Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность фотопродуктов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Козырь, Людмила Анатольевна

• Козырь, Людмила Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козырь, Людмила Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Обзор литературы

1.1. Спектральные свойства мероцианина

1.1.1. Влияние полярности растворителя

1.1.2. Влияние рН растворителя

1.1.3. Влияние катионов

1.1.4. Влияние микроокружения 13 12. Типы фотохимических реакций фотосенсибилизаторов

1.3. Фотохимические реакции мероцианина

1.3.1 .Биологическая активность фотопродуктов мероцианина'

1.4. Современные представления о механизмах развития реакций 31 замедленного типа (ГЗТ и КЧ)

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Спектральные и фотохимические свойства МЦ

3.1.1. Зависимость спектров поглощения и возбуждения 50 флуоресценции МЦ540 от растворителя

3.1.2. Фотолиз МЦ540 в водных и этанольных растворах

3.2. Действие МЦ540 и его фотопродуктов на эритроциты и 66 метгемоглобин

3.2.1. Гемолиз, индуцированный необлученным и фотоокисленным 66 МЦ

3.2.2. Превращения метгемоглобина, индуцированные 71 предоблученным МЦ

3.3. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на реакции 74 гиперчувствительности замедленного типа у мышей

• 3.3.1 Модуляция фотопродуктами МЦ540 реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана

3.3.2. Супрессорное действие продуктов фотодеградации МЦ540 на 78 реакцию контактной чувствительности (КЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону у мышей

3.3.3. Выяснение иммунных механизмов супрессии реакции КЧ, обусловленной продуктами фотодеградации МЦ

Ослабление функций эффекторов КЧ

Активация клеток с супрессорным потенциалом

3.4. Супрессорное действие фотоокисленного псоралена (ФОП) на рёакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей

3.4.1. Изучение дозовых зависимостей ФОП на реакцию КЧ

3.4.2. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП на

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность фотопродуктов»

Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор - соединение, повышающее чувствительность биообъектов к свету. Это соединение успешно применяется в фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty T.J., 2002; Mopper С., 2000].

ФДТ - один из современных методов лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанный на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС) [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002; Collaud S., 2004; Beischer A.D. et al. 2002; Kirdaite G. et al., 2002; Ibbotson S.H. 2002]. Метод заключается в следующем: при однократном введении в организм человека ФС, его молекулы избирательно накапливаются в высокопролиферирующих тканях (например, опухолях) и повышают чувствительность этих тканей к световому излучению определенной длины полны (в области поглощения ФС). После введения ФС на ткани пациента, содержащие ФС, воздействуют светом, инициирующим фотобиологические процессы, которые приводят к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson B.C., 2002].

Предполагается, что фотодеградация опухолевых тканей при ФДТ может происходить по двум механизмам [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]:

- прямое повреждение опухолевых клеток, приводящее к индукции апоптоза или некроза;

- непрямое повреждение опухолевых клеток в результате разрушения сосудов опухоли (что приводит к ее некрозу), или активации иммунных механизмов.

Данные механизмы противоопухолевого действия ФДТ могут инициироваться в результате протекания фотохимических реакций ФС двух типов (тип I и II). В реакциях типа I происходит перенос электрона (или Н) между молекулами ФС в триплетном возбужденном состоянии и биосубстратом, в результате образуются радикалы ФС и/или субстрата. Свободные радикалы затем взаимодействуют с молекулярным кислородом, что приводит к необратимым повреждениям биосубстрата [Ochsner М., 1997; Foote C.S., 1991]. В реакциях типа

И происходит перенос энергии с триплетного ФС на молекулярный кислород с образованием электронно-возбужденного синглетного кислорода ('СЬ), который повреждает биологический субстрат [Ochsner М. 1997; Moan J. and Berg К., 1991].

В последние годы обсуждается другой, отличный от типов I и 11, фотохимический механизм, существенный для ФДТ. Этот механизм заключается в том, что повреждение (модификацию) биосубстрата вызывают относительно стабильные фотопродукты ФС, а не '02 или свободные радикалы. Фотопродукты ФС образуются в результате автофотоокисления самих молекул ФС по следующей схеме:

ФС—+ 02->фопюпродуктыФС , где ФС и 3ФС* - молекулы фотосенсибилизатора в основном и возбужденном триплетном состояниях, соответственно.

Данные литературы о механизме реакций автофотоокисления МЦ540 в растворах противоречивы и требуют дополнительных исследований.

В литературе предполагается, что противоопухолевая активность ФДТ с использованием МЦ540 может быть следствием действия его фотопродуктов. Так, например, обнаружено, что продукты фотоокисления МЦ540, полученные путем облучения данного ФС, способны ингибировать пролиферацию, вызывать апоптоз и некроз различных типов опухолевых клеток в культурах in vitro. Показано также, что введение фотопродуктов МЦ540 мышам с привитыми опухолями, приводит к замедлению роста и деградации опухолей [Gulliya K.S. et al., 1990; Pervaiz S. et al., 1998; Pervaiz S., 2001]. Присутствуют данные о способности фотопродуктов инактивировать in vitro различные типы вирусов [Tran С.С. et al., 1992]. До сих пор остается неясным, могут ли перечисленные биологические эффекты фотопродуктов МЦ540 быть следствием повреждения мембран клеток. В этой связи изучение мембранотоксических свойств фотопродуктов МЦ540 является актуальным.

С другой стороны известно, что одним из механизмов противоопухолевой активности ФДТ, например с такими красителями, как порфирины и хлорины, может быть влияние ФДТ на иммунную систему [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]. Известно так же, что проведение ФДТ с упомянутыми красителями часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Simkin G.O. et al.

1997; Simkin G.O. et al., 2000, Musser D.A. and Oseroff A.R., 2001 J. В литературе отсутствуют данные о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов на иммунную систему также является актуальным.

Цель настоящей работы:

Изучить фотофизические и фотохимические свойства МЦ540 и оценить биологическую активность его фотопродуктов.

Задачи исследования:

1. Изучить методами спекгрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540.

2. Исследовать мембранотоксические свойства фотопродуктов МЦ540 (пМЦ540) на модели гемолиза.

3. Изучить действие пМЦ540 на Т-клегочный иммунный ответ in vivo в моделях реакций гиперчувствительности замедленного типа и контактной чувствительности у мышей и сравнить с эффектами фотоокисленного псоралена.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Козырь, Людмила Анатольевна

выводы

1. Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. Так в водпо-этанольных смесях скорость фотолиза возрастала с уменьшением содержания этанола. А в водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих отрицательно заряженную группу SO3" и таким образом способствующих агрегации. Эти данные указывают па ведущую роль в автофотоокислении МЦ540 реакций типа I.

2. Установлено, что МЦ540 обладает гемолитическим эффектом. Так скорость темнового гемолиза в присутствии 10 мкг/мл МЦ540 возрастала примерно в три раза по сравнению со спонтанным. Выявлено, что МЦ540 в темноте вызывал превращение меггемоглобина (Metí Ib) в другие формы. Фотопродукты МЦ540 обладали меньшей гемолитической активностью и способностью модифицирован, метгемоглобин, чем необлученный МЦ540.

3. Обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять па Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. При этом пМЦ540 вызывал: а) модуляцию ГЗТ к эритроцитам барана (ЭБ), а именно, при малых дозах облучения вызывалась активация ГЗТ, а при больших дозах - ее супрессия; б) зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к различным гаптенам [2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону].

4. Показано, что супрессия КЧ, вызванная фотоокисленным МЦ540, адоптивно переносится другим животным. В основе иммунного механизма супрессорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим суирессориым действием на КЧ.

5. Обнаружено, что фотоокисленный псорален (ФОП) при его пероральном введении мышам вызывает зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к ДНФБ. В отличие от пМЦ540 в основе иммунного механизма супрессорного действия ФОП на КЧ лежит активация клеток, специфически угнетающих КЧ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козырь, Людмила Анатольевна, 2005 год

1. Красновский А.А., мл. (2001) Синглетный кислород и механизм фотодинамического действия порфиринов в кн. Успехи химии порфиринов. Т. 3, гл. 11, с. 191-216, СПб.

2. Alcindor Т., Gorgun G., Miller K.B., Roberts T.F., Sprague K., Schenkein D.P., F.M. Foss (2001). Immunomodulatory effects of extracorporeal photochemotherapy in patients with extensive chronic graft-versus-host disease. Blood. 98, No.5, p. 1622-1625.

3. Banchereau J., Briere F., Caux C. Davoust J., Lebecque S., Liu Y.J. Pulendran В., Palucka K. (2000) Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. V. 18, p. 767-811.

4. Beischer A.D., Bhathal P., de Steiger R., Penn D., Stylli S. (2002) Synovial ablation in a rabbit rheumatoid arthritis model using photodynamic therapy.

5. A NZ J Surg. V. 72, No. 7, p. 517-22.

6. Bernik D. Tymczyszyn E. DaraioM.E. Negri R.M. (1999) Fluorescent dimmers of merocyanine-540 (MC540) in the gel phase of phosphatidylcholine liposomes. J Photochem Pholobiol V.70, No. 1, p.40-48.

7. Bilski P., McDevitt T., Chignell C.F. (1999). Mcrocyanine 540 solubilized as an ion pair with cationic surfactant in nonpolar solvents: spectral and photochemical properties. J Photochem Photobiol. V.69, No6, p.671-676.

8. Black C.A. (1999) Delayed type hypersensitivity: current theories with an historic perspective. Dermatol. Online J. 5, No.l, p. 7.

9. Bonnett R., McGarvey D.J., Harriman A., Land E.J., Truscott TG, Winfield U.J. (1988). Photophysical properties of meso-tetraphenylporphyrin and some meso-tetra(hydroxyphenyl)porphyrins. J. Photochem Photobiol. V.48, No3, p.271-276.

10. Bouloc A., Cavani A., Katz S.I. (1998) Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. J. Invest. Dermato I. V.III. No.l, p. 44-49.

11. Byeon S.W., Pelley R.P., Ullrich S.E., Waller T.A., Bucana C.D., Strickland F.M. (1998) Aloe barbadensis extracts reduce the production of interleukin-10 after exposure to ultraviolet radiation. J. Invest. Dermatol. V.l 10, No.5, p. 811-817.

12. Cella M., Sallusto 1\, Lanzavecchia A. (1997) Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr. Opin. Immunol. V.9, No.l, p. 1016.

13. Chanh T., Allan J., Pervaiz S., Matthews J., Gulliya K. (1992). Preacktivated MC540 inactivates H1V-1 and SIV-1: potential therapeutic and blood banking applications. J. of A.l.D.S. No.5 p. 188-195.

14. Clarke R.J., Schrimpf P., Schoneich M. (1992), Spectroscopic investigations of the potential-sensitive membrane probe RH421. Biochim Biophys Acta. V.l 112, No.l, p.142-52.

15. Collaud S., Juzeniene A., Moan J. Lange N. (2004). On the selectivity of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX formation.Curr Med Chem Anti-Canc Agents. V. 4, No. 3, p. 301-16. Review.

16. Dall'Acqua F., Vadaldi D. and S. Caffieri (1996) Principles of psoralen photocensitization. In: The Fundamental Bases of Phototherapy (Edited by H. Honigsmann, G. Jori and A.R. Young), OEMF spa, Milano, p. 1-16.

17. Dall'Acqua F., Martelli P. (1991) Photosensitizing action of furocoumarins on membrane components and consequent intracellular events. J.

18. Photochem. Photobiol. B. V.8, No.3, p. 235-254.

19. Davila J., Guliya K., Harriman A. (1989) Inactivation of tumors and viruses via efficient photoisomerisation. J. Chem.Soc Chem Commun. No. 17, p. 1215-6.

20. Davila J., Harriman A., Gulliya K.S. (1991). Photochemistry of merocyanine 540: the mechanism of chemotherapeutic activity with cyanine dyes. J. Photochem Photobiol V.53,Nol,p.l-ll.

21. Dearman R.J., Kimber I. (2000). Role of CD4(+) T helper 2-type cells in cutaneous inflammatory responses induced by lluorescein isothiocyanate. Immunology V. 101, No. 4, p. 442-45 1.

22. Demidova T.N., Hamblin M.R. (2004). Macrophage-targeted photodynamic therapy. IntJ. Immunopathol Pharmacol. V. 17, No. 2, p. 117-26. Review.

23. Dougherty T.J. (2002). An update on photodynamic therapy applications. J. Clin Laser Med Surg. V. 20, No. 1, p. 3-7.

24. Edelson R.L. (1991). Photopheresis: present and future aspects. J. Photochem. Photobiol. B.V. 10, No. 1-2, p. 165-174.