Динамика процессов репарации и клеточной гибели в модели ишемизированной длительно незаживающей кожной раны у мышей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Моргун Елена Игоревна

• Моргун Елена Игоревна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Моргун Елена Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна и значимость работы

Методология исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Регенерация раны

3.1.1. Регенерация кожной раны в норме

3.1.2. Регенерация длительно незаживающей раны. Способы её моделирования

3.2. Биомедицинские клеточные продукты

3.3. Запрограммированная клеточная гибель в ранозаживлении и других патологических состояниях кожи

3.3.1. Апоптоз

3.3.2. Некроптоз и его компоненты ЫРК-1 и ЫРК-3

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

4.1. Клеточные культуры

4.1.1. Кератиноциты

4.1.2. Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани

4.1.3. Изготовление биологического эквивалента кожи

4.2 Работа с животными

4.2.1. Хирургические манипуляции

4.2.2. Индукция стадии роста волосяного фолликула при помощи депиляции

4.3. Работа с кожей человека

4.4. Пробоподготовка материала

4.5. Гистологическое исследование

4.6. Иммуногистохимическое окрашивание

4.7. Выявление гибнущих клеток

4.8. Выделение РНК, обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ)

4.9. Растровая сканирующая оптоакустическая мезоскопия

4.10. Морфометрический анализ

4.11. Статистический анализ

4.12. Построение сетей функциональных взаимодействий

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Разработка модели ишемизированной длительно незаживающей кожной раны

5.2. Регенерация в модели ишемизированной длительно незаживающей раны без лечения, а также под воздействием тканеинженерной конструкции БЭК

5.2.1. Характеристика раневого процесса методами гистологии и

иммуногистохимии

5.2.2. Характеристика раневого процесса методом растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии

5.3. Паттерны экспрессии маркеров некроптоза ЫРК-1 и ЫРК-3 в длительно незаживающей ране

5.4. Экспрессия протеинкиназ некроптоза ЫРК-1 и ЫРК-3 в коже мыши на различных стадиях цикла ВФ, а также в коже человека

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика процессов репарации и клеточной гибели в модели ишемизированной длительно незаживающей кожной раны у мышей»

Актуальность темы исследования

Изучение процессов регенерации тканей, в том числе кожи, имеет безусловную важность, как с точки зрения фундаментальной науки, так и прикладных разработок. В норме процесс регенерации кожного повреждения завершается полным восстановлением структуры и функций кожи, однако, в случае присоединения инфекции, гипоксии, или иммунной дисфункции рана может приобрести статус длительно незаживающей [Xu et al., 2013]. Длительно незаживающие раны характеризуются избыточным воспалением, повышенным уровнем протеолитической активности и уменьшением отложения матрикса [Zhang et al, 2017]. Регенерация длительно незаживающей раны происходит с теми же стадиями, что и ранозаживление в норме, однако, со значительной задержкой в фазе воспаления [Eming et al, 2007]. К факторам, вызывающим хронизацию раны, относят диабет, сосудистую недостаточность, истощение, пожилой возраст, местную инфекцию, а также некроз вследствие сдавливания [Eming et al, 2007, Zhao et al, 2016]. В зависимости от генеза заболевания выделяют такие типы длительно незаживающих ран, как пролежни, диабетические язвы, а также ишемизированные длительно незаживающие раны. Такие раны трудно поддаются консервативной терапии.

Особенности строения, отличающие кожу лабораторных животных от кожи человека, являются причиной сложностей в моделировании ишемизированных длительно незаживающих ран [Lindblad, 2008]. Для приближения процесса регенерации в модели животного к человеческой патологии исследователи нередко используют синтетические конструкции и материалы. Например, наличие швов в непосредственной близости к ране вызывает значительный фон

при проведениях работ и вызывает сложности с интерпретацией результатов. Это является одной из причин наличия широкого разнообразия моделей ишемизированных длительно незаживающих ран на лабораторных животных.

Одним из перспективных направлений в лечении длительно незаживающих ран является трансплантация биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) типа кожных эквивалентов в раневое ложе. Этот способ лечения способствует эффективному ремоделированию грануляционной ткани и устранению косметического дефекта, который является одним из последствий хронизации ран [Васильев, 2003]. Модели на лабораторных животных для проведения такого рода исследований, адекватные человеческим патологиям, называются схожими моделями. Разработка схожей модели ишемизированной длительно незаживающей раны является неотъемлемой частью исследований, направленных на создание БМКП. На данный момент на территории России запатентовано несколько моделей длительно незаживающих ран, однако, схожей модели этой патологии, которая бы полностью подходила для проведения доклинических исследований БМКП, нет.

К лечению длительно незаживающих ран на сегодняшний день отсутствует единый терапевтический подход, что говорит о том, что механизмы регенерации в длительно незаживающих ранах плохо исследованы [Zhang et al, 2008].

Известно, что помимо репаративных процессов, неотъемлемой частью ранозаживления является запрограммированная клеточная гибель. Так, путем апоптоза в ране происходит элиминация клеток, выполнивших свою функцию в ходе раневого заживления, например, таких, как нейтрофилы, макрофаги и фибробласты [Rai et al, 2005]. Нарушения этого процесса также вызывают отклонения в регенерации кожи, что может приводить к приобретению раной статуса длительно незаживающей, а также к серьезным косметическим дефектам

[Lao et al, 2019]. Нарушения, связанные с процессом апоптоза, являются одной из причин аномалий рубцевания [Shaikh-Kader et al, 2019]. Кроме апоптоза, есть и иные типы запрограммированной клеточной гибели, такие, как некроптоз [Pasparakis, Vandenabelle, 2015]. Знания о роли этого процесса и его компонентов в ранозаживлении, на данный момент ограничены. Вместе с тем, есть работы, указывающие на возможное участие протеинкиназ некроптоза Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK-1) и Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK-3) в развитии рака почки, а также псориаза -патологических состояний, ассоциированных с неконтролируемой пролиферацией и дедифференциацией эпителиальных клеток [Saito et al, 2018, Al-lamki et al, 2016] - процессов, лежащих в основе ранозаживления. Следовательно, есть основания предполагать, что компоненты некроптоза могут участвовать в процессах, сопутствующих регенерации ишемизированной длительно незаживающей раны.

Идентификация новых механизмов регуляции морфогенеза и регенерации кожи и придатков с участием белков некроптотического комплекса актуальна в плане фундаментальных исследований биологии кожи и, в то же время, может наметить новые мишени и подходы для лечения патологий кожи.

Цели и задачи исследования

Целью исследования является определение динамики процессов репарации и клеточной гибели в модели ишемизированной длительно незаживающей раны. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать и охарактеризовать модель ишемизированной

длительно незаживающей раны на мышах.

2. Оценить возможность использования предложенной модели для доклинических исследований БМКП путем проведения эксперимента по трансплантации тканеинженерной конструкции «Биологический эквивалент кожи» (БЭК), представляющий собой эпидермально-мезенхимный пласт на носителе.

3. Определить паттерны экспрессии маркеров некроптоза протеинкиназ ШРК-1 и ЫРК-3 на различных стадиях раневого процесса в ишемизированной кожной ране мыши.

4. Соотнести экспрессию ЫРК-1 и ЫРК-3 с процессами запрограммированной клеточной гибели и регенерации. Исследовать паттерн экспрессии ЫРК-1 и ЫРК-3 в здоровой коже мыши на всех стадиях цикла волосяного фолликула (ВФ).

Научная новизна и значимость работы

В рамках текущей работы была разработана и запатентована модель ишемизированной длительно незаживающей раны на мыши, оптимизированная для проведения доклинических исследований БМКП, а также отработана процедура трансплантации тканеинженерной конструкции «БЭК» и оценки эффективности устранения косметического дефекта по состоянию зоны ремоделирования ткани в раневом ложе. Наработки, представленные в диссертации, могут быть методологически значимыми для проведения доклинических исследований БМКП, предназначенных для лечения ишемизированных длительно незаживающих ран и других патологических состояний кожи.

Разработанная модель пригодна для проведения фундаментальных исследований процессов, которые проходят в ране, в том числе таких, как изучение запрограммированной клеточной гибели и её компонентов.

На сегодняшний день данные по динамике репаративных и дегенеративных процессов в ишемизированной длительно незаживающей ране остаются неполными, в частности информация о роли некроптоза и его протеинкиназ ЫРК-1 и ЫРК-3 в регенерации кожных повреждений, в том числе ишемизированной длительно незаживающей раны являются крайне ограниченной. В диссертации впервые была показана динамика экспрессии компонентов некроптоза протеинкиназ ЫРК-1 и ЫРК-3 на всех стадиях регенерации ишемизированной длительно незаживающей раны - воспаления, пролиферации и ремоделирования рубца.

Кроме того, понимание возможной роли ЫРК-1 и ЫРК-3 в ранозаживлении затруднено в виду ограниченности и противоречивости данных о паттернах экспрессии, а также функциях ЫРК-1 и ЫРК-3 в здоровой коже. Учитывая физиологию кожи и зависимость ранозаживления от стадии цикла ВФ, расположенных в коже, полученная в работе информация о паттернах экспрессии этих протеинкиназ на всех стадиях цикла ВФ позволяет делать предположения о возможном влиянии этих протеинкиназ на регенеративные процессы.

В текущей работе впервые удалось показать, что экспрессия ЫРК-1 и ЫРК-3 во время ранозаживления может быть не связана с запрограммированной клеточной гибелью. Исходя из полученных результатов, был сделан вывод о возможных неканонических функциях ЫРК-1 и ЫРК-3 во время регенерации. Возможно, неканонические функции этих протеинкиназ могут осуществляться через сигнальные пути, Wnt/p-катенин, ТЬК3/!Ь-6/8ТЛТ3, а также каскады,

активированные при участии трансформирующего фактора роста бета (англ. transforming growth factor- pi TGF-p1), IL-1p, IL-17A, IL-22, TNFR и EGFR.

Полученные данные об экспрессии RIPK-1 и RIPK-3 в коже и ВФ в норме и во время регенерации длительно незаживающей раны дают основания полагать, что эти протеинкиназы могут быть важными регуляторами эпидермального гомеостаза и общими терапевтическими мишенями при лечении патологий ранозаживления и ВФ.

Результаты работы имеют важность в плане фундаментальных исследований биологии кожи и, в то же время, могут наметить новые мишени и подходы для лечения патологий кожи.

Методология исследования

Для моделирования ситуации возникновения раны в условиях ишемии на первом этапе была отработана методика формирования ишемизированного кожного лоскута, на котором в дальнейшем формировали рану. Ишемия в лоскуте была подтверждена методами гистологии, иммуногистохимии, морфометрии и статистики. Приобретение раной статуса длительно незаживающей было доказано сравнением с острой раной, нанесенной на спину мыши без лоскута. Хирургические процедуры и ведение животных с ранами были оптимизированы для трансплантации БЭК. Динамика регенерации ишемизированной длительно незаживающей раны без лечения, а также при трансплантации БЭК была охарактеризована согласно фазам ранозаживления - воспаления, пролиферации и ремоделирования рубца. Для анализа использовали методы гистологии, иммуногистохимии и растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии (РСОМ). Для контроля, полученные результаты сравнили с результатами трансплантации носителя, используемого при создании БЭК, без клеток. Паттерны

экспрессии RIPK-1 и RIPK-3 в ишемизированной длительно незаживающей ране были определены на всех стадиях ранозаживления, параллельно с детекцией запрограммированной клеточной гибели и пролиферации клеток методами иммуногистохимии и TUNEL. Кроме того, паттерны экспрессии RIPK-1 и RIPK-3 были определены в здоровой коже на различных стадиях цикла ВФ, инициированного депиляцией, методом иммуногистохимии. Экспрессия RIPK-3 на уровне мРНК в здоровой коже была подтверждена методом ПЦР. Для предположения о роли RIPK-1 и RIPK-3 в ранозаживлении были составлены сети функциональных взаимодействий с помощью программы GeneMANIA.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана модель ишемизированной длительно незаживающей кожной раны, адекватная человеческой патологии.

2. Предложенная модель подходит для доклинических испытаний биомедицинских клеточных продуктов, а также для проведения фундаментальных исследований.

3. Экспрессия регуляторов некроптоза RIPK-1 и RIPK-3 во время заживления ишемизированной длительно незаживающей раны мыши не сопряжена с процессом клеточной гибели путем некроптоза в клетках тех зон кожи, в которых обнаруживаются эти протеинкиназы.

4. Локализация экспрессии RIPK-1 и RIPK-3 в здоровой коже отличается, и ее паттерн зависит от фазы цикла ВФ.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обеспечивается стандартизацией методик и протоколов, сопровождением экспериментов техническими и

биологическими повторами и контролями, а также статистической обработкой результатов.

Полученные результаты были представлены на следующих конференциях:

• III Национальный Конгресс по Регенеративной Медицине 15-18 ноября 2017 года, Москва, Россия.

• II CTERP International Conference, Moscow, April, 11-13, 2018.

• 26th Conference of the European Cell Death Organization, Saint Petersburg, October, 10-12, 2018.

• 27th Conference of the European Cell Death Organization, Dresden, Germany, September, 25-17, 2019.

• XVIII Конференция-школа с международным участием «Актуальные проблемы биологии развития» 14-19 октября 2019 года.

• VII Молодежная конференция ИНЦ РАН, Санкт-Петербург, 12 -15 октября 2020.

Личный вклад автора

Автором был проведен анализ литературных данных, на основе чего был спроектирован дизайн эксперимента. Автором были разработаны модели ишемизированного лоскута, ишемизированной длительно незаживающей раны и способа трансплантации БЭК в рану. Автором были проведены гистологические, иммуногистохимические и морфометрические исследования. Автором был проведен анализ и интерпретация полученных данных, на основе чего были получены выводы и предположения. Полученные результаты были представлены автором на всероссийских и международных конференциях, а также опубликованы в рецензируемых журналах. РСОМ был проведен к.б.н.

Новоселовой Мариной, к.б.н. Гусляковой Ольгой и д.б.н. проф. Гориным Дмитрием Александровичем.

Структура и объем диссертации

Текст диссертации приведен на 120 страницах, содержит 26 рисунков, 4 таблиц и дополнен 1 приложением на 12 страницах. В работе процитирован 146 литературный источник.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Регенерация раны

3.1.1. Регенерация кожной раны в норме.

Кожа человека выполняет функцию барьера, разделяющего организм человека и внешнее пространство, поэтому регенерация кожных ран является крайне важным процессом для сохранения гомеостаза. Разные источники делят процесс ранозаживления на 3 [Gurtner, 2008, Eming et al, 2007; Han, Ceilley 2017], или на 4 стадии [Gantwerker, Hom, 2011, Zhao et al, 2016]. Если отталкиваться от трехстадийного процесса, то заживление состоит из фаз воспаления, пролиферации и ремоделирования [Gurthner, 2008, Eming et al, 2007, Han, Ceilley, 2017]. В четырехстадийном процессе выделяют гемостаз, воспаление, пролиферацию, мацерацию/ремоделирование [Gantwerker, Hom, 2011, Zhao et al, 2016]. В данной работе ранозаживление будет рассматриваться как трехстадийный процесс, в котором фазы гемостаза и воспаления совмещены [Gantwerker, Hom, 2011].

Фаза воспаления. В процессе гемостаза формируется сгусток из тромбоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов [Eming et al, 2007]. Тромбоциты являются наиболее важными участниками гемостаза, они выделяют различные цитокины, гормоны и хемокины, которые используются на последующих стадиях заживления [Gantwerker, Hom, 2011]. Также они высвобождают содержимое альфа-гранул, которые содержат такие факторы, как эпидермальный фактор роста (англ. еpidermal growth factor, EGF), тромбоцитарный фактор роста (англ. platet-derived growth factor, PDGF), TGF-P [Barrientos et al, 2008]. Катехоламины и серотонин воздействуют на эндотелий и вызывают сужение сосудов, окружающих

рану. Тромбоциты связываются на коллагеновых волокнах поврежденного субэндотелия между собой при помощи рецептора GpIIb-IIIa, после чего активируются и формируют тромб [Gantwerker, Hom, 2011]. Далее тромб замещается фибриновым матриксом, который служит скаффолдом для инфильтрирующих клеток. На первом этапе в рану мигрируют нейтрофилы, которые далее замещаются моноцитами, которые впоследствии дифференциируются в макрофаги [Gurtner et al, 2008].

Нейтрофилы играют важную роль в удалении дебриса и фагоцитозе бактерий. В ходе этих процессов нейтрофилы выделяют активные формы кислорода (АФК), катионные пептиды, эйкозаноиды и протеазы. Также эти клетки секретируют про- и противовоспалительные цитокины. На 2 день ранозаживления нейтрофильная фаза сменяется макрофагальной [Eming et al, 2007]. Под воздействием TGF-ß моноциты, мигрировавшие из кровяного русла в рану, трансформируются в макрофаги.

Макрофаги выделяют провоспалительные цитокины, такие как IL-1 и IL-6, а также факторы роста: фактор роста фибробластов (англ. fibroblast growth factor, FGF), EGF, TGF-ß, PDGF [Barrientos et al, 2008]. Инфильтрация макрофагов регулируется градиентом факторов роста, провоспалительных цитокинов, хемокинови моноцитарного хемотаксического протеина-1 (англ. onocyte chemoattractant protein, МСР-1), источниками которых являются пролиферирующие кератиноциты по краям раны, тромбоциты из фибринового сгустка, фибробласты и лейкоциты. На поверхности макрофагов расположены такие рецепторы, как как Толл-подобный рецептор (TLR от англ. Toll-like receptor), F-рецептор и рецептор комплемента, [Eming et al, 2007]. В зависимости от фенотипа, макрофаги разделяются на подтипы М1 и М2. Макрофаги М1, которые секретируют провоспалительные цитокины и фагоцитируют мертвые

клетки и патогены, приобретают свой фенотип под воздействием IFN-y, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (англ. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) и в присутствии компонентов бактерий. Макрофаги М2, активация которых регулируется IL-4 и/или IL-13, секретируют противовоспалительные цитокины и ангиогенные факторы [Xu et al, 2013, Qing, 2017].

Кроме нейтрофилов и макрофагов в раневом заживлении важную роль играют тучные клетки. Они являются одним из источников провоспалительных медиаторов и цитокинов в раневом ложе. Кроме того, тучные клетки способны модулировать привлечение нейтрофилов в область воспаления [Eming et al., 2007].

Фаза пролиферации. Следующий этап раневого заживления характеризуется пролиферацией и миграцией различных типов клеток в раневое ложе, что обеспечивает процессы реэпителизации, ангиогенеза и формирования грануляционной ткани [Gurtner et al, 2008].

Источником кератиноцитов для реэпителизации являются Sca-1+, Gli+, Lgr6+ и Lgr5+ стволовые клетки ВФ [Brownell et al, 2011, Rompolas, Greco, 2014]. Во время реэпителизации стволовые клетки ВФ дифференцируются и мигрируют от краев раны к центру где, контактируя с внеклеточным матриксом (ВКМ), они начинают синтез белков новой базальной мембраны [Gantwerker, Hom, 2011]. Во время миграции кератиноциты меняют свою форму благодаря поляризации клеток, во время которой происходит полимеризация актиновых филаментов с образованием ведущих псевдоподий [Qing, 2017]. Кератиноциты заполняют раневой дефект и перестают мигрировать под влиянием контактного торможения [Gantwerker and Hom, 2011]. Процесс реэпителизации регулируется ростовыми факторами семейств фактора роста гепатоцитов (англ. hepatocyte growth factor, HGF), FGF, EGF и KGF [Martin and Nunan, 2015].

Во время нормального ранозаживления происходит мощный рост капилляров с последующей контролируемой регрессией. В заживающих ранах новые капилляры прорастают в 2, 3 и даже в 10 раз плотнее, чем в нормальной ткани [DiPierto et al, 1998]. Ангиогенез активируется под воздействием VEGF. Во время этого процесса от сосудов, окружающих рану, отпочковываются новые сосуды и прорастают в раневое ложе [Gantwerker, Hom, 2011]. Этот процесс обеспечивается эндотелиальными прогениторными клетками, экспрессирующие маркеры и гематопоэтических стволовых клеток (CD34 и CD133), и эндотелиальных клеток (CD 146, vWF и VEGFR2). Эндотелиальные прогениторные клетки мобилизируются в регенерирующую ткань из костного мозга [Qing, 2017].

Грануляционная ткань состоит из фибробластов, прорастающих сосудов и незрелого коллагена III типа [Gantwerker, Hom, 2011]. Грануляционная ткань является субстратом для миграции кератиноцитов [Gurthner et al, 2008]. Далее фибробласты под воздействием TGF-ß, фибронектина, эндотелина-1 дифференциируются в миофибробласты, которые способствуют контракции раны [Barrientos et al, 2008].

Фаза ремоделирования рубца и эпителизации. На протяжении этой стадии большая часть эндотелиальных клеток, макрофагов и миофибробластов подвергается апоптозу или мигрирует из раневого ложа, которое состоит из коллагена и белков ВКМ. Фибробласты, макрофаги и клетки эндотелия выделяют матриксные металлопротеиназы (MMP от англ. Matrix metalloproteinases), которые регулируют замещение коллагена III типа на коллаген I типа [Gurtner et al, 2008]. Начинается инволюция грануляционной ткани [Gantwerker and Hom, 2011] и снижение плотности кровеносных сосудов путем селективного апоптоза новосформированных капилляров [DiPierto, 2016]. Оставшиеся капилляры

созревают и, таким образом, количество кровеносных сосудов раневого ложа возвращается к значениям, характерным для неповрежденной ткани [DiPierto, 2016].

На стадии ремоделирования важную роль играют Т-клетки: клетки субпопуляции Th1 выделяют IFN-y, IL-2, TNF-a, а Th2 - IL-4, 5, 10, что способствует ремоделированию ткани. Кроме того, Т клетки участвуют в межклеточных взаимодействиях между резидентными и нерезидентными клетками раневого ложа [Eming et al, 2007].

Важным этапом ранозаживления является формирование рубца -образования грубой волокнистой соединительной ткани [Гуллер, Шехтер, 2005]. Этот процесс регулируется факторами роста из семейства TGF-P: TGF-pi и TGF-Р2 способствуют накоплению матрикса, а TGF-рЭ имеет противорубцовое действие [Shah et al, 1995]. Рубец состоит из так называемой рубцовой ткани, формирующейся в результате заместительной регенерации, и эпидермиса. По архитектонике и функциональному состоянию коллагеновых волокон, клеточному составу и степени зрелости выделяют такие типы рубцовой ткани, как нормотрофическая, гипертрофическая, келоидная, атрофическая и фиброзно-измененная дерма. Наиболее благоприятным исходом рубцевания является образование нормотрофической рубцовой ткани, характеризующейся упорядоченными коллагеновыми волокнами, ориентированными параллельно эпидермису, наличием небольшого количества эластических волокон и фибробластов с умеренной, или слабой функциональной активностью [Гуллер, Шехтер, 2005]. Характер рубцевания зависит от воспалительного статуса организма человека [Eming et al, 2007]. У плода кожа регенерирует без образования рубца, поскольку фетальное раневое заживление происходит при сниженной воспалительной реакции. При безрубцовом ранозаживлении и во

время регенерации с образованием рубца наблюдаются различия в размерах и зрелости макрофагов, нейтрофилов и тучных клеток [Takeo et al, 2015].

На стадии ремоделирования рубца и реэпителизации у грызунов происходит рано-индуцированный неогенез волос [Gay et al, 2020]. Регенерация ВФ имеет сходство с эмбриональным морфогенезом волоса [Gong et al, 2018, Wang et al, 2017]. Регенерирующий ВФ экспрессирует маркеры, которые являются типичными для эмбриогенеза волоса: Krt17, Lefl, щелочная фосфатаза, Wnt10b, and Shh [Ito et al., 2007]. На данный момент вовлеченность различных типов стволовых клеток в этот процесс остается дискутируемой. Есть экспериментальные данные в пользу того, что Lgr6+ стволовые клетки ВФ в фазе телогена, трансплантированные в кожу спины мышей линии nude, способны реконструировать ВФ [Snippert et al, 2010]. Работа Ванга демонстрирует ключевую роль в рано-индуцированном неогенезе волоса Lgr5+ стволовых клеток так называемой зоны балдж. Кроме того, было показано, что потомки Lgr5+ клеток обнаруживаются в 40% ВФ, образованных de novo во время ранозаживления [Wang et al, 2017]. ВФ, новообразованный в раневом ложе, содержит дермальную папиллу (волосяной сосочек), сформированную за счет конденсации дермальных фибробластов. Эксперименты на мышах с генетическим нокаутом по Blimp-1 демонстрируют нарушения в рано-индуцированном неогенезе волос, из чего можно сделать вывод о том, что фибробласты, экспрессирующие Blimp-1 играют важную роль в неогенезе дермальной папиллы [Telerman et al, 2017].

3.1.2. Регенерация длительно незаживающей раны. Способы её моделирования.

В норме процесс регенерации кожного повреждения завершается полным восстановлением структуры и функций кожи, однако, в случае присоединения инфекции, гипоксии, или иммунной дисфункции рана может приобрести статус длительно незаживающей [Xu et al., 2013]. Длительно незаживающие раны характеризуются избыточным воспалением, повышенным уровнем протеолитической активности и уменьшением отложения матрикса [Zhang et al, 2017]. Регенерация длительно незаживающей раны происходит с теми же стадиями, что и ранозаживление в норме, однако, со значительной задержкой в фазе воспаления [Eming et al, 2007]. К факторам, вызывающим хронизацию раны, относят диабет, сосудистую недостаточность, истощение, пожилой возраст, местную инфекцию, а также некроз вследствие сдавливания [Eming et al, 2007, Zhao et al, 2016]. В зависимости от генеза заболевания выделяют такие типы длительно незаживающих ран, как пролежни, диабетические язвы, а также ишемизированные длительно незаживающие раны.

Ключевым фактором в развитии хронического воспаления, который приводит к приобретению раной статуса длительно незаживающей и может рассматриваться в качестве гистологического биомаркера, является чрезмерная инфильтрация нейтрофилов в раневое ложе. Избыточность нейтрофилов вызывает сверхпродукцию АФК, из-за чего происходит повреждение ВКМ и клеточных мембран и, как следствие, преждевременное снижение функций клеток [Zhao et al, 2016]. Помимо повреждения мембран и структурных белков ВКМ АФК могут активировать экспрессию провоспалительных цитокинов таких, как IL-1, 6, TNF-а, а также хемокинов и протеолитических энзимов, в том числе ММР и сериновых

протеаз [Eming et al, 2007]. Кроме того, нейтрофилы могут не только косвенно воздействовать на экспрессию MMP и сериновых протеаз через выработку АФК, но и непосредственно выделять эти ферменты. В результате сериновые протеазы эластазы расщепляют факторы роста, а MMP коллагеназы вызывают деградацию ВКМ. Продукты распада ВКМ, в свою очередь, вызывают эскалацию воспалительного процесса [Zhao et al, 2016]. Схема патогенеза длительно незаживающих ран представлена на Рис. 1.

ММР-1 * АФК

ММР-2 ------- .

ММР-3

ММР-9 Деградация факторов роста и Липопероксиды

ММР-13 белков ВКМ

Рисунок 1. Модель многофакторных молекулярных и клеточных механизмов, которые способствуют приобретению раной статуса длительно незаживающей. Eming et al., 2007, с модификациями.

На данный момент существует широкое разнообразие моделей длительно незаживающей раны на различных видах лабораторных животных [Gould et al, 2005]. Для моделирования кожных патологий используют свиней ввиду сходства кожи этих животных с человеческой по многим параметрам, например, таким, как плотность нервов, эпителиальная архитектура, компоненты матрикса и другие

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Моргун Елена Игоревна, 2021 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rai N.K. et al. Apoptosis: A basic physiologic process in wound healing // Int. J. Low. Extrem. Wounds. 2005. Vol. 4, № 3. P. 138-144.

2. Lao G. et al. Human tissue inhibitor of metalloproteinases-1 improved wound healing in diabetes through its anti-apoptotic effect. // Exp. Dermatol. Denmark, 2019. Vol. 28, № 5. P. 528-535.

3. Shaikh-Kader A. et al. The link between advanced glycation end products and apoptosis in delayed wound healing // Cell Biochem. Funct. 2019. Vol. 37, № 6. P. 432-442.

4. Pasparakis M., Vandenabeele P. Necroptosis and its role in inflammation. // Nature. England, 2015. Vol. 517, № 7534. P. 311-320.

5. Saito N. et al. RIPK1 downregulation in keratinocyte enhances TRAIL signaling in psoriasis // J. Dermatol. Sci. Japanese Society for Investigative Dermatology, 2018. Vol. 91, № 1. P. 79-86.

6. Al-Lamki R.S. et al. Tubular epithelial cells in renal clear cell carcinoma express high RIPK1/3 and show increased susceptibility to TNF receptor 1-induced necroptosis // Cell Death Dis. 2016. Vol. 7, № 6. P. 1-14.

7. Eming S.A., Krieg T., Davidson J.M. Inflammation in wound repair: Molecular and cellular mechanisms // J. Invest. Dermatol. Elsevier Masson SAS, 2007. Vol. 127, № 3. P. 514-525.

8. Zhao R. et al. Inflammation in chronic wounds // Int. J. Mol. Sci. 2016. Vol. 17, № 12. P. 1-14.

9. Lindblad W.J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. England, 2008. Vol. 19, № 8. P. 1087-1096.

10. Российская Федерация. Законы. О биомедицинских клеточных продуктах : Федеральный закон № 180-Ф3: [принят Государственной Думой 8 июня 2016 г.: одобрен Советом Федерации 15 июня 2016 г.].

11. Zhang Q. et al. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation in an ischemic wound model. // J. Invest. Dermatol. United States, 2008. Vol. 128, № 8. P. 2102-2112.

12. Васильев А.В., Клеточные механизмы репарации тканевых повреждений : автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.25. - М., 2003. - 39 с.

13. Chermnykh E.S. et al. Tissue-engineered biological dressing accelerates skin wound healing in mice via formation of provisional connective tissue. // Histol. Histopathol. Spain, 2018. Vol. 33, № 11. P. 1189-1199.

14. Dong X.H. et al. Postconditioning with inhaled hydrogen attenuates skin ischemia/reperfusion injury through the RIP-MLKL-PGAM5/Drp1 necrotic pathway // Am. J. Transl. Res. 2019. Vol. 11, № 1. P. 499-508.

15. Liu H. et al. Necroptosis was found in a rat ischemia/reperfusion injury flap model // Chin. Med. J. (Engl). 2019. Vol. 132, № 1. P. 42-50.

16. Reddy A.S. et al. The role of necroptosis in burn injury progression in a rat comb burn model // Acad. Emerg. Med. 2015. Vol. 22, № 10. P. 1181-1186.

17. Gurtner G.C. et al. Wound repair and regeneration // Nature. 2008. Vol. 453, № 7193. P. 314-321.

18. Han G., Ceilley R. Chronic Wound Healing: A Review of Current Management and Treatments // Adv. Ther. Springer Healthcare, 2017. Vol. 34, № 3. P. 599-610.

19. Gantwerker E.A., Hom D.B. Skin: Histology and Physiology of Wound Healing // Facial Plast. Surg. Clin. North Am. Elsevier Inc, 2011. Vol. 19, № 3. P. 441453.

19. Li X. et al. Optoacoustic mesoscopy analysis and quantitative estimation of specific imaging metrics in Fitzpatrick skin phototypes II to V // J. Biophotonics. 2019. Vol. 12, № 9. P. 1-9.

20. Barrientos S. et al. Growth factors and cytokines in wound healing // Wound Repair Regen. 2008. Vol. 16, № 5. P. 585-601.

21. Xu F., Zhang C., Graves D.T. Abnormal cell responses and role of TNF- a in impaired diabetic wound healing // Biomed Res. Int. 2013. Vol. 2013.

22. Qing C. The molecular biology in wound healing & non-healing wound // Chinese J. Traumatol. - English Ed. Elsevier Ltd, 2017. Vol. 20, № 4. P. 189-193.

23. Brownell I. et al. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2011. Vol. 8, № 5. P. 552-565.

24. Rompolas P., Greco V. Stem cell dynamics in the hair follicle niche. // Semin. Cell Dev. Biol. 2014. Vol. 25-26. P. 34-42.

25. Martin P., Nunan R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing // Br. J. Dermatol. 2015. Vol. 173, № 2. P. 370-378.

26. DiPietro L.A. et al. MIP-1alpha as a critical macrophage chemoattractant in murine wound repair. // J. Clin. Invest. 1998. Vol. 101, № 8. P. 1693-1698.

27. Гуллер А., Шехтер А.Б. Рубцы кожи человека: диагностика, основанная на морфологических данных // Экспериментальная и клиническая дерматокосметолгия. 2005. №6 С. 0-12.

28. Shah M., Foreman D.M., Ferguson M.W.J. Neutralisation of TGF-ß1 and TGF-ß2 or exogenous addition of TGF-ß3 to cutaneous rat wounds reduces scarring // J. Cell Sci. 1995. Vol. 108, № 3. P. 985-1002.

29. Takeo M., Lee W., Ito M. Wound healing and skin regeneration // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2015. Vol. 5, № 1. P. 1-12.

30. Gay D. et al. Phagocytosis of Wnt inhibitor SFRP4 by late wound macrophages drives chronic Wnt activity for fibrotic skin healing // Sci. Adv. 2020. Vol. 6, № 12.

31. Gong L., Xu X.-G., Li Y.-H. Embryonic-like regenerative phenomenon: wound-induced hair follicle neogenesis. // Regen. Med. England, 2018. Vol. 13, № 6. P. 729-739.

32. Wang X. et al. Macrophages induce AKT/ß-catenin-dependent Lgr5+ stem cell activation and hair follicle regeneration through TNF // Nat. Commun. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 8. P. 1-14.

33. Ito M. et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding // Nature. 2007. Vol. 447, № 7142. P. 316-320.

34. Snippert H.J. et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin // Science (80-. ). 2010. Vol. 327, № 5971. P. 1385-1389.

35. Telerman S.B. et al. Dermal Blimp1 Acts Downstream of Epidermal TGFß and Wnt/ß-Catenin to Regulate Hair Follicle Formation and Growth // J. Invest. Dermatol. 2017. Vol. 137, № 11. P. 2270-2281.

36. Zhang J. et al. PKCn as a promising therapeutic target for TNFa-induced inflammatory disorders in chronic cutaneous wounds // Int. J. Mol. Med. 2017. Vol. 40, № 5. P. 1335-1346.

37. Ramos M.L.C., Gragnani A., Ferreira L.M. Is there an ideal animal model to study hypertrophic scarring? // J. Burn care Res. Off. Publ. Am. Burn Assoc. England, 2008. Vol. 29, № 2. P. 363-368.

38. Zhu K.Q. et al. Review of the female Duroc/Yorkshire pig model of human fibroproliferative scarring. // Wound repair Regen. Off. Publ. Wound Heal. Soc. [and] Eur. Tissue Repair Soc. 2007. Vol. 15 Suppl 1, № Suppl 1. P. S32-9.

39. Bedell M.A. et al. Mouse models of human disease. Part II: recent progress

and future directions. // Genes Dev. United States, 1997. Vol. 11, № 1. P. 11-43.

40. Paus R. et al. A comprehensive guide for the recognition and classification of distinct stages of hair follicle morphogenesis. // J. Invest. Dermatol. United States, 1999. Vol. 113, № 4. P. 523-532.

41. Wong V.W. et al. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. // J. Biomed. Biotechnol. 2011. Vol. 2011. P. 969618.

42. Пат. 2618653C1 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01). Способ моделирования трофической язвы венозной этиологии в эксперименте / Г.Н. Гуликян ; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясеневского. - № 2618653C1 ; заявл. 23.05.2016 ; опубл. 05.05.2017, Бюл. №13.

43. Пат. 72348U1 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01). Устройство для моделирования ран кожи / М.А. Погодина ; заявители и патентообладатели Погодина Мария Александровна, Шехтер Анатолий Борухович, Руденко Татьяна Георгиевна. - № 72348 U1 ; заявл. 06.11.2007 ; опубл. 10.04.2008, Бюл.

44. Пат. 2702603C1 Российская Федерация, МПК G09B 23/28 (2006.01). Способ моделирования длительно незаживающих ран для оценки ранозаживляющего действия биомедицинских клеточных продуктов / Е.А. Воротеляк ; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН. - № 2702603 C1 ; заявл. 27.12.2018 ; опубл. 08.10.2019, Бюл. №28.

45. Lee D.W. et al. The Effect of Polydeoxyribonucleotide on Ischemic Rat Skin Flap Survival // Ann. Plast. Surg. 2015. Vol. 75, № 1. P. 84-90.

46. Biswas S. et al. Hypoxia inducible microRNA 210 attenuates keratinocyte

proliferation and impairs closure in a murine model of ischemic wounds. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2010. Vol. 107, № 15. P. 6976-6981.

47. Rippa A.L., Kalabusheva E.P., Vorotelyak E.A. Regeneration of Dermis: Scarring and Cells Involved // Cells. 2019. Vol. 8, № 6. P. 607.

48. Bello Y.M., Falabella A.F., Eaglstein W.H. Tissue-engineered skin: Current status in wound healing // Am. J. Clin. Dermatol. 2001. Vol. 2, № 5. P. 305-313.

49. Rheinwatd J.G., Green H. Seria cultivation of strains of human epidemal keratinocytes: the formation keratinizin colonies from single cell is // Cell. 1975. Vol. 6, № 3. P. 331-343.

50. Bell E. et al. Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full thickness. // Science. United States, 1981. Vol. 211, № 4486. P. 10521054.

51. Bell E. et al. The living skin equivalent: Its manufacture, its organotypic properties and its responses to irritants // Toxicol. Vitr. 1991. Vol. 5, № 5-6. P. 591596.

52. Michel M. et al. Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair // Vitr. Cell. Dev. Biol. - Anim. 1999. Vol. 35, № 6. P. 318-326.

53. Abaci H.E. et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach // Nat. Commun. Springer US, 2018. Vol. 9, № 1. P. 1-11.

54. Black A.F. et al. In vitro reconstruction of a human capillary- like network in a tissue- engineered skin equivalent // FASEB J. 1998. Vol. 12, № 13. P. 1331-1340.

55. Schechner J.S. et al. In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000. Vol. 97, № 16. P. 9191-9196.

56. Samadikuchaksaraei A. et al. A Dermal Equivalent Engineered with TGF-

ß3 Expressing Bone Marrow Stromal Cells and Amniotic Membrane: Cosmetic Healing of Full-Thickness Skin Wounds in Rats // Artif. Organs. 2016. Vol. 40, № 12. P. E266-E279.

57. Darby I.A. et al. Apoptosis is increased in a model of diabetes-impaired wound healing in genetically diabetic mice // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. Vol. 29, № 1. P. 191-200.

58. Liang Y. et al. Matrix metalloproteinase 9 induces keratinocyte apoptosis through FasL/Fas pathway in diabetic wound // Apoptosis. Springer US, 2019. Vol. 24, № 7-8. P. 542-551.

59. Delanghe T., Dondelinger Y., Bertrand M.J.M. RIPK1 Kinase-Dependent Death: A Symphony of Phosphorylation Events // Trends Cell Biol. Elsevier Ltd, 2020. Vol. 30, № 3. P. 189-200.

60. Ke F.F.S. et al. Embryogenesis and Adult Life in the Absence of Intrinsic Apoptosis Effectors BAX, BAK, and BOK. // Cell. United States, 2018. Vol. 173, № 5. P. 1217-1230.e17.

61. Raju S. et al. Kinase domain dimerization drives RIPK3-dependent necroptosis. // Sci. Signal. 2018. Vol. 11, № 544.

62. Grootjans S., Vanden Berghe T., Vandenabeele P. Initiation and execution mechanisms of necroptosis: An overview // Cell Death Differ. Nature Publishing Group, 2017. Vol. 24, № 7. P. 1184-1195.

63. Orozco S. et al. RIPK1 both positively and negatively regulates RIPK3 oligomerization and necroptosis. // Cell Death Differ. 2014. Vol. 21, № 10. P. 15111521.

64. Devos M. et al. Sensing of endogenous nucleic acids by zbp1 induces keratinocyte necroptosis and skin inflammation // J. Exp. Med. 2020. Vol. 217, № 7.

65. Cho Y.S. et al. Phosphorylation-Driven Assembly of the RIP1-RIP3

Complex Regulates Programmed Necrosis and Virus-Induced Inflammation // Cell. 2009. Vol. 137, № 6. P. 1112-1123.

66. Newton K. Multitasking kinase ripk1 regulates cell death and inflammation // Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2020. Vol. 10, № 3. P. 1-22.

67. Najjar M. et al. RIPK1 and RIPK3 Kinases Promote Cell-Death-Independent Inflammation by Toll-like Receptor 4. // Immunity. 2016. Vol. 45, № 1. P. 46-59.

68. Moriwaki K. et al. The Necroptosis Adaptor RIPK3 Promotes Injury-Induced Cytokine Expression and Tissue Repair // Immunity. Elsevier Inc., 2014. Vol. 41, № 4. P. 567-578.

69. Habib A.A. et al. The epidermal growth factor receptor engages receptor interacting protein and nuclear factor-KB (NF-KB)-inducing kinase to activate NF-kB: Identification of a novel receptor-tyrosine kinase signalosome // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 12. P. 8865-8874.

70. Lin Y. et al. The essential role of the death domain kinase receptor-interacting protein in insulin growth factor-I-induced c-Jun N-terminal kinase activation. // J. Biol. Chem. United States, 2006. Vol. 281, № 33. P. 23525-23532.

71. Li J. et al. Exogenous IGF-1 promotes hair growth by stimulating cell proliferation and down regulating TGF-ß1 in C57BL/6 mice in vivo // Growth Horm. IGF Res. Elsevier B.V., 2014. Vol. 24, № 2-3. P. 89-94.

72. Duan X. et al. Inhibition of keratinocyte necroptosis mediated by RIPK1/RIPK3/MLKL provides a protective effect against psoriatic inflammation // Cell Death Dis. Springer US, 2020. Vol. 11, № 2.

73. Zheng M. et al. Hair growth promotion by necrostatin-1s. // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, № 1. P. 17622.

74. Paus R., Stenn K.S., Link R.E. Telogen skin contains an inhibitor of hair

growth // Br. J. Dermatol. 1990. Vol. 122, № 6. P. 777-784.

75. Honda T. et al. Receptor-interacting protein kinase 3 controls keratinocyte activation in a necroptosis-independent manner and promotes psoriatic dermatitis in mice // J. Allergy Clin. Immunol. Elsevier Inc., 2017. Vol. 140, № 2. P. 619-622.e6.

76. Muller-Rover S. et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages // J. Invest. Dermatol. 2001. Vol. 117, № 1. P. 3-15.

77. Kim J., Krueger J.G. The Immunopathogenesis of Psoriasis // Dermatol. Clin. Elsevier Inc, 2015. Vol. 33, № 1. P. 13-23.

78. Моргун Е.И., Роговая О.С., Воротеляк Е.А. Модель ишемизированной длительно незаживающей кожной раны: клеточная гибель и механизмы ранозаживления // Современные технологии в медицине. 2018. Т. 10, № 4. С. 6977.

79. Tsai T.-C. et al. Anti-inflammatory effects of Antrodia camphorata, a herbal medicine, in a mouse skin ischemia model. // J. Ethnopharmacol. Ireland, 2015. Vol. 159. P. 113-121.

80. Elder, D.E. Atlas and synopsis of lever's histopathology of the skin / R. Elenitsas, A.I. Rubin, M. Ioffreda, J. Miller, O.F. Miller. - Lippincott Williams & Wilkins, 2013.

81. Rah D.K. et al. Effect of Platelet-Rich Plasma on Ischemia-Reperfusion Injury in a Skin Flap Mouse Model. // Int. J. Med. Sci. 2017. Vol. 14, № 9. P. 829-839.

82. Moor A.N. et al. Consequences of age on ischemic wound healing in rats: altered antioxidant activity and delayed wound closure. // Age (Dordr). 2014. Vol. 36, № 2. P. 733-748.

83. Brenner D.A. et al. Prolonged activation of jun and collagenase genes by tumour necrosis factor-alpha. // Nature. England, 1989. Vol. 337, № 6208. P. 661-663.

84. Dayer J.M., Beutler B., Cerami A.A. Cachectin/tumor necrosis factor stimulates collagenase and prostaglandin E2 production by human synovial cells and dermal fibroblasts // J. Exp. Med. 1985. Vol. 162, № 6. P. 2163-2168.

85. Salomon G.D. et al. The local effects of cachectin/tumor necrosis factor on wound healing. // Ann. Surg. 1991. Vol. 214, № 2. P. 175-180.

86. Wang X. et al. Principles and mechanisms of regeneration in the mouse model for wound-induced hair follicle neogenesis. // Regen. (Oxford, England). 2015. Vol. 2, № 4. P. 169-181.

87. Tong X., Coulombe P.A. Keratin 17 modulates hair follicle cycling in a TNFa-dependent fashion // Genes Dev. 2006. Vol. 20, № 10. P. 1353-1364.

88. Zhao J. et al. Foxp1 regulates the proliferation of hair follicle stem cells in response to oxidative stress during hair cycling // PLoS One. 2015. Vol. 10, № 7. P. 115.

89. Godwin A. et al. Receptor-Interacting Protein Kinase 3 Deficiency Delays Cutaneous Wound Healing. // PLoS One. 2015. Vol. 10, № 10. P. e0140514.

90. Chandrakesan P. et al. Dclk1, a tumor stem cell marker, regulates pro-survival signaling and self-renewal of intestinal tumor cells // Mol. Cancer. Molecular Cancer, 2017. Vol. 16, № 1. P. 1-14.

91. Lindley L.E. et al. Biology and Biomarkers for Wound Healing. // Plast. Reconstr. Surg. 2016. Vol. 138, № 3 Suppl. P. 18S-28S.

92. Lichtman M.K., Otero-Vinas M., Falanga V. Transforming growth factor beta (TGF-ß) isoforms in wound healing and fibrosis // Wound Repair Regen. 2016. Vol. 24, № 2. P. 215-222.

93. Imamura M. et al. RIPK3 promotes kidney fibrosis via AKT-dependent ATP citrate lyase // JCI insight. 2018. Vol. 3, № 3. P. 1-14.

94. Rahmani W. et al. Macrophages Promote Wound-Induced Hair Follicle

Regeneration in a CX3CR1- and TGF-P1-Dependent Manner // J. Invest. Dermatol. Society for Investigative Dermatology, 2018. Vol. 138, № 10. P. 2111-2122.

95. Kahata K., Dadras M.S., Moustakas A. TGF-P Family Signaling in Epithelial Differentiation and Epithelial-Mesenchymal Transition. // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2018. Vol. 10, № 1.

96. Nelson A.M. et al. dsRNA Released by Tissue Damage Activates TLR3 to Drive Skin Regeneration // Cell Stem Cell. Elsevier Inc., 2015. Vol. 17, № 2. P. 139151.

97. Morgun E.I., Vorotelyak E.A. Epidermal Stem Cells in Hair Follicle Cycling and Skin Regeneration: A View From the Perspective of Inflammation // Front. Cell Dev. Biol. 2020. Vol. 8. P. 1-32.

98. Моргун Е.И., Позднякова Е.Д., Воротеляк Е.А. Экспрессия протеинкиназ RIPK-1 и RIPK-3 в клетках волосяного фолликула мыши и человека // Доклады Российской академии наук. Науки о жизни. 2020. Т. 494, № 1. С. 252255.

99. Ansell D.M. et al. Exploring the hair growth-wound healing connection: Anagen phase promotes wound re-Epithelialization // J. Invest. Dermatol. Elsevier Masson SAS, 2011. Vol. 131, № 2. P. 518-528.

100. Yang C.-C., Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells. // J. Dermatol. Sci. 2010. Vol. 57, № 1. P. 2-11.

101. Krause K., Foitzik K. Biology of the Hair Follicle: The Basics // Semin. Cutan. Med. Surg. 2006. Vol. 25, № 1. P. 2-10.

102. Wu P. et al. The balance of Bmp6 and Wnt10b regulates the telogen-anagen transition of hair follicles // Cell Commun. Signal. Cell Communication and Signaling, 2019. Vol. 17, № 1. P. 1-10.

103. Shimizu H., Morgan B.A. Wnt Signaling through the P-Catenin Pathway Is

Sufficient to Maintain, but Not Restore, Anagen-Phase Characteristics of Dermal Papilla Cells // J. Invest. Dermatol. Elsevier Masson SAS, 2004. Vol. 122, № 2. P. 239-245.

104. Udeh A. et al. Wnt signaling induces neurite outgrowth in mouse retinal ganglion cells // Exp. Eye Res. Elsevier, 2019. Vol. 182, № November 2018. P. 39-43.

105. Tripurani S.K. et al. Suppression of Wnt/ß-catenin signaling by EGF receptor is required for hair follicle development // Mol. Biol. Cell. 2018. Vol. 29, № 22. P. 2784-2799.

106. Ekman A.K. et al. IL-17 and IL-22 Promote Keratinocyte Sternness in the Germinative Compartment in Psoriasis // J. Invest. Dermatol. 2019. Vol. 139, № 7. P. 1564-1573.e8.

107. Hoffmann R., Happle R., Paus R. Elements of the interleukin-1 signaling system show hair cycle-dependent gene expression in murine skin. // Eur. J. Dermatol. France, 1998. Vol. 8, № 7. P. 475-477.

108. Foitzik K. et al. Control of murine hair follicle regression (catagen) by TGF-ß1 in vivo // FASEB J. 2000. Vol. 14, № 5. P. 752-760.

109. Brenner D., Blaser H., Mak T.W. Regulation of tumour necrosis factor signalling: Live or let die // Nat. Rev. Immunol. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 15, № 6. P. 362-374.

110. Dajon M., Iribarren K., Cremer I. Toll-like receptor stimulation in cancer: A pro- and anti-tumor double-edged sword // Immunobiology. Elsevier GmbH., 2017. Vol. 222, № 1. P. 89-100.

111. Bchetnia M. et al. Severe epidermolysis bullosa simplex phenotype caused by codominant mutations p.Ile377Thr in keratin 14 and p.Gly138Glu in keratin 5 // Exp. Dermatol. 2020. Vol. 29, № 10. P. 961-969.

112. Blessing M., Schirmacher P., Kaiser S. Overexpression of bone morphogenetic protein-6 (BMP-6) in the epidermis of transgenic mice: inhibition or

stimulation of proliferation depending on the pattern of transgene expression and formation of psoriatic lesions // J. Cell Biol. 1996. Vol. 135, № 1. P. 227-239.

113. Celetti S.J. et al. Implications of pannexin 1 and pannexin 3 for keratinocyte differentiation // J. Cell Sci. 2010. Vol. 123, № 8. P. 1363-1372.

114. Chen C.C., Mo F.E., Lau L.F. The Angiogenic Factor Cyr61 Activates a Genetic Program for Wound Healing in Human Skin Fibroblasts // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 50. P. 47329-47337.

115. Cui W. et al. Concerted action of TGF-beta 1 and its type II receptor in control of epidermal homeostasis in transgenic mice. // Genes Dev. United States, 1995. Vol. 9, № 8. P. 945-955.

116. Du H. et al. CCN1 accelerates re-epithelialization by promoting keratinocyte migration and proliferation during cutaneous wound healing // Biochem. Biophys. Res. Commun. Elsevier Ltd, 2018. Vol. 505, № 4. P. 966-972.

117. Feng Y. et al. In vitro significance of SOCS-3 and SOCS-4 and potential mechanistic links to wound healing // Sci. Rep. Springer US, 2017. Vol. 7, № 1. P. 115.

118. Gat U. et al. De Novo hair follicle morphogenesis and hair tumors in mice expressing a truncated beta-catenin in skin. // Cell. United States, 1998. Vol. 95, № 5. P. 605-614.

119. Hamburg-Shields E. et al. Sustained P-catenin activity in dermal fibroblasts promotes fibrosis by up-regulating expression of extracellular matrix protein-coding genes. // J. Pathol. 2015. Vol. 235, № 5. P. 686-697.

120. Han G. et al. Temporal Smad7 transgene induction in mouse epidermis accelerates skin wound healing // Am. J. Pathol. 2011. Vol. 179, № 4. P. 1768-1779.

121. Hara M., Ma T., Verkman A.S. Selectively reduced glycerol in skin of aquaporin-3-deficient mice may account for impaired skin hydration, elasticity, and

barrier recovery // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 48. P. 46616-46621.

122. Hara-Chikuma M., Verkman A.S. Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing // J. Mol. Med. 2008. Vol. 86, № 2. P. 221-231.

123. Homberg M. et al. Distinct Impact of Two Keratin Mutations Causing Epidermolysis Bullosa Simplex on Keratinocyte Adhesion and Stiffness // J. Invest. Dermatol. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 135, № 10. P. 2437-2445.

124. Hosokawa R. et al. TGF-ß3 decreases type I collagen and scarring after labioplasty // J. Dent. Res. 2003. Vol. 82, № 7. P. 558-564.

125. Kim Y.H. et al. Overexpression of activin receptor-like kinase 1 in endothelial cells suppresses development of arteriovenous malformations in mouse models of hereditary hemorrhagic telangiectasia // Circ. Res. 2020. P. 1122-1137.

126. Hwang E.A., Lee H.B., Tark K.C. Comparison of bone morphogenetic protein receptors expression in the fetal and adult skin. // Yonsei Med. J. Korea (South), 2001. Vol. 42, № 6. P. 581-586.

127. Kaiser S. et al. Induction of bone morphogenetic protein-6 in skin wounds. Delayed reepitheliazation and scar formation in BMP-6 overexpressing transgenic mice // J. Invest. Dermatol. 1998. Vol. 111, № 6. P. 1145-1152.

128. Kohama K. et al. TGF-beta-3 promotes scarless repair of cleft lip in mouse fetuses // J. Dent. Res. 2002. Vol. 81, № 10. P. 688-694.

129. McDonnell M.A. et al. Antagonistic effects of TGF/ß1 and BMP-6 on skin keratinocyte differentiation // Exp. Cell Res. 2001. Vol. 263, № 2. P. 265-273.

130. Mi B. et al. Saliva exosomes-derived UBE2O mRNA promotes angiogenesis in cutaneous wounds by targeting SMAD6 // J. Nanobiotechnology. BioMed Central, 2020. Vol. 18, № 1. P. 1-14.

131. Mori T. et al. Role and interaction of connective tissue growth factor with

transforming growth factor-P in persistent fibrosis: A mouse fibrosis model // J. Cell. Physiol. 1999. Vol. 181, № 1. P. 153-159.

132. Muñoz-Félix J.M. et al. ALK1 heterozygosity increases extracellular matrix protein expression, proliferation and migration in fibroblasts // Biochim. Biophys. Acta -Mol. Cell Res. 2014. Vol. 1843, № 6. P. 1111-1122.

133. Osaka N. et al. ASK1-dependent recruitment and activation of macrophages induce hair growth in skin wounds // J. Cell Biol. 2007. Vol. 176, № 7. P. 903-909.

134. Pérez-Gómez E. et al. Impaired wound repair in adult endoglin heterozygous mice associated with lower NO bioavailability // J. Invest. Dermatol. 2014. Vol. 134, № 1. P. 247-255.

135. Quintanilla M. et al. Expression of the TGF-P coreceptor endoglin in epidermal keratinocytes and its dual role in multistage mouse skin carcinogenesis // Oncogene. 2003. Vol. 22, № 38. P. 5976-5985.

136. Schiavinato A. et al. Targeting of EMILIN-1 and EMILIN-2 to Fibrillin Microfibrils Facilitates their Incorporation into the Extracellular Matrix // J. Invest. Dermatol. The Authors, 2016. Vol. 136, № 6. P. 1150-1160.

137. Sougrat R. et al. Functional expression of AQP3 in human skin epidermis and reconstructed epidermis // J. Invest. Dermatol. 2002. Vol. 118, № 4. P. 678-685.

138. Stelnicki E.J. et al. Bone morphogenetic protein-2 induces scar formation and skin maturation in the second trimester fetus // Plastic and Reconstructive Surgery. 1998. Vol. 101, № 1. P. 12-19.

139. Sundaram G.M. et al. 'See-saw' expression of microrna-198 and fstl1 from a single transcript in wound healing // Nature. Nature Publishing Group, 2013. Vol. 495, № 7439. P. 103-106.

140. Torsney E. et al. Inducible expression of human endoglin during

inflammation and wound healing in vivo // Inflamm. Res. 2002. Vol. 51, № 9. P. 464470.

141. Waseem A. et al. Keratin 15 expression in stratified epithelia: Downregulation in activated keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1999. Vol. 112, № 3. P. 362-369.

142. Wojcik S.M., Bundman D.S., Roop D.R. Delayed Wound Healing in Keratin 6a Knockout Mice // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20, № 14. P. 5248-5255.

143. Yamawaki S. et al. Htra1 is specifically up-regulated in active keloid lesions and stimulates keloid development // Int. J. Mol. Sci. 2018. Vol. 19, № 5. P. 112.

144. Yan C. et al. Epithelial to mesenchymal transition in human skin wound healing is induced by tumor necrosis factor-a through bone morphogenic protein-2 // Am. J. Pathol. 2010. Vol. 176, № 5. P. 2247-2258.

145. Yu H. et al. Decreased expression of inhibitory SMAD6 and SMAD7 in keloid scarring // J. Plast. Reconstr. Aesthetic Surg. 2006. Vol. 59, № 3. P. 221-229.

146. Zheng Z. et al. Delayed wound closure in fibromodulin-deficient mice is associated with increased TGF-ß3 signaling. // J. Invest. Dermatol. 2011. Vol. 131, № 3. P. 769-778.

ПРИЛОЖЕНИЕ А

Таблица. Гены, принимающие участие в поддержании гомеостаза кожи и её придатков

Гены Кодируемый белок С какими «узлами» связаны Модель/Материал Экспериментальные данные Предполагаемое место (роль) в поддержании кожного гомеостаза

Acvrll Activin receptor-like kinase 1, ACVRL1, ALK1 TGF-P1, TGF-P3 1. Ранозаживление у мышей, нокаутных по Л1к1 (К2 6+/СгеЕ^ДЦ^} 21охР/21охР^ 1. У мышей, нокаутных по Álkl возникали артриовенозные мальформаци во время ранозаживления [Hwang Kim et al, 2020] Регуляция ангиогенеза и рубцевания во время ранозаживления

2. Культура Л1к1+/+ и Л1к1+/ мышиных эмбриональных фибробластов. 2. Álk1+/ мышиные эмбриональные фибробласты демонстрировали повышение экспрессии белков ВКМ (коллагена I типа, фибронектина и CTGF/CCN2), а также пролиферации и миграции фибробластов [Muñoz-Félix JM et al., 2014].

Emilinl Elastin microfibril interfacer 1 EMILIN-1 TGF-P1 Модель ранозаживления у мыши. Экспрессия EMILIN-1 во время ранозаживления была колокализована с фибриллином. Кроме фибриллина, EMILIN-1 коэкспрессировался с фибронектином [Schiavinato et al., 2016]. Компонент ВКМ

Fmod Fibromodulin TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3 Модель кожной раны 1у. ]тосГ- мышей У мышей, нокаутных по fmod наблюдали задержку в закрытии раны из-за снижения способности к Регуляция формирования грануляционной ткани и рубца во время

миграции дермальных клеток и формирования грануляционной ткани. Размер сформированного рубца у мутантных мышей был больше, чем у животных дикого типа [Zheng et al, 2011]. ранозаживления

Tgfb2 Transforming growth factor-beta 2 (TGF-ß2) TG F-ß1, TG F-ß3 Крысам на спины наносили по четыре полнослойных разреза. Один оставляли без манипуляций, во второй вводили PBS/0.1% БСА/4 mM HCl (носитель для изоформ TGF-ß); в третий и в четвертый вводили нейтрализующие антитела к соответствующим изоформам TGF- ß. Введение нейтрализующего антитела против TGF- pi вместе с нейтрализующим антителом против TGF-P2 приводило к уменьшению неоваскуляризации и отложения фибронектина и коллагенов III и I на ранних стадиях ранозаживления, улучшало архитектуру новообразованной дермы и, таким образом, уменьшало рубцевание. Введение антитела против TGF-P2 без антитела против TGF-pi не имело антирубцового эффекта. Инъекция антитела против TGF-pi без антитела против TGF-P2 приводила к незначительному уменьшению рубца [Shah et al, 1995]. Усиление прорубцового эффекта, вызываемого TGF-ß1.

Fstl1 Follistatin-related protein 1, FSTL1 TGF-ß1 Культура кератиноцитов N/TERT-1 кератиноцитов из нормальной человеческой кожи, который были иммортализированны при помощи каталитической Нокдаун по Fstl1 при помощи анти-Fstl1 siRNA ухудшал мигационную активность кератиноцитов [Sundaram et al., 2013]. Регуляция миграции кератиноцитов

субъединицы теломеразы.

Eng Endoglin TGF-ß1, TGF-ß2, TGF-ß3 1. Кожа человека. 1. Eng экспрессируется в базальных кератиноцитах ИФЭ и в клетках ВФ нормальной кожи человека [Quintanilla et al, 2003]. Регуляция пролиферации и миграции кератиноцитов. Компонент ангиогенеза во время ранозаживления.

2. Модель полнослойной раны у Eng+/- мышей. 2. У Eng+/- мышей наблюдали задержку ранозаживления по сравнению с мышами дикого типа. Кератиноциты, расположенные по краям раны у мутантных животных, демонстрировали задержку пролиферации, но при том были более миграционно активными, чем кератиноциты мышей дикого типа [Pérez-Gómez et al., 2014].

3. Ранозаживление у человека. 4. Eng экспрессировался во время ранозаживления в эндотелиальных клетках человека [Torsney et al., 2002].

Tgfb3 Transforming growth factor-beta 3 (TGF-ß3) TGF-ß1, TGF-ß2 1. Крысам на спины наносили по четыре полнослойных разреза. Один оставляли без манипуляций, во второй вводили PBS/0.1% БСА/4 mM HCl (носитель для изоформ TGF-ß); в третий и в четвертый вводили нейтрализующие 1. Экзогенное введение TGF-P3 приводило к уменьшению отложения фибронектина и коллагенов I и III на ранних стадиях ранозаживления, а также улучшению архитектуры неодермы, а также у уменьшению размера рубца [Shah et al., 1995]. Отрицательная регуляция рубцевания; участие в безрубцовом ранозаживлении и регенерации у плода

антитела

соответствующим изоформам TGF- р.

2. Мышиным эмбрионам. были проведены

операции по зашиванию расщелины губы

2. Мышата, которым были проведены операции, рождались без шрама. Было показано, что ТОБ-РЗ был апрегулирован после операции (КоЬаша).

3.1. Модель in vitro. Полнослойный разрез был нанесен на верхнюю губу неонатальным мышам. Животные были поделены на такие группы: контроль без операций, наложение стежков, наложение стежков с введением PB S, наложение стежков с введением TGF- Р3.

3.2. Модель in vitro: культивирование эксплантов

верхнечелюстных и носовых отростков под воздействием TGF- Р3.

3.1. В эксперименте in vivo показано уменьшение рубца под воздействием TGF-P3.

3.2. В эксперименте in vitro показано уменьшение аккумуляции коллагена I типа и экспрессии a-SMA, а также увеличение экспрессии и активности MMP9 под воздействием TGF-P3 [Hosokawa et al., 2003].

Tgfbl Transforming growth factor-beta 1

TGF-P2, TGF-P3

Крысам на спины наносили по четыре полнослойных разреза. Один оставляли без манипуляций, во второй вводили PBS/0.1%

Б С А/4 mM НС1 (носитель для изоформ TGF-P); в третий и в четвертый вводили нейтрализующие антитела к

соответствующим изоформам TGF- р. Модель ранозаживления у СХЗСК1ф/ф:ССК2ф/ф мышей,

характеризующихся дефектами рано-

индуцированного анагена.

Модель in vivo: KIO-Tgf-blact трансгенные мыши, экспрессирующие Tgfbl в супрабазальном слое эпидермиса.

Эпидермальная гиперплазия была

индуцирована путем апликации TP А (12-tetradecanoyl-phorbol-13 -acetate).

Введение нейтрализующего антитела против TGF- pi вместе с нейтрализующим антителом против TGF-P2 приводило к уменьшению неоваскуляризации и отложения фибронектина и коллагенов III и I на ранних стадиях ранозаживления, улучшало архитектуру

новообразованной дермы и, таким образом, уменьшало рубцевание. Введение антитела против TGF-P2 без антитела против TGF-pi не имело антирубцового эффекта. Инъекция антитела против TGF-pi без антитела против TGF-P2 приводила к незначительному уменьшению рубца [Shah et al, 1995].

Экзогенное введение TGF-pi СХЗСЯ1ф/ф:ССЯ2ф/ф мышам

стимулировало рано-индуцированный анаген у этих животных [Rahmani et al., 2018].

У трансгенных мышей эпидермальный пролиферативный ответ на ТРА был меньше, чем у животных дикого типа [Cui et al., 1995].

Участие в рубцевании и рано-индуцированном анагене; регуляция эпидермальной пролиферации.

Ctgf Connective tissue growth factor, CTGF TGF-P2 Новорожденным мышам вводили TGF-pi и CTGF. Введение CTGF в синергизме с TGF-P1 вызывало разрастание фибротической ткани, что выражалось в агрегации фибробластов и депозиции ВКМ [Mori et al., 1999]. Регуляция рубцевания

Tnfrsfla Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A (TNFRSF1A) TGF-P3 Lrig Lgr5 Lgr6 Модель ранозаживления у мышей с нокдауном Tnfrl в Lgr5+ клетках. Модель ранозаживления у Tnfr-/- мышей. У мышей с нокдауном Tnfrl в Lgr5+ клетках наблюдали нарушение рано-индуцированного анагена, а у Tnfr-/-мышей наблюдали нарушения процессов рано-индцированного анагена и рано-индуцированного неогенеза волоса [Wang et al., 2017]. Участие в регенерации ВФ путем рано-индуцированного неогенеза волос и рано-индуцированного анагена в мышиной модели.

Htral Serine protease HTRA1 TGF-P2 Культура нормальных и келоидных человеческих фибробластов, трансфицированных с помощью siRNA против HtrAl. Нокдаун HtrAl ингибировал пролиферацию келоидных фибробластов. Этот же эффект имел место быть и у нормальных фибробластов, но не был столь выраженным [Yamawaki et al., 2018]. Регуляция рубцевания

Cyr61 Cysteine-rich angiogenic inducer 61 (CYR61) or CCN family member 1 (CCN1) TGF-P3 1.1. Модель in vitro: культуру человеческих кератиноцитов экспонировали к CCN1. 1.2. Модель in vivo: полнослойную мышиные модели (1) полнослойной кожной раны и (2) ожога второй степени экспонировали к раствору CCN1. Экспозиция к CCN стимулировала пролиферацию и миграцию кератиноцитов в эксперименте in vitro и вызывала депозицию коллагена и ремоделиование дермы в модели полнослойной раны. Кроме того, экспозиция к CCN вызывала повышение пролиферационной активности кератиноцитов и реэпителизации в модели ожога [Du et al., 2018]. Участие в реэпителизации, ангиогенезе, воспалительном процессе и ремоделировании ВКМ во время ранозаживления.

2.1. Модель in vitro: культура человеческих фибробластов линии 1064SK, которые экспониовали к Cyr61. 2.2. Мышиная модель регенерации кожной раны. 2.1. В эксперименте in vitro было показано, что экспозиция фибробластов к CCN1 стимулировала экспрессию VEGF-A, VEGF-C, IL-1b, MMP1, MMP3 и TIMP1 и даунрегулировала экспрессию COL1A1 and COL1A2. 2.2. В модели ранозаживления CCN1 экспрессировался в дермальных фибробластах ВКМ на стадии ремоделирования [Chen et al., 2001].

Panx1 Pannexin 1, PANX Lrigl Lgr6 Культура крысиных эпидермальных кератиноцитов, оверэкспрессирующих Panx1-GFP В культуре крысиных эпидермальных кератиноцитов, оверэкспрессирующих Panx1-GFP, наблюдалось снижение пролиферации и нарушение их дифференциации [Celetti et al., 2010]. Участие в регуляции пролиферации и дифференциации кератиноцитов.

Aqp3 Aquaporin 3 Krt15 1. Эпидермис человека 1. Aqp экспрессировался в базальном слое эпидермиса человека [Sougrat et al., 2002]. Гидратация эпидермиса; участие в реэпителизации за счет повышения пролиферации и миграции

2.1. Инъекции aqp-нокаутным мышам 3H2O. 2.2 Модель ранозаживления у aqp-нокаутных мышей. 2.3 Соскоб липкой лентой рогового слоя эпидермиса aqp-нокаутным мышам. 2. У нокаутных мышей по Aqp3 наблюдается ухудшение гидратации эпидермиса, а также его эластических, барьерных и регенеративных свойств [Hara et al., 2002]. кератиноцитов.

3.1. Модель in vivo. Ранозаживление у Aqp-нокаутных мышей. 3.2. Модель in vitro. Культура человеческих кератиноцитов, трансфицированная при помощи siRNA против AQP3. 3.1. В АдаЗ-дефицитные мыши демонстрировали задрержку ранозаживления. 3.2. Кератиноциты с нокдауном AQP3 демонстрировали ухудшение пролиферативных и миграционных свойств, а также снижение проницаемости мембраны для воды и глицерола [Hara-Chicuma and Verkman, 2007].

Krt14 Keratin 14 Krt15 1. Кожа человека. 1. Экспрессия кератина 14 была обнаружена в базальном слое эпидермиса [Waseem et al., 1999]. Компонент десмосом.

2. Культура KtyI-2-K14R131P кератиноцитов мыши, которые не экспрессируют кератин I типа и имеют мутацию кератина 14. 2. У клеток, имеющих мутацию цитокератина K14R131P, были обнаружены дефектные десмосомы [Homberg et al., 2015].

Krt6a Keratin 6A Krt15 Модели ранозаживлени1я. полнослойной раны и соскоба липкой лентой рогового слоя эпидермиса у Krt6a-/-мышей. У Krt6a-/- мышей происходила задержка пролиферации и миграции кератиноцитов ВФ во время ранозаживления [Wojcik et al., 2000]. Регуляция пролиферации и миграции кератиноцитов ВФ.

Krt5 Keratin5 Krt15 Человеческий материал с мутацией p.Glu477Lys в гене кератина 5. У людей с мутациями кератина 5 развиваются симптомы буллезного эпидермолиза [Bchetnia et al., 2020]. Участвует в обеспечении эпидермально-дермальной целостности.

Smad7 SMAD7 Bmpria 1. Культура фибробластов, выделенных из келоидов, нормальных рубцов, а также нормальной кожи человека. Экспрессия мРНК SMAD7 существенно ниже в фибробластах келоидов, чем в фибробластах нормальной кожи. Экспрессия мРНК SMAD7 была даунрегулирована в фибробластах нормального рубца и апрегулирована в фибробластах нормальной кожи при экспозиции к TGF-P1. Экспрессия белка SMAD7 была апегулирована в нормальной коже и в фибробластах рубца под воздействием TGF-P1. Кроме того, экспрессия былка SMAD7 была обнаружена в малом количестве в келоидных фибробластах [Yu et al., 2006]. Регуляция рубцевания, реэпителизации, воспаления и ангиогенеза.

2.1. Эксперимент in vivo: модель полнослойной раны у трансгенных мышей, эпидермальные клетки которых оверэкспрессировали Smad7 (Smad7 tg мыши), а также у животных дикого типа. 2.2. Эксперимент in vitro: культуры нормальных и Smad7 tg кератиноцитов. 2.1. В эксперименте in vivo было показано, раны Smad7 tg мышей заживали быстрее, чем у животных дикого типа. Оверэкспрессия Smad7 способствовала пролиферации кератиноцитов, приводила к снижению уровня экспрессии воспалительных цитокинов, уменьшению количества лейкоцитов и уменьшению синтеза коллагена. Кроме того, у этих мышей наблюдали уменьшение ангиогенеза на поздних стадиях ранозаживления. 2.2. Оверэкспрессия Smad7 приводила к повышению способности к миграции у кератиноцитов в эксперименте in vitro [Han et al., 2011].

Ctnnbl P-catenin Bmprla Модель ранозаживления у мышей с различными генетическими мутациями (-Сге:Р1еП1ох/*0х, Ь%г5-Сге :РХеП1о^/1ох: Ъ-сагетпР0^0*). Активация AKT/p-catenin способствовала рано-индуцированному неогенезу волос [Wang et al., 2017]. Регуляция регенерации ВФ, а также рубцевания во время ранозаживления.

.Мыши, овеэкспрессирующие т.н. стабилизированный (т.е. неспособный к деградации) (в-саХетп в эпидермисе. Оверэкспрессия в-catenin в клетках эпидермиса индуцировала морфогенез волосяных фолликулов de novo в мышиной коже [Gat et al., 1998].

Мыши, экспрессирующие в фибробластах стабилизированный Р-са1ешп. У трансгенных мышей наблюдали фиброз кожи, который выражался в утолщении коллагеновых волокон и изменении морфологии коллагеновых фибрилл [Hamburg-Shields et al., 2015].

Bmp6 Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) Bmprla 1. Культура кератиноцитов мыши. 1. Экспозиция культуры кератиноцитов мыши к Bmp6 способствовала экспрессии маркеров дифференциации [McDonnell et al., 2001]. Регуляция пролиферации и дифференциации кератиноцитов; участие в реэпителизации раны.

2. Модель ранозаживления у трансгенных мышей, оверэкспрессирующих Втрб в супрабазальных слоях эпидермиса. 2. Трансгенные мыши демонстрировали задержку в реэпителизации [Kaiser et al., 1998].

3. Трансгенные мыши, оверэкспрессирующие Втрб в супрабазальных слоях ИФЭ. 3. Эмбрионы трансгенных мышей демонстрировали зарержку пролиферации эпидермальных клеток. У взрослых животных была показана гиперфпролиферация кератиноцитов, а также нарушение их дифференциации [Blessing et al., 1996].

Bmp2 Bone morphogenetic protein 2 (BMP2) Bmpr1a 1. Культура эксплантов человеческой кожи и культура кератиноцитов человека. 1. Экспозиция эксплантов кожи и культуры кератиноцитов человека к TNF-a приводила к экспрессии Vimentin, FSP1 и MMP, что свидетельствовало об эпителиально-мезенхимальном переходе. Более того, TNF-a-индуцированный эпителиально-мезенхиамльный переход был предотвращен антагонистами BMP 2/4 [Yan et al., 2010]. Опосредование ТОТ-а- индуцированного эпителиально- мезенхимального перехода во время ранозаживления, участие в формировании ВФ в эмбриогенезе.

2. Кожа человеческого плода. 2. Показана экспрессия BMP2 у человеческого плода во втором триместре беременности в клетках внутреннего корневого влагалища и балджа [Stelnicki et al., 1998].

Bmprlb Bone morphogenetic protein receptor type-1B Bmpr1a Кожа взрослог1о. человека Была обнаружена экспрессия BMPRIB в супрабазальных слоях интрфолликулярного и фолликулярного эпидермиса человека [Hwang et al., 2001]. Опосредование ВМР-сигналов в коже.

Smad6 SMAD6 Bmpr1a 1. Культура фибробластов, выделенных из нормальных и келоидных рубцов, а также нормальной кожи человека. 1. Экспрессия мРНК SMAD6 была значительно ниже в келоидных фибробластах, чем в фибробластах нормального рубца и нормальной кожи. Экспрессия мРНК SMAD6 после экспозиции к TGF-P1 была значительно даунрегулирована в фибробластах нормального рубца и апрегулирована в фибробластах нормальной кожи [Yu et al., 2006]. Регуляция рубцевания и ангиогенеза.

2. Культура ИиУЕС, трансфицированная при помощи в1КЫЛ против БМЛБб. 2. Нокдаун SMAD6 приводит к повышению пролиферационной и миграционной активности HUVEC, а также вызывает формирование трубоподобных структур этими клетками [Mi et al., 2020].

Il-lb IL-1P Lgr5 Lgr6 Bmpr1a Tgfb3 Lrig1 Krt15 Tgfb3 Tgfb2 Трансплантация ГЬ-1Р-стимулированных макрофагов костного мозга в кожу спины мышей. Трансплантация макрофагов костного мозга, стимулированных IL-1Р, вызывала рост волос у мышей [Osaka et al., 2007]. Участие в рано-индуцированном анагене.

Socs-4 SOCS-4 Lgr6 Культуры клеток НаСаТ и НЕСУ, трансфицированных рибозимом 80С8-4. Нокдаун SOCS-4 уменьшает миграцию HaCaT и способность HECV к формированию трубкоподобных структур [Feng et al., 2017]. Участие в реэпителизации и ангиогенезе.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю огромную благодарность моему научному руководителю

Екатерине Андреевне Воротеляк за помощь и консультирование в планировании экспериментов и написании статей, ценные идеи и огромный вклад в формирование научного мышления. Также я очень благодарна за обсуждения результатов экспериментов и научных статей. Я крайне признательна за предоставленные возможности участвовать во всероссийских и международных конференциях, где я почерпнула знания, которые помогли мне при работе над диссертацией. Кроме того, я очень благодарна Екатерине Андреевне за жизненные советы, доброе и теплое отношение ко мне, общение на научные и неформальные темы, а также большую роль в моем саморазвитии.

Также я хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории клеточной биологии за неоценимую помощь с проведением экспериментов, советы, возможность обсудить интересующие меня научные вопросы, моральную поддержку и дружественную обстановку в коллективе. Особую благодарность хочу выразить Ольге Сергеевне Роговой за обучение методам культивирования клеток и помощь с получением биологических эквивалентов кожи для трансплантации в рану. Кроме того, я благодарна Ольге Сергеевне за введение меня в курс дела, помощь в адаптации на первых этапах моей работы в коллективе, а также научные и жизненные советы. Я очень признательна Михаилу Борисову за обучение и помощь с постановкой ОТ-ПЦР-РВ и интерпретацией результатов, а также за искреннее желание помочь. Кроме того, я хочу поблагодарить Любовь Измайлову за оказанную мне помощь в подборе праймеров, подготовке животных к операциям, приятное времяпровождение, моральную поддержку

и дружбу. Также за помощь в подборе праймеров я крайне благодарна Анне Гайдамака.

Большое спасибо сотрудникам лаборатории проблем регенерации. Я очень признательна Кириллу Сухиничу за неоценимую помощь в проведении иммуногистохимических исследований и статистической обработке результатов, многочисленные консультации, проявленное искреннее участие, а также интереснейшее общение на научные и жизненные темы. Кроме того, я крайне благодарна Марии Анатольевне Александровой за внимательную и ёмкую рецензию, позволившую существенно улучшить качество диссертационной работы.

Я благодарна сотрудникам Сколковского института науки и технологий Дмитрию Александровичу Горину, Ольге Гусляковой и Марине Новоселовой за проведение РСОМ.

Наконец, я выражаю благодарность супругу, родителям и друзьям за веру в мои силы, неоценимую поддержку, советы, помощь, оптимизм и жизнеутверждающий настрой даже в те моменты, которые казались безнадежными.