Флуоресцентные 5-алкинил-2'-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Скоробогатый, Михаил Валерьевич

• Скоробогатый, Михаил Валерьевич
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Скоробогатый, Михаил Валерьевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. АЛКИНИЛИРОВАННЫЕ НУКЛЕОЗИДЫ: СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ (обзор литературы)

1.1. Флуоресцентные алкинилированные нуклеозиды и их производные: методы получения, физико-химические свойства и применение

1.1.1. Введение флуоресцентной метки в состав нуклеозидов и их производных при помощи алкинильного линкера

1.1.2. Флуоресцентные терминаторы для автоматического секвенирования ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флуоресцентные 5-алкинил-2'-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНК»

В последние годы в химических и биологических исследованиях флуоресцентные метки практически полностью вытеснили радиоизотопные. Такое положение связано с рядом преимуществ флуоресцентных меток - стабильностью, высокой чувствительностью определния (сравнимой с чувствительностью радиоизотопных меток и даже превосходящей ее), возможностью автоматизации процедур модификации и детекции, возможностью одновременного определения нескольких соединений, меченных разными флуорофорами, а также меньшим отрицательным воздействием на окружающую среду.

Очень широкое применение получили флуоресцентные метки в исследованиях нуклеиновых кислот. Однако, в настоящее время их использование в данной области в большинстве случаев ограничивается детекцией олиго- или полинуклеотидной части конъюгатов и намного реже для исследования структурных изменений в процессе различных взаимодействий: гибридизации нуклеиновых кислот с образованием дуплексов или триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Это вызвано тем, что детекция процессов взаимодействия биомолекул на основе спектров флуоресценции связана с решением ряда проблем: подбор флуоресцентного красителя, разработка синтеза его функционализированного производного, а также нуклеозидных и олигонуклеотидных конъюгатов и исследование их спектральных свойств. Несмотря на все эти трудности, флуоресцентные метки могут служить эффективным инструментом изучения динамики нуклеиновых кислот.

Весьма перспективными флуоресцентными красителями для создания высокочувствительных зондов являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они химически устойчивы, обычно имеют высокие коэффициенты экстинкции и высокие квантовые выходы флуоресценции, способны к нековалентным взаимодействиям с ДНК (интеркаляция, стэкинг, связывание в бороздках дуплексов). Важным и часто используемым свойством ПАУ является их способность к образованию эксимеров (сокращение от excited dimers - возбужденные димеры). Кроме того, ПАУ относительно легко модифицировать с расширением системы л-сопряжения, что может приводить к соединениям, по люминесцентным свойствам резко отличающимся от исходных ПАУ (т. е., к новым красителям).

На основании приведенных данных в качестве красителей нами были выбраны флуорофоры на основе ароматических полициклических углеводородов, сопряженные с нуклеиновыми основаниями, в частности, с основанием 2'-дезоксиуридина. При введении подобных модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид флуоресценция красителя может дополнительно измениться в результате взаимодействия с нуклеиновыми основаниями олигомера. Гибридизация меченного таким образом олигонуклеотида с комплементарной последовательностью может сопровождаться дальнейшими изменениями в спектре флуоресценции метки.

Целью данной работы явился синтез амидофосфитных реагентов на основе флуоресцентных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов, получение модифицированных такими реагентами олигонуклеотидов и изучение физико-химических, спектральных и фотофизических свойств полученных конъюгатов. Отдельной частью работы является исследование биологической активности полученных 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов. Мы обнаружили противовирусную активность у таких нуклеозидов, и представляло интерес более подробно изучить взаимосвязь структуры и активности этих соединений.

Настоящая работа выполнена в лаборатории химии нуклеиновых кислот Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Скоробогатый, Михаил Валерьевич

выводы

1. Синтезированы амидофосфитные реагенты на основе 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина и 5-[3-(перилен-3-илметокси)пропин-1-ил]-2'-дезоксиуридина, содержащие остаток полициклического ароматического углеводорода перилена. В первом реагенте флуорофор я-сопряжен с нуклеиновым основанием, во втором такое сопряжение отсутствует.

2. С использованием данных реагентов, а также синтезированных ранее амидофосфитов на основе флуоресцентных 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов, получены модифицированные олигонуклеотиды, проанализированы их физико-химические, спектральные и фотофизические свойства. Интенсивность флуоресценции олигонуклеотидов, несущих остаток перилена в сопряжении с нуклеиновым основанием, увеличивется в несколько раз при образовании дуплекса с комплементарной последовательностью. В случае несопряженного конъюгата интенсивность флуоресценции остатка перилена, наоборот, уменьшается в 2-4 раза. Потенциально данный эффект можно использовать для детекции гибридизации ДНК в растворе.

3. Обнаружено явление полного или частичного переноса энергии флуоресценции между двумя различными 5-арил-2'-дезоксиуридинами в составе олигонуклеотидного дуплекса. Показано, что нуклеиновое основание остатка гуанозина, расположенного по соседству с донором, эффективно тушит остаточную флуоресценцию донора.

4. Обнаружен новый класс антивирусных агентов (5-арилэтинил-2-дезоксиуридины с объемными полиароматическими заместителями), способных подавлять репродукцию вируса простого герпеса типа 1 в культуре клеток Vero. Производные этого класса сохраняют активность в отношении штаммов вирусов, обладающих лекарственной устойчивостью, и проявляют аддитивный эффект при комбинированном действии с ацикловиром. Исследована взаимосвязь структуры и противовирусного действия 5-арилэтинил-2'-дезоксиуридинов. Показана важность как этинильного линкера, так и объемного ароматического остатка для сохранения противовирусной активности.

-114

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор хотел бы посвятить свою работу памяти Юрия Адольфовича Берлина (1936-2001). Он ушел из жизни слишком рано, далеко не реализовав свой творческий потенциал, свою энергию. За недолгое время работы с Юрием Адольфовичем автор приобрел ясность и понимание во многих аспектах как научной деятельности, так и жизни в целом. Автор и сейчас считает Юрия Адольфовича примером, ориентиром для себя.

Автор выражает благодарность В.А. Коршуну за руководство диссертационной работой, отеческую заботу, помощь и долготерпение; заведующему лабораторией химии нуклеиновых кислот В.А. Ефимову и всем коллегам из лаборатории за постоянную поддержку и помощь. Автор особенно признателен А.Д. Малахову, A.JI. Петруниной и A.A. Пчелинцевой за помощь в проведении большой части экспериментов и регистрации физико-химических и спектральных данных, а также JI.B. Грузинцевой за помощь в работе и моральную поддержку. Автор также выражает благодарность 3.0. Шенкареву и К.Д. Надеждину за регистрацию спектров ЯМР, Н.Б. Пестову за помощь в регистрации УФ-спектров и А.Ф. Фрадкову за помощь в регистрации флуоресценции. Автор призателен также коллегам из других институтов: М.С. Щепинову (Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания) за регистрацию масс-спектров высокого разрешения; В.В. Шманаю, М.В. Квачу, Ю.И. Габрусю и C.B. Гонтареву (Институт физикоорганической химии HAH РБ, Минск, Белоруссия) за помощь в синтезе олигонуклеотидов; СЛ. Бондареву, A.A. Турбану и A.A. Ступаку (Институт молекулярной и атомной физики HAH РБ, Минск, Белоруссия) за измерение квантовых выходов и динамики затухания флуоресценции; П.М. Филипченко (Институт биоорганической химии HAH РБ, Минск, Белоруссия) за предоставление для экспериментов 1-(4-гидроксифенил)адамантана и эстрона; Г.А. Галегову и B.J1. Андроновой (Институт вирусологии им. Ивановского РАМН, Москва) за исследование противовирусной активности 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов.

-451.2.3. Заключение

С определенной уверенностью можно говорить о том, что сопряженные при помощи этинильного линкера конъюгаты являются отдельным быстрорастущим классом флуоресцентно меченых алкинилированных нуклеозидов. Трудно оценить возможные перспективы развития этого класса (как в плане разработки, так и применения производных), но совершенно очевидно, что в ближайшее время ему будет уделено самое пристальное внимание со стороны исследователей. Связано это в первую очередь с уникальностью свойств сопряженных конъюгатов, сочетающих самые разнообразные спектральные характеристики с высокой чувствительностью к изменению различных параметров микроокружения.

Кажущиеся сложности, возникающие при внедрении в практику конъюгатов такого типа, вероятно, являются следствием того, что исследования приходится вести на стыке трех дисциплин - органической химии, молекулярной биологии и флуоресцентной спектроскопии. Однако есть все основания полагать, что эти сложности будут преодолены, и примером тому может служить большое количество вышедших в последние годы работ по исследованию свойств и возможного применения 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридина, первого представителя класса сопряженных флуоресцентных нуклеозидов.

ГЛАВАП. Флуоресцентные 5-алкинил-2'-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНК результаты и обсуждение)

II.1. Синтез амидофосфитных реагентов на основе 5-алкинил-2 дезоксиуридинов

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), вне сомнения, являются одним из самых интересных типов флуоресцентных красителей, как с исследовательской, так и с практической точек зрения. Разнообразие спектральных свойств, широчайшие возможности модификации, высокая фотостабильность и устойчивость к действию химических агентов - отличительные особенности этого класса флуорофоров. Однако в области химии НК работы по ПАУ до сих пор носят исследовательский характер; в прикладных целях, например, в методах молекулярной биологии, используются другие типы флуорофоров. Связано это, вероятно, с липофильным характером ПАУ и, как следствие, низкой растворимостью и ухудшенными спектральными характеристиками их производных в водных средах. Тем не менее, работы по ПАУ в приложении к НК постоянно ведутся вот уже три десятилетия. При этом в подавляющем большинстве исследований используются производные пирена.

В последнее время интерес к ПАУ возрос с новой силой. Этот интерес обусловлен трудностями в адаптации традиционных флуорофоров для детекции точечных мутаций [23, 106]. Хорошо зарекомендовавшие себя как флуоресцентные метки ксантеновые (флуоресцеины и родамины) и цианиновые красители малочувствительны к изменениям микроокружения НК. Для использования их в качестве молекулярных маяков приходится составлять пары краситель-тушитель или регистрировать эффективность резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) в паре донор-акцептор. В свою очередь, флуоресценция липофильных ПАУ в водных средах значительно потушена, ее интенсивность не достигает уровня, например, ксантеновых красителей. Но по этим же причинам параметры флуоресценции ПАУ могут сильно изменяться вслед за самыми незначительными изменениями среды. Именно в возможности исследования окружения НК на молекулярном уровне и заключается перспективность исследования свойств коньюгатов ПАУ с НК.

Одним из направлений работы Лаборатории химии нуклеиновых кислот ИБХ РАН (зав. лаб. проф. Ефимов В.А.) является синтез 5-алкинил-2'-дезоксиуридинов, изучение их физико-химических и спектральных свойств и возможностей практического применения.

Общая схема синтеза таких производных (Схема II. 1) включает три ключевых стадии:

1) Синтез производного 5-йод-2'-дезоксиуридина II.1.

2) Синтез алкинильного производного ПАУ II.2.

3) Ключевая стадия - конденсация двух блоков ПЛ и II.2 в условиях реакции Соногаширы [1-4] с последующим превращением производного II.3 в незащищенный нуклеозид II.4 или амидофосфитный реагент II.5 на его основе.

По этой схеме в 1996 г. синтезирован 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридин П.4а [72, 73], исследованы его спектральные свойства.

Позднее на основе нуклеозида П.4а получены амидофосфитный реагент и твердофазный носитель для автоматического ДНК-синтезатора, и с их использованием -модифицированные олигонуклеотиды [107]. В этой работе впервые отмечено возрастание интенсивности флуоресценции остатка 5-(пирен-1-илэтинил)-2'-дезоксиуридина П.4а в составе олигонуклеотидной цепи при гибридизации с комплементарной последовательностью.

Следующим этапом исследований стал синтез нуклеозидов, несущих остатки двух других флуорофоров - 2-фенилбензоксазола (нуклеозид II.4b) и перилена (нуклеозид П.4с).

Схема II. I ч ^ он он

4>л

4>л он он фл

11.4(1

400 нм Л*. 460 нм фл

Настоящая работа является логическим продолжением этих исследований. В ней описан синтез нуклеозида 11.4(1 и проведено сравнительное исследование спектральных свойств нуклеозидов И.4а-(1 в составе олигонуклеотидов и их дуплексов с комплементарными последовательностями, влияния модификации на термическую стабильность, а также возможности переноса энергии флуоресценции с одного красителя на другой.

Определенный интерес также представляло изучение того, как влияет наличие или отсутствие сопряжения между остатками красителя и нуклеинового основания на физико-химические и спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов. С этой целью был получен амидофосфитный реагент на основе нуклеозида 11.4(1. У этого производного, как и у 5-(перилен-3-илэтинил)-2'-дезоксиуридина Н.4с, присутствует периленильный и этинилурацильный фрагменты, однако сопряжение между ними нарушено введением метоксиметильного мостика.

Синтез амидофосфитного реагента на основе нуклеозида 11.4(1 можно осуществить по вышеприведенной схеме (Схема 11.1). Для ее реализации необходим соответствующий ацетилен - (перилен-З-илметил)пропаргиловый эфир 11.2(1, синтез которого проводили следующим образом (Схема 11.2).

Реагенты ij H3COCHCI2 / TiCl4 / о-дихлорбензол, и) NaBH4 / МеОН / THF, ш) а) КОН / lS-краун-б / THF, б) НС=ССН2Вг

Схема II.2

Перилен II.6 формилировали в условиях реакции Фриделя-Крафтса. Формилирование перилена можно проводить в разных условиях [108,109]; в наших руках наибольший выход дала методика формилирования с использованием 1,1-дихлорметилметилового эфира и хлорида титана(1У) [110]. Реакция протекает гладко при комнатной температуре с образованием единственного изомера - 3-формилперилена - и небольшой примеси продуктов бис-формилирования.

Основной проблемой в данном синтезе является отделение непрореагировавшего перилена II.6 от продукта реакции Н.7. Вследствие очень низкой растворимости в большинстве органических растворителей следовые количества перилена остаются и после перекристаллизации, и после колоночной хроматографии альдегида II.7. Проблема была решена путем использования большего количества растворителя, 1,2-дихлорбензола, чем в оригинальной статье, без его отделения перед колоночной хроматографией продукта II.7. Растворимость перилена II.6 в 1,2-дихлорбензоле достаточно высока, а хроматографическая подвижность на силикагеле (Rf) при элюции этим растворителем равна 1,0, в то время как подвижность продукта II.7 существенно ниже. Таким образом, примесь перилена II.6 выходит с мертвым объемом колонки, и дальнейшую элюцию целевого 3-формилперилена II.7 можно проводить хлороформом. Важно отметить, что при нанесении реакционной смеси на хроматографическую колонку в хлороформе такого результата достичь не удается - перилен II.6 кристаллизуется на неподвижной фазе, в результате чего очень медленно смывается элюентом, загрязняя целевой продукт II.7.

Полученный с выходом 72% 3-формилперилен II.7 в две стадии превращали в целевой (перилен-З-илметил)пропаргиловый эфир II.2d.

На первой стадии по известной методике [111] 3-формилперилен II.7 восстанавливали боргидридом натрия в смеси метанол-тетрагидрофуран. Продукт, 3-гидроксиметилперилен II.8, использовали далее без очистки; это связано с его плохой растворимостью и склонностью к окислению на воздухе.

На второй стадии из спирта II.8 получали алкоголят, который затем алкилировали пропаргилбромидом. Первоначальный вариант генерации алкоголята - обработкой спирта гидридом натрия в DMF - дал низкий выход алкилирования и сильное осмоление реакционной смеси. Поэтому было решено проводить межфазный вариант реакции: 3-гидроксиметилперилен II.8 и 18-краун-6 растворяли в THF, к полученному раствору при сильном перемешивании добавляли равный объем 50% водного раствора КОН. Перемешивание продолжали 30 мин, затем прикапывали пропаргилбромид. В таком варианте реакция протекает с высоким выходом — 93% на две стадии.

Первоначальный вариант синтеза амидофосфитных реагентов представлял из себя следующую схему превращений (Схема II.3).

HN

ОН 11.9

HN O^N

О ^R

АсО. I

ОАс 11.10 о „/R

DMTr-O.

HN

O^N

Yr и)

HN O^N

ОАс 11.11

DMTr-O.

Ш)

HN

O^N ^

ОН 11.4 0

II.5

11.12

Реагенты i) Ас20 / пиридин, и) R—= / Pd(PPh3)4 / Cul / Et3N / DMF, m) NH3 / MeOH / H20, ivj DMTr-Cl / пиридин, v) 1V2NP(C1)0CH2CH2CN / EtNPr'j / CH2C12

Схема II. 3

3',5'-Гидроксильные группы исходного 5-йод-2'-дезоксиуридина 11.9 блокировали ацетильной защитой. Полученное производное 11.10 вводили в реакцию Соногаширы с одним из терминальных ацетиленов. Продукт конденсации 11.11 деблокировали аммиаком с образованием нуклеозида 11.4, который затем последовательно тритилировали и фосфитилировали.

Первый недостаток данной схемы заключается в необходимости превращения гидроксильных групп в ацетоксильные с их последующим деблокированием, т.е. вводятся две дополнительные стадии. Это связано с низкой растворимостью 5-арилэтинил-2'дезоксиуридинов II.4 в пригодных для колоночной хроматографии растворителях. При получении нуклеозидов II.4 непосредственно из 5-йод-2'-дезоксиуридина II.9 невозможно отделить целевой продукт от примесей - преимущественно от исходного нуклеозида и от побочного продукта окислительной димеризации терминального алкина. Второй, менее существенный недостаток схемы - потери ценного промежуточного продукта II.4 на стадии диметокситритилирования (в виде непрореагировавшего исходного вещества или побочного продукта бис-диметокситритилирования).

Экспериментальным путем было установлено, что диметокситритильная защита выдерживает условия реакции Соногаширы. С учетом этого удалось максимально упростить схему получения целевых амидофосфитных реагентов II.5 (Схема II.4).

II.5a-d

Реагенты t) DMTr-Cl / пиридин, и) II.2 / Pd(PPh3)4 / Cul / Et3N / DM F, iu) PrJ2NP(Cl)OCH2CH2CN / EtNPi'j / CH2C12

Схема II.4

Исходный 5-йод-2'-дезоксиуридин Н.9 тритилировали по литературной методике [112]. Полученный 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-йод-2'-дезоксиуридин 11.13 вводили в реакцию Соногаширы с различными терминальными ацетиленами 11.2 [81]. Методика проведения этой реакции в приложении к йодпроизводным нуклеозидов детально описана в литературе [5-7]. Реакцию проводили в ЭМБ с добавлением триэтиламина; нуклеозид, терминальный ацетилен, тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) и йодид меди(1) брали в соотношениях 1 : 1,2 :0,1 : 0,2.

Основная проблема на этой стадии заключалась в неполной конверсии исходного йодида 11.13. Хроматографическая подвижность на силикагеле нуклеозидов 11.12 и 11.13 очень близка в самых разнообразных элюирующих смесях, что очень сильно затрудняет омтг-о очистку нуклеозидов 11.12 методом колоночной хроматографии. Попытки провести полную конверсию производного 11.13, увеличивая загрузку катализаторов и время проведения реакции, приводят к накоплению побочного продукта циклизации - фуранопиримидинона 11.14. Выход из затруднения оказался в добавлении небольшого количества ацетилена II.2 (0,2-0,3 экв.) через 2-3 ч. после начала реакции.

Структура полученных на этой стадии тритилированных нуклеозидов 11.12 (выходы 65-90%) подтверждена методами 'Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения (см. Эксперимент, часть).

Производные 11.12 превращали в целевые амидофосфитные реагенты II.5 взаимодействием с А^Д-диизопропиламино-2-цианэтоксихлорфосфином в хлористом метилене. В качестве амина, необходимого для связывания выделяющегося НС1, использовали АуУ-диизопропилэтиламин. Выходы на этой стадии колеблются в интервале 70-80%; структура амидофосфитных реагентов II.4 доказана 'Н- и 31Р-спектрами, а также масс-спектрами высокого разрешения (см. Экспериментальную часть).

-5311.2 Синтез и исследование гибридизационных свойств модифицированных олигонуклеотидов.

Амидофосфитные реагенты Н.5а-{1 использовали для синтеза модифицированных олигонуклеотидов, структура которых приведена в Табл. ПЛ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Скоробогатый, Михаил Валерьевич, 2007 год

1. Sonogashira К, Tohda Y, Hagihara N A convenient synthesis of acetylenes: catalytic substitutions of acetylenic hydrogen with bromoalkanes, iodoarenes, and bromopyridines. Tetrahedron Lett, 1975 (50), 4467-4470 (1975).

2. Comprehensive Organic Synthesis, т. 3 (под редакцией В. М. Trost, I. Fleming), Pergamon, Oxford, 1991, c. 521-549.

3. Handbook of Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis, т. 1 (под редакцией E. Negishi, A. de Meijere), Wiley-Interscience, New York, 2002, c. 493-529.

4. Robins MJ., Barr PJ. Nucleic acid related compounds. 39. Efficient conversion of 5-iodo to 5-alkynyl and derived 5-substituted uracil bases and nucleosides. J. Org Chem., 48 (11), 1854-1862 (1983).

5. Hobbs F.W. Jr. Palladium-catalyzed synthesis of alkynylamino nucleosides. A universal linker for nucleic acids. J. Org. Chem., 54 (14), 3420-3422 (1989).

6. Robins MJ., Vinayak R.S, Wood SG. Solvent, not palladium oxidation state, is the primary determinant for successful coupling of terminal alkynes with iodo-nucleosides. Tetrahedron Lett., 31 (26), 3731-3734 (1990).

7. Prober J.M., Trainor G.L, Dam RJ., Hobbs F.W., Robertson C.W., Zagursky RJ., Cocuzza A.J., Jensen M.A., Baumeister К A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238 (4825), 336-341 (1987).

8. Коршун В А., Манасова ЕВ, Берлин Ю А. Алкинилированные нуклеозиды и их аналоги. Биоорган, химия, 23 (15), 324-387 (1997).

9. Haralambidis J., Chai М., Tregear G. W. Preparation of base-modified nucleosides suitable for non-radioactive label attachment and their incorporation into synthetic oligonucleotides. Nucl Acids Res., 15 (12), 4857-4876 (1987).

10. Trevisiol E, Defrancq E.,Lhomme J, Laayoun A., Cros P. Synthesis of methylketone containing nucleoside triphosphates for RNA labelling. Tetrahedron, 56 (35), 6501-6510 (2000).

11. Kahl J.D., Greenberg M.M. Introducing structural diversity into oligonucleotides via photolabile, convertible C5-substitued nucleotides. J. Amer. Chem. Soc., 121 (4), 597-604 (1999).

12. Crisp G. T, Gore J. Palladium-catalysed attachment of labels with acetylenic linker arms to biological molecules. Tetrahedron, 53 (4), 1523-1544 (1997).

13. Crisp G.T., Gore J. Preparation of biological labels with acetylenic linker arms. Tetrahedron, 53 (4), 1505-1522 (1997).

14. Furey W. S, Joyce C.M, Osborne MA , Klenerman D., Peliska J A, Balasubramanian S Use of fluorescence resonance energy transfer to investigate the conformation of DNA substrates bound to the Klenow fragment. Biochemistry, 37 (9), 2979-2990 (1998).

15. McKeen C.M., Brown LJ., Nicol J.TG., Mellor JM, Brown T Synthesis of fluorophore and quencher monomers for use in Scorpion primers and nucleic acid structural probes. Org. Biomol. Chem ,1 (13), 2267-2275 (2003).

16. Graham D., Grondin A., McHugh C, Fruk L., Smith W.E Internal labeling of oligonucleotide probes by Diels-Alder cycloaddition. Tetrahedron Lett., 43 (27), 47854788 (2002).

17. Martin V.V., Alferiev IS, Weis A L. Amplified fluorescent molecular probes based on 1,3,5,7-tetrasubstituted adamantine. Tetrahedron Lett, 40 (2), 223-226 (1999).

18. Kawai R, Kimoto M., Ikeda S, Mitsui T., Endo M., Yokoyama S, Hirao I. Site-specific fluorescent labeling of RNA molecules by specific transcription using unnatural base pairs. J. Amer. Chem Soc., 121 (49), 17286-17295 (2005).

19. Okamoto A., Kanatani K, Saito I. Pyrene-labeled base-discriminating fluorescent DNA probes for homogeneous SNP typing. J. Amer. Chem Soc, 126 (15), 4820-4827 (2004).

20. Kalyanasundaram K, Thomas J. K. Solvent-dependent fluorescence of pyrene-3-carboxaldehyde and its applications in the estimation of polarity at micelle-water interfaces. J. Phys Chem., 81 (23), 2176-2180 (1977).

21. Okamoto A., Saito Y., Saito I Design of base-discriminating fluorescent nucleosides. J. Photochem. Photobiol Cm Photochem Rev., 6 (2-3), 108-122 (2005).

22. Ono A., Togashi H. Highly selective oligonucleotide-based sensor for mercury(II) in aqueous solutions. Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 43 (33), 4300-4302 (2004).

23. Okamoto A., Ochi Y., Saito I Modulation of base-selectivity for a base-discriminating fluorescent nucleobase by addition of mercury ion. Bioorg Med Chem. Lett., 15 (19), 4279-4281 (2005).

24. Okamoto A , Ochi Y., Saito I. Fluorometric sensing of the salt-induced B-Z DNA transition by combination of two pyrene-labeled nucleobases. Chem Commun, 2005 (9), 1128-1130 (2005).

25. Okamoto A., Tainaka K, Nishiza K, Saito I. Monitoring DNA structures by dual fluorescence of pyrene derivatives. J. Amer. Chem. Soc., 127 (38), 13128-13129 (2005).

26. Bag SS, Saito Y„ Hanawa K, Kodate S, Suzuka I, Saito I Intelligent fluorescent nucleoside in sensing cytosine base: importance of hydrophobic nature of perylene fluorophore. Bioorg Med. Chem Lett., 16 (24), 6338-6341 (2006).

27. Saito Y, Motegi K, Bag SS, Saito I Anthracene based base-discriminating fluorescent oligonucleotide probes for SNPs typing: synthesis and photophysical properties. Bioorg. Med Chem., 15, in press (2007).

28. Khan SI., Grinstaff M.W. Palladium(0)-catalyzed modification of oligonucleotides during automated solid-phase synthesis. J. Amer. Chem Soc., 121 (19), 4704-4705 (1999).

29. Khan SI., Beilstein AE, Grinstaff MW. Automated solid-phase synthesis of site-specifically labeled ruthenium-oligonucleotides. Inorg Chem, 38 (3), 418-419 (1999).

30. Khan SI., Beilstein A E, Smith G.D, Sykora M, Grinstaff M.W. Synthesis and excited-state properties of a novel ruthenium nucleoside: 5-Ru(bpy)2(4-m-4'-pa-bpy).2+-2'-deoxyuridine. Inorg Chem, 38 (10), 2411-2415 (1999).

31. Khan SI., Beilstein A E, Tierney M.T., Sykora M, Grinstaff MW. Solid-phase synthesis and photophysical properties of DNA labeled at the nucleobase with Ru(bpy)2(4-m-4'-pa-bpy).2+. Inorg. Chem, 38 (26), 5999-6002 (1999).

32. Tierney M.T., Sykora M, Khan S.I, Grinstaff MW Photoinduced electron transfer in an oligodeoxynucleotide duplex: observation of the electron-transfer intermediate. J. Phys. Chem B, 104 (32), 7574-7576 (2000).

33. Minakawa N., Ono Y., Matsuda A. A versatile modification on on-column oligonucleotides using a copper-catalyzed oxidative acetylenic coupling reaction. J. Amer. Chem Soc., 125 (38), 11545-11552 (2003).

34. Sanger F., Nicklen S, Coulson A.R DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 74 (12), 5463-5467 (1977).

35. Dale R.M.K, Livingston D.C., Ward D C. The synthesis and enzymatic polymerization of nucleotides containing mercury: potential tools for nucleic acid sequencing and structural analysis. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 70 (8), 2238-2242 (1973).

36. Langer P.R, Waldrop A A, Ward D.C. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc. Natl. Acad Sci USA, 78 (11), 6633-6637(1981).

37. Confalone P.N. The use of heterocyclic chemistry in the synthesis of natural and unnatural products. J. Heterocycl. Chem, 27 (1), 31-46 (1990).

38. Trainor G.L, Hobbs F.W., Cocuzza A J, Confalone P.N. Synthesis of reagents for fluorescence-tagging of DNA. Nucleosides & Nucleotides, 8 (5-6), 1175-1176 (1989).

39. Bergstrom DE, Ruth J L. Synthesis of C-5 substituted pyrimidine nucleosides via organopalladium intermediates. J Amer. Chem. Soc., 98 (6), 1587-1589 (1976).

40. Trainor G.L, Jensen M.A. A procedure for the preparation of fluorescence-labeled DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase. Nucl Acids Res., 16 (24), 11846 (1988).

41. Nampalli S, Finn P.J., Sun L, Xiao H., Nelson J.R, Grossmann G., Flick P.K, Fuller C.W, Kumar S Negatively charged, dye labeled-dideoxynucleotides for "direct-load" DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1471-1474 (2003).

42. Tabor S, Richardson C.C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl. Acad Sci. USA, 92 (14), 6339-6343 (1995).

43. Rosenblum B.B, Lee L G, Spurgeon SL, Khan SH, Menchen SM, Heiner C R, Chen SM. New dye-labeled terminators for improved DNA sequencing patterns. Nucl Acids Res, 25 (22), 4500-4504 (1997).

44. Hayashizaki Y., Ozawa K.Fujio K, Tanaka I. Preparation of rhodamine dye-labeled 3'-deoxyribonucleotide-5'-triphosphate derivatives as terminators for DNA sequencing. Pat. JP 10158293 (1998).

45. Lee LG., Spurgeon SL, Heiner C.R., Benson SC, Rosenblum B.B, Menchen SM, Graham R.J., Constantinescu A, Upadhaya K.G., Cassel J.M New energy transfer dyes for DNA sequencing. Nucl. Acids Res, 25 (14), 2816-2822 (1997).

46. Ju J., Li Z, Edwards J, Itagaki Y. Massive parallel method for decoding DNA and RNA. Pat. US 6,664,079 (2003).

47. Bi L, Kim D.H, Ju J. Design and synthesis of a cleavable fluorescent nucleotide, 3'-0-allyl-dGTP-PC-bodipy-FL-510, as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis. J. Amer. Chem Soc., 128 (8), 2542-2543 (2006).

48. Meng Q., Kim D.H, Bai X., Bi L., Turro NJ, Ju J. Design and synthesis of a photocleavable fluorescent nucleotide 3'-0-allyl-dGTP-PC-bodipy-FL-510 as a reversible terminator for DNA sequencing by synthesis. J. Org. Chem , 71 (8), 3248-3252 (2006).

49. KumarS, NampalliS, Finn? J, Rao TS, Chen C.-Y., FlickP.K, Fuller C.W. Synthesis and energy transfer efficiency of FRET terminators derived from different linkers. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1595-1598 (2003).

50. Nampalli S, Khot M„ Kumar S. Fluorescence resonance energy transfer terminators for DNA sequencing. Tetrahedron Lett., 41 (46), 8867-8871 (2000).

51. Nampalli S, Zhang W, Rao T.S, Xiao H, Kotra LP., Kumar S Unnatural amino acid derived FRET cassettes, terminators and their DNA sequencing potencial. Tetrahedron Lett., 43 (11), 1999-2003 (2002).

52. Rao T.S, Zhang W., Xiao H., Flick P K, Kumar S, Nampalli S. Synthesis of novel tyrosinyl FRET cassettes, terminators, and their potential use in DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 22 (5-8), 1443-1445 (2003).

53. Rao TS, NampalliS, Zhang W., Xiao H., Kumar S Synthesis of novel piperidinyl based energy transfer terminators and their potential use in DNA sequencing. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 24 (5-7), 801-804 (2005).

54. Jiao G.-S, Thoresen L.H., Burgess K Fluorescent, through-bond energy transfer cassettes for labeling multiple biological molecules in one experiment. J. Amer. Chem Soc., 125 (48), 597-604 (2003).

55. Kim T.G., Castro JC, Loudet A., Jiao G.-S, Hochstrasser R.M, Burgess K, Topp MR. Correlations of structure and rates of energy transfer for through-bond energy-transfer cassettes. J. Phys. Chem A, 110 (1), 20-27 (2006).

56. Базыль O.K., Майер Г.В, Копылова Т.Н., Данилова В И, Чайковский В К. Теоретическое и экспериментальное исследование генерации фенилэтинильных замещенных нафталина. Ж прикл спектроск, 35 (2), 261-267 (1981).

57. Hanhela PJ, Paul D.B Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. I. The phenylethynylation of antraquinone. Aust. J. Chem, 34 (8) 1669-1685 (1981).

58. Hanhela PJ., Paul DB. Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. II. Violet and blue emitters. Aust. J Chem, 34 (8) 1687-1700(1981).

59. Hanhela PJ., Paul D.B Synthesis and evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. III. Yellow and red fluorescent emitters. Aust J. Chem, 34 (8) 1701-1717(1981).

60. Hanhela PJ, Paul D.B Evaluation of fluorescent materials for colour control of peroxylate chemiluminescence. IV. Fluorescence quantum yields of some phenyl and phenylethynyl aromatic compounds. Aust. J. Chem, 37 (3), 553-559 (1984).

61. Devadoss С., Bharathi P., Moore J.S Energy transfer in dendritic macromolecules: molecular size effects and the role of an energy gradient. J. Am Chem. Soc., 118 (40), 9635-9644(1996).

62. Pan Y., Lu M, Peng Za, Melinger JS Synthesis and optical properties of unsymmetrical conjugated dendrimers focally anchored with perylenes in different geometries. J Org Chem, 68 (18), 6952-6958 (2003).

63. Schiedel M-S, Briehn C.A., Bauerle P. Single-compound libraries of organic materials: perellel synthesis and screening of fluorescent dyes. Angew. Chem, Int. Ed, 40 (24), 46774680 (2001).

64. Коршун В А., Манасова ЕВ, Балакин KB, Прохоренко И. А , Бучацкий А Г., Берлин ЮА 5-(1-Пиренилэтинил)-2'-дезоксиуридин, новое флуоресцентное нукпеозидное производное. Биоорган, химия, 22 (12), 923-925 (1996).

65. Korshun VA, Prokhorenko I A., Gontarev S V., Skorobogatyi M.V., Balakin K.V., Manasova EV, Malakhov A.D., Berlin YuA New pyrene derivatives for fluorescent labeling of oligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 16 (7-9), 1461-1464 (1997).

66. Amann N., Pandurski E, Fiebig Т., Wagenknecht H-A. A model nucleoside for electron injection into DNA: 5-pyrenyl-2'-deoxyribose. Angew. Chem, Int. Ed., 41 (16), 2978-2980 (2002).

67. Amann N., Wagenknecht H.-A. Preparation of pyrenyl-modified nucleosides via Suzuki-Miyaura cross-coupling reactions. Synlett, 2002 (5), 687-691 (2002).

68. Amann N., Pandurski E, Fiebig Т., Wagenknecht H-A Electron injection into DNA: synthesis and spectroscopic properties of pyrenyl-modified oligonucleotides. Chem Eur. J, 8 (21), 4877-4883 (2002).

69. Wagenknecht H-A. Reductive electron transfer and transport of excess electrons in DNA. Angew. Chem, Int Ed., 42 (22), 2454-2460 (2003).

70. Korshun V.A, Manasova E.V, Balakin K.V., Malakhov A.D., Perepelov A.V., Sokolova T.A., Berlin Y.A. New fluorescent nucleoside derivatives — 5-alkynylated 2'-deoxyuridines. Nucleosides & Nucleotides, 17 (9/11), 1809-1812 (1998).

71. Hwang G. Т., Seo Y. J., Kim SJ, Kim В. H. Fluorescent oligonucleotide incorporating 5-(l-ethynylpyrenyl)-2'-deoxyuridine: sequence-specific fluorescence changes upon duplex formation. Tetrahedron Lett., 45 (18), 3543-3546 (2004).

72. Hwang G Т., Seo Y. J., Km В H. Pyrene-labeled deoxyuridine and deoxyadenosine: fluorescent discriminating phenomena in their oligonucleotides. Tetrahedron Lett., 46 (9), 1475-1477 (2005).

73. Seo YJ., Kim В H. Probing the 5-to-Z-DNA duplex transition using terminally stacking ethynyl pyrene-modified adenosine and uridine bases. Chem Commun, 2006 (2), 150-152 (2006).

74. Seo Y.J., Hwang G. Т., Kim В H Quencher-free molecular beacon systems with two pyrene units in the stem region. Tetrahedron Lett., 47 (24), 4037-4039 (2006).

75. Hwang G.T., Seo YJ., Kim ВН. A highly discriminating quencher-free molecular beacon for probing DNA. J Amer. Chem Soc., 126 (21), 6528-6529 (2004).

76. Seo Y.J, Ryu J.H., Kim В H Quencher-free, end-stacking oligonucleotides for probing single-base mismatches in DNA. Org Lett., 7 (22), 4931-4933 (2005).

77. Mayer E, Valis L., Wagner C., Rist M., Amann N., Wagenknecht H.-A. 1-Ethynylpyrene as a tunable and versatile molecular beacon for DNA. ChemBioChem, 5 (6), 865-868 (2004).

78. Wagner C., Rist M., Mayer-Enthart E., Wagenknecht H.-A. 1-Ethynylpyrene-modified guanine and cytosine as optical labels for DNA hybridization. Org. Biomol. Chem ,3(11), 2062-2063 (2005).

79. Trifonov A., Raytchev M., Bucharov I, Rist M, Barbaric J, Wagenknecht H.-A., Fiebig T. Ultrafast energy transfer and structural dynamics in DNA. J. Phys Chem B, 109 (41), 19490-19495 (2005).

80. Barbaric J., Wagenknecht H-A. DNA as a supramolecular scaffold for the helical arrangement of a stack of 1-ethynylpyrene chromophores. Org. Biomol. Chem., 4 (11), 2088-2090 (2006).

81. Gaballah ST., Collier G, Netzel T. Charge transfer excited-state dynamics in DNA duplexes substituted with an ethynylpyrenyldeoxyuridine electron source and a fluorodeoxyuridine electron trap. J Phys Chem B, 109(24), 12175-12181 (2005).

82. Thorensen L H, Jiao G.-S, Haaland W.C., Metzker ML, Burgess К Rigid, conjugated, fluoresceinated thymidine triphosphates: syntheses and polymerase mediated incorporation into DNA analogues. Chem Eur J ,9 (19), 4603-4610 (2003).

83. Jiao G.-S, Burgess K. Oligonucleotides with strongly fluorescent groups я-conjugated to a nucleobase: syntheses, melting temperatures, and conformation. Bioorg Med Chem Lett., 13 (16), 2785-2788 (2003).

84. Jiao G.-S, Kim T.G, Topp M.R., Burgess K. A blue-to-red energy-transfer thymidine analogue that functions in DNA. Org. Lett, 6 (11), 1701-1704 (2004).

85. Hurley DJ., Tor Y. Metal-containing oligonucleotides: solid-phase synthesis and luminescence properties. J. Amer. Chem Soc., 120 (9), 2194-2195 (1998).

86. Hurley DJ., Tor Y. Ru(II) and Os(II) nucleosides and oligonucleotides: synthesis and properties. J. Amer. Chem Soc., 124 (14), 3749-3762 (2002).

87. Joshi HS, Tor Y. Metal-containing DNA hairpins as hybridization probes. Chem Commun 2001 (6), 549-550 (2001).

88. Cavigiolio G., Morgan J.L., Robinson BH, Simpson J. Fluorescent sugar and uridine conjugates of 1,8-naphthalimides with methyl and ferrocenyl headgroups. Aust. J. Chem, 57 (8), 885-894 (2004).

89. SesslerJ.L, Jayawickramarajah J., Gouloumis A., Dan Pantos G., Torres Т., Guldi DM Guanosine and fullerene derived de-aggregation of a new phthalocyanine-linked cytidine derivative. Tetrahedron, 62 (9), 2123-2131. (2006).

90. Yang C.J., Pinto M., Schanze K., Tan W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem, Int. Ed. Engl 44 (17), 2572-2576 (2005).

91. Ranasinghe R.T., Brown T. Fluorescence based strategies for genetic analysis. Chem Commun, 2005 (44), 5487-5502 (2005).

92. Вии-Hoi N.P., Long С.Т. Hydrocarbures polycycliques aromatiques. II. La formylation du perylene et du 3-methylperylene. Rec Trav. Chim Pay-Bas, 75(10), 1121-1126(1956).

93. Asseline U., Cheng E. Synthesis and binding properties of perylene-oligo-2'-deoxyribonucleotide conjugates. Tetrahedron Lett., 42 (5), 9005-9010 (2001).

94. Kieche A., Gross H, Hoft E Uber a-Halogenather IV. Synthesen aromatischer Aldehyde mit Dichloromethyl-alkylathern. Chem Ber., 93 (1), 88-94 (1960).

95. Grechishnikova I.V., Johansson L B.-A., Molotkovsky J.G. Synthesis of new bifluorophobic probes adapted to studies of donor-donor electronic energy transfer in lipid systems. Chem Phys. Lipids, 81 (1), 87-98 (1996).

96. Часть промоторной области, кодирующей ген гомолога NG-диметиларгининдиметиламиногидролазы (GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), AF129756, локус DJ01G24 (в составе МНС III, хромосома 6, часть 6р21).

97. Damha M.J., Giannaris Р.А, Zabarylo S.V. An improved procedure for derivatization of controlled-pore glass beads for solid-phase oligonucleotide synthesis. Nucl. Acids Res. 18 (13), 3813-3821 (1990).

98. Manas, SA.E, Kramer F.R., Tyagi S Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucl. Acids Res, 30 (21), el22 (2002).

99. Nazarenko, I., Pires R, Lowe B, Obaidy M, Rashtchian A. Effect of primary and secondary structure of oligodeoxyribonucleotides on the fluorescent properties of conjugated dyes. Nucl. Acids Res., 30 (9), 2089-2095 (2002).

100. De Clercq E. (£)-5-(2-Bromovinyl)-2'-deoxyuridine. Med Res Rev., 25 (1), 1-20 (2005).

101. De Clercq E Strategies in the design of antiviral drugs. Nature Rev. Drug Discovery, 1(1), 13-25 (2001).

102. De Clercq E, Descamps J., Balzarini J., Giziewicz J., Barr P.J, Robins MJ. Nucleic acid related compounds. 40. Synthesis and biological activities of 5-alkynyluracil nucleosides. J. Med Chem, 26 (5), 661-666 (1983).

103. De Clercq E. Highly potent and selective inhibition of varicella-zoster virus replication by bicyclic fiiro 2,3-i/.pyrimidine nucleoside analogues. Medicinal Res. Rev., 23 (3), 253-274 (2003).

104. De Clercq E Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs): past, present, and future. Chem Biodiv., 1 (1), 44-54 (2004).

105. Stang P.J., Напаек M., Subramanian LR. Perfluoroalkanesulfonic esters: methods of preparation and applications in organic chemistry. Synthesis, 1982 (2), 85-126 (1982).

106. Rieche A, Gross H., Hoft E Synthesen aromatischer Aldehyde mit Dichlormethyl-alkylathern. Chem. Ber, 93 (1), 88-94 (1960).

107. Coulson D.R. Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0), Inorg Synth, 13,121-124 (1972).

108. Karrer F. Substituted phenyl derivatives. Pat US 4172146 (1979).

109. Buzby GC., Jr., Edgren R.A, Fisher J.A, Hughes GA., Jones R.C., Ledig K., Pattison T.W., Rees R., Smith H, Smith LL, Teller D.M, Wendt G.R. Oxoestrapolyene ketals as antilipemic agents. J. Med. Chem, 7 (6), 755-758 (1964).

110. Sweet F. Boron estrogens: synthesis, biochemical and biological testing of estrone and estradiol-17P 3-carboranylmethyl esters. Steroids, 37 (2), 223-238 (1981).

111. PuglisiJ.D, Tinoco, Jr. I. Absorbance melting curves of RNA. Meth. Enzymol, 180, 304325 (1989).

112. Борисевич EA , Кныкшто ВН., Козырев А К, Соловьев К. H. Влияние периферийных атомов брома на фотофизические процессы и NH-перестройку в порфириновом макроцикле. Оптика и спектроскопия, 74 (1), 210-218 (1993).

113. Melhuish W.H. Quantum efficiencies of fluorescence of organic substances: effect of solvent and concentration of the fluorescent solute. J. Phys. Chem, 65 (2), 229-235 (1961).