Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и механизмы их иммуносупрессорного действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Пятницкий, Илья Алексеевич

• Пятницкий, Илья Алексеевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Пятницкий, Илья Алексеевич

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

12

1.1. Строение и фотофизические характеристики псораленов

1.2. Фотохимические реакции фурокумаринов

1.3. Мембранотоксические эффекты продуктов фотоокисления 15 псоралена

1.4. Общие положения теории PCP

1.5. Закон Бунзена-Роско

1.6. Современные представления о механизмах развития реакции 24 контактной чувствительности

1.7. Иммунологические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза

1.8. Методы регистрации апоптоза

1.9. Иммунологические эффекты продуктов фотоокисления псоралена

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы

2.2. Приготовление раствора фотосенсибилизатора и его облучение

2.3. Изучение агрегатного состояния и фотолиза псоралена 45 оптическими методами

2.4. Приготовление суспензии эритроцитов и постановка ФОП- 46 гемолиза

2.5. Лабораторные животные, постановка реакции КЧ

2.6. Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок, оценка 49 абсолютного числа клеток и пролиферации лимфоцитов в лимфатических узлах

2.7. Оценка уровня секреторных цитокинов

2.8. Оценка апоптоза in vivo: подготовка суспензий клеток и 51 цитометрический анализ

2.9. Оценка апоптоза in vitro

2.10. Иммуномагнитная сепарация

2.11. Статистическая обработка результатов 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 .АГРЕГАЦИЯ ПРОДУКТОВ ФОТООКИСЛЕНИЯ ПСОРАЛЕНА 56 3.1.1 Фотоиндуцированная агрегация псоралена, спектры PCP

3.1.2. Измерение спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции 58 продуктов фотоокисления псоралена

3.1.3. Влияние тушения флуоресценции на PCP фотопродуктов 60 псоралена

3.1.4. Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во 63 времени

3.1.5. Измерение сигналов PCP при разведении ФОП

3.1.6. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от дозы 69 УФА-облучения

3.1.7. Зависимость фотоиндуцированной агрегации псоралена от 72 интенсивности УФА-излучения и концентрации псоралена во время облучения

3.1.8. Исследование спектров PCP и гемолитической активности ФОП 75 при облучении псоралена в бескислородной среде и в присутствии кислорода

3.1.9. Проверка выполнимости закона Бунзена-Роско при 82 фотоиндуцированной агрегации псоралена и при образовании ФОП-гемолизинов

3.1.10. Влияние интенсивности УФА-излучения на образование ФОП- 85 гемолизинов

3.2. ИЗУЧЕНИЕ ИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ОГРАНИЧЕНИЯ РЕАКЦИИ КЧ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФОП

3.2.1. Супрессорное действие ФОП на разные фазы развития реакции

3.2.2. Действие ФОП на афферентную стадию реакции КЧ в 90 зависимости от способа его введения

3.2.3. Влияние ФОП на динамику накопления клеток в лимфоузлах и 92 селезенках ДНФБ-сенсибилизированных мышей

3.2.4. Измерение пролиферативной активности клеток лимфоузлов 95 под действие ФОП in vivo

3.2.5. Изменение цитокинового профиля клеток лимфоузлов под 97 действием ФОП in vivo

3.2.6. Индукция апоптоза клеток ЛУ продуктами фотоокисления 100 псоралена in vivo и in vitro

3.2.7. Выполнимость закона Бунзена-Роско для проапоптотического 109 действия ФОП на клетки лимфоузлов интактных мышей

3.2.8. Образование агрегатов продуктов ФОП при дозах, вызывающих 112 апоптоз клеток лимфоузлов мышей

3.2.9. Выявление субпопуляции Т-лимфоцитов, ответственной за 115 развитие реакции КЧ к ДНФБ

3.2.10. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП при 118 его внутривенном введении мышам

3.2.11. Выявление популяции клеток, ответственных за супрессорное 123 действие продуктов фотоокисления псоралена

КЧ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

129

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

132

133

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБ антибиотик

АГ антиген

АКД аллергический контактный дерматит

АПК антигенпрезентирующая клетка

ГЗТ гиперчувствительность замедленного типа

ДНФБ 2,4-динитрофторбензол

ИЛ интерлейкин

ИФН-у интерферон-у

кч контактная чувствительность

КЛ клетки Лангерганса

8-МОП 8-метоксипсорален

Пс Псорален

ПУВА (ПУФА) псорален + УФ-А

PCP резонансное светорассеяние

РТПХ реакция трансплантат против хозяина

ТФР-Р Трансформирующий фактор роста (3

УФ-А ультрафиолет области А (320-400 нм)

ФБР фосфатный буферный раствор

ФИТЦ флуоресцеин изотиоцианат

ФК Фурокумарины

ФНО-а фактор некроза опухоли-а

ФОП фотоокисленный псорален

ЭКФ экстракорпоральный фотоферез

An-V Аннексин-У

PI йодистый пропидий

ICAM межклеточные молекулы адгезии

*

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и механизмы их иммуносупрессорного действия»

Введение

Псоралены - вещества растительного или синтетического происхождения, которые используют для фотохимиотерапии дерматозов. Существует, по крайней мере, два основных метода терапии с использованием псораленов и УФ-А облучения светом в УФА-диапазоне области спектра (320-400 нм): ПУВА-терапия (псорален+УФА) и фотоферез. При ПУВА-терапии УФА облучают кожу пациента предварительно получившего препарат псораленов. При фотоферезе облучению в присутствии псораленов подвергается лейкоцитарная фракция крови пациентов. Наряду с терапевтическим действием ПУВА вызывает побочные токсические эффекты, такие как гиперпигментация и эритема. Тем не менее, оба метода давно успешно используются в клинической практике для лечения патологий, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета, например, витилиго, псориаза, аллергического контактного дерматита и др [81 ].

При УФА облучении тканей пациентов в присутствии псораленов (ПУВА-воздействие) происходит фотолиз фотосенсибилизатора с образованием продуктов его фотоокисления (ФОП). В нашей лаборатории ранее было выявлено, что существуют стабильные продукты ФОП, которые, при введении их в биологические объекты, инициируют фотобиологические эффекты сходные с таковыми при ПУВА-воздействии [66]. А именно, ФОП обладал как мембранотоксическим, так и иммуномодулирующим действием. Эти данные указывали на то, что продукты ФОП могут вносить вклад как в терапевтические, так и побочные токсические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза.

Мембранотоксические эффекты ПУВА-воздействия чаще всего изучались на модели гемолиза эритроцитов [5]. Показано, что облучение эритроцитов в присутствии псоралена приводит к индукции гемолиза (ПУФА-гемолизу), механизм которого сильно зависел от интенсивности

используемого УФА-излучения. При низкой интенсивности ПУФА-гемолиз имеет все черты, присущие коллоидно-осмотическому гемолизу, тогда как при высокой интенсивности механизм становится иным. Было высказано предположение, что основной вклад в развитие высокоинтенсивного ПУФА-гемолиза вносят ФОП-продукты фотоокисления псоралена [46]. Так появилось новое направление исследований, ориентированное на изучение механизма гемолиза, индуцируемого стабильными продуктами фотоокисления псоралена (ФОП-гемолиза).

Черты ФОП-гемолиза имеют много общего с чертами высокоинтенсивного ПУФА-гемолиза, поэтому было высказано предположение о сходности их механизмов. Интенсивные исследования в этой области привели к описанию ряда физико-химических закономерностей, присущих развитию ФОП-гемолиза, но механизм этих процессов оставался во многом неясным. Предполагалось, что мембранотоксическое действие ФОП может быть опосредовано тем, что при облучении раствора псоралена в нем образуются фотоиндуцированные агрегаты его фотопродуктов, которые и вызывают повреждение мембраны эритроцитов. Этот механизм гемолиза был назван механохимическим. Однако, прямых методов, позволяющих обнаружить такие агрегаты, ранее не существовало. В настоящее время появился метод резонансного светорассеяния (PCP), позволяющий с высокой чувствительностью выявлять агрегаты красителей. Таким образом, одна из задач настоящей работы заключалась в том, что привлекая метод PCP, ответить на вопрос - образуются ли фотоиндуцированные агрегаты псоралена и играют ли они какую-либо роль в мембранотоксическом действии ФОП.

Предполагается, что терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии основано на индукции специфической иммуносупрессии. Эти данные были получены преимущественно в моделях Т-клеточного иммунного ответа in vivo (реакции гиперчувствительности замедленного типа и контактной гиперчувствительности) [71]. В нашей лаборатории в моделях

реакций КЧ и ГЗТ впервые было продемонстрировано, что ФОП модулирует (активирует/супрессирует) Т-клеточный иммунный ответ in vivo [44]. Это указывало на то, что ФОП-продукты могут вносить вклад в терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии [46]. Предварительные данные показывают, что ФОП-продукты эффективны при лечении атопической экземы и псориаза [2]. На сегодня иммунные механизмы супрессорного, и, как следствие, терапевтического действия ФОП остаются не ясными. В этой связи изучение влияния ФОП-продуктов на различные этапы развития Т-клеточного иммунного ответа является актуальным и может позволить приблизиться к пониманию иммуносупрессорного действия ФОП и тем самым дать предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии - ФОП-терапии. Очевидным преимуществом ФОП перед ПУВА-терапией или фотоферезом может быть тот факт, что ФОП-терапия не требует облучения тканей пациента, что позволит избежать негативных побочных эффектов воздействия УФА-света.

Цель настоящей работы:

Изучить агрегацию продуктов фотоокисления псоралена и иммунологические механизмы их супрессорного действия.

Задачи исследования:

1. Исследовать возможность обнаружения агрегации фотопродуктов псоралена методом резонансного светорассеяния, исследовать ее кинетику при разных концентрациях и интенсивностях облучения.

2. Оценить образование фотоиндуцированных агрегатов в растворах псоралена, облученных в присутствии или в отсутствие кислорода, с параллельным тестированием их гемолитической активности.

3. Исследовать динамику накопления в лимфоузлах животных ДНФБ-специфических лимфоцитов, их цитокиновый профиль и пролиферативную активность при действии ФОП in vivo.

4. Оценить проапоптотическую активность ФОП in vivo и in vitro, сопоставить дозовые зависимости для ФОП-индуцированного апоптоза in vitro и ФОП-агрегации.

5. В опытах по адоптивному переносу выявить клеточные популяции, ответственные за иммуносупрессорное действие ФОП в реакции КЧ.

Научная новизна.

В данной работе впервые показано, что облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления. Кроме того, продемонстрировано, что величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена. Впервые установлены схожие закономерности между степенью агрегации ФОП и его гемолитической активностью. Указанные данные позволили предположить, что мембранотоксические эффекты ФОП могут быть следствием действия его агрегатов. Впервые установлено, что иммуносупрессорное действие ФОП является следствием угнетения пролиферативной активности лимфоцитов in vivo и in vitro, которое реализуется путем модуляции цитокинового профиля последних. Методом проточной цитофлуориметрии исследована проапоптотическая активность ФОП-продуктов in vivo и in vitro. Впервые показано, что индуцируемый ФОП-продуктами апоптоз лимфоцитов не может играть ведущую роль в иммуносупрессорных эффектах ФОП.

Научно-практическая значимость исследования

Совокупность полученных результатов работы показывают, что продукты ФОП обладают иммунорегуляторными свойствами, и механизмы их иммуносупрессорного действия в некоторых чертах сходны с таковыми для традиционной псораленовой фотохимиотерапии (ПУВА-терапии и фотофереза). Выявленные механизмы иммуносупрессорного действия продуктов ФОП дают предпосылки для разработки нового способа

псораленовой фотохимиотерапии (ФОП-терапии) для лечения заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунной системы. Преимущество ФОП-терапии перед ПУВА-терапией/фотоферезом заключается в отсутствии необходимости УФА-воздействия на ткани пациента, что позволит исключить развитие различных побочных эффектов, например, эритемы или преждевременного старения кожи.

Положения, выносимые на защиту

1. Облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления; величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена.

2. Исследования агрегации продуктов фотоокисления псоралена методом PCP позволяют установить схожие закономерности между степенью агрегации ФОП-продуктов и их гемолитической активностью.

3. Иммуносупрессорное действие продуктов ФОП на реакцию КЧ обусловлено модуляцией цитокинового профиля АГ-специфических Т-лимфоцитов и угнетением их пролиферативной активности.

4. Проапоптотическая активность ФОП-продуктов, по-видимому, не играет ведущей роли в проявлении иммуносупрессорных свойств последних.

Апробация результатов

Материалы диссертационной работы были представлены на конгрессе Европейского общества дерматологических исследований в Будапеште, Венгрия (2009 г.) и Барселоне, Испания (2011 г.), Европейских фотобиологических конгрессах во Вроцлаве, Польша (2009 г.), Женеве, Швейцария (2011 г.), и Льеже, Бельгия (2013 г.), Съезде Российского фотобиологического общества в Шепси, РФ (2011 г.), 4-м Съезде биофизиков России в Нижнем Новгороде (2012 г.). Работа апробирована на совместном заседании кафедры физики и математики, кафедры фармакологии и кафедры

иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 23 сентября 2013 г.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и фотофизические характеристики псораленов

Псоралены (фурокумарины) - соединения растительного или синтетического происхождения. Они образуются в результате линейной (псорален, 8-метоксипсорален, 5-метоксипсорален и др.) или угловой (ангелицин) конденсации двух гетероциклов: фуранового кольца и кумарина [15]. На рисунке 1 представлены химические структуры некоторых фурокумаринов.

псорален 8-метоксипсорален

5 4

5-метоксипсорален

Рисунок 1. Химические структуры псораленов.

Фурокумарины (ФК), применяемые в медицине в качестве фотосенсибилизаторов, поглощают свет в УФА области спектра (315-400 нм). Их максимумы поглощения лежат около 290-330 нм, причем положения максимумов практически не зависят от полярности растворителя [15]. При поглощении квантов света молекулы псораленов переходят в электронно-возбужденное состояние. Из них большая часть дезактивируется безызлучательно, а другая часть молекул из электронно-возбужденного синглетного состояния вступает в фотохимические реакции, флуоресцирует

или переходит в триплетиое состояние в процессе интеркомбинационной конверсии [40].

Псоралены, как и другие фотосенсибилизаторы, вступают в фотоокислительные реакции из триплетного возбужденного состояния, время жизни в котором для них составляет 2-7 мкс [20], что значительно дольше, чем в синглетном состоянии (1-4 не) [61]. Особенность ФК, как органических молекул, состоит в том, что триплетное состояние не делокализовано по всей системе сопряженных двойных связей, а локализуется в области 3,4-двойной связи [75]. Следовательно, в фотоокисленных реакциях участвует, в основном, 3,4-двойная связь.

1.2. Фотохимические реакции фурокумаринов

Фотохимические реакции ФК, приводящие к модификациям биологических субстратов (биомолекул), разделяют на 4 типа (рис. 2).

ФК Ьу

Свободные радикалы (Тип I)

ФК*

Биомолекулы

Продукты фотоокисления Фотоаддукты ФК фурокумаринов с биомолекулами

(Тип II) (Тип IV) (Тип III)

Биомолекулы

г

Окисление биомолекул

Рисунок 2. Фотохимические реакции фурокумаринов (ФК).

Тип реакций III наиболее подробно описан в литературе [74]. Реакции этого типа не зависят от присутствия Ог и приводят к ковалентному фотоприсоединению ФК к белкам, нуклеиновым кислотам и липидам, в состав которых входят остатки ненасыщенных жирных кислот [83].

Показано, что ФК образуют циклобутановые аддукты между 3,4-двойной связью ФК и одной из двойных связей ненасыщенных жирных кислот. Эти аддукты приводят к повреждению антиоксидантой системы клетки, ингибированию активности фосфолипаз, препятствуют активации протеинкиназы С и других регуляторных ферментов клеток. Доказано, что аддукты ФК-ДНК обуславливают летальное и мутагенное действие ФК на бактерии, вирусы и опухолевые клетки [68].

Реакции типов I, II и IV являются фотодинамическими, т.е. происходят с участием кислорода. Субстратами для фотодинамических реакций могут служить белки, липиды и ДНК [5]. В реакциях типа I образуются свободные радикалы в результате переноса электрона (или водорода) между молекулами ФК в возбужденном состоянии и молекулами субстрата. Кислород, взаимодействуя с радикалами, делает эти реакции необратимыми. Показано, что окисление липидов и а-токоферола, индукция ПУВА-эритемы могут быть результатом реакций типа I [5].

В реакциях второго типа триплетный псорален реагирует с молекулярным кислородом. Такие реакции могут сопровождаться образованием супероксидного радикала. Чаще образуется синглетный кислород ('02) при переносе энергии с электронно-возбужденного триплетного состояния сенсибилизатора на молекулярный кислород. Но роль синглетного кислорода в индукции фотобиологических эффектов ФК не велика.

В реакциях IV типа с субстратом реагируют относительно стабильные фотооки с ленные молекулы ФК [11].

1.3. Мембранотоксические эффекты продуктов фотоокисления псоралена

ПУФА -гемолиз

В 1986 году, впервые, в нашей лаборатории было обнаружено, что псорален в сочетании с УФА способен вызывать деструкцию мембран. Указанный факт был продемонстрирован на модели гемолиза - последний является хорошей моделью для оценки мембранотоксических свойств химических соединений (например, лекарств). Для этого в разбавленную суспензию эритроцитов добавляли псорален, и проводили УФА-облучение полученной смеси (ПУФА-гемолиз). Обязательным условием для возникновения такого гемолиза являлась последующая термоактивация указанного раствора до температуры 37°С. При этом известно, что гемолитический эффект для других ФК не зависит от такой термоактивации.

Отсюда возникло предположение, что за гемолитический эффект псоралена ответственными являются не первичные продукты облучения псоралена, а образующиеся в ходе темнового термовоздействия вторичные продукты деградации исследуемого фурокумарина. Кроме того, было показано, что характер индуцированного псораленом гемолиза зависит от интенсивности УФА-излучения [65]. В соответствии с этим было выделено два вида ПУФА-гемолиза: высокоинтенсивный (ВИ) и низкоинтенсивный (НИ).

НИ ПУФА-гемолиз (интенсивность УФА-излучения ниже 80 Вт/м ) имеет черты коллоидно-осмотического гемолиза. Коллоидно-осмотический гемолиз сопровождается увеличением катионной проницаемости и увеличением объема клетки с последующим лизисом последней [63]. Примером такого вида повреждения эритроцитов является гемолиз под действием коротковолнового УФ-излучения (к < 320 нм) или более длинноволнового света в присутствие фотосенсибилизаторов [63]. Некоторые вещества, например, сахароза, при их добавлении в суспензионную среду, способны тормозить этот процесс: сахароза выравнивает осмотическое давление,

препятствуя развитию коллоидно-осмотического гемолиза [67]. Для фотогемолиза, протекающего по коллоидно-осмотическому механизму, характерным является тот факт, что после облучения лизису подвергаются все клетки суспензии, а кривая зависимости доли лизировавших клеток от времени постлучевой инкубации имеет сигмоидную форму.

Скоростью гемолиза принято называть отношение 1Д5о, где 150 - время, за которое лизировало 50 % клеток в суспензии. Было показано, что скорость НИ ПУФА гемолиза описывается уравнением: V = у0+ аЭх, где у0 - скорость в присутствии сенсибилизатора, но без облучения; а - коэффициент, зависящий от вида и концентрации сенсибилизатора, спектрального состава света и концентрации клеток; Э - доза облучения; х - безразмерный параметр, для НИ ПУФА равный приблизительно 2. На рисунке 3 представлена зависимость скорости гемолиза от дозы облучения.

*

Рисунок 3. Зависимость скорости ПУФА гемолиза от дозы облучения при низкой 4 интенсивности УФА-излучения (366 нм, 20,5 Вт/м2). Кривая построена по результатам

трех независимых экспериментов. Рисунок представлен согласно работе [3].

Таким образом, НИ ПУФА-гемолиз обладал следующими свойствами коллоидно-осмотического гемолиза:

• пороговая доза ПУФА-воздействия, ниже которой гемолиз не вызывается, отсутствует;

• лизируют все клетки;

• кривая гемолиза имеет сигмоидный характер;

• скорость гемолиза пропорциональна квадрату дозы облучения;

• гемолиз является термоактивируемым - развивается при температуре свыше 37°С (среди соединений фурокумаринового ряда последнее характерно только для псоралена);

• образующиеся каналы непроницаемы для сахарозы.

При увеличении интенсивности действующего света характер гемолиза изменяется. ВИ ПУФА-гемолиз характеризуется следующими чертами, схожими с чертами гемолиза, при котором предполагается образование крупных, каналов проницаемости, через которые может осуществляться утечка не только ионов, но и крупных молекул, например сахарозы и, возможно, гемоглобина. Этот механизм гемолиза эритроцитов характерен для детергентов. Отличительной чертой гемолиза, индуцированного добавлением детергентов к эритроцитам, является наличие пороговой концентрации детергента, ниже которой гемолиз не индуцируется. При дальнейшем увеличении концентрации детергента в суспензии лизирует только часть клеток, при этом долю лизировавших клеток называют амплитудой гемолиза. Зависимость амплитуды гемолиза от концентрации детергента носит сигмоидный характер и при высоких концентрациях детергента гемолиз становится завершенным, т.е. в суспензии наблюдается лизис 100% клеток. Аналогичное поведение гемолитической кривой было продемонстрировано в модели ВИ ПУФА-гемолиза (рисунок 4). Такой механизм гемолиза был назван механохимическим.

Таким образом, ВИ ПУФА-гемолиз обладал следующими свойствами механо-химического гемолиза:

• существует пороговая доза облучения, ниже которой гемолиз не индуцируется;

• в узком интервале малых доз облучения лизируют не все клетки суспензии, а только их часть;

АКПЯИГУЯА ______

СКОРОСТИ

дал облучения, *

Рисунок 4. Зависимость амплитуды (кривая 1) и скорости (кривые 2 и 3) ПУФА-гемолиза от дозы облучения при различной интенсивности УФА-излучения: кривые 1 и 2 - 154 Вт/м2; кривая 3 - 20,5 Вт/м2. Представлены усредненные результаты 3 опытов ±

SEM. Согласно работе [3].

• дозовая зависимость доли лизировавших клеток (амплитуды гемолиза) имеет сигмовидную форму;

• не нуждается в обязательной термоактивации.

ФОП гемолиз

Ранее, в нашей лаборатории было показано, что ФК способны вызывать гемолиз не только при совместном их облучении в суспензии эритроцитов (ПУВА-гемолиз), но и при добавлении предварительно облученного раствора псораленов в эритроцитарную суспензию (ФОП-гемолиз) [3]. Было обнаружено, что ФОП-гемолиз обладает чертами ВИ ПУФА-гемолиза, т.е. протекает по механо-химическому типу. На рисунке 5 представлены дозовые зависимости амплитуды и скорости ФОП-гемолиза. Сходство ВИ ПУФА- и ФОП-гемолиза дало возможность предположить, что псорален-индуцируемый гемолиз может осуществляться через стадию образования его фотопродуктов.

л

доза облучения, кДж/м

Рисунок 5. Дозовые зависимости амплитуды и скорости ФОП-гемолиза. ФОП

получали УФА-облучением (365 нм, I = 180 Вт/м2) раствора псоралена (0,1 мМ, 1% этанола) в фосфатном буферном растворе (ФБР) (рН = 7,4) при t = 20°С. Амплитуду гемолиза определяли после смешивания ФОП с суспензией эритроцитов (20 млн.кл./мл) в соотношении 1:1 и последующей инкубации при t = 37°С. Согласно работе [3].

В модели гемолиза индуцированного ионолом было обнаружено, что его гемолитический эффект начинает проявляться одновременно с агрегацией молекул последнего в ходе увеличения его концентрации. При этом существовала пороговая концентрация ионола, при которой не регистрировался ни гемолитический эффект, ни значимая его агрегация. Таким образом, появляющиеся в растворе агрегаты ионола могли быть ответственными за деструкцию мембран эритроцитов.

Обнаружение агрегации ионола осуществлялось

спектрофотометрическим методом по D светорассеяния при 290 нм. Выбор этой длины волны обусловлен следующим: обычно регистрацию светорассеяния производят вне полосы поглощения; при этом наименьшая длина волны, которую можно использовать для ионола где нет поглощения составляет 290 нм (далее начинается полоса поглощения указанного соединения). Известно, что псорален поглощает до 400 нм, поэтому чтобы обнаружить агрегаты псоралена по величине D светорассеяния необходимо проводить измерения при 400 нм и больших длинах волн. Агрегаты псоралена имеют малый размер, а указанное светорассеяние является

рэлеевским. Для такого типа светорассеяния интенсивность светорассеяния обратно пропорциональна длине волны в четвертой степени. Поэтому с помощью метода регистрации светорассеяния по типу рэлеевского обнаружить агрегацию псоралена не удалось.

Также было обнаружено, что последующее увеличение концентрации ионола приводило к снижению его гемолитической эффективности. Авторы предположили, что постепенное увеличение размеров агрегатов в ходе повышения концентрации ионола приводит к ухудшению их гемолитических свойств.

Сходное с ионолом поведение гемолитической кривой было обнаружено и для ФОП-гемолиза, а именно: увеличение дозы облучения псоралена приводило в конечном итоге к снижению гемолитической эффективности последнего. Проведя аналогию с механизмом гемолиза, индуцированного ионолом, авторы предположили, что за деструкцию мембран эритроцитов в случае ФОП-гемолиза могли быть ответственны образующиеся агрегаты продуктов фотоокисления псоралена. При этом ухудшение гемолитических свойств ФОП с увеличением дозы облучения могло быть также следствием увеличения размеров агрегатов продуктов ФОП. Однако, как уже было сказано выше, обнаружить такие агрегаты авторам не удалось, т.к. для этого не было подходящих методов. Регистрация таких агрегатов в растворе ФОП могла бы позволить сделать более уверенное предположение о роли агрегатов в механизме ФОП-гемолиза.

В настоящее время существует метод резонансного светорассеяния, позволяющий селективно и чувствительно обнаруживать агрегаты красителей. В следующем разделе подробно рассматривается этот метод.

1.4. Общие положения теории PCP.

Согласно данным литературы, метод резонансного светорассеяния является одним из самых чувствительных и селективных для регистрации агрегации фотосенсибилизаторов [87].

Обычно эксперименты по регистрации светорассеяния проводят в спектральной области, где нет поглощения света исследуемыми молекулами. Явление усиления светорассеяния в области поглощения молекул получило название резонансного светорассеяния (PCP). Интенсивность рассеянного света при агрегации хромофоров может возрастать на несколько порядков в области полос поглощения, обусловленных тс-электронными переходами. Классические и квантово-механические расчеты эффектов резонансного рассеяния на некоторых формах агрегатов даны в работах [59; 60].

Когда свет проходит через раствор агрегатов (в непоглощающем растворителе), энергия проходящего пучка уменьшается за счет двух процессов: поглощения и рассеяния на агрегатах. Возникновение рассеянного света есть следствие различий поляризуемости агрегатов и растворителя. Падающая электромагнитная волна индуцирует осциллирующий диполь в агрегате, который излучает свет в разных направлениях. Отношение скорости поглощения энергии из падающего пучка к интенсивности падающего пучка называется поперечным сечением поглощения (абсорбции) - Cabs- Отношение скорости рассеяния (во всех направлениях) к интенсивности падающего пучка называют поперечным сечением рассеяния - Csca. Если индуцированный диполь можно считать точечным (размеры агрегата малы по сравнению с длиной волны падающего света), оба поперечных сечения связаны с поляризуемостью агрегатов простым способом:

Cabs = ка1,

где к - волновой вектор и равен 2п/Х, а а - поляризуемость агрегатов, X - длина волны.

Поглощение зависит от первой степени поляризуемости, которая, в свою очередь, линейно связана с объемом агрегата. Напротив, степень рассеяния зависит от квадрата объема агрегатов и поэтому оно резко увеличивается в

результате агрегации. Следовательно, PCP очень чувствительный метод для обнаружения даже малых концентраций крупных агрегатов.

Спектры PCP измеряют на спектрофлуориметрах с двумя монохроматорами, настроенными на одну и ту же длину волны. Однако измеренные спектры PCP бывают искажены как регистрирующим прибором, так и самим объектом исследования.

В этой связи в настоящей работе для получения исправленных спектров PCP использовались поправки, представленные в работе [91]:

1) Поправка на эффекты внутреннего светофильтра:

При прохождении возбуждающего света через кювету до задних слоев доходит меньше света, чем до передних. За счет такого экранирования задних слоев передними происходит ослабление регистрируемого сигнала светорассеяния. Рассеянный свет имеет ту же длину волны, что и падающий, поэтому, проходя через толщу образца, он будет реабсорбироваться, что еще дополнительно уменьшит интенсивность регистрируемого рассеянного света. Эти два эффекта (экранировки и реабсорбции) и есть эффекты внутреннего фильтра.

Для исправления сигнала PCP на эффекты внутреннего фильтра нами была использована следующая формула:

т =т /1(Yd

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Пятницкий, Илья Алексеевич, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Владимиров, Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. Дрофа, 2006. — 65 с.

2. Козлов, И.Г. Новый подход к псораленовой фотохимиотерапии, исключающий облучение кожи пациентов ультрафиолетовым светом / И.Г. Козлов, Н.А. Ларина, М.Б. Неклюкова, А.Я. Потапенко, Ч.Р. Саха-Меллер, В. Адам, Н.К. Горлина, Н.К. Чередеев, А.А. Кягова // Успехи клинической иммунологии и аллергологии. - 2001 - №2. - С. 277286

3. Лысенко, Е.П. Фотофизические свойства и фотоокислительные реакции фурокумаринов в растворах биомембранах: дис. ... канд. биол. наук: 03.00.02 / Лысенко Евгений Петрович. — М., 1991. 155-175 с.

4. Потапенко, А.Я. Биофизические проблемы фотомедицины в дерматологии. А.Я. Потапенко, А.А. Кягова // Дерматовенерология. Национальное руководство, под редакцией Бутова Ю.С. Скрипкина Ю.К., Иванова О.Л. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. — 111-121 с.

5. Потапенко, А.Я. Фотобиофизика фурокумаринов / А.Я. Потапенко, М.В. Малахов, А.А. Кягова // Биофизика - 2004.- №49. - С. 322-339.

6. Хаитов P.M. Иммунология: учебник / P.M. Хаитов, Г.Л. Игнатьева, И.Г. Сидорович -М.: Медицина, 2000. - 25 с.

7. Хайдуков, С.В. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение / С.В. Хайдуков, А.В. Зурочка - Челябинск: Бумаж. Двор, 2008. - 26 с.

8. Ahn, G. Immunomodulatory effects of an enzymatic extract from Ecklonia cava on murine splenocytes / G. Ahn, I. Hwang, E. Park, J. Kim, Y.J. Jeon, J. Lee, J.W. Park, Y. Jee // Mar Biotechnol (NY) - 2008,- №10. - C. 278-289.

9. Aubin, F. Local suppression of contact hypersensitivity in mice by a new bifunctional psoralen, 4,4',5'-trimethylazapsoralen, and UVA radiation / F. Aubin, F. DallAcqua, M.L. Kripke // J Invest Dermatol - 1991,- №97. - C. 50-54.

10. Belichenko, V. Comparison of haemolytic effects of butilated hydroxytoluene and previously photooxidized psoralen / V. Belichenko, E.P. Lysenko, N.N. Zhuravel, A.A. Kyagova, A.Y. Potapenko // Phys. Chem. Biol. & Med - 1995,- №2. - C. 159-164.

11. Besaratinia, A. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to С and T to a mutations / A. Besaratinia, G.P. Pfeifer // J Invest Dermatol - 2004.- №123. - С. 1140-1146.

12. Biedermann, T. Mast cells control neutrophil recruitment during T cell-mediated delayed-type hypersensitivity reactions through tumor necrosis factor and macrophage inflammatory protein 2 / T. Biedermann, M. Kneilling, R. Mailhammer, K. Maier, C.A. Sander, G. Kollias, S.L. Kunkel, L. Hultner, M. Rocken // J Exp Med - 2000,- №192. - C. 1441-1452.

13. Bladon, J. Extracorporeal photopheresis: a focus on apoptosis and cytokines / J. Bladon, P.C. Taylor // J Dermatol Sci - 2006,- №43. - C. 85-94.

14. Bulat, V. The mechanisms of action of phototherapy in the treatment of the most common dermatoses / V. Bulat, M. Situm, I. Dediol, I. Ljubicic, L. Bradic // Coll Antropol - 2011- №35 Suppl 2. -C. 147-151.

15. Caffieri, S. Furocoumarin photolysis: chemical and biological aspects / S. Caffieri // Photochem Photobiol Sci - 2002.- №1. - C. 149-157.

16. Caffieri, S. The mitochondrial effects of novel apoptogenic molecules generated by psoralen photolysis as a crucial mechanism in PUVA therapy / S. Caffieri, F. Di Lisa, F. Bolesani, M. Facco, G. Semenzato, F. DallAcqua, M. Canton // Blood - 2007,- №109. - C. 4988-4994.

17. Cavani, A. Immune regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis and contact sensitization / A. Cavani // Chem Immunol Allergy - 2008.- №94. - C. 93-100.

18. Christensen, A. Immunological mechanisms of contact hypersensitivity in mice / A.D. Christensen, C. Haase // APMIS - 2012,- №120. - C. 1-27.

19. Coimbra, S. Interleukin (IL)-22, IL-17, IL-23, IL-8, vascular endothelial growth factor and tumour necrosis factor-alpha levels in patients with psoriasis before, during and after psoralen-ultraviolet A and narrowband ultraviolet B therapy / S. Coimbra, H. Oliveira, F. Reis, L. Belo, S. Rocha, A. Quintanilha, A. Figueiredo, F. Teixeira, E. Castro, P. Rocha-Pereira, A. Santos-Silva //Br J Dermatol-2010,-№163. -C. 1282-1290.

20. Craw, M. Some photophysical properties of 3-carbethoxypsoralen, 8-methoxypsoralen and 5-methoxypsoralen triplet states / M. Craw, R.V. Bensasson, J.C. Ronfard-Haret, M.T. Sa e Melo, T.G. Truscott // Photochem Photobiol - 1983,- №37. - C. 611-615.

21. Dearman, R. Allergen-induced cytokine phenotypes in mice: role of CD4 and CD8 T cell populations / R.J. Dearman, N. Humphreys, R.A. Skinner, I. Kimber // Clin Exp Allergy -2005.-№35. - C. 498-505.

22. Demchenko, A. Beyond annexin V: fluorescence response of cellular membranes to apoptosis / A.P. Demchenko // Cytotechnology - 2013.- №65. - C. 157-172.

23. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens / A. Dudeck, J. Dudeck, J. Scholten, A. Petzold, S. Surianarayanan, A. Kohler, K. Peschke, D. Vohringer, C. Waskow, T. Krieg, W. Muller, A. Waisman, K. Hartmann, M. Gunzer, A. Roers // Immunity - 2011.- №34. - C. 973-984.

24. Edelson, B. Peripheral CD 103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells / B.T. Edelson, W. Kc, R. Juang, M. Kohyama, L.A. Benoit, P.A. Klekotka, C. Moon, J.C. Albring, W. Ise, D.G. Michael, D. Bhattacharya, T.S. Stappenbeck, M.J. Holtzman, S.S. Sung, T.L. Murphy, K. Hildner, K.M. Murphy // J Exp Med -2010,-№207. -C. 823-836.

25. Efferth, T. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro / T. Efferth, U. Fabry, R. Osieka // Anticancer Res - 2001.- №21. - C. 2777-2783.

26. Furuhashi, T. Photo(chemo)therapy reduces circulating Thl7 cells and restores circulating regulatory T cells in psoriasis / T. Furuhashi, C. Saito, K. Torii, E. Nishida, S. Yamazaki, A. Morita // PLoS One - 2013,- №8. - C. e54895.

27. Gaffen, S. Recent advances in the IL-17 cytokine family / S.L. Gaffen // Curr Opin Immunol - 2011,-№23. -C. 613-619.

28. George, J. Role for CD4(+)CD25(+) T cells in inhibition of graft rejection by extracorporeal photopheresis / J.F. George, C.W. Gooden, L. Guo, J.K. Kirklin // J Heart Lung Transplant -2008,-№27. -C. 616-622.

29. Gollnick, S. IL-10 does not play a role in cutaneous Photofrin photodynamic therapy-induced suppression of the contact hypersensitivity response / S.O. Gollnick, D.A. Musser, A.R. Oseroff, L. Vaughan, B. Owczarczak, B.W. Henderson // Photochem Photobiol - 2001,- №74. - C. 811816.

30. Grabbe, S. Removal of the majority of epidermal Langerhans cells by topical or systemic steroid application enhances the effector phase of murine contact hypersensitivity / S. Grabbe, K. Steinbrink, M. Steinert, T.A. Luger, T. Schwarz // J Immunol - 1995.- №155. - C. 4207-4217.

31. Guan, H. GammadeltaT cells regulate the development of hapten-specific CD8+ effector T cells in contact hypersensitivity responses / H. Guan, G. Zu, M. Slater, C. Elmets, H. Xu // J Invest Dermatol - 2002,- №119. - C. 137-142.

32. Gutting, B. Oxazolone and diclofenac-induced popliteal lymph node assay reactions are attenuated in mice orally pretreated with the respective compound: potential role for the induction of regulatory mechanisms following enteric administration / B.W. Gutting, F. Bouzahzah, P.L. Kong, L.W. Updyke, D.E. Amacher, J. Craft // Toxicol Appl Pharmacol -2003,-№189. -C. 120-133.

33. Hannani, D. Photochemotherapy induces the apoptosis of monocytes without impairing their function / D. Hannani, F. Gabert, D. Laurin, M. Sail, J.P. Molens, O. Hequet, L. Chaperot, J. Plumas // Transplantation - 2010.- №89. - C. 492-499.

34. He, D. IL-17 and IFN-gamma mediate the elicitation of contact hypersensitivity responses by different mechanisms and both are required for optimal responses / D. He, L. Wu, H.K. Kim, H. Li, C.A. Elmets, H. Xu // J Immunol - 2009,- №183. - C. 1463-1470.

35. Heald, P. T-cell responses in photoimmune therapy / P.W. Heald, H.Y. Kim, M. Perez, R.L. Edelson, C.L. Berger // J Clin Apher - 1995.- №10. - C. 144-149.

36. Honda, T. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis / T. Honda, G. Egawa, S. Grabbe, K. Kabashima // J Invest Dermatol - 2013,- №133. - C. 303-315.

37. Honda, T. Compensatory role of Langerhans cells and langerin-positive dermal dendritic cells in the sensitization phase of murine contact hypersensitivity / T. Honda, S. Nakajima, G. Egawa, K. Ogasawara, B. Malissen, Y. Miyachi, K. Kabashima // J Allergy Clin Immunol -2010,- №125. -C. 1154-1156 el 152.

38. Igyarto, B. Langerhans cells suppress contact hypersensitivity responses via cognate CD4 interaction and langerhans cell-derived IL-10 / B.Z. Igyarto, M.C. Jenison, J.C. Dudda, A. Roers, W. Muller, P.A. Koni, D.J. Campbell, M.J. Shlomchik, D.H. Kaplan // J Immunol - 2009,-№183. -C. 5085-5093.

39. Kabashima, K. Prostaglandin E2-EP4 signaling initiates skin immune responses by promoting migration and maturation of Langerhans cells / K. Kabashima, D. Sakata, M. Nagamachi, Y. Miyachi, K. Inaba, S. Narumiya // Nat Med - 2003.- №9. - C. 744-749.

40. Kovalskaya, M. The nature of electronically exited states and photoprocesses in psoralen molecules and their complexes / M. Kovalskaya, J. Sokolova // High Energy Chem - 2002-№36. - C. 237-240.

41. Kubo, A. External antigen uptake by Langerhans cells with reorganization of epidermal tight junction barriers / A. Kubo, K. Nagao, M. Yokouchi, H. Sasaki, M. Amagai // J Exp Med -2009.-№206. - C. 2937-2946.

42. Kyagova, A. Specific suppression of contact hypersensitivity in mice by photolysis products of psoralens / A. Kyagova, Z. Moshnina, L. Kozir, O. Glazunova, M. Moshnin, A. Potapenko // J. Invest. Dermatol. - 2006.- №126, Suppl. 3. - C. 79.

43. Kyagova, A. Immunosuppression caused by photochemo-and photodynamic therapy: focus on photosensitizer photoproducts / A.A. Kyagova, M.V. Malakhov, A.Ya Potapenko // Immunosupression: new research - 2009.— C. 167-183.

44. Kyagova, A. Modulation of delayed type hypersensitivity in mice treated with photoproducts of various photo sensitizers used in photodynamic therapy / A.A. Kyagova, L.A. Kozir, G.V. Mansurova, V.P. Zorin, L.N. Bezdetnaya, F. Guillemin, A.Y. Potapenko // Russ J Immunol -2002,- №7. - C. 327-334.

45. Kyagova, A. The Attenuation of Effectors and Induction of Suppressors of Delayed Type Hypersensitivity Reaction under the Treatment with Psoralen Photooxidation Products / A.A. Kyagova, E.N. Nagurskaya, V.A. Bekhalo, I.Y. Chernyakhovskaya, I.V. Belichenko, A.Y. Potapenko // Russ J Immunol - 1996.- №1. - C. 61-68.

46. Kyagova, A. Suppression of delayed-type hypersensitivity and hemolysis induced by previously photooxidized psoralen: effect of fluence rate and psoralen concentration / A.A. Kyagova, N.N. Zhuravel, M.Y. Malakhov, E.P. Lysenko, W. Adam, C.R. Saha-Moller, A. Potapenko // Photochem Photobiol - 1997,-№65. - C. 694-700.

47. Larsen, J. Cellular dynamics in the draining lymph nodes during sensitization and elicitation phases of contact hypersensitivity / J.M. Larsen, C. Geisler, M.W. Nielsen, L. Boding, M. Von Essen, A.K. Hansen, L. Skov, C.M. Bonefeld // Contact Dermatitis - 2007,- №57. - C. 300-308.

48. Lepoittevin J. Metabolism versus chemical transformation or pro- versus prehaptens? / J.P. Lepoittevin // Contact Dermatitis - 2006 - №54. - C. 73-74.

49. Luftl, M. PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages / M. Luftl, M. Rocken, G. Plewig, K. Degitz // J Invest Dermatol - 1998.- №111. - C. 399-405.

50. Lynch, D. Systemic immunosuppression induced by photodynamic therapy (PDT) is adoptively transferred by macrophages / D.H. Lynch, S. Haddad, V.J. King, M.J. Ott, R.C. Straight, C.J. Jolles // Photochem Photobiol - 1989.-№49. - C. 453-458.

51. Maeda, A. Experimental extracorporeal photopheresis inhibits the sensitization and effector phases of contact hypersensitivity via two mechanisms: generation of IL-10 and induction of regulatory T cells / A. Maeda, A. Schwarz, A. Bullinger, A. Morita, D. Peritt, T. Schwarz // J Immunol -2008.- №181. -C. 5956-5962.

52. Maeda, A. Intravenous infusion of syngeneic apoptotic cells by photopheresis induces antigen-specific regulatory T cells / A. Maeda, A. Schwarz, K. Kernebeck, N. Gross, Y. Aragane, D. Peritt, T. Schwarz // J Immunol - 2005,- №174. - C. 5968-5976.

53. Martin, S. Toll-like receptor and IL-12 signaling control susceptibility to contact hypersensitivity / S.F. Martin, J.C. Dudda, E. Bachtanian, A. Lembo, S. Liller, C. Durr, M.M. Heimesaat, S. Bereswill, G. Fejer, R. Vassileva, T. Jakob, N. Freudenberg, C.C. Termeer, C. Johner, C. Galanos, M.A. Freudenberg // J Exp Med - 2008,- №205. - C. 2151-2162.

54. McMinn, P. Effects of gliotoxin on Langerhans' cell function: contact hypersensitivity responses and skin graft survival / P.C. McMinn, G.M. Halliday, H.K. Muller // Immunology -1990,- №71. -C. 46-51.

55. Moniaga, C. Flaky tail mouse denotes human atopic dermatitis in the steady state and by topical application with Dermatophagoides pteronyssinus extract / C.S. Moniaga, G. Egawa, H. Kawasaki, M. Hara-Chikuma, T. Honda, H. Tanizaki, S. Nakajima, A. Otsuka, H. Matsuoka, A. Kubo, J. Sakabe, Y. Tokura, Y. Miyachi, M. Amagai, K. Kabashima // Am J Pathol - 2010-№176. -C. 2385-2393.

56. Montoya, M. Cell adhesion and polarity during immune interactions / M.C. Montoya, D. Sancho, M. Vicente-Manzanares, F. Sanchez-Madrid // Immunol Rev - 2002.- №186. - C. 6882.

57. Nakae, S. Interleukin-1 beta, but not interleukin-1 alpha, is required for T-cell-dependent antibody production / S. Nakae, M. Asano, R. Horai, Y. Iwakura // Immunology - 2001,- №104. - C. 402-409.

58. Otsuka, A. Requirement of interaction between mast cells and skin dendritic cells to establish contact hypersensitivity / A. Otsuka, M. Kubo, T. Honda, G. Egawa, S. Nakajima, H. Tanizaki, B. Kim, S. Matsuoka, T. Watanabe, S. Nakae, Y. Miyachi, K. Kabashima // PLoS One - 2011.-№6. -C. e25538.

59. Parkash, J. Depolarized resonance light scattering by porphyrin and chlorophyll a aggregates / J. Parkash, J.H. Robblee, J. Agnew, E. Gibbs, P. Collings, R.F. Pasternack, J.C. de Paula // Biophys J - 1998,- №74. - C. 2089-2099.

60. Pasternack, R. Resonance light scattering: a new technique for studying chromophore aggregation / R.F. Pasternack, P.J. Collings // Science - 1995,- №269. - C. 935-939.

61. Pathak, M. Molecular aspects of drug photosensitivity with special emphasis on psoralen photosensitization reaction / M.A. Pathak // J Natl Cancer Inst - 1982,- №69. - C. 163-170.

62. Peiser, M. Allergic contact dermatitis: epidemiology, molecular mechanisms, in vitro methods and regulatory aspects. Current knowledge assembled at an international workshop at BfR, Germany / M. Peiser, T. Tralau, J. Heidler, A.M. Api, J.H. Arts, D.A. Basketter, J. English, T.L. Diepgen, R.C. Fuhlbrigge, A.A. Gaspari, J.D. Johansen, A.T. Karlberg, I. Kimber, J.P. Lepoittevin, M. Liebsch, H.I. Maibach, S.F. Martin, H.F. Merk, T. Platzek, T. Rustemeyer, A. Schnuch, R.J. Vandebriel, I.R. White, A. Luch // Cell Mol Life Sei - 2012.- №69. - C. 763-781.

63. Pooler, J. The kinetics of colloid osmotic hemolysis. II. Photohemolysis / J.P. Pooler // Biochim Biophys Acta - 1985,-№812. - C. 199-205.

64. Potapenko, A. Mechanisms of photodynamic effects of furocoumarins / A. Potapenko // J Photochem Photobiol B - 1991,-№9. - C. 1-33.

65. Potapenko, A. Photohemolysis sensitized by psoralen: reciprocity law is not fulfilled / A. Potapenko, M.A. Agamalieva, A.I. Nagiev, E.P. Lysenko, L.N. Bezdetnaya, V.L. Sukhorukov // Photochem Photobiol - 1991.-№54. - C. 375-379.

66. Potapenko, A. Products of psoralen photooxidation possess immunomodulative and antileukemic effects / A. Potapenko, A.A. Kyagova, L.N. Bezdetnaya, E.P. Lysenko, I. Chernyakhovskaya, V.A. Bekhalo, E.V. Nagurskaya, V.A. Nesterenko, N.G. Korotky, S.N. Akhtyamov, et al. // Photochem Photobiol - 1994,- №60. - C. 171-174.

67. Potapenko, A. Photosensitized modification of erythrocyte membranes induced by furocoumarins / Potapenko A.Ya., Wunderlich S., Bezdetnaya L.N., S. V.L. // Photobiochem. Photobiophys. - 1986.-№10. -C. 175-180.

68. Punnonen, K. Effects of in vitro UVA irradiation and PUVA treatment on membrane fatty acids and activities of antioxidant enzymes in human keratinocytes / K. Punnonen, C.T. Jansen, A. Puntala, M. Ahotupa // J Invest Dermatol - 1991.- №96. - C. 255-259.

69. Ring, S. CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress contact hypersensitivity reactions by blocking influx of effector T cells into inflamed tissue / S. Ring, S.C. Schafer, K. Mahnke, H.A. Lehr, A.H. Enk // Eur J Immunol - 2006,- №36. - C. 2981-2992.

70. Rosado-Schlosser, B. The reciprocity rule in photobiology - a review / B. Rosado-Schlosser, Trautinger, F. // Journal - 2010.— C.

71. Saint-Mezard, P. The role of CD4+ and CD8+ T cells in contact hypersensitivity and allergic contact dermatitis / P. Saint-Mezard, F. Berard, B. Dubois, D. Kaiserlian, J.F. Nicolas // Eur J Dermatol -2004,-№14. -C. 131-138.

72. Schmidt, M. Crucial role for human Toll-like receptor 4 in the development of contact allergy to nickel / M. Schmidt, B. Raghavan, V. Muller, T. Vogl, G. Fejer, S. Tchaptchet, S. Keck, C. Kalis, P.J. Nielsen, C. Galanos, J. Roth, A. Skerra, S.F. Martin, M.A. Freudenberg, M. Goebeler//Nat Immunol-2010.-№ 11. -C. 814-819.

73. S. Schmitt, S. Extracorporeal photophoresis augments function of CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells by triggering adenosine production / S. Schmitt, T.S. Johnson, S. Karakhanova, H. Naher, K. Mahnke, A.H. Enk // Transplantation - 2009.- №88. - C. 411-416.

74. Serrano-Perez, J. Photoreactivity of furocoumarins and DNA in PUVA therapy: formation of psoralen-thymine adducts / J.J. Serrano-Perez, M. Merchan, L. Serrano-Andres // J Phys Chem B -2008-№112. -C. 14002-14010.

75. Serrano-Perez, J. A theoretical insight into the photophysics of psoralen / J.J. Serrano-Perez, L. Serrano-Andres, M. Merchan // J Chem Phys - 2006,- №124. - C. 124502.

76. Shornick, L. IL-lbeta is essential for langerhans cell activation and antigen delivery to the lymph nodes during contact sensitization: evidence for a dermal source of IL-lbeta / L.P. Shornick, A.K. Bisarya, D.D. Chaplin // Cell Immunol - 2001,- №211. - C. 105-112.

77. Simkin, G. IL-10 contributes to the inhibition of contact hypersensitivity in mice treated with photodynamic therapy / G.O. Simkin, J.S. Tao, J.G. Levy, D.W. Hunt // J Immunol - 2000-№164. - C. 2457-2462.

78. Singh, T. 8-Methoxypsoralen plus UVA treatment increases the proportion of CLA+ CD25+ CD4+ T cells in lymph nodes of K5.hTGFbetal transgenic mice / T.P. Singh, M.P. Schon, K. Wallbrecht, P. Wolf// Exp Dermatol - 2012,- №21. - C. 228-230.

79. M. Tsai, M. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic -responses in vivo / M. Tsai, M.A. Grimbaldeston, M. Yu, S.Y. Tam, S.J. Galli // Chem Immunol Allergy-2005,-№87. - C. 179-197.

80. Vocanson, M. CD8+ T cells are effector cells of contact dermatitis to common skin allergens in mice / M. Vocanson, A. Hennino, M. Cluzel-Tailhardat, P. Saint-Mezard, J. Benetiere, C. Chavagnac, F. Berard, D. Kaiserlian, J.F. Nicolas // J Invest Dermatol - 2006.- №126. - C. 815820.

81. Voss, C. Extending the horizon for cell-based immunotherapy by understanding the mechanisms of action of photopheresis / C.Y. Voss, T.J. Fry, M.J. Coppes, M.A. Blajchman // Transfus Med Rev - 2010,- №24. - C. 22-32.

82. Wang, L. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions / L. Wang, L.S. Bursch, A. Kissenpfennig, B. Malissen, S.C. Jameson, K.A. Hogquist // J Immunol - 2008,-№180. - C. 4722-4727.

83. Waszkowska, E. Spectroscopic detection of photoproducts in lecithin model system after 8-methoxypsoralen plus UY-A treatment / E. Waszkowska, Z. Zarebska, J. Poznanski, I. Zhukov // J Photochem Photobiol B - 2000.- №55. - C. 145-154.

84. Watanabe, H. Contact hypersensitivity: the mechanism of immune responses and T cell balance / H. Watanabe, M. Unger, B. Tuvel, B. Wang,-D.N. Sauder // J Interferon Cytokine Res - 2002,- №22. - C. 407-412.

85. Watanabe, R. CD 19 expression in B cells is important for suppression of contact hypersensitivity / R. Watanabe, M. Fujimoto, N. Ishiura, Y. Kuwano, H. Nakashima, N. Yazawa, H. Okochi, S. Sato, T.F. Tedder, K. Tamaki // Am J Pathol - 2007.- №171. - C. 560-570.

86. Worel, N. Clinical Results of Extracorporeal Photopheresis / N. Worel, G. Leitner // Transfus Med Hemother - 2012,- №39. - C. 254-262.

87. Xiao, C. Comprehensive study of the interaction between a potential antiprion cationic porphyrin and human prion protein at different pH by using multiple spectroscopic methods / C.Q. Xiao, B.Y. Feng, Y.S. Ge, X.Y. Fan, F.L. Jiang, G. Xiao, Y. Liu // J Pharm Sci - 2013.-№102.-C. 1076-1085.

88. Yoo, E. Apoptosis induction of ultraviolet light A and photochemotherapy in cutaneous T-cell Lymphoma: relevance to mechanism of therapeutic action / E.K. Yoo, A.H. Rook, R. Elenitsas, F.P. Gasparro, B.R. Vowels // J Invest Dermatol - 1996,-№107. - C. 235-242.

89. Yurchenko, M. The multilevel regulation of CD95 signaling outcome / M. Yurchenko, L.M. Shlapatska, S.P. Sidorenko // Exp Oncol - 2012,- №34. - C. 153-159.

90. Suda, T. Physiological and pathological roles of apoptosis / T. Suda // Nippon Rinsho -2005,-№63 Suppl 4. -C. 395-400.

91. Tikhomirov, A. Investigation of aggregates of dyes by the method of resonance light scattering: correction of spectra / A.M. Tikhomirov, T.A. Shmigol, E.A. Kozhinova, A.A. Kiagova, L.N. Bezdetnaia, A. Potapenko // Biofizika - 2009.- №54. - C. 824-830.

92. Helewski, K. Apoptosis and necrosis-two different ways leading to the same target / K.J. Helewski, G.I. Kowalczyk-Ziomek, J. Konecki // Wiad Lek - 2006.- №59. - C. 679-684.