Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SH/SS-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Пермяков, Алексей Викторович

• Пермяков, Алексей Викторович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пермяков, Алексей Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Запасные белки пшеницы.

1.1.1. Глиадины.

1.1.2 Глюгенины

1.1.3. Биосинтез запасных белков

Ф 1.1.4. Отложение белков в запас

1.2. Роль ББ-связей в формировании и стабилизации белкового комплекса клейковины

1.3. Тиол-дисульфидные реакции в белках

1.3.1. Тпол:прогеиндисульфид оксидоредуктаза (КФ 1.8.4.2)

1.3.2. НАДФН:окислеппый глутатион оксидоредуктаза (КФ 1.6.4.2)

1.3.3. НАДФН:тиоредоксин редуктаза (КФ 1.6.4.5)

1.3.4. Тиолгиротеиндисульфид изомераза (КФ 5.3.4.1)

1.3.5. Тиолжислород оксидоредукгаза (КФ 1.8.3.2)

1.3.6. Линолеатгкислород оксидоредуктаза (КФ 1.13.11.12)

1.3.7. Глутагионтрансфераза (КФ 2.5.1.18)

1.4. Сопряженность функционирования системы ферментов БН/БЗ-метаболизма

ГЛАВА

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследования

2.2. Выделение ферментных экстрактов

2.3. Определение содержания белка

2.4. Определение активности тиолгпрогеиндисульфид оксидоредуктазы

2.5. Определение активности липоксигеназы

2.6. Определение содержания БН-групп и ББ-связей в белках созревающих зерновок пшснинм.

2.7. Выделение уксусно-растворимой фракции белков клейковины

2.8. Определение агрегирующей способности запасных белков и показателей качества клейковины

2.9. Очистка ферментов тиол-дисульфидного обмена с помощью

Ф ионообменной хроматографии

2.10. Электрофорез белков ферментных экстрактов

2.10.1. Электрофорез пативных белков в ПААГ

2.10.2. Электрофорез в ПААГ с ДЦСМЧа.

2.10.3. Окраска и обесцвечивание гелей

2.10.4. Окраска гелей нитратом серебра

2.10.5. Определение молекулярной массы белков

2.11. Селективное окрашивание ферментов в пластинках ПААГ

2.11.1. Селективное окрашивание глутатионредуктазы

2.11.2. Селективное окрашивание липоксигеназы

2.12. Капиллярный электрофорез

2.13. Определение константы Михаэлиса-Ментон методом Лайнуивера-Бэрка

2.14. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние протеин-дисульфид редуктазной активности на БН/ЗБ-статус запасных белков в развивающейся зерновке пшеницы .•

3.2. Выделение и определение физико-химических свойств протеиндисульфид редуктазы

3.2.1. Состав белков ферментных фракций, контроль чистоты препаратов

3.2.2. Сродство фермента к различным субстратам.

3.2.3. Оптимум температуры

3.2.4. Оптимум рН

3.2.5. Молекулярная масса фермента

3.3. Действие протеин-дисульфид редуктазы на агрегирующую способность белков клейковины и физические свойства теста пшеницы

3.4. Эффекты замещения хромосом 4 и 5 гомеологических групп по удельной активности липоксигсназы у линий разнокачественных сортов пшеницы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Протеин-дисульфид редуктаза и липоксигеназа пшеницы в ферментативной регуляции SH/SS-обмена в запасных белках зерновки: физиолого-биохимические аспекты»

Белки пшеничного зерна, образующие клейковину, отличаются от запасных белков семян других злаков, прежде всего своими уникальными реологическими свойствами. В зависимости от сорта и условий выращивания пшеницы в зерне формируются белковые комплексы клейковины с очень разными физико-химическими и реологическими свойствами, совокупность которых принято обозначать технологическим термином "качество клейковины". Выделенная из пшеничной муки обычными методами клейковина содержит 80-85 % белка, 10-15 % углеводов и 2-8 % лииидов ( Вакар, 1961). В клейковине высокого качества содержание SS-связей на 22

31 % выше (Кретович, Вакар, 1974). Разнокачественность клейковины у сортов пшениц связана с содержанием и соотношением в ней SS-связей и SI 1-групп (Кретович, 1987, 1991; Труфанов и др., 1993). Существующая в зерновках пшеницы специфическая система ферментов тиол-дисульфидного метаболизма катализирует образование, распад и изомеризацию (перегруппировку) SS-связей в запасных белках, т.е. имеет прямое отношение к созданию SM/SS-статуса запасных белков и, следовательно, к формированию структур!,I белкового комплекса клейковины (Труфанов,

1994).

В этом отношении представляют интерес данные о функционировании в зерновке пшенице системы НАДФН-зависимой тиоредоксинредуктазы (Suskc et al., 1979; Kobrehel et al., 1992; Wong et al., 1996), НАДФН-зависимой иротеиидисульфид оксидоредуктазы (Hatch et al., 1960; Горпинчснко и др., 1972, 1975), глутатион-зависимой протеиндисульфид оксидоредуктазы (Кузнецов, Труфанов, 1981; Труфанов, Кичатинова, 1989), восстанавливающих SS-связи в запасных белках пшеницы, и НАДФНзависимой глутатионредуктазы, восстанавливающей SS-связи окисленного глутатиона (Проскуряков, Зуева, 1963, 1964; Lascano et. al., 2001). НАДФНзависимая протеин-дисульфид изомераза катализирует перегруппировку в белках термодинамически напряженных SS-связей (Grynberg et al., 1977; Shimoni et al., 1995; Galili et al., 1996).

Имеются сведения об участии линоксигеназы в образовании SS-связей в запасных белках пшеницы путем опосредованного окисления SH-групп перекисями и гидроперекисями ненасыщенных жирных кислот (Кретович, 1991; Shiiba, 1991).

Ферментативное окисление сульфгидрильных групп запасных белков может происходить с помощью кислород-зависимых тиолоксидаз (Труфанов и др., 1989), подобных тиолоксидазам животных клеток (Lash, Jones, 1984, 1986). Участие в тиол-дисульфидных реакциях в запасных белках пшеницы могут принимать также глутатионтрансфераза (Pascal et al., 1988) и глугатион-зависимая дегидроаскорбат оксидоредуктаза (Every, 1996; De Gara et al., 2002).

Таким образом, в зерновке пшеницы одновременно функционирует сложная система специфических ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и регулирующих SH/SS-статус белков в клетке. Катализируя образование, распад пли перегруппировку термодинамически напряженных SS-связей и обеспечивая оптимальный уровень низкомолекулярных тиолоиых кофакторов (например, глутатионредуктаза), эти ферменты участвуют в регуляции процессов тиол-дисульфидного обмена в зерновках in vivo.

Одни из этих ферментов изучены более хорошо, другие недостаточно. Так, протеин-дисульфид редуктаза, катализирующая восстановление SS-связей в белках, слабо изучена в объектах растительного происхождения. Линоксигеназа, наоборот, являясь многофункциональным ферментом, часто привлекает внимание исследователей.

Цель настоящей работы заключалась в изучении физиолого-биохимических аспектов регуляции тиол-дисульфидного обмена в развивающейся зерновке пшеницы на примере трех ферментов: протеин-дисульфид редуктазы, глутатионредуктазы и липоксигеназы участвующих в создании БМ/БЗ-статуса запасных белков.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить динамику протеин-дисульфид редуктазной активности и содержание небелковых БН-групп в процессе созревания зерновки пшеницы.

2. Выделить в гомогенном состоянии протеин-дисульфид редуктазу пшеницы с использованием методов солевого фракционирования, колоночной хроматографии и электрофореза в ПААГ.

3. Изучить биохимические характеристики очищенного фермента.

4. Изучить компонентный состав ферментного экстракта методами нативного и денатурирующего электрофореза в пластинках ПААГ.

5. Выявить молекулярные формы исследуемых ферментов в созревающей зерновке пшеницы.

6. Изучить особенности проявления активности липоксигеназы у разнокачественных сортов и линий пшеницы с межсортовым замещением хромосом 4 и 5 гомеологических групп.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, главы с результатами и их обсуждением, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включая восемь таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 246 наименований, из них 46 на русском языке.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Пермяков, Алексей Викторович

выводы

1. В созревающей зерновке пшеницы одновременно присутствуют липоксигеназа, способная окислять SII-группы белков и система -НАДФН, НАДФН-зависимая глутатиоиредуктаза, глутатиои и протеин-дисульфид редуктаза - катализирующая реакции восстановления SS-связей в белковых молекулах и регенерацию окисленного глутатиона.

2. Из зерновок пшеницы выделен в гомогенном состоянии фермент с тиол:протеиндисульфид оксидоредуктазной активностью, подобный глутатион:инсулин трансгидрогеназе из животных и микробиологических объектов.

3. Протеин-дисульфид редуктаза пшеницы имеет коистаиту Михаэлиса-Меитои 2.18 мкМ для инсулина и 570 мкМ для БСА. Фермент имеет оптимум рН от 6.5 до 7.5 ( max 7.0), а температуры от 33 до 38 С° ( шах 36 С0). Молекулярная масса фермента, состоящего из двух субъединиц с молекулярной массой 73 и 77 кДа, составляет 167 кДа.

4. Динамика активности протеин-дисульфид редуктазы в ходе развития зерновки пшеницы тесно коррелирует с активностью глутатионредуктазы (г = 0.76), а также с содержанием в запасных белках SS-связей и SH-групп.

5. В модельных экспериментах in vitro протеии-дисульфид редуктаза оказывает существенное влияние на SH/SS-баланс в белковом комплексе клейковины, изменяя агрегирующую способность запасных белков; силу муки, упругость, растяжимость, устойчивость и величину P/L. При этом степень изменений зависит от генотииических особенностей пшеницы и сорта муки.

6. В зерновках мягкой яровой пшеницы полной спелости, вероятно, присутствуют три молекулярные формы протеин-дисульфид редуктазы и две - глутатионредуктазы. Установлено, что специфическая активность протеин-дисульфид редуктазы не зависит от типа глутатионредуктазы.

В зерновках мягкой яровой пшеницы различных сортов и линий с межсортовым замещением хромосом присутствуют 3 формы лииоксигеназы, различающиеся поверхностным зарядом молекулы. Наибольший вклад в проявление активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных экспериментов по изучению тиол-дисульфидного обмена в запасных белках зерновки пшеницы, установлено, что в регуляции этого процесса решающее значение имеют тиоловые кофакторы, такие как глутатион, выполняющий донорно-акценторные функции в ферментативном катализе при расщеплении ЗБ-связей. Глутатион-зависимая протеин-дисульфид редуктаза проявляет наибольшую активность в присутствии восстановленного глутатиоиа, регенерация которого происходит с помощью глутатионредуктазы, расщепляющей окисленный глутатион. При исследовании серии генотипически различных сортов мягкой яровой пшеницы выявлена тесная сопряженность содержания низкомолекулярных БН-соединений (восстановленного глугатиона) с активностью протеин-дисульфид редуктазы. При этом на физиологически разных стадиях развития зерновки у различных сортов наблюдалась однотипная зависимость. С фазы формирования зерновок начинался интенсивный синтез низкомолекулярных БН-соединений, в основном Г-БН -тиолового кофактора ферментативного восстановления ББ-связей в белках. В ходе дальнейшего развития зерновки количество низкомолекулярных БН-соединений возрастало и на стадии молочной спелости (при влажности зерновки около 50%) достигало максимума, а с наступлением фазы тестообразной спелости содержание низкомолекулярных БН-груин снижалось параллельно со снижением протеин-дисульфид редуктазной активности. Интенсивное образование небелковых БН-соединепий сопровождалось увеличением активности протеин-дисульфид редуктазы, при этом максимум содержания тиоловых кофакторов совпадал с максимумом БЗ-редуктазной активности. Наличие сильной корреляционной связи (г=0.76) свидетельствует о важной роли глутатионредуктазы в регуляции нрогеин-дисульфид редуктазной функции фермента, т.е. о функциональной взаимосвязи этих ферментов в процессах создания и регуляции SII/SS-статуса запасных белков.

Эксперименты по очистке протеин-дисульфид редуктазы из зерновок пшеницы методами дробного фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на ДЕЛЕ А-50, позволили очистить этот фермент до электрофоретически чистого состояния. В результате были изучены некоторые биохимические характеристики и свойства протеин-дисульфид редуктазы пшеницы и сопоставлены с аналогичными по функциям ферментами. Так при молекулярной массе нативного белка 167 кДа и субъединичиому составу 73 и 77 кДа, протеин-дисульфид редуктаза пшеницы отличается от подобных ферментов из других объектов. По молекулярной массе протеин-дисульфид редуктаза не является протеин-дисульфид изомеразой (57 кДа (Freedman et al., 1994) и 60 кДа (Shimoni et al., 1995)), и тиоредоксииредутазой (35 кДа (Kobrehel et al., 1992)), способных, по литературным данным также восстанавливать SS-связи в запаенглх белках зерновки пшеницы. По субстратной специфичности фермент близок к тиол:нротеиндисульфид оксидоредуктазам из различных объектов, способен катализировать инактивацию инсулина путем восстановления SS-мостиков между А- и В-цепочками белка, ио имеет различие в константе Михаэлиса-Ментона. По оптимуму рН 7.0 фермент близок протеин-дисульфид редуктазе из холерного вибриона (Ruddock et al., 1996), а оптимуму температуры 36°С -к ферментам из животных объектов (Carmichael et al., 1979).

При действии протеин-дисульфид редуктазы на уксуснорастворимую фракцию клейковинных белков пшеницы выявлено снижение агрегирующей способности при внесении фермента но сравнению с контролем. Различие в величине показателя агрегации Тю/С между контролем и опытом составляла в среднем от 15 до 22%. Показатель агрегации Тю/С (за 10 мин процесса) контроля составлял 134.1 ± 4.6 при опыте 114.6 ± 1.2, что говорит о снижении агрегирующей способности клейковинных белков при добавлении фермента. На примере двух сортов разного качества - Granmulino и Мироновская 808 показано изменение физических свойств теста даже при слабом действии протеин-дисульфид редуктазы (малое соотношение фермент/субстрат).

На основе полученных результатов можно предположить, что в зерновках пшеницы (Triticum ciestivum L.) одновременно с двумя системами ферментативного восстановления SS-связей в запасных белках пшеницы -ПАДФН, НАДФН-зависимая тиоредоксинредуктаза, тиорсдоксин и НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и глутаредоксин (Rouhier et al., 2002), существует третья система - НАДФН, НАДФН-зависимая глутатионредуктаза, глутатион и протеин-дисульфид редуктаза (рис.32).

Рис. 32. Гипотетическая схема восстановления SS-связей в белках 11 ротеи н-ди сул ьфид реду ктазой.

GR-глутатионредуктаза; RED-протеин-дисульфид редуктаза.

Как уже отмечалось, наш интерес к липоксигеназе обусловлен, прежде всего, участием этого фермента в образовании оксидных радикалов, способных окислять in vivo SH-группы запасных белков пшеницы с образованием внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей, стабилизирующих белковый комплекс клейковины. Это обстоятельство имеет важное значение при разработке теоретических основ для создания новых генотипов (сортов) пшеницы методами хромосомной инженерии. Действительно, межсортовое замещение определенных хромосом у высокобелковых, но с низким качеством клейковины сортов реципиентов, на гомологичные хромосомы высококачественных сортов доноров, несущих основные структурные и/или регуляторные гены липоксигеназы, перспективно для обогащения реципиентов этим ферментом и улучшения реологических показателей теста и качества клейковины на уровне copra.

На примере неродственных сортов мягкой яровой пшеницы Саратовская 29 и Janetzkis Probat и их линий с межсортовым замещением отдельных пар хромосом 4-й и 5-й гомсологических групп нами были изучены вклады хромосом 4А, 4В, 4D, 5А, 5В и 5D в проявление активности липоксигеназы. В результате исследований было установлено, что наибольшее влияние на проявление удельной активности липоксигеназы оказывают структурные гены, локализованные на хромосомах 4А и 5А. Однако, учитывая то, что регуляция активности данного фермента носит полигенный характер (Li et al., 1999), возможно важную роль играют также гены-регуляторы, расположенные на других хромосомах.

Снижение удельной активности липоксигеназы при замещении хромосом 4В, 4D, 5В и 5D, вероятно, объясняется тем, что хромосомы сорта-донора Janetzkis Probat несут такие аллели липоксигеназы, которые не могут компенсировать активности соответствующих аллелей сорта-реципиента Саратовская 29. Имеются данные, что суммарная генетическая активность липоксигеназы у сорта обеспечивается генами шестью хромосом 4 и 5 гомсологических групп (Li et al., 1999). При замещении отдельных пар хромосом, естественно, нарушается этот генетически сбалансированный комплекс. Тем не менее, исходя из полученных результатов, при создании генотипов с высокой активностью фермента следует учитывать основополагающую роль хромосом 4А и 5А.

При исследовании ферментных экстрактов электрофоретическими методами с селективным окрашиванием в ПААГ нами обнаружено наличие грех, отличающихся по заряду форм липоксигеназы как у разных сортов (Permyakov et al., 2002), так и у замещенных линий по хромосомам 4 и 5 гомсологических групп (Пермяков и др., 2000).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пермяков, Алексей Викторович, 2004 год

1. Асриян И.С., Зуева Е.С., Проскуряков Н.И. // Прикл. биохимия и микробиол. 1965. Т.1. С. 500-504.

2. Батыгииа Т.Б. Хлебное зерно ( аглас). Л.: Наука, 1987. 103 с.

3. Борисова И.Г., Чеиуренко Н.В., Будницкая Е.В. Разделение молекулярных форм липоксигеназы семян гороха // Биохимические методы. М.: Наука. 1980. С. 34-39.

4. Вакар А.Б. Белковый комплекс клейковины // Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975. С. 38-58.

5. Вакар А.Б., Демидов B.C., Забродина Т.М. Исследование физико-химических различий клейковины разного качества // Прикл. биохимия и микробиология. 1972. Т. 8. С. 292-303.

6. Василенко И.И., Комаров В.И. Оценка качества зерна. Справочник. М.: Агропромиздат. 1987.

7. Голицин В.М. Неденатурирующий электрофорез. Фракционирование фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и белков плазмы крови // Биохимия. 1999. Т. 64. С. 44-51.

8. Горпинченко Т.В., Забродина Т.М, Вакар А.Б. Изменение сульфгидрильных групп и дисульфидных связей в белках при созревании и прорастании пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1972. Т. 8. С.386-390.

9. Горпинченко Т.В., Вакар А.Б., Кретович В.Л. Исследование протеиндисульфидредуктазы пшеницы // Биохимия. 1975. Т.40. С. 323330.

10. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.:Мир, 1982. Т. 1. 392 с.

11. Евстигнеева З.Г., Соловьева H.A., Сиделышкова Л.И. Структура и функции шаиеронов п шаиеронннов (обзор) // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. С. 5-18.

12. Заиров С.З. Накопление и обмен белков в зерне пшеницы. Алма-Ата: Наука, 1987. 176 с.

13. Кичатииова C.B., Труфанов В.А., Пермяков A.B. Тиолоксидазная и дисульфидредуктазная активности клеточных органелл пшеницы // Прикл. биохимия и микробиология. 1993. Т. 29. С. 412-417.

14. Кичатииова C.B. Ферменты тиол-дисульфидного обмена и их роль в формировании белкового комплекса зерновки пшеницы: Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. Иркутск. 1997. 27 с.

15. Колесниченко A.B., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 624-630.

16. Коиарев В.Г. Белки пшеницы. М.: Колос. 1980, 351 с.

17. Конарев В.Г. Белки растений как генетические маркеры. М.: Колос, 1983.320 с.

18. Коиарев В.Г., Гаврилкж И.П., Губарева II.К. О природе ппотенина пшеницы по данным иммупохимического анализа // Докл. ВАСХНИЛ. 1970. №. 7. С. 16-18.

19. Кретович В.Л. Биохимия зерна и хлеба. М.: Наука, 1991. 133 с.

20. Кретович В.Л., Вакар А.Б. Роль водородных и дисульфидных связей в структуре биополимеров зерна // С.-х. Биология. 1974. Т. 9. С. 175-186.

21. Кударов Б.Р. Изменение соотношения S-S/SH-груии в запасных белках созревающего зерна пшеницы // Биологическое развитие микроорганизмов и растений. Алма-Ата: Наука. 1978. С. 121-127.

22. Кузнецов А.Н., Труфанов В.А. Тиол:прогеин-дисульфидоксидоредук-тазная активность созревающих семян пшеницы // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1981. Т. 3. С. 86-89.

23. Мииеев В.Г., Павлов А.Н. Агрономические основы повышения качества зерна пшеницы. М.: Колос, 1981. 228 с.

24. Осборн Т.Б. Растительные белки. М.; Л.: Биомедгиз, 1935. 320 с.25