные механизмы, лежащие в основе терапевтической эффективности данного класса тканеинженерных конструкций.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования данной диссертационной работы являются тканеинженерные конструкции из МСК жировой ткани (клеточные пласты) и их влияние на процессы заживления повреждений кожи различной этиологии. Предметом исследования в диссертации является экспериментальная оценка эффективности КП из МСК при дефектах кожи и мягких тканей и выяснение механизмов, за счет которых реализуется регенеративное действие КП из МСК при их трансплантации в очаг повреждения.

Научная новизна. Впервые выявлена способность КП из МСК ЖТ полностью восстанавливать пролежневые дефекты кожи с минимальным фиброзом или его отсутствием. Впервые предложена гипотеза о том, что МСК ЖТ в составе КП реализуют эффекты за счет действия паракринных факторов, способствующих стабилизации сосудистого русла и созреванию грануляционной ткани. Результаты работы открывают новые возможности для использования КП из МСК ЖТ при разработке эффективных методов стимуляции заживления при повреждении кожи различного генеза.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты расширяют понимание механизмов регенераторных эффектов МСК ЖТ в составе КП. Исследование дает комплексную оценку

эффективности КП из МСК ЖТ при восстановлении повреждений кожи.

9

Важным аспектом настоящего исследования является выяснение секреторной активности МСК в составе пласта и ее вклада в модуляцию хода ранозаживления по сравнению с суспензией клеток. Данный вопрос ранее не исследовался применительно к использованию КП из МСК для лечения глубоких травм кожи или длительно заживающих дефектов (пролежней). В работе проведено прямое сравнение эффективности тканеинженерных конструкций в виде пластов из МСК с их введением в виде суспензии, которое широко используется в клинике по сходным показаниям. Полученные данные могут способствовать созданию новых терапевтических подходов, а разработанные модели могут быть использованы на этапе ДКИ клеточных и тканеинженерных продуктов.

Методология и методы исследования. Методология диссертационного исследования основана на анализе данных литературы, постановке цели и задач с дальнейшей экспериментальной оценкой выдвинутого предположения в сравнительном эксперименте на двух животных моделях, релевантно воспроизводящих патологические состояния у человека. В работе использованы цитологические (выделение и культивирование МСК, сборка тканеинженерных конструкций, клеточные модели оценки биологической активности секретома МСК); биохимические (иммуноферментный анализ); гистологические (окрашивание гематоксилином и эозином, иммуногистохимический анализ с флуоресцентной меткой); молекулярно-биологические (РНК-секвенирование, биоинформатический анализ); физиологические (две модели повреждений кожи на двух видах животных) и статистические методы научного исследования.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Трансплантация МСК жировой ткани в виде клеточных пластов превосходит суспензионное введение по динамике закрытия глубоких ран и пролежней кожи.

2. Заживление шинированной раны кожи под влиянием клеточных пластов из МСК жировой ткани характеризуется быстрым закрытием дефекта, а также активным созреванием грануляционной ткани и формированием рубца.

3. Трансплантация клеточных пластов из МСК жировой ткани с целью заживления пролежня приводит к регенерации кожи и ее придатков без рубца, которой предшествует образование грануляционной ткани с низкой плотностью капилляров и формированием стабильных сосудов с просветом и выраженной муральной компонентой.

4. Регенераторные эффекты клеточных пластов из МСК жировой ткани, вероятно, связаны с их паракринной активностью и составом секретома, который значительно обогащен белковыми факторами, участвующими в регуляции ангиогенеза и стабилизации образованных сосудов.

Степень достоверности данных. Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ GraphPad Prism (GraphPad, США) и RStudio (США). Результаты исследования доложены на российских и зарубежных конференциях и опубликованы в рецензируемых журналах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, среди которых 4 статьи в журналах Scopus и Web of Science, в т.ч. 2 статьи в журналах Q1.

Подготовка к публикации полученных результатов проводилась совместно с соавторами, причем вклад соискателя был определяющим. Вклад автора в научных трудах:

1. Aleksandrushkina N.A., Danilova N.V., Grigorieva O.A., Mal'kov P.G., Popov V.S., Efimenko A.Yu, Makarevich P.I. Cell sheets of mesenchymal stromal cells effectively stimulate healing of deep soft tissue defects // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. — 2019. — Vol. 167, no. 1. — P. 159-163; IF=0.622, квартиль Q3 - составляет 70%

2. Nimiritsky P.P., Eremichev R. Yu., Aleksandrushkina N.A., Efimenko A.Yu, Tkachuk V.A., Makarevich P.I. Unveiling mesenchymal stromal cells' organizing function in regeneration // International Journal of Molecular Sciences. — 2019. — Vol. 20, no. 4. — P. 823; IF=4.556, квартиль Q1 - 25%

3. Alexandrushkina N.A., Nimiritsky P.P., Eremichev R.Yu., Popov V.S., Arbatskiy M., Danilova N.V., Mal'kov P.G., Akopyan Zh. A., Tkachuk V.A., Makarevich P.I. Cell sheets from adipose tissue msc induce healing of pressure ulcer and prevent fibrosis via trigger effects on granulation tissue growth and vascularization // International Journal of Molecular Sciences. — 2020. — Vol. 21, no. 15. — P. 5567; IF=4.556, квартиль Q1 -70%

4. Александрушкина Н.А., Тарасова Е.В., Макаревич П.И., Габбасова Л.А., Акопян Ж.А., Камалов А.А., Ткачук В.А. Вопросы нормативно-правового регулирования реализации биомедицинских клеточных продуктов в международной практике // Гены и клетки. — 2017. — Т. 12, № 4. — С. 97108; IF=0.914, квартиль Q4 - 50%

Апробация диссертации. Результаты работы были представлены на III и IV Национальных конгрессах по регенеративной медицине в Москве (15-18 ноября 2017 г.; 20-23 ноября 2019 г.); Всероссийской конференции с международным участием "Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий", Санкт-Петербург (8-11 октября 2019 г.); VII Молодёжной школе-конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН, Санкт-Петербург (12-15 октября 2020 г.); 25-м и 27-м Конгрессах Европейского общества генной и клеточной терапии ESGCT (17-20 октября 2017 г., Берлин, Германия; 22-25 октября 2019 г., Барселона, Испания); 21 -м ежегодном Конгрессе Американского общества генной и клеточной терапии ASGCT, США (16-19 мая 2018 г.). Апробация работы проведена на заседании Кафедры биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова, состоявшемся 19 ноября 2021 г. по адресу Ломоносовский проспект 27 к.10, протокол № 19/11.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ключевая роль в постановке целей и задач диссертационного исследования. Вся работа по выделению и наращиванию клеточных культур, а также эксперименты in vitro были выполнены автором. Работы по планированию и проведению экспериментов in vivo также были выполнены лично автором работы. Стоит отметить, что отработка и валидация использованной модели пролежневого дефекта была проведена в данной лаборатории впервые. Необходимо отметить весомый вклад автора в части проведения гистологических и биохимических работ, а также при подготовке публикаций по теме исследования.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, содержит 21 рисунок. Список литературы включает 181 источник, из них 2 отечественных и 179 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Принципы восстановления поврежденной ткани.

Многие виды животных способны восполнять участки тканей, утраченные в результате повреждения. Степень восстановления у разных животных варьируется - некоторые виды способны к полной регенерации, т.е. возмещению всех недостающих типов клеток и восстановлению структуры и функции органов, тогда как другие виды способны к регенерации лишь определенных частей тела [14]. У млекопитающих, в том числе у человека, наиболее распространенной естественной реакцией на значительное повреждение является восстановление ткани с фиброзированием и формированием рубца [15]. Фиброзирование приводит к появлению нефункциональных участков, блокирующих образование или восстановление функциональных элементов ткани, ограничивающих подвижность окружающих тканей и препятствующих нормальной реализации функций органом. Таким образом, поиск возможностей для предотвращения фиброза и стимуляции регенеративных процессов в тканях представляет собой актуальную задачу современной медицины.

Рисунок 1. Динамика процессов восстановления поврежденной ткани (на примере кожи); адаптировано с сайта Biodermis.com.

Чтобы управлять регенеративными процессами, важно понимать основные принципы восстановления поврежденной ткани, т.е. ход и регуляцию вовлеченных процессов. Традиционно ранозаживление делят на фазы 1) гемостаза и воспаления; 2) пролиферации и 3) ремоделирования (Рис.1).

Принимая во внимание акцент на процессы заживления, эти же этапы можно представить следующим образом [16]:

1. Закрытие раны

2. Пролиферация и миграция клеток

3. Морфогенез/фиброгенез

Несмотря на морфологические и молекулярные различия между таксономическими единицами, перечисленные этапы присутствуют почти у всех многоклеточных животных, что говорит об универсальности и консервативности их механизмов. У животных, обладающих способностью к регенерации, на последнем этапе происходит восстановление тканей и органов с исходной структурой и функцией, идущее по принципам, во многом схожим с морфогенезом, т.е. с возникновением и развитием тканей в ходе онтогенеза данного организма.

В литературе примером, хорошо иллюстрирующим все перечисленные

этапы, является процесс ранозаживления кожи. Для прочих органов и тканей

ход восстановления может быть описан во многом аналогичным образом вне

зависимости от причины и характера повреждения. Активация каскада

реакций, ведущего к заживлению, происходит в первые минуты после

повреждения. Нарушение целостности кровеносных сосудов приводит к

быстрой гемостатической реакции с образованием фибринового сгустка и

высвобождением из активированных тромбоцитов целого спектра

паракринных сигналов. Фибронектин плазмы, попадающий в состав тромба,

образует временный фибрин-фибронектиновый матрикс, который становится

«каркасом» для инфильтрирующих клеток, в первую очередь, нейтрофилов и

макрофагов, которые попадают в рану в ответ на активацию системы

15

комплемента, дегрануляцию тромбоцитов и продукты деградации микроорганизмов [17]. Клетки иммунной системы удаляют погибшие клетки и попавшие в рану патогенные микроорганизмы, а также выделяют широкий спектр сигнальных молекул, стимулирующих пролиферацию и миграцию клеток из близлежащей ткани [18]. Закрытие раны предотвращает потерю жидкости и снижает риск инфицирования. Кроме того, образуемые «временные» структуры обеспечивают необходимые сигналы для окружающих тканей и могут играть решающую роль в дальнейшем процессе заживления.

Здесь необходимо отметить, что в ходе неосложненного заживления его этапы сменяют друг друга в надлежащей последовательности в строго определенное время, а любые нарушения скоординированного процесса могут привести к ухудшению заживления. Факторами, влияющими на этот процесс, могут быть характеристики как раны (размер, глубина, инфицированность), так и организма (возраст, наличие сопутствующих заболеваний). В большинстве хронических ран наблюдается патологическое воспаление, при котором непрерывная воспалительная фаза ведет к аномальной продукции воспалительных цитокинов вследствие гиперактивации иммунной системы. Резидентные клетки в хронических ранах демонстрируют заметные изменения фенотипа, сопровождающиеся снижением пролиферативного потенциала и чувствительности к ФР и цитокинам [19]. Увеличение количества воспалительных клеток в ране приводит к деградации ВКМ из-за увеличения секреции матриксных металлопротеиназ и снижения продукции ключевых факторов заживления, таких как трансформирующий фактор роста TGF-P (transforming growth factor в), тромбоцитарный фактор роста PDGF-BB (platelet-derived growth factor BB) и фактор роста гепатоцитов (HGF, hepatocyte growth factor).

Таким образом, формирование фибринового сгустка на первом этапе

ранозаживления с одной стороны способствует закрытию раны и изоляции

зоны повреждения, а с другой - становится матрицей для клеток иммунной

16

системы. Иммунные клетки, в свою очередь, подготавливают пространство для роста новой ткани за счет удаления погибших клеток и высвобождения митогенных сигналов.

В ответ на возникшие стимулы близлежащие к очагу повреждения ткани усиливают клеточную пролиферацию и миграцию. Регулируемая пролиферация клеток лежит в основе образования новых структур в большинстве биологическим систем. Цитокины и ФР, протеолитические ферменты и белки ВКМ служат регуляторными сигналами для клеток и тканевых структур, в том числе кровеносных сосудов и нервов. Сравнительные данные показывают, что даже у неродственных видов животных в ходе заживления задействованы сходные пути запуска пролиферации: передача сигналов от апоптотических клеток, ФР, каскада mTOR, Wnt и BMP. При этом митотическая активность строго регулируется в пространстве и времени и критична для полноценной регенерации [20].

Пролиферация и миграция различных типов клеток приводит к постепенному замещению фибринового каркаса специализированной структурой, которой дали название грануляционная ткань (ГТ) (от лат. granum — зерно) из-за входящих в ее состав многочисленных капилляров, которые придают новой строме зернистый вид (Рис.2). Данный тип «временной» ткани богат не только кровеносными сосудами, встроенными в ВКМ, но и активированными стромальными и иммунными клетками.

Под стромальными клетками с точки зрения восстановления тканей, как правило, обычно подразумевают фибробласты, принимающие наиболее активное участие в формировании стромы органа и ответственные за синтез, отложение и ремоделирование ВКМ на протяжении всей дальнейшей жизни. При этом необходимо уточнить, что к стромальным клеткам относят также мезенхимные стромальные клетки (МСК), перициты и гладкомышечные клетки (ГМК). Морфофункциональные характеристики клеток и их вклад в

ход раневого процесса будут описаны в следующем разделе.

17

|Рисунок 2. Типичная гистологическая картина в зоне пролежневого дефекта у мыши на 3-и сутки после повреждения. 1 - зона поврежденной ткани вплоть до (а) мышечного слоя с инфильтрацией (b) клетками, происходящими из моноцитов, и (с) отеком подлежащей ткани; 2 - зона образования грануляционной ткани и линия, обозначающая измеренную толщину, кровеносные сосуды указаны стрелками; 3 - поверхность дефекта с (d) мигрирующим слоем эпителия и (е) струпом. Окрашивание гематоксилином и эозином, масштабный отрезок соответствует 50 мкм.

Все три упомянутых клеточных типа мигрируют в раневое пространство примерно одновременно и выполняют определенные функции [21]. Иммунные клетки, на данном этапе представленные в основном макрофагами, осуществляют расщепление фибринового сгустка и фагоцитоз, а также являются постоянным источником ФР, необходимых для координации процессов ангиогенеза и фиброплазии. Под последней понимают рост количества стромальных клеток и замещение временной матрицы новой соединительной тканью [22]. Наиболее важными регуляторными молекулами в этих процессах можно назвать фактор роста эндотелия сосудов А (VEGFA, vascular endothelial growth factor), фактор роста фибробластов 2 (FGF2, fibroblast growth factor) и ране упомянутый TGF-ß.

Для миграции клеток в раневое пространство через толщу поперечно-сшитого фибрина необходима высокая активность протеолитических систем. Кроме плазмина сыворотки крови в очаге повреждения этому способствуют продуцируемые стромальными клетками протеазы, в том числе активаторы плазминогена и коллагеназы [23]. Функциональные механизмы, позволяющие стромальным клеткам покидать коллагеновый матрикс нормальной соединительной ткани и проникать во временный матрикс фибринового сгустка, однозначно не определены, однако исследования показывают, что важную роль в этом процессе играет фибронектин, выполняющий роль субстрата для миграции клеток [24].

По мере увеличения объема ГТ стромальные клетки активно синтезируют коллагены и протеогликаны [25], создавая каркас будущей соединительной ткани. Таким образом, для индукции роста ГТ должна произойти активация стромальных клеток, т.е. стимуляция их пролиферации, миграции и продукции ими паракринных сигналов и белков ВКМ. При этом активация стромы является лимитирующим этапом образования ГТ, что было убедительно показано McClain S.A. в 1996г [26]. Однако фиброплазия не обязательно коррелирует исключительно с синтезом и депонированием коллагенов, т.к. для их процессинга и сшивания необходимо достаточное количество кислорода [23].

В этой связи для образующейся ткани необходимо формирование новых кровеносных сосудов - ангиогенез, представляющий собой комплексный процесс, зависящий от скоординированной реализации физиологических функций различных типов клеток. Во взрослом организме основным способом образования новых сосудов является их ответвление от предсуществующих [27]. Данный процесс начинается с пролиферации и миграции эндотелиальных клеток (ЭК), которые затем сменяются этапом стабилизации образованных сосудов.

Наиболее важным стимулом для ангиогенеза является гипоксия [28]. Первоначально стромальные клетки насыщаются кислородом за счет диффузии, однако когда рост ткани выходит за пределы диффузии (более 100 мкм), то возникающий дефицит кислорода запускает индуцируемые гипоксией факторы транскрипции HIFs (hypoxia-inducible factors) [29]. HIFs активируют многие гены, но наиболее важной является индукция экспрессии VEGF - в течение нескольких минут после стимуляции гипоксией его продукция возрастает до 30 раз [30]. VEGF дозозависимым образом стимулирует как физиологический, так и патологический ангиогенез. Потеря одного из аллелей кодирующего его гена вызывает тяжелые дефекты эмбриональных сосудов [31]. Помимо членов семейства HIF и VEGF существует множество других молекул, регулирующих рост эндотелия, такие как Ang-1 и 2, FGF2, HGF, различные хемокины, гормоны и нейропептиды. Также следует отметить критическое значение белков ВКМ в образовании и поддержании кровеносных сосудов. В покоящихся сосудах базальная мембрана, состоящая из коллагена IV, ламинина и других компонентов окружает эндотелий и перициты, которые встроены в ту же базальную мембрану. Интерстициальный матрикс из коллагена I и эластина дополнительно обеспечивает прочность стенки сосуда. Действие ангиогенных факторов приводит к ослаблению плотных межклеточных контактов между клетками эндотелия и высвобождению ими протеолитических ферментов (активаторов плазминогена и проколлагеназы). Все это приводит к фрагментации базальной мембраны, что позволяет ЭК мигрировать и образовывать новые кровеносные сосуды в месте повреждения. Когда сосудистые клетки мигрируют с образованием новых ростков, временная фибронектин-фибриновая матрица обеспечивает опорный каркас, направляя клетки эндотелия, которые при пролиферации временно откладывают повышенное количество фибронектина в стенке сосуда [32]. При этом протеолитическое ремоделирование ВКМ должно происходить

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Александрушкина Наталья Андреевна, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Friedenstein, A. J.; Petrakova, K. V.; Kurolesova, A. I. et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.

// Transplantation 1968, 6, (2), 230-47.

2. Caplan, A. I.; Correa, D. The MSC: an injury drugstore. // Cell Stem Cell 2011, 9, (1), 11-5.

3. Kalinina, N. I.; Sysoeva, V. Y.; Rubina, K. A. et al. Mesenchymal stem cells in tissue growth and repair. // Acta Naturae 2011, 3, (4), 30-7.

4. Pittenger, M. F.; Discher, D. E.; Peault, B. M. et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. // npj Regenerative Medicine 2019, 4, (1), 22.

5. Savukinas, U. B.; Enes, S. R.; Sjöland, A. A. et al. Concise Review: The Bystander Effect: Mesenchymal Stem Cell-Mediated Lung Repair. // Stem Cells 2016, 34, (6), 1437-44.

6. Hofmann, M.; Wollert, K. C.; Meyer, G. P. et al. Monitoring of bone marrow cell homing into the infarcted human myocardium. // Circulation 2005, 111, (17), 2198-202.

7. Yamato, M.; Okano, T. Cell sheet engineering. // Materials Today 2004, 7, (5), 42-47.

8. Li, M.; Ma, J.; Gao, Y. et al. Cell sheet technology: a promising strategy in regenerative medicine. // Cytotherapy 2019, 21, (1), 3-16.

9. Kondo, M.; Kameishi, S.; Grainger, D. W. et al. Novel therapies using cell sheets engineered from allogeneic mesenchymal stem/stromal cells. // Emerg Top Life Sci 2020, 4, (6), 677-689.

10. Макаревич, П. И.; Болдырева, М. А.; Дергилев, К. В. et al.

Трансплантация клеточных пластов из мезенхимальных стромальных клеток

жировой ткани эффективно индуцирует ангиогенез в ишемизированных

скелетных мышцах. // Гены и клетки 2015, 10, (3), 68-77.

84

11. Makarevic, P. I.; Dergilev, K. V.; Tsokolaeva, Z. I. et al. Delivery of Genetically Engineered Adipose-Derived Cell Sheets for Treatment of Ischemic Disorders - Development of Application in Animal Models. // Molecular Therapy 2015, 23, (S1), S262.

12. Kato, Y.; Iwata, T.; Morikawa, S. et al. Allogeneic Transplantation of an Adipose-Derived Stem Cell Sheet Combined With Artificial Skin Accelerates Wound Healing in a Rat Wound Model of Type 2 Diabetes and Obesity. // Diabetes 2015, 64, (8), 2723-34.

13. Kato, Y.; Iwata, T.; Washio, K. et al. Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model. // J

Vis Exp 2017, (126).

14. Bely, A. E.; Nyberg, K. G. Evolution of animal regeneration: re-emergence of a field. // Trends Ecol Evol 2010, 25, (3), 161-70.

15. Rockey, D. C.; Bell, P. D.; Hill, J. A. Fibrosis--a common pathway to organ injury and failure. // The New England journal of medicine 2015, 372, (12), 113849.

16. Carlson, B. M. Principles ofregenerative biology. // Burlington: Elsevier. 2007.

17. Grose, R.; Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. // Mol Biotechnol 2004, 28, (2), 147-66.

18. Lacy, P.; Stow, J. L. Cytokine release from innate immune cells: association with diverse membrane trafficking pathways. // Blood 2011, 118, (1), 9-18.

19. Falanga, V. Wound healing and its impairment in the diabetic foot. // Lancet 2005, 366, (9498), 1736-43.

20. Ricci, L.; Srivastava, M. Wound-induced cell proliferation during animal regeneration. // Wiley Interdiscip. Rev.-Dev. Biol. 2018, 7, (5), 17.

21. Hunt, T. K. The physiology of wound healing. // Annals of emergency medicine 1988, 17, (12), 1265-1273.

22. Hesketh, M.; Sahin, K. B.; West, Z. E. et al. Macrophage Phenotypes Regulate Scar Formation and Chronic Wound Healing. // International journal of molecular sciences 2017, 18, (7).

23. Clark, R. A. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. //

SpringerLink 1988.

24. Lenselink, E. A. Role of fibronectin in normal wound healing. // Int Wound J 2015, 12, (3), 313-6.

25. Clark, R. A.; Nielsen, L. D.; Welch, M. P. et al. Collagen matrices attenuate the collagen-synthetic response of cultured fibroblasts to TGF-beta. // J Cell Sci 1995, 108 ( Pt 3), 1251-61.

26. McClain, S. A.; Simon, M.; Jones, E. et al. Mesenchymal cell activation is the rate-limiting step of granulation tissue induction. // The American journal of pathology 1996, 149, (4), 1257-70.

27. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. // Nat Med 2003, 9, (6), 65360.

28. Krock, B. L.; Skuli, N.; Simon, M. C. Hypoxia-induced angiogenesis: good and evil. // Genes Cancer 2011, 2, (12), 1117-1133.

29. Pugh, C. W.; Ratcliffe, P. J. Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of the HIF system. // Nat Med 2003, 9, (6), 677-84.

30. Ferrara, N.; Gerber, H.-P.; LeCouter, J. The biology of VEGF and its receptors. // Nat. Med. 2003, 9, (6), 669-676.

31. Ferrara, N.; Carver-Moore, K.; Chen, H. et al. Heterozygous embryonic lethality induced by targeted inactivation of the VEGF gene. // Nature 1996, 380, (6573), 439-442.

32. Clark, R. A.; Quinn, J. H.; Winn, H. J. et al. Fibronectin is produced by blood vessels in response to injury. // J Exp Med 1982, 156, (2), 646-51.

33. Luttun, A.; Dewerchin, M.; Collen, D. et al. The role of proteinases in angiogenesis, heart development, restenosis, atherosclerosis, myocardial ischemia, and stroke: insights from genetic studies. // Curr Atheroscler Rep 2000, 2, (5), 40716.

34. Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. // Nat. Med. 2003, 9, (6), 685-693.

35. Hirschi, K. K.; Rohovsky, S. A.; D'Amore, P. A. PDGF, TGF-beta, and heterotypic cell-cell interactions mediate endothelial cell-induced recruitment of 10T1/2 cells and their differentiation to a smooth muscle fate. // The Journal of cell biology 1998, 141, (3), 805-14.

36. Betsholtz, C.; Karlsson, L.; Lindahl, P. Developmental roles of platelet-derived growth factors. // Bioessays 2001, 23, (6), 494-507.

37. Watt, S. M.; Pleat, J. M. Stem cells, niches and scaffolds: Applications to burns and wound care. // Adv Drug Deliv Rev 2018, 123, 82-106.

38. Rittie, L. Cellular mechanisms of skin repair in humans and other mammals.

// J Cell Commun Signal 2016, 10, (2), 103-20.

39. Raja; Sivamani, K.; Garcia, M. S. et al. Wound re-epithelialization: modulating keratinocyte migration in wound healing. // Frontiers in bioscience : a journal and virtual library 2007, 12, 2849-68.

40. Jacinto, A.; Martinez-Arias, A.; Martin, P. Mechanisms of epithelial fusion and repair. // Nat. Cell Biol. 2001, 3, (5), E117-E123.

41. Breitkreutz, D.; Koxholt, I.; Thiemann, K. et al. Skin basement membrane: the foundation of epidermal integrity--BM functions and diverse roles of bridging molecules nidogen and perlecan. // BiomedRes Int 2013, 2013, 179784.

42. Xue, M.; Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. // Advances in wound care 2015, 4, (3), 119-136.

43. Gabbiani, G.; Ryan, G. B.; Majne, G. Presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible role in wound contraction. // Experientia 1971, 27, (5), 549-50.

44. Yang, X.; Chen, B.; Liu, T. et al. Reversal of myofibroblast differentiation: a review. // European journal ofpharmacology 2014, 734, 83-90.

45. Hinz, B.; Gabbiani, G. Mechanisms of force generation and transmission by miofibroblast. // Current opinion in biotechnology 2003, 14, 538-46.

46. Nimiritsky, P. P.; Eremichev, R. Y.; Alexandrushkina, N. A. et al. Unveiling Mesenchymal Stromal Cells' Organizing Function in Regeneration. // International journal of molecular sciences 2019, 20, (4).

47. Stoica, A. E.; Grumezescu, A. M.; Hermenean, A. O. et al. Scar-Free Healing: Current Concepts and Future Perspectives. // Nanomaterials (Basel) 2020, 10, (11).

48. Iismaa, S. E.; Kaidonis, X.; Nicks, A. M. et al. Comparative regenerative mechanisms across different mammalian tissues. // NPJRegen Med 2018, 3, 6.

49. Schweisguth, F.; Corson, F. Self-Organization in Pattern Formation. // Dev Cell 2019, 49, (5), 659-677.

50. Morales, J. S.; Raspopovic, J.; Marcon, L. From embryos to embryoids: How external signals and self-organization drive embryonic development. // Stem Cell Reports 2021, 16, (5), 1039-1050.

51. Pispa, J.; Thesleff, I. Mechanisms of ectodermal organogenesis. // Developmental biology 2003, 262, (2), 195-205.

52. Ghosh, S.; Laha, M.; Mondal, S. et al. In vitro model of mesenchymal condensation during chondrogenic development. // Biomaterials 2009, 30, (33), 6530-40.

53. Hilfer, S. R.; Rayner, R. M.; Brown, J. W. Mesenchymal control of branching pattern in the fetal mouse lung. // Tissue Cell 1985, 17, (4), 523-38.

54. Takebe, T.; Enomura, M.; Yoshizawa, E. et al. Vascularized and Complex Organ Buds from Diverse Tissues via Mesenchymal Cell-Driven Condensation. // Cell Stem Cell 2015, 16, (5), 556-65.

55. Eremichev, R.; Kulebyakina, M.; Alexandrushkina, N. et al. Scar-Free Healing of Endometrium: Tissue-Specific Program of Stromal Cells and Its Induction by Soluble Factors Produced After Damage. // Front Cell Dev Biol 2021, 9, 616893.

56. Owen, M.; Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. // Ciba Found Symp 1988, 136, 42-60.

57. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. // J Orthop Res 1991, 9, (5), 641-50.

58. Dominici, M.; Le Blanc, K.; Mueller, I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy 2006, 8, (4), 315-7.

59. Berebichez-Fridman, R.; Montero-Olvera, P. R. Sources and Clinical Applications of Mesenchymal Stem Cells: State-of-the-art review. // Sultan Qaboos Univ Med J 2018, 18, (3), e264-e277.

60. Kalinina, N.; Kharlampieva, D.; Loguinova, M. et al. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes. // Stem cell research & therapy 2015, 6, 221.

61. Rubina, K.; Kalinina, N.; Efimenko, A. et al. Adipose stromal cells stimulate angiogenesis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation. // Tissue engineering. Part A 2009, 15, (8), 2039-50.

62. Lopatina, T.; Kalinina, N.; Karagyaur, M. et al. Adipose-derived stem cells stimulate regeneration of peripheral nerves: BDNF secreted by these cells promotes nerve healing and axon growth de novo. // PloS one 2011, 6, (3), e17899.

89

63. Sioud, M. New insights into mesenchymal stromal cell-mediated T-cell suppression through galectins. // Scand J Immunol 2011, 73, (2), 79-84.

64. Makarevich, P. I.; Efimenko, A. Y.; Tkachuk, V. A. Biochemical Regulation of Regenerative Processes by Growth Factors and Cytokines: Basic Mechanisms and Relevance for Regenerative Medicine. // Biochemistry (Mosc) 2020, 85, (1), 11-26.

65. Novoseletskaya, E.; Grigorieva, O.; Nimiritsky, P. et al. Mesenchymal Stromal Cell-Produced Components of Extracellular Matrix Potentiate Multipotent Stem Cell Response to Differentiation Stimuli. // Frontiers in Cell and Developmental Biology 2020, 8, (983).

66. Usunier, B.; Benderitter, M.; Tamarat, R. et al. Management of fibrosis: the mesenchymal stromal cells breakthrough. // Stem cells international 2014, 2014, 340257.

67. Mohammadi Gorji, S.; Karimpor Malekshah, A. A.; Hashemi-Soteh, M. B. et al. Effect of mesenchymal stem cells on Doxorubicin-induced fibrosis. // Cell J 2012, 14, (2), 142-51.

68. Mias, C.; Lairez, O.; Trouche, E. et al. Mesenchymal stem cells promote matrix metalloproteinase secretion by cardiac fibroblasts and reduce cardiac ventricular fibrosis after myocardial infarction. // Stem Cells 2009, 27, (11), 273443.

69. Hauschka, S. D.; Konigsberg, I. R. The influence of collagen on the development of muscle clones. // Proc Natl Acad Sci US A 1966, 55, (1), 119-26.

70. Kopen, G. C.; Prockop, D. J.; Phinney, D. G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. // Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96, (19), 10711-6.

71. Makino, S.; Fukuda, K.; Miyoshi, S. et al. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. // J Clin Invest 1999, 103, (5), 697-705.

72. Snykers, S.; De Kock, J.; Rogiers, V. et al. In vitro differentiation of embryonic and adult stem cells into hepatocytes: state of the art. // Stem Cells 2009, 27, (3), 577-605.

73. Arthur, A.; Rychkov, G.; Shi, S. et al. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. // Stem Cells 2008, 26, (7), 1787-95.

74. Калинина, Н. И.; Сысоева, В. Ю.; К.А., Р. et al. Мезенхимальные стволовые клетки в процессах роста и репарации тканей // ACTA NATURAE 2011, 3, (4), 32-39.

75. Muzlifah, A. H.; Matthew, P. C.; Christopher, D. B. et al. Mesenchymal stem cells: the fibroblasts' new clothes? // Haematologica 2009, 94, (2), 258-263.

76. Hematti, P. Mesenchymal stromal cells and fibroblasts: a case of mistaken identity? // Cytotherapy 2012, 14, (5), 516-21.

77. Denu, R. A.; Nemcek, S.; Bloom, D. D. et al. Fibroblasts and Mesenchymal Stromal/Stem Cells Are Phenotypically Indistinguishable. // Acta Haematol 2016, 136, (2), 85-97.

78. Ugurlu, B.; Karaoz, E. Comparison of similar cells: Mesenchymal stromal cells and fibroblasts. // Acta Histochem 2020, 122, (8), 151634-151634.

79. Covas, D. T.; Panepucci, R. A.; Fontes, A. M. et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts. // Exp

Hematol 2008, 36, (5), 642-54.

80. Tormin, A.; Li, O.; Brune, J. C. et al. CD146 expression on primary nonhematopoietic bone marrow stem cells is correlated with in situ localization. // Blood 2011, 117, (19), 5067-77.

81. Soundararajan, M.; Kannan, S. Fibroblasts and mesenchymal stem cells: Two sides of the same coin? // Journal of cellular physiology 2018, 233, (12), 9099-9109.

82. Gronthos, S.; Zannettino, A. C.; Hay, S. J. et al. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. // J Cell Sci 2003, 116, (Pt 9), 1827-35.

83. Shi, S.; Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. // J Bone Miner Res 2003, 18, (4), 696-704.

84. Covas, D. T.; Siufi, J. L.; Silva, A. R. et al. Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells. // Brazilian journal of medical and biological research = Revista brasileira depesquisas medicas e biologicas 2003, 36, (9), 117983.

85. Covas, D. T.; Piccinato, C. E.; Orellana, M. D. et al. Mesenchymal stem cells can be obtained from the human saphena vein. // Experimental cell research 2005, 309, (2), 340-4.

86. Tintut, Y.; Alfonso, Z.; Saini, T. et al. Multilineage potential of cells from the artery wall. // Circulation 2003, 108, (20), 2505-10.

87. Crisan, M.; Yap, S.; Casteilla, L. et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. // Cell Stem Cell 2008, 3, (3), 301-13.

88. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? // Cell Stem Cell 2008, 3, (3), 229-30.

89. Sims, D. E. The pericyte--a review. // Tissue Cell 1986, 18, (2), 153-74.

90. Rouget, C. Memoire sur le develloppment, la structure et les propietes physiologiques des capillaries senguins et lymphatiques. // Arch. Physiol. Norm. Pathol. 1873, 5, 603-663.

91. Harrell, C. R.; Simovic Markovic, B.; Fellabaum, C. et al. Molecular mechanisms underlying therapeutic potential of pericytes. // J Biomed Sci 2018, 25, (1), 21.

92. Armulik, A.; Genove, G.; Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. // Dev Cell 2011, 21, (2), 193-215.

93. de Souza, L. E.; Malta, T. M.; Kashima Haddad, S. et al. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related? // Stem cells and development 2016, 25, (24), 1843-1852.

94. Lazarus, H. M.; Haynesworth, S. E.; Gerson, S. L. et al. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. // Bone marrow transplantation 1995, 16, (4), 557-64.

95. Horwitz, E. M.; Prockop, D. J.; Fitzpatrick, L. A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. // Nat Med 1999, 5, (3), 309-13.

96. Ullah, I.; Subbarao, R. B.; Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. // Biosci Rep 2015, 35, (2).

97. Levy, O.; Kuai, R.; Siren, E. M. J. et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. // Sci Adv 2020, 6, (30), eaba6884.

98. Squillaro, T.; Peluso, G.; Galderisi, U. Clinical Trials With Mesenchymal Stem Cells: An Update. // Cell transplantation 2016, 25, (5), 829-48.

99. Caplan, H.; Olson, S. D.; Kumar, A. et al. Mesenchymal Stromal Cell Therapeutic Delivery: Translational Challenges to Clinical Application. // Frontiers in immunology 2019, 10, 1645-1645.

100. De Becker, A.; Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy? // World journal of stem cells 2016, 8, (3), 73-87.

101. Gao, J.; Dennis, J. E.; Muzic, R. F. et al. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. // Cells, tissues, organs 2001, 169, (1), 12-20.

102. Schrepfer, S.; Deuse, T.; Reichenspurner, H. et al. Stem cell transplantation: the lung barrier. // Transplantation proceedings 2007, 39, (2), 573-6.

103. Janowski, M.; Lyczek, A.; Engels, C. et al. Cell size and velocity of injection are major determinants of the safety of intracarotid stem cell transplantation. // J

Cereb Blood Flow Metab 2013, 33, (6), 921-7.

104. Horwitz, E. M.; Gordon, P. L.; Koo, W. K. et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. // Proc Natl Acad Sci US A 2002, 99, (13), 8932-7.

105. Le Blanc, K.; Rasmusson, I.; Sundberg, B. et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. // Lancet 2004, 363, (9419), 1439-41.

106. Hamidian Jahromi, S.; Davies, J. E. Concise Review: Skeletal Muscle as a Delivery Route for Mesenchymal Stromal Cells. // Stem cells translational medicine 2019, 8, (5), 456-465.

107. Hanson, S. E.; Bentz, M. L.; Hematti, P. Mesenchymal stem cell therapy for nonhealing cutaneous wounds. // Plastic and reconstructive surgery 2010, 125, (2), 510-516.

108. Magne, B.; Lataillade, J. J.; Trouillas, M. Mesenchymal Stromal Cell Preconditioning: The Next Step Toward a Customized Treatment For Severe Burn. // Stem cells and development 2018, 27, (20), 1385-1405.

109. Liu, X. H.; Bai, C. G.; Xu, Z. Y. et al. Therapeutic potential of angiogenin modified mesenchymal stem cells: angiogenin improves mesenchymal stem cells survival under hypoxia and enhances vasculogenesis in myocardial infarction. //

Microvasc Res 2008, 76, (1), 23-30.

110. Aguado, B. A.; Mulyasasmita, W.; Su, J. et al. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. // Tissue engineering. Part A 2012, 18, (7-8), 806-15.

111. Karoubi, G.; Ormiston, M. L.; Stewart, D. J. et al. Single-cell hydrogel encapsulation for enhanced survival of human marrow stromal cells. // Biomaterials 2009, 30, (29), 5445-55.

112. Zhou, T.; Yuan, Z.; Weng, J. et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. // Journal of hematology & oncology 2021, 14, (1), 24-24.

113. Eleuteri, S.; Fierabracci, A. Insights into the Secretome of Mesenchymal Stem Cells and Its Potential Applications. // International journal of molecular sciences 2019, 20, (18), 4597.

114. Sagaradze, G.; Basalova, N.; Kirpatovsky, V. et al. A magic kick for regeneration: role of mesenchymal stromal cell secretome in spermatogonial stem cell niche recovery. // Stem cell research & therapy 2019, 10, (1), 342.

115. Bogatcheva, N. V.; Coleman, M. E. Conditioned Medium of Mesenchymal Stromal Cells: A New Class of Therapeutics. // Biochemistry (Mosc) 2019, 84, (11), 1375-1389.

116. Pawitan, J. A. Prospect of Stem Cell Conditioned Medium in Regenerative Medicine. // BioMedResearch International 2014, 2014, 965849.

117. Sagaradze, G.; Grigorieva, O.; Nimiritsky, P. et al. Conditioned Medium from Human Mesenchymal Stromal Cells: Towards the Clinical Translation. //

International journal of molecular sciences 2019, 20, (7).

118. Sousa, B. R.; Parreira, R. C.; Fonseca, E. A. et al. Human adult stem cells from diverse origins: an overview from multiparametric immunophenotyping to clinical applications. // Cytometry A 2014, 85, (1), 43-77.

119. Liu, X.; Rui, T.; Zhang, S. et al. Heterogeneity of MSC: Origin, Molecular Identities, and Functionality. // Stem cells international 2019, 2019, 92815209281520.

120. Tang, J.; Wang, X.; Tan, K. et al. Injury-induced fetal reprogramming imparts multipotency and reparative properties to pericardial adipose stem cells. // Stem cell research & therapy 2018, 9, (1), 218.

121. Miceli, V.; Bulati, M.; Iannolo, G. et al. Therapeutic Properties of Mesenchymal Stromal/Stem Cells: The Need of Cell Priming for Cell-Free Therapies in Regenerative Medicine. // International journal of molecular sciences 2021, 22, (2), 763.

122. Deng, H.; Sun, C.; Sun, Y. et al. Lipid, Protein, and MicroRNA Composition Within Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes. // Cell Reprogram 2018, 20, (3), 178-186.

123. Qiu, G.; Zheng, G.; Ge, M. et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles affect disease outcomes via transfer of microRNAs. // Stem cell research & therapy 2018, 9, (1), 320.

124. Dostert, G.; Mesure, B.; Menu, P. et al. How Do Mesenchymal Stem Cells Influence or Are Influenced by Microenvironment through Extracellular Vesicles Communication? // Frontiers in cell and developmental biology 2017, 5, 6-6.

125. Allan, D.; Tieu, A.; Lalu, M. et al. Mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles for regenerative therapy and immune modulation: Progress and challenges toward clinical application. // Stem cells translational medicine 2020, 9, (1), 39-46.

126. Kalluri, R.; LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. // Science 2020, 367, (6478).

127. Thery, C.; Witwer, K. W. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. // J Extracell Vesicles 2018, 7, (1), 1535750.

128. Shi, J.; Zhao, Y.-C.; Niu, Z.-F. et al. Mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles in the treatment of human diseases: Progress and prospect. //

World journal of stem cells 2021, 13, (1), 49-63.

129. Jeppesen, D. K.; Fenix, A. M.; Franklin, J. L. et al. Reassessment of Exosome Composition. // Cell 2019, 177, (2), 428-445.e18.

130. Gao, P.; Ding, Q.; Wu, Z. et al. Therapeutic potential of human mesenchymal stem cells producing IL-12 in a mouse xenograft model of renal cell carcinoma. //

Cancer Lett 2010, 290, (2), 157-66.

131. Relation, T.; Yi, T.; Guess, A. J. et al. Intratumoral Delivery of Interferony-Secreting Mesenchymal Stromal Cells Repolarizes Tumor-Associated Macrophages and Suppresses Neuroblastoma Proliferation In Vivo. // Stem Cells 2018, 36, (6), 915-924.

132. Hu, X.; Li, L.; Yu, X. et al. CRISPR/Cas9-mediated reversibly immortalized mouse bone marrow stromal stem cells (BMSCs) retain multipotent features of mesenchymal stem cells (MSCs). // Oncotarget 2017, 8, (67), 111847-111865.

133. Noronha, N. C.; Mizukami, A.; Caliari-Oliveira, C. et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. // Stem cell research & therapy 2019, 10, (1), 131.

134. Kim, D. S.; Jang, I. K.; Lee, M. W. et al. Enhanced Immunosuppressive Properties of Human Mesenchymal Stem Cells Primed by Interferon-y. //

EBioMedicine 2018, 28, 261-273.

135. Lee, J. H.; Yoon, Y. M.; Lee, S. H. Hypoxic Preconditioning Promotes the Bioactivities of Mesenchymal Stem Cells via the HIF-1a-GRP78-Akt Axis. //

International journal of molecular sciences 2017, 18, (6).

136. Rao, V. V.; Vu, M. K.; Ma, H. et al. Rescuing mesenchymal stem cell regenerative properties on hydrogel substrates post serial expansion. // Bioeng Transl Med 2019, 4, (1), 51-60.

137. Ho, S. S.; Murphy, K. C.; Binder, B. Y. et al. Increased Survival and Function of Mesenchymal Stem Cell Spheroids Entrapped in Instructive Alginate Hydrogels.

// Stem cells translational medicine 2016, 5, (6), 773-81.

138. Park, Y. B.; Ha, C. W.; Kim, J. A. et al. Single-stage cell-based cartilage repair in a rabbit model: cell tracking and in vivo chondrogenesis of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells and hyaluronic acid hydrogel composite. //

Osteoarthritis Cartilage 2017, 25, (4), 570-580.

139. Feng, C.; Luo, X.; He, N. et al. Efficacy and Persistence of Allogeneic Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Combined with Hyaluronic Acid in Osteoarthritis After Intra-articular Injection in a Sheep Model. // Tissue engineering. Part A 2018, 24, (3-4), 219-233.

140. Jang, C. H.; Ahn, S. H.; Yang, G.-H. et al. A MSCs-laden polycaprolactone/collagen scaffold for bone tissue regeneration. // RSC Advances 2016, 6, (8), 6259-6265.

141. Meinel, L.; Karageorgiou, V.; Fajardo, R. et al. Bone Tissue Engineering Using Human Mesenchymal Stem Cells: Effects of Scaffold Material and Medium Flow. // Annals of Biomedical Engineering 2004, 32, (1), 112-122.

142. Pelham, R. J.; Wang, Y.-l. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. // Proceedings of the National Academy of Sciences 1997, 94, (25), 13661-13665.

143. Engler, A. J.; Sen, S.; Sweeney, H. L. et al. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. // Cell 2006, 126, (4), 677-89.

144. Trappmann, B.; Gautrot, J. E.; Connelly, J. T. et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate. // Nature Materials 2012, 11, (7), 642-649.

145. Wong, S. W.; Lenzini, S.; Giovanni, R. et al. Matrix biophysical cues direct mesenchymal stromal cell functions in immunity. // Acta biomaterialia 2021, 133, 126-138.

146. Okano, T.; Yamada, N.; Okuhara, M. et al. Mechanism of cell detachment from temperature-modulated, hydrophilic-hydrophobic polymer surfaces. // Biomaterials 1995, 16, (4), 297-303.

147. Kikuchi, A.; Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs.

// Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society 2005, 101, (1-3), 69-84.

148. Kim, K.; Bou-Ghannam, S.; Kameishi, S. et al. Allogeneic mesenchymal stem cell sheet therapy: A new frontier in drug delivery systems. // Journal of Controlled Release 2021, 330, 696-704.

149. Yamato, M.; Utsumi, M.; Kushida, A. et al. Thermo-responsive culture dishes allow the intact harvest of multilayered keratinocyte sheets without dispase by reducing temperature. // Tissue engineering 2001, 7, (4), 473-80.

150. Nishida, K.; Yamato, M.; Hayashida, Y. et al. Functional bioengineered corneal epithelial sheet grafts from corneal stem cells expanded ex vivo on a temperature-responsive cell culture surface. // Transplantation 2004, 77, (3), 37985.

151. Ohki, T.; Yamato, M.; Murakami, D. et al. Treatment of oesophageal ulcerations using endoscopic transplantation of tissue-engineered autologous oral mucosal epithelial cell sheets in a canine model. // Gut 2006, 55, (12), 1704-10.

152. Shiroyanagi, Y.; Yamato, M.; Yamazaki, Y. et al. Urothelium regeneration using viable cultured urothelial cell sheets grafted on demucosalized gastric flaps. // BJU international 2004, 93, (7), 1069-75.

153. Matsuda, N.; Shimizu, T.; Yamato, M. et al. Tissue Engineering Based on Cell Sheet Technology. // Advanced Materials 2007, 19, (20), 3089-3099.

154. Shimizu, T.; Yamato, M.; Kikuchi, A. et al. Two-dimensional manipulation of cardiac myocyte sheets utilizing temperature-responsive culture dishes augments the pulsatile amplitude. // Tissue engineering 2001, 7, (2), 141-51.

99

155. Shimizu, T.; Yamato, M.; Akutsu, T. et al. Electrically communicating three-dimensional cardiac tissue mimic fabricated by layered cultured cardiomyocyte sheets. // J. Biomed. Mater. Res. 2002, 60, (1), 110-117.

156. Sekiya, S.; Shimizu, T.; Yamato, M. et al. Bioengineered cardiac cell sheet grafts have intrinsic angiogenic potential. // Biochemical and biophysical research communications 2006, 341, (2), 573-82.

157. Tano, N.; Narita, T.; Kaneko, M. et al. Epicardial placement of mesenchymal stromal cell-sheets for the treatment of ischemic cardiomyopathy; in vivo proof-of-concept study. // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2014, 22, (10), 1864-71.

158. Kim, J. H.; Joo, H. J.; Kim, M. et al. Transplantation of Adipose-Derived Stem Cell Sheet Attenuates Adverse Cardiac Remodeling in Acute Myocardial Infarction.

// Tissue engineering. Part A 2017, 23, (1-2), 1-11.

159. Chen, M.; Xu, Y.; Zhang, T. et al. Mesenchymal stem cell sheets: a new cell-based strategy for bone repair and regeneration. // Biotechnol Lett 2019, 41, (3), 305318.

160. Nakamura, K.; Ikeuchi, T.; Nara, K. et al. Perlecan regulates pericyte dynamics in the maintenance and repair of the blood-brain barrier. // J. Cell Biol. 2019, 218, (10), 3506-3525.

161. Iwata, T.; Washio, K.; Yoshida, T. et al. Cell sheet engineering and its application for periodontal regeneration. // Journal of tissue engineering and regenerative medicine 2015, 9, (4), 343-356.

162. Imafuku, A.; Oka, M.; Miyabe, Y. et al. Rat Mesenchymal Stromal Cell Sheets Suppress Renal Fibrosis via Microvascular Protection. // Stem cells translational medicine 2019, 8, (12), 1330-1341.

163. Chang, D.; Fan, T.; Gao, S. et al. Application of mesenchymal stem cell sheet to treatment of ischemic heart disease. // Stem cell research & therapy 2021, 12, (1), 384.

164. Miyahara, Y.; Nagaya, N.; Kataoka, M. et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. // Nat. Med. 2006, 12, (4), 459-465.

165. Boldyreva, M. A.; Shevchenko, E. K.; Molokotina, Y. D. et al. Transplantation of Adipose Stromal Cell Sheet Producing Hepatocyte Growth Factor Induces Pleiotropic Effect in Ischemic Skeletal Muscle. // International journal of molecular sciences 2019, 20, (12), 3088.

166. Nussbaum, S. R.; Carter, M. J.; Fife, C. E. et al. An Economic Evaluation of the Impact, Cost, and Medicare Policy Implications of Chronic Nonhealing Wounds.

// Value in Health 2018, 21, (1), 27-32.

167. Griffiths, M.; Ojeh, N.; Livingstone, R. et al. Survival of Apligraf in acute human wounds. // Tissue engineering 2004, 10, (7-8), 1180-95.

168. Urciuolo, F.; Casale, C.; Imparato, G. et al. Bioengineered Skin Substitutes: the Role of Extracellular Matrix and Vascularization in the Healing of Deep Wounds. // J Clin Med 2019, 8, (12).

169. Lin, Y. C.; Grahovac, T.; Oh, S. J. et al. Evaluation of a multi-layer adipose-derived stem cell sheet in a full-thickness wound healing model. // Acta biomaterialia 2013, 9, (2), 5243-50.

170. Yu, J.; Wang, M. Y.; Tai, H. C. et al. Cell sheet composed of adipose-derived stem cells demonstrates enhanced skin wound healing with reduced scar formation.

// Acta biomaterialia 2018, 77, 191-200.

171. Stadler, I.; Zhang, R. Y.; Oskoui, P. et al. Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse. // Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research 2004, 17, (4), 221-7.

172. Wei, F.; Qu, C.; Song, T. et al. Vitamin C treatment promotes mesenchymal

stem cell sheet formation and tissue regeneration by elevating telomerase activity. //

Journal of cellular physiology 2012, 227, (9), 3216-24.

101

173. Theocharis, A. D.; Skandalis, S. S.; Gialeli, C. et al. Extracellular matrix structure. // Adv Drug Deliv Rev 2016, 97, 4-27.

174. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. // Science 2009, 326, (5957), 1216-9.

175. Scadden, D. T. Nice neighborhood: emerging concepts of the stem cell niche. // Cell 2014, 157, (1), 41-50.

176. Schlie-Wolter, S.; Ngezahayo, A.; Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. // Experimental cell research 2013, 319, (10), 1553-61.

177. DiPietro, L. A. Angiogenesis and wound repair: when enough is enough. //

Journal of leukocyte biology 2016, 100, (5), 979-984.

178. Hellström, M.; Gerhardt, H.; Kalen, M. et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. // The Journal of cell biology 2001, 153, (3), 543-53.

179. L, P. K.; Kandoi, S.; Misra, R. et al. The mesenchymal stem cell secretome: A new paradigm towards cell-free therapeutic mode in regenerative medicine. //

Cytokine Growth Factor Rev 2019, 46, 1-9.

180. Rose, D. P.; Connolly, J. M. Regulation of tumor angiogenesis by dietary fatty acids and eicosanoids. // Nutr Cancer 2000, 37, (2), 119-27.

181. Matesanz, N.; Park, G.; McAllister, H. et al. Omega-3 Fatty Acids Modulate Angiogenesis Through the Regulation of Nitric Oxide and Superoxide Anion Production in Retinal Microvascular Endothelial Cells (RMEC). // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2009, 50, (13), 2957-2957.