Физиолого-биохимические основы формирования белкового комплекса клейковины пшеницы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, доктор биологических наук в форме науч. докл. Труфанов, Виталий Александрович

• Труфанов, Виталий Александрович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1999

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Труфанов, Виталий Александрович

выводы

1. Выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины пшеницы (Trit i cum aestivua L.), согласно которой фолдинг и стабилизация макроструктурных форм запасных белков эндосперма in vivo ч регулируются системой ферментов тиол-дисульфидного обмена, ката-\црирующих образование, распад и изомеризацию S-S-связей.

2. Установлены особенности биосинтеза и накопления белков на последовательных этапах репродуктивной фазы онтогенеза, отражаю-'щие^скоордини^ системы зерновок. Альбумины, глобулины и глютенины интенсивно синтезируются на самых ранних стадиях развития зерновок, а биосинтез глиадиновых белков происходит в основном в фазе напива.

3. В составе глиадина обнаружены полипептиды со сходной динамикой биосинтеза и накопления, представляющие собой блоки генетически сцепленных компонентов, Генотипически специфичный состав глютенина формируется в процессе налива зерновок, при этом интенсивность синтеза и накопления субъединиц с мол. массой 41, 58 и 111 кДа заметно выше независимо от фазы развития зерновок.

4. Процессы формирования в развивающихся зерновках белковых комплексов, типичных для клейковины семян полной спелости, сопряжены с особенностями пространственной организации запасных белков: а) содержание" регулярных структурных форм, в частности «(-спиралей и р-структур, в глиадине значительно выше, чем в глютенине; пространственная структура функционально важных субфракций глиадина стабильна независимо от фазы спелости зерновок; / б) содержание регулярных белковых структур в глютенине зако-/ номерно возрастает в ходе налива и созревания зерновок; процессы i синтеза субъединиц глютенина и их посттрансляционная модификация \и укладка разобщены во времени; в) формирование и стабилизация глютенина как основы структур-/ного матрикса клейковины совпадают по времени с интенсивным нако-\плением в запасных белках внутри- и межмолекулярных S-S-связей.

5. Формирование макромолекулярных комплексов запасных белков происходит с участием различных стабилизирующих сил: ионно-соле-вых и гидрофобных взаимодействий, водородных и дисульфидных связей, действие которых носит кооперативный характер и существенно зависит от условий среды и биохимической природы полипептидов.

6. В развивающихся зерновках пшеницы координирование функционирует специализированная система ферментов, катализирующих образование (тиол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.8.3.2, линолеат: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.13.11.12), диссоциацию (тиол:протеин-дисульфид оксидоредуктаза, КФ 1.8.4.2) и перегруппировку (тиол: протеиндисульфидизомераза, КФ 5.3.4.1) S-S-связей в белках: а) динамика тиолоксидазной и дисульфидредуктазной активности тесно .дордвлщщ^т с содержанием в запасных белках S-S-связеи и БН^групп. Характер изменения активности дисульфидредуктазы сходен с динамикой активности дисульфидизомеразы и глутатионредуктазы и коррелирует с содержанием в зерровках небелковых тиолов (восстановленный глутатион, цистеин) - кофакторов ферментативного расщепления дисульфидных связей. достоверные изменения S-S/SH-соотношения в клейковинных белках при действии ферментов тиол-дисульфидного обмена in vitro служат независимым экспериментальным подтверждением концепции ферментативной регуляции SH/S-S-статуса запасных белков in vivo. в) ферменты SH/S-S-метаболизма не имеют узкой локачизации в клетке; напичие этих ферментов во фракциях мембран эндоплазмати-ческого ретикулума и белковых тел может быть связано с их участием в фолдинге запасных белков с образованием в эндосперме натив-ных белковых структур как предшественников клейковины физиологически зрелого зерна.

7. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена является генотипически специфичным признаком, завися1Дим~~дт~~фактороз"~~ внешней среды, в том числе от уровня минерального питания растений. Весьма вероятно, что лабильная ферментная система, регулирующая

5-S/SH-равновесие в запасных белках, имеет отношение к изменчивости показателей качества клейковины в меняющихся условиях среды.

8. Активность протеиндисульфидредуктазы и липоксигеназы у линий пшеницы с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 3-й и

6-й гомеологических групп от разнокачественных сортов Диамант 1 и Новосибирская 67 достоверно связана с хромосомами 1А и 6D, в которых, видимо, локализованы структурные и/или регуляторные гены, контролирующие синтез и/или активность этих ферментов. ницы сорта Скала методом ИК-спектроскопии // Физиология роста и развития растений / Иркутск: С-ИФИБР СО АН СССР, 1976. С. 24-25.

6. Чернов А. Б., Березовская Е. В., Левина Н. В., Олехова Г. Н., Кондрашов В.В., Труфачов В. А. Сравнительная характеристика глиадина пшеницы в связи с условиями выращивания // Физиолого-биохи-мические и экологические аспекты устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды /Отв. ред. Р. К. Саляев. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1977. С. 66-70.

7. Чернов А. Б. .Левина Н. В., Труфачов В. А. Динамика биосинтеза отдельных компонентов глиадина и глютенина в созревающем зерне пшеницы //Азотный и белковый обмен растений / Материалы Всесоюзн. симпозиума. Тбилиси, 1978. С. 70-71.

8. Труфанов В. А., Квашонкина Н. Б., Фартышева Н. В., Чернов А. Б. Субъединичный состав глютенинов различных сортов пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СЙФИВР СО АН СССР, 1979. С. 29-30.

9. Макаренко С. П., Труфанов В. А. Дейтерообмен глиадиновых банков клейковины пшеницы // Физиология и биохимия роста и развития растений / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1979. С.45-47.

10. Труфанов В.А., Чернов А.Б. Клейковинные белки пшеницы в зависимости от азотного питания и фазы спелости зерновки // IV Всесоюзный биохимический съезд / Тез. науч. сообщ. М.: Наука, 1979. Т. 3. С. 190.

И. Чернов А.Б.,Левина Н. В., Труфачов В.А. Интенсивность включения 14 С- и Зэ5-метаболитов в различные компоненты глиадина и глютенина в зависимости от фазы развития зерновки // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1980. С. 58-60.

12. Труфанов В.А.,Чернов А. Б. Разобщенность биосинтеза глюте-ниновых белков с процессом формирования надмолекулярных структур клейковины // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1980. С. 55-56.

13. Труфачов В. А., Чернов А. Б., Макаренко С. П., Куделина H.A., Дешко Т.Н. Изучение вторичной структуры белков клейковины пшеницы '// Химия и физика белков и пептидов / Тез. научн. сообщ. V Всесоюзного симпозиума. Баку,. 1980. С. 125.

14. Кузнецов А.Н., Труфанов В. А. Тиол:протеиндисульфид оксидо-редуктазная активность созревающих семян пшеницы // Известия СО СССР. Сер. биол. наук. 1981. Т.З. С. 86-89.'

15. Безносов М. В., Корытов М. В., Козаренко Т.Д., Труфанов В. А. Электрофорез белков в^ цилиндрическом блоке полиакриламидного геля // Электрофоретические методы анализа белков / Новосибирск: Наука, 1981. С. 114-117.

16. Труфанов В. А., Левина Н. В., Кондратов В. В., Глянько А. К. Влияние осеннего заморозка и форм азота на фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков пшеницы // Агрохимия. 1982, N 8. С. 24-27.

17. Чернов А. Б., Труфанов В. А., Березовская Е.В. Формирование вторичной структуры запасных бачков в созревающей зерновке пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири /Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1982. С. 23-27.

18. Чернов А. Б., Труфанов В. А., Макаренко С. П. Пространственная структура запасных белков семян // Химия белков и пептидов / Тез. научн. сообщений VI Всесоюзн. симпозиума. Рига, 1983. С. 222-223.

19. Труфанов В. А., Чернов А. Б., Березовская Е.В. Состав запасных белков сибирских сортов пшеницы и их селекционных форм // Молекулярные механизмы генетических процессов / Тез. научн. сообщений V Всесоюзн. симпозиума. Москва, 1983.

20. Труфанов В. А., Глянько А. К. Фракционный и аминокислотный состав глиадиновых белков в зерне пшеницы при действии осеннего заморозка и в зависимости от формы азота // Устойчивость к неблагоприятным факторам среды и продуктивность растений / Тез. научн. сообщ. Всесоюзн. конф. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1984. С. 33-34.

21. Чернов А.Б., Труфанов В.А. Влияние различных способов выделения на определяемый состав глиадиновых и глютениновых белков пшеницы // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т.21, N 5. С. 665-670.

22. Труфанов В. А. Аминокислотный состав глиадинов в зависимости от условий выращивания и фазы спелости зерна //Условия среды и продуктивность растений. Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 97-104.

23. Труфанов В.А. 0 химической природе белковых фракций клейковины пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 48-51.

24. Труфанов В.А., Чернов А. Б. Особенности биосинтеза отдельных компонентов запасного белка пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 51-54.

25. Труфачов В. А., Чернов А. Б. Биосинтез запасных белков пшеницы в зависимости от условий выращивания // V Всесоюзный биохим. съезд. Тез. научн. сообщений / М.: Наука, 1985. Т. 3. С. 231-232.

26. Кичатинова С. В., Труфачов В. А., Трофимова И. Н. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков пшеницы // У Всесоюзн. биохим. съезд. Тез. науч. сообщений / М.: Наука, 1985. С. 206-207.

27. Труфачов В. А., Березовская -Е. В., Логинов Ю. П. Компонентный состав глиадина и селекционная ценность гибридов яровой пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1985. С. 29-32.

23. Березовская Е. В., Дачиловцева Т.Н., Труфанов В. А. Оценка селекционных признаков пшеницы по компонентному составу запасных белков // Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири / Красноярск: Агропром, 1987. С. 5-6.

29. Кичатинова С. В., Труфачов В. А. К вопросу о субклеточной локализации ферментов тиол-дисульфидного обмена в белках пшеницы // Физиология роста и развития растений в условиях Сибири / Иркутск: СИФИБР СО АН СССР, 1987. С. 54-56.

30. Труфанов В. А., Кичатинова С. В. Дисульфидредуктазная и тиол-оксидазная активности созревающих семян пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1989. Т. 25, N 3. С. 361-367.

31. Труфанов В. А., Хвостова Г. И. 0 характере биосинтеза компонентов глиадина и глютенина в созревающем зерне яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 65-66.

32. Березовская Е. В., Труфанов В. А.", Даниловцева Т. Н., Логинов Ю.П. Изучение адаптационной вариабельности признаков у гибридов яровой пшеницы // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научной конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 117.

33. Назарова Г.Д., Труфанов В. А., Аникеева М.Д.,Казарцева А.Т., Бурдун A.M. Биохимические и технологические признаки качества зерна у яровой пшеницы в.зависимости от условий среды и генотипа // Онтогенетика высших растений / Материалы Всесоюзн. научн. конференции. Кишинев: Штиинца, 1989. С. 194.

34. Аникеева М. Д., Хвостова Г. И., Казарцева А. Т., Труфаноз В. А. Изменчивость качества зерна гТшеницы в зависимости от условий среды и сорта // Пути повышения эффективности с.-х. производства Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 1989. С. 24-25.

35. Дихтярева И. .4., Назарова Г. Д., Останин В, А., Труфанов В. .4. Урожай, технологические и биохимические свойства зерна яровой пшеницы в зависимости от условий минерального питания // Пути повышения эффективности с.-х. производства в Восточной Сибири. Красноярск: Агропром, 1989. С. 25-27.

36. Труфанов В. А. О характере экспрессии генов в развивающемся зерне пшеницы // II съезд Всесоюзного общества физиологов растений / Тез. докл. Минск, 1990.

3?. Труфанов В. А., КичатиноЕа С. В., Шатилов В. Р., Кретович В. Л. Ферменты тиол-дисульфидного обмена белков (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 1990. Т. 26, N 1. С. 3-10.

38. Назарова Г. Д., Труфанов В. А., Останин В. А., Казарцева А. Т. Урожай и технологические свойства зерна яровой пшеницы в зависимости от условий минерального питания // Сибирский вестник с.-х. науки. 1990. N 4. С. 37-42.

39. Труфанов В. А. Возможности электрофоретического анализа в изучении полиморфизма запасных белков // Материалы Всесоюзной конференций "Электрофорез-90" / Рига: Наука, 1990. С. 13-15.

40. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Даииловцева Т.Н. Возможности направленного отбора мутантов яровой пшеницы на зерновую продуктивность // Сиб. вестник с.-х. науки. 1991. N 6. С.36-40.

41. Труфанов В. А. Физиолого-биохимические аспекты формирования белкового комплекса пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т.2. С. 220.

42. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Пермяков А. В. Активность ферментов тиол-дисульфидного обмена в клеточных органеллах развивающихся семян пшеницы // III съезд Всероссийского общества физиологов растений / Санкт-Петербург: Наука, 1993. Т. 2. С: 127.

43. Кичатинова С. В., Труфанов В. А., Пермяков A.B. Тиолоксидаз-ная и дисульфидредуктазная активность клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29, N 3. С. 412-417. ciase and disulfide reductase activities of wheat cell organelles // Appl. Biocheffl. and Microbiol. /Plenum Publ. Corp., 1993, P. 333336. (Translated [43]).

45. Труфаков В. A., Пермяков А. В., Кичатинова С. В. Дисульфидре-дуктазная и тиолоксидазная активности в зависимости от содержания низкомолекулярных тиолов в созревающей зерновке яровой пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 3993. Т. 29, К 5. С. 728-733.

46. Trufanov У. А., Permyakov А. У., Kichatinova S. У. Disulfide reductase and thiol oxidase activity as function of low-molecu-larmass thiol content in developing spring wheat seeds // Apll. Biocheffl. and Microbiol. / Plenum Publ. Corp., 1994. P.542-546. (Translated [45]).

47. Труфанов В.А. Клейковина пшеницы: проблемы качества. Новосибирск: Наука, 1994. 367 с.

48. Trufanov У. А., Kichatinova S. У., Permyakov А. УГ~ The functional role of the enzymes of thiol-disulphide interchange in the formation of the wheat protein complex // Annual Symp. "Physical-chemical basis of plant physiology"/ Penza, 3996. P.143-344.

49. Trufanov У.A. The expression of genes controlling storade protein syntesis in the developing wheat grain // Annual -Вушр. "Physikal-chemikai basis of plant physiology" /Penza, 1996. P.37.

50. Диденко С.Л., Корякина 0. В., Наумова М. С., Труфанов В. А. Продуктивность и качество белка гибридных линий яровой пшеницы от скрещивания сортов Ангара 86 и Целинная 20 //Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю. В. Богородский. Иркутск, 3997. N 7. С. 34-37.

51. Труфанов В. А., Березовская Е. В., Вершинина Г. Г., Пермякова М. Д. Генетический контроль признаков качества пшеницы // Вестник ИГСХА: Сборник научных трудов / Отв. ред. Ю.В. Богородский. Иркутск, 3997. N 6. С. 7-9.

52. Давыдов В. А., Труфанов В. А., Березовская Е. В. Взаимосвязь физиологических и морфологических показателей у различных сортов и линий яровой пшеницы // Физиология и биохимия культурных растений. 3998. Т. 30, N 4. С. 332-317.

53. Труфачов В. А., Кичатинова С. В., Пермяков А. В. Ферменты ти-ол-дисульфидного обмена и их действие на белки клейковины // мягкой яровой пшеницы: молекулярные формы, возможная физиологическая роль // IV съезд Общества физиологов растений России / М. : ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2.' С. 567-568.

57. Труфанов В. А., Митрофанова Т. Н., Дихтярева И. А. Влияние факторов среды на метаболизм запасных белков пшеницы Triticum aestivum L. // IV съезд Общества физиологов растений России / М.: ИФР РАН, 1999. Тез. докл. Т. 2. С. 762.

58. Кичатинова 0. В., Пермякова М. Д., Пшеничникова Т. А., Труфанов В. А., Майстренко 0.И. Эффекты замещения хромосом у пшениц Triticum aestivum L. по активности ферментов SH/S-S-метаболизма // IV съезд Общества физиологов растений России / М. : ИФР РАН, 1999. Т. 2. С. 765.

59. Труфанов В. А., Кичатинова С. В., Казарцева А. Т. ,• Пермяков A.B. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности зерновки пшениц Triticum aestivum L. и их технологические свойства // Прикл. биохимия и микробиол. 2000. Т. 36, M 3. Принята в печать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые детально изучены процессы биосинтеза и накопления запасных белков в развивающихся зерновках яровой мягкой пшеницы. Наиболее характерной чертой биосинтетических процессов является неравномерность в интенсивности синтеза отдельных белков.

На самых ранних этапах развития зерновок интенсивнее синтезируются белки глютениновой фракции, а в фазе налива - глиадиновые белки, особенно с£-глиадины (см. табл. 1 и 2). В составе глиадина выявлены группы синхронно синтезирующихся полипептидов (см. табл. 4), представляющих собой аллельные варианты блоков генетически сцепленных компонентов, кодируемых, как известно [Созинов, 1985], гомологичными локусами хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп.

Следовательно, несмотря на различия в количественном содержании отдельных компонентов глиадина, регуляция их синтеза осуществляется скоординированными механизмами функционирования белоксин-тезирующей системы зерновки. Аналогичным образом, в составе глю-тенина обнаружены группы субъединиц со сходным характером биосинтеза (см. табл. 5). Известно, что высокомолекулярные субъединицы функционального глютенина контролируются генами, локализованными в длинном плече хромосом 1-й гомеологической группы [Bietz, Wall, 1975], однако относительно генетического контроля других субъединиц глютенина имеется крайне мата сведений [Morris, 1998].

Совпадение по времени периода интенсивного накопления в созревающих зерновках высокоагрегированных белковых ассоциатов функционального глютенина (см. табл. 3) с периодами максимального образования в запасных белках S-S-связей (см. рис. 5, А) и с максимумом активности тиолоксидазы, катализирующей реакции окисления SH-групп в полипептидах, при относительно низкой при этом активности дисульфидредуктазы, расщепляющей S-S-связи (см. рис. 5, Б), свидетельствует о взаимозависимости этих показателей in vivo.

Кроме указанных активностей, в развивающихся зерновках нами обнаружены также активность протеиндисульфидизомеразы, катализирующей, как известно [Wang, 1998], реакции ферментативной изомеризации термодинамически напряженных S-S-связей в белковых молекулах, активность липоксигеназы, способной окислять SH-группы остатков цистеина опосредованно через образование перекисных и гидроперекисных радикалов полиненасыщенных жирных кислот [Buttrose, 1963; Кретович, 1991], и активность глутатионредуктазы, регенерирующей восстановленные формы глутатиона - кофактора протеинди-сульфидредуктазы и, вероятно, протеиндисульфидизомеразы. Характер изменения дисульфидредуктазной, дисульфидизомеразной и глутатион-редуктазной активности в процессе развития зерновок совпадал.

Одновременное функционирование в развивающихся зерновках специфических ферментативных активностей позволило выдвинуть гипотезу о системе ферментов, катализирующих оксидоредуктазные S-S/SH-превращения в динамичной системе запасных белков в котрансляцион-ный и/или посттрансляционный периоды.

С учетом этих результатов, а также данных по прямому действию SH-оксидазы и S-S-редуктазы на запасные белки in vitro (см. рис. 8), выдвинута и экспериментально обоснована концепция ферментативного характера формирования в эндосперме белковых ассоциатов как структурных предшественников белкового комплекса клейковины физи-ологичеки зрелого зерна пшеницы.

Более полное представление о роли -S-S-связек и SH-групп в процессах образования белковых макроассоциатов в созревающих зерновках было получено при изучении особенностей пространственной организации запасных белков методами спектроскопии кругового дихроизма и дейтерообмена амидных атомов водорода полипептидных цепей. Оказалось, что в репродуктивной фазе онтогенеза вторичная структура суммарного глиадина и его основных субфракций не зависит от стадии развития зерновок (см. рис. 1, Б и В), в то время как конформационная структура глютениновых белков претерпевает существенные изменения (см. рис. 1, Г). Как и следовато ожидать, структурное состояние белков суммарной клейковины занимает промежуточное положение между глиадиновыми и глютениновыми белками (см. рис. 3, А и рис. 2).

Пространственная организация проламинов злаков с заведомо разнокачественной клейковиной - пшеницы, ржи и ячменя, не имеет принципиальных различий, однако для глиадина пшеницы "характерно сравнительно более высокое содержание d-спирапьных участков (см. рис. 3 и 4). Результаты позволили постулировать, что различия в физических свойствах клейковины этих злаков в большей степени связаны со структурой их глютелиновых белков.

Дальнейшие исследования были направлены на изучение факторов и природы сил внутри- и межмолекулярных взаимодействий и их вклада в белок-белковую агрегацию как процесса, определяющего в конечном счете формирование клейковинного комплекса.

Поскольку способность запасных белков к образованию ассоциа-тов in vitro сильно зависит от рН, ионной силы и состава среды, для получения исходной информации о роли этих факторов в физиологических условиях in vivo необходимо было смоделировать условия, имитирующие внутриклеточные. Экспериментально были определены минимальные концентрации нейтральных солевых ионов в среде агрегации и другие условия, при которых параметры агрегации белков в опыте достоверно отличались от контроля (см. табл. 8-11).

Интерпретируя величину показателя tlO/C (отношение содержания агрегированных форм белка к его концентрации в среде агрегации за 10 мин процесса) в качестве биофизического критерия способности белков к межмолекулярной ассоциации и сопоставляя его значения в контроле к опыте в меняющихся условиях, была дана оценка вклада в белок-белковые взаимодействия ионно-солевых, гидрофобных, водородных и дисульфидных -связей.

Результаты этой серии экспериментов позволили прийти к важному выводу, что независимо от факторов среды процесс агрегации может быть представлен в виде интегральной суммы множества временных состояний взаимодействующих белковых молекул, но в любом случае агрегация запасных белков носит кооперативный характер и является результатом совместного действия различных по природе сил. По нашему мнению, в этом заключается многофакторный характер формирования многокомпонентной макроструктуры клейковины.

Описанный подход к трактовке экспериментальных данных позволил приблизиться к пониманию механизмов самоорганизации белковых молекул in vivo. Существование в нативном эндосперме характерного для клейковины белкового матрикса [Попов, 1979; Батыгина, 1987; Shewry et ai., 1997] косвенно подтверждает наше предположение о том, что, образование белковых ассоциатов в развивающемся эндосперме осуществляется с участием сил, обнаруживаемых нами в экспериментах in vitro.

Результаты исследований процессов синтеза запасных белков, формирования их вторичной структуры in vivo и агрегированных белновых форм in vitro, позволили постулировать, что процесс самоорганизации запасных белков в развивающихся зерновках состоит по крайней мере из трех стадий. На самых ранних этапах развития зерновок вновь синтезированные полипептиды находятся главным образом в виде неупорядоченного клубка. В ходе интенсивных биосинтетических процессов, связаных с наливом зерновок, эти полипептиды претерпевают посттрансляционные преобразования, формируя элементы регулярной вторичной структуры глютенина, в стабилизации которых участвуют в основном водородные связи и гидрофобные взаимодействия неполярных аминокислотных групп полипептидных цепочек.

В дальнейшем, в конце нааива - начале созревания, из субъединиц различной биохимической природы (в том числе альбумино-глобулиновых и глиадиновых) происходит интенсивное формирование промежуточных, но достаточно компактных белковых структур натив-ного глютенина, стабилизируемых межцепочечными S-S-связями, образование которых регулируется ферментами SH/S-S-метаболизма.

Поскольку пространственная структура глиадина и его основных субфракций остается при этом неизменной (см. рис.1), следовательно, именно сложные по компонентному составу белковые ассоциаты глютенина определяют в конечном счете структурный остов клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы.

И наконец, в процессе гидратации запасных белков, в частности при отмывании клейковины или приготовлении теста, глютениновые ассоциаты путем тонкой подстройки молекул глиадина превращаются в уникальную надмолекулярную белковую структуру, стабилизированную всеми силами специфических взаимодействий, включая дисульфидные, водородные и ионно-солевые связи, а также гидрофобные контакты.

Выращивание одной и той же группы сортов пшеницы в разные годы в экологически контрастных зонах страны (Краснодарский край и Иркутская область) позволило определить генотипическую вариабельность и - паратипическую изменчивость основных признаков качества клейковины и удельной активности ферментов тиол-дисульфидного обмена. Реакция различных генотипов пшеницы на действие факторов внешней среды оказалась неоднозначной. Независимо от сорта особенно сильные изменения отмечались по устойчивости теста к релаксации, то есть показателю, который в наибольшей степени может определяться S-S/SH-соотношением в белках клейковины, определяющим плотность ее пространственной упаковки (см. табл. 6, 7 и 13).

55

Аналогичные по сути результаты были получены при изучении влияния на качество- зерна условий минерального питания растений. Основные элементы интенсивной технологии (различные соотношения NPK, способы внесения удобрений, азотные подкормки в разные фазы онтогенеза растений, сеникация и т.д.) в условиях Иркутской области вызывали сходные по характеру, но не равноценные изменения.

Наиболее заметный эффект был получен при выращивании растений на высоком фоне минеральных удобрений Ш60Р60К60), внесенных в рядки при посеве, с последующими некорневыми подкормками в фазах кущения и/или колошения 20%-ным раствором мочевины из расчета 20-30 кг/га (см. табл. 14). В сравнении с контрольными вариантами опыта эти условия приводили к статистически значимому увеличению содержания клейковины и к улучшению ряда показателей качества.

G точки зрения развиваемых в настоящей работе представлений можно.полагать, что действие благоприятных факторов среды на признаки качества клейковины связано не только с созданием оптимальных условий для сбалансированного функционирования белоксинтези-рующей системы в репродуктивный период онтогенеза, но и необходимых условий для образования белковых ассоциатов эндосперма, прежде всего глютенина как структурной основы клейковины.

Выдвинутая концепция ферментативного характера формирования белкового комплекса клейковины основывается на следующих экспериментальных данных: а) на сходстве изменений в соотношениях активности 5Н-оксидаза/5-5-редуктаза и содержания S-S/SH-групп в ходе развития зерновок (см. рис. 6); б) на совпадении по времени максимума тиолоксидазной активности с интенсивным образованием в созревающих зерновках белковых комплексов глютенина (см. рис.1, Г и рис. 5); в) на результатах экспериментов in vitro по прямому действию ферментов на белковые субстраты клейковины (см. рис. 8): г) на различиях в уровнях удельной активности ферментов у разнокачественных сортов пшеницы (см. раздел 3.3); д) на данных по зависимости специфических активностей от факторов внешней среды (см. табл. 6); е) на существовании тесных связей между активностью ферментов и основными показателями качества пшеницы (см. табл. 7); ж) на данных по локализации ферментов в клеточных органел-лах (ЭПР, белковые тельца), имеющих непосредственное отношение к синтезу и запасанию белков (см. рис.9).

Вполне вероятно, что высокая генотипическач вариабельность и весьма сильная модификационнач изменчивость признаков качества клейковины обусловлены особенностями функционирования в меняющихся условиях среды лабильной системы ферментов, регулирующих SH/ S-S-статус запасных белков пшеницы.

В пользу этого представления свидетельствуют также данные о сложной системе регуляции ферментативной активности в развивающихся зерновках с помощью небапковых тиоловых кофакторов (восстановленный глутатион и цистеин). На самых ранних фазах баланс ферментов складывайся в пользу -SH-оксидазы при относительно низком содержании небелковых тиолов. В период налива S-S-редуктазная активность возрастала более высокими темпами параллельно с интенсивным образованием небелковых SH-групп. К началу фазы восковой спелости содержание этих групп снижаюсь, а банане активностей вновь складывайся в пользу SH-оксидазы; при этом S-S/SH-равновесие смещаюсь за счет усиленного образования дисульфидных связей. Изменения в содержании восстановленного глутатиона и цистеина связано, скорее всего, с их участием в реакциях ферментативного расщепления S-S-связей in vivo в качестзе кофакторов, окисленные формы которых затем восстанавливаются с НАДФН-зависимыми соответственно глутатионредуктазой и цистинредуктазой. Тесная взаимосвязь между дисульфидредуктазной активностью и содержанием в зерновках небелковых SH-групп (см. рис. 7) позволяет предположить их важную регуляторную функцию в тиол-дисульфидном обмене.

Сходство динамики дисульфидредуктазной и протеиндисульфидизо-меразной активности позволяет предположить, что эти тиолы могут участвоать и в реакциях ферментативной изомеризациии S-S-связей.

По всей вероятности, тиолоксидаза, дисульфидредуктаза, ди-сульфидизомераза, цистин- и глутатионредуктазы функционируют в клетке в едином (совмещенном) тесте, координирование регулируя не только работу белоксинтезирующей системы в целом, в том числе активность ключевых ферментов транскрипции и трансляции, . но и SH/ S-S-метаболизм запасных белков и, видимо, их фолдинг in vivo.

Высказанное представление является основополагающим в развиваемой концепции ферментативного характера формирования в эндосперме белковых макроассоциатов как структурных предшественников клейковины физиологически зрелого зерна пшеницы.

Описанные в разделе 3.2 результаты по прямому действию ферментного экстракта на клейковинные белки iv vitro позволяли постулировать, что белковая матрица теста, представляющая собой комплекс глкадина и глютенина, может быть укреплена с помощью ферментов, способных изменять S-S/SH-соотношение в клейковинных белках в процессе приготовления теста. Проведенные нами исследования показали реальность использования этих ферментов в качестве биологических улучшителей физических свойств клейковины и консистенции теста вместо применяемых химических окислителей (см. рис.17).

Изучение активности ферментов SH/S-S-метаболизма в зерновках линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 1-й и 6-й гомеологических групп (1 A, IB, ID, 6А, 6В или 6D), несущих, как известно, гены запасных белков в гексаплоидных пшеницах, у высокобелкового, но сравнительно низкокачественного сорта-реципиента Диамант 1, на гомологичные хромосомы от высококачественного сорта-донора Новосибирская 67, показало, что замещение хромосом 1А и 6D оказывает статистически достоверное влияние на изменение липокси-геназной и дисульфидредуктазной активности. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли этих хромосом в синтезе и/или регуляции активности ферментов тиол-дисульфидного обмена и, следовательно, в определении структуры белкового матрикса клейковины.

В целом эти исследования направлены на выяснение путей и возможностей направленного конструирования перспективных геномов яровой мягкой пшеницы методами хромосомной инженерии.

Научно-практические разработки и рекомендации

1. Способ повышения хлебопекарных качеств клейковины из муки слабых сортов яровой мягкой пшеницы с помощью ферментных препаратов растительного происхождения вместо химических улучшителей.

2. Способ оценки и отбора из гибридных популяций ранних поколений перспективных генотипов при селекции пшеницы на качество по составу запасных белков, параметрам их агрегации и величине отношения активности 5Н-оксидаза/8-5-редуктаза.

3. Способ улучшения качества клейковины сибирских сортов яровой мягкой пшеницы путем повышения оксидоредуктазного S-S/SH-no-казателя оптимизацией условий минерального питания растений.