Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Казаков, Алексей Сергеевич

• Казаков, Алексей Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Казаков, Алексей Сергеевич

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Классификация белков теплового шока. Малые белки теплового шока.

1.2. Структура малых белков теплового шока

1.3. Шапероноподобная активность малых белков теплового шока

1.4. Общие сведения об Hsp

1.5. Роль малых белков теплового шока в наследственных заболеваниях

1. 6. Белки с разупорядочепной третичной структурой 31 1.7. Белки с непрерывным тепловым переходом

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Материалы и методы

2.1. Препаративные методы

2.1.1. Получение компетентных клеток

2.1.2. Экспрессия и выделение Hsp

2.1.3. Выделение актина из ацетонового порошка [Spudich and Watt, 1971].

2.1.4. Выделение изолированных головок миозина (субфрагмент 1 миозина, SI) ^ из глицениризированного препарата миозина.

2.2. Флуоресцентные методы исследования 52 2.2.1. Измерение спектров собственной триптофановой флуоресценции

2.2.2. Разложение спектров флуоресценции согласно модели дискретных состоянии

2.2.3. Динамическое тушение флуоресценции анионами Г. Определение доступности остатков триптофана тушителю.

2.2.4. Использование метода флуоресцентной спектроскопии для исследования связывания АТР с Hsp22.

2.2.5. Определение параметров связывания Bis-ANS с Hsp22 дикого типа и его ^ точечного мутанта К141Е

2.2.6. Исследование тепловой денатурации Hsp22 по флуоресцентным ^ параметрам

2.2.7. Исследование флуоресценции тиофлавина Т.

2.2.8. Исследование денатурации Hsp22 в присутствии мочевины.

2.3. Спектроскопия кругового дихроизма

2.4. Изучение вторичной структуры Hsp22 методом инфракрасной ^ спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR)

2.5. Изучение структуры белка методом ограниченного протеолиза

2.5.1. Сравнение устойчивости к протеолизу Hsp22 и его точечных мутантов

2.5.2. Влияние АТР на ограниченный протеолиз Hsp

2.6. Изучение четвертичной структуры Hsp22 и его точечных мутантов методом химического сшивания диметилсуберимидатом (ДМС) и глутаровым 67 альдегидом

2.7. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом аналитического ^^ ультрацентрифугирования

2.8. Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)

2.9. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации

2.10. Термо-гель анализ Hsp

2.11. Определение шапероноподобной активности Hsp22 и его мутантов

2.11.1. Определение шапероноподобной активности с инсулином

2.11.2. Определение шапероноподобной активности с роданазой

2.11.3. Определение шапероноподобной активности с F-актином

2.11.4. Определение шапероноподобной активности с S

2.12. SDS-Электрофорез в ПААГ

3. Результаты исследования

3.1. Некоторые физико-химические свойства Hsp22 и его точечных мутантов

3.1.1. Флуоресцентные свойства Hsp

3.1.2. Изучение вторичной структуры Hsp22 и его мутантов методом спектроскопии кругового дихроизма.

3.1.3. Изучение структуры Hsp22 и его точечных мутантов методом ограниченного протеолиза

3.2. Четвертичная структура Hsp22 и его точечных мутантов

3.2.1. Изучение четвертичной структуры Hsp22 с помощью химического сшивания диметилсуберимидатом

3.2.2. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом седиментационпого анализа

3.2.3. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом

3.2.4. Динамическое лазерное светорассеяние

3.3. Исследование гидрофобных свойств Hsp22 и его точечных мутантов с помощью гидрофобного зонда Bis-AJSS

3.4. Шапероноподобная активность Hsp22 и его точечных мутантов

3.4.1. Измерение шапероноподобной активности с использованием инсулина в ^ качестве субстрата

3.4.2. Измерение шапероноподобной активности с использованием роданазы в ^^ качестве субстрата

3.4.3. Измерение шапероноподобной активности с использованием субфрагмента 1 миозина в качестве субстрата

3.5. Особенности тепловой денатурации Hsp

3.5.1. Индуцированные температурой изменения триптофановой флуоресценции Hsp22 и его точечных мутантов

3.5.2. Исследование тепловой денатурации Hsp22 методом ДСК

3.5.3. Изменения вторичной структуры Hsp22 в процессе тепловой денатурации

3.5.4. Изменения гидрофобных свойств Hsp22 в процессе тепловой ^ денатурации

3.5.5. Тепловая денатурация Hsp22 и его шапероноподобная активность

4. Обсуждение результатов

4.1. Hsp22 - белок с сильно разупорядоченной третичной структурой

4.2. Влияние точечных мутаций К137Е, К141Е и К137/141Е на структуру и функции Hsp

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека»

Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высоко консервативного участка, который впервые был обнаружен в а-кристаллинах хрусталика глаза и получил название кристаллинового домена.

Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. In vivo sHsp вовлечены в большое количество разнообразных процессов, таких как усиление устойчивости к стрессам, регуляция динамики актиновых и промежуточных филаментов, ингибирование апоптоза, изменение текучести мембран и др.

В настоящее время у человека описано 10 малых белков теплового шока. Из них подробно изучены только аА- и аВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl).

Сравнительно недавно появились первые сведения о малом белке теплового шока человека с кажущейся молекулярной массой 22 кДа (Hsp22, также обозначаемом как HspB8 или Н11 киназа). Точечные мутации К141Е или K141N в Hsp22 коррелируют с развитием тяжелых нейропатий. Мутация Hsp22 по данному остатку гомологична мутации Hsp27 по 140 остатку, и в случае Hsp27 также приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний. В структуре Hsp27 есть еще несколько аминокислотных остатков, подверженных мутациям, и в их числе - остаток 136. Мутация этого остатка также сопровождается развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний. Высказывается предположение о том, что в структуре малых белков теплового шока есть своеобразные «горячие точки», мутации которых приводят к развитию врожденных заболеваний. Структура и свойства Hsp22 изучены недостаточно полно и поэтому до последнего времени не было сведений о том, как влияют мутации вблизи так называемых «горячих точек» на структуру и свойства Hsp22. Тем не менее, имеющиеся в литературе сведения позволяют предположить, что Hsp22 отличается по своей структуре от других малых белков теплового шока; было даже высказано предположение о том, что Hsp22 принадлежит к быстро растущему семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (т.н. "intrinsically disordered proteins", ГОР). Все эти предположения требовали подтверждений. Вследствие этого, одной из главных целей данной работы стало подробное исследование физико-химических свойств Hsp22 (в частности, проверка предположения о его принадлежности к семейству IDP). Другой не менее важной целью настоящей работы было исследование свойств трех мутантов Hsp22 с точечными заменами остатков 137 и 141 (К137Е, К141Е и К137/141Е), расположенных в области, наиболее подверженной мутациям в других малых белках теплового шока. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Различными методами исследовать особенности вторичной, третичной и четвертичной структуры Hsp22, включая подробное изучение процесса его тепловой денатурации.

2. Изучить влияние точечных замен К137Е, К141Е и К137/141Е в молекуле Hsp22 на его структурные свойства и шапероноподобную активность.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые проведен детальный анализ структуры и свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека. Получены убедительные доказательства наших предположений о том, что Hsp22, в отличие от всех исследованных к настоящему времени малых белков теплового шока, относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (IDP). В работе был применен практически весь набор методов, позволяющих изучать изменения во вторичной и третичной структуре белка в процессе его тепловой денатурации. Оказалось, что разные методы, использованные для исследования тепловой денатурации Hsp22, дают разные результаты: они либо вообще не выявляют выраженных тепловых переходов, либо выявляют их, но при этом температура полуперехода может существенно варьировать в зависимости от используемого метода. Именно такой тип поведения был ранее предсказан при математическом моделировании процесса тепловой денатурации белков, демонстрирующих непрерывный переход ("downhill unfolding"), и наши данные являются одним из первых экспериментальных подтверждений этого предсказания. При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 установлено, что он, в отличие от других малых белков теплового шока человека, не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока. Показано, что точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22 и снижают его шапероноподобную активность; именно этим, по-видимому, можно объяснить тот факт, что подобные мутации в малых белках теплового шока ассоциированы с развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний.

Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств малых белков теплового шока, а также представляют несомненную важность для исследования тех функций, которые Hsp22 осуществляет в клетке. Разработанные в процессе работы экспериментальные подходы - такие, например, как параллельное исследование температурных зависимостей различных параметров, измеряемых разными методами, могут использоваться (и уже успешно используются) для структурно-функциональных исследований других белков.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Казаков, Алексей Сергеевич

Выводы

Проведено комплексное изучение физико-химических свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека с использованием методов флуоресценции, спектроскопии кругового дихроизма, дифференциальной сканирующей калориметрии, инфракрасной спектроскопии, аналитического ультрацентрифугирования, динамического светорассеяния, химического «сшивания» и ограниченного протеолиза трипсином. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 показано, что он существует в растворе в виде равновесной смеси мономеров, димеров и тетрамеров. При этом не обнаружено более крупных олигомеров, характерных для большинства других малых белков теплового шока человека, исследованных к настоящему времени.

2) Установлено, что более половины молекулы Hsp22 обладает неупорядоченной третичной структурой, хотя некоторые, относительно небольшие участки молекулы являются более или менее упорядоченными.

3) Исследования процесса тепловой денатурации Hsp22 показали, что при использовании интегральных методов (дифференциальная сканирующая калориметрия, спектроскопия кругового дихроизма) Hsp22 демонстрирует непрерывный тепловой переход, тогда как при исследовании температурных зависимостей триптофановой флуоресценции обнаружен четкий кооперативный переход, для которого были рассчитаны термодинамические параметры. Сделан вывод о том, что этот переход отражает локальную денатурацию небольшой, но достаточно хорошо упакованной части а-кристаллинового домена Hsp22, содержащей остаток триптофана 96.

4) Точечные замены аминокислотных остатков К141Е и К137Е (и особенно двойная замена К141/137Е) оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22, что заметно отражается на его функциях: эти замены значительно снижают термостабильность Hsp22 и приводят к уменьшению его шапероноподобной активности.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Казаков, Алексей Сергеевич, 2009 год

1. Клюева А.В., Левчук Ю.Н., Набока Ю.Н. (2002) Фотон-корреляционная спектроскопия белков, Укр. биохим. журнал, т. 74, №5, с. 12—26.

2. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии т. 43, 59—98

3. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. Наука, Москва, 2003.

4. Пивоварова А.В. «Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина». Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 2008 г.

5. Попов Е.М., Демин В.В., Шибанова Е.Д. «Проблема белка». Москва, 1996 г., т. 2. С. 418-421.

6. Финкельштейн А.В., Иванков Д.Н., Галзитская О.В. (2005) Предсказание скоростей и ядер сворачивания глобулярных белков на основе теории их самоорганизации. Успехи биологической химии, т. 45, С. 3-36.

7. Abulimiti A., Fu X., Gu, L., Feng X. and Chang Z. (2003). Mycobacterium tuberculosis Hspl6.3 nonamers are assembled and re-assembled via trimer and hexamer intermediates. J. Mol. Biol. 326, 1013-1023.

8. Agius M.A., Kirvan C.A., Schafer A.L., Gudipati E., Zhu S. (1999) High prevalence of anti- alpha-crystallin antibodies in multiple sclerosis: correlation with severity and activity of disease. Acta Neurol. Scand. 100, 139-147.

9. Andley U.P., Mathur S., Griest T.A. and Petrash J.M. (1996) Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alphaA-crystallin. J. Biol. Chem. 271, 31973-31980.

10. Barth A, Zscherp C. (2002) What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430.

11. Bera S., Thampi P., Cho W.J., Abraham E.C. (2002) A positive charge preservation at position 116 of alphaA-crystallin is critical for its structural and functional integrity. Biochemistry 41, 12421-12426.

12. Bhattacharyya J., and Sharma K.K. (2001) Conformational specificity of mini-aA-crystallin as a molecular chaperone. J. Peptide Res. 57, 428-434.

13. Bhattacharyya J., Padmanabha Udupa E. G., Wang J., and Sharma K.K. (2006) Mini-alphaB-crystallin: a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-like activity. Biochemistry 45, 3069-3076

14. Bova M.P., Huang Q., Ding L., and Horwitz J. (2002) Subunit exchange, conformational stability, and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J. Biol. Chem. 277, 38468-38475.

15. Bukach O.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., and Gusev N.B. (2003) Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur. J. Biochem. 271, 291-302.

16. Bukau B. and Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92, 351-366.

17. Burstein E.A., Abornev S.M., and Reshetnyak Y.K. (2001a) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms. Biophys. J. 81, 1699-1709.

18. Burstein E.A., Abornev S.M., and Reshetnyak Y.K. (2001b) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins. Biophys. J. 81, 1710-1734.

19. Bushueva T.L., Busel E.P., and Burstein E.A. (1978) Relationship of thermal quenching of protein fluorescence to intramolecular structural mobility. Biochim. Biophys. Acta 534, 141-152.

20. Bushueva T.L., Busel E.P., and Burstein E.A. (1980) Some regularities of dynamic accessibility of buried fluorescent residues to external quenchers in proteins. Arch. Biochem. Biophys. 204, 161-166.

21. Bryngelson J.D., Onuchic J.N., Socci N.D., and Wolynes P.G. (1995) Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. Proteins 21, 167-195.

22. Carral S., Sivilotti M., Zobel A.T.C., Lambert H., and Landry J. (2005) HspB8, small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Human Mol. Gen. 141, 1659-1669.

23. Carra S., Brunsting J.F., Lambert H., Landry J., and Kampinga H.H. (2009) HspB8 participates in protein quality control by a non-chaperone-like mechanism that requires eIF2{alpha} phosphorylation. J. Biol. Chem. 284, 5523-5532.

24. Carver J.A., Esposito G., Schwedersky G., and Gaestel M. (1995) !H-NMR spectroscopy reveals that mouse Hsp25 has a flexible C-terminal extension of 18 amino acids. FEBS Lett. 369, 305-310.

25. Charpentier A.H., Bednarek A.K., Daniel R.L., Hawkins K.A., Laflin K.J., Gaddis S., MacLeod M.C., and Aldaz C.M. (2000) Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res. 60, 5977-5983.

26. Chavez Zobel A.T., Loranger A., Marceau N., Theriault J.R., Lambert H., and Landry J. (2003) Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Human Mol. Genet. 12, 1609-1620.

27. Chernik I.S., Panasenko O.O., Li Y., Marston S.B., and Gusev N.B. (2004) pH-induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27 kDa (HspBl). Biochem. Biophys. Res. Commun. 324,1199-1203.

28. Chowdary Т.К., Raman В., Ramakrishna Т., and Rao C.M. (2004) Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem. J. 381, 379-387.

29. Depre C., Hase M., Gaussin V., Zajac A., Wang L., Hittinger L., Ghaleh В., Yu X., Kudej R.K., Wagner Т., Sadoshima J., and Vatner, S. F. (2002) HI 1 kinase is a novel mediator of myocardial hypertrophy in vivo. Circ. Res. 91, 1007-1014.

30. Dill K.A., Shortle D. (1991) Denatured states of proteins. Annu. Rev. Biochem. 60, 795825.

31. Dragan A.I., Privalov P.L. (2002) Unfolding of a leucine zipper is not a simple two-state transition. J. Mol Biol. 321, 891-908.

32. Dudich I.V., Zav'yalov V.P., Pfeil W„ Gastel M., Zav'yalova G.A., Denesyuk A.I., Korpela T. (1995) Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins. Biochim. Biophys. Acta. 125, 163-168.

33. Eaton WA. (1999) Searching for "downhill scenarios" in protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5897-5899.

34. Eifert С., Burgio M.R., Bennett P.M., Salerno J.C., Koretz J.F. (2005) N-terminal control of small heat shock protein oligomerization: Changes in aggregate size and chaperone-like function. Biochim. Biophys. Acta. 1748, 146-156.

35. Farnsworth P.N. and Singh K. (2000) Self-complementary motifs (SCM) in alphacrystallin small heat shock proteins. FEBSLett. 482, 175-179.

36. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van Der Zandt H., and Svergun D.I. (2001) A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J. Bio.l Chem. 276, 12024-12029.

37. Feng X., Huang S., Fu X., Abulimiti A., and Chang Z. (2002) The reassembling process of the nonameric Mycobacterium tuberculosis small heat-shock protein Hspl6.3 occurs via a stepwise mechanism. Biochem. J. 363, 329-334.

38. Fonte V., Kapulkin V., Taft A., Fluet A., Friedman D., Link C.D. (2002) Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9439-9444.

39. Franck E., Madsen O., van Rheede Т., Ricard G., Huynen M.A., de Jong W.W. (2004) Evolutionary diversity of Vertebrate small heat shock proteins. Mol. Evol. 59, 792-802.

40. Garcia-Mira M.M., Sadqi M., Fischer N., Sanchez-Ruiz J.M., and Munoz V. (2002) Experimental identification of downhill protein folding. Science 298, 2191-2195.

41. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Foster K., Maurer H.R., Mtiller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J., and Damaschun G. (1995) Prothymosin a: A biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry 34, 13211-13218.

42. Ghosh J.G., Estrada M.R. and Clark J.I. (2005) Interactive domains for chaperone activity in the small heat shock protein, human alphaB crystallin. Biochemistry 44, 14854-14869

43. Ghosh J.G., and Clark J.I. (2005) Insights into the domains required for dimerization and assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci. 14, 684—695.

44. Gober M.D., Smith C.C., Ueda K., Toretsky J.A., Aurelian L. (2003) Forced expression of the Hll heat shock protein can be regulated by DNA methylation and trigger apoptosis in human cells. J. Biol. Chem. 278, 37600-37609.

45. Golitsina N.L., Shnyrov V.L., and Levitsky D.I. (1992) Thermal denaturation of the alkali light chain-20 kDa fragment complex obtained from myosin sub fragment 1. FEBS Lett. 303, 255-257.

46. Guo Z., and Cooper L.F. (2000) An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 183-189.

47. Hackel M, Hinz H.J., Hedwig G.R. (1999) A new set of peptide-based group heat capacities for use in protein stability calculations. J. Mol. Biol. 291, 197-213.

48. Haley D.A., Horwitz J., and Stewart P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol. 277, 27-35.

49. Hase M., Depre С., Vatner S.F. and Sadoshima J. (2005) Hll has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. Biochem. J. 388, 475483.

50. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Moll. Life Sci. 59, 1649-1657.

51. Haslbeck M., Ignatiou A., Saibil H., Helmich S., Frenzl E., Stromer Т., and Buchner J. (2004) A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J. Mol. Biol 343,445-455.

52. Haslbeck M., Walke S., Stromer Т., Ehrnsperger M., White H.E., Chen S., Saibil H.R., and Buchner J. (1999) Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO. J. 18, 67446751.

53. Haslbeck M., Franzmann Т., Weinfiirtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nature Struct. Mol. Biol. 10, 842846.

54. Haugland R.P. (1996) Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Molecular Probes, 6 edition.

55. Head M.W., Corbin E., and Goldman J.E. (1993) Overexpression and abnormal modification of the stress proteins alpha B-crystallin and hsp27 in Alexander disease. Am. J. Pathol. 143, 1743-1753.

56. Hedges J.C., Dechert M.A., Yamboliev I.A., Martin J.L., Hickey E., Weber L.A., and Gerthoffer W.T. (1999) A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. J. Biol. Chem. 274, 24211-24219.

57. Horwitz J., Huang Q. and Ding L. (2004) The native oligomeric organization of alphacrystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res. 79, 817-821.

58. Hu Z„ Chen L., Zhang J., Li Т., Tang J., Xu N., Wang X. (2007) Structure, function, properties and role in neurological diseases and other diseases of sHsp22. J. Neurosci. Res. 85, 2071-2079

59. Irobi J., Van Impe K., Seeman P., Jordanova A., Direck I., Verpooten N., Michalik A., De Vriendt E., Jacobs A., Van Gerwen V., et al. (2004) Hot spot residue in small heat-shock protein 22 causes distal motor neuropathy. Nature Genetics 36, 597-601.

60. Ito H., Okamoto K., Nakayama H., Isobe Т., and Kato K. (1997) Phosphorylation of alphaB-crystallin in response to various types of stress. J. Biol. Chem. 272, 29934-29941.

61. Javid В., MacAry P.A., and Lehner P.J. (2007) Structure and function: heat shock proteins and adaptive immunity. J. Immunol. 179, 2035-40.

62. Kappe G., Franck E., Verschuure P., Boelens W.C., Leunissen J.A. and de Jong W.W. (2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8, 53-61.

63. Kato K., Ito H., Kamei K., Inaguma Y., Iwamoto I., and Saga, S. (1998) Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphorylation. J. Biol. Chem. 273, 28346-28354.

64. Kataoka M., Kuwajima K., Tokunaga F., and Goto Y. (1997) Structural characterization of the molten globule of alpha-lactalbumin by solution X-ray scattering. Protein Sci. 6, 422—430.

65. Kim M.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B. and Gusev N.B. (2004a) Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (Hll or HspB8). Biochem. Biophys. Res.1. Commun. 315, 796-801.

66. Kim M.V., Seit-Nebi A.S. and Gusev N.B. (2004b) The problem of protein kinase activity of small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 649652.

67. Kim M.V., Kasakov A.S., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., Gusev N.B. (2006) Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, HI 1) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch. Biochem. Biophys. 454. 32-41.

68. Kim K.K., Kim R., and Kim S.H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394, 595-599.

69. Klemenz R., Frohli E., Steiger R.H., Schafer R., and Aoyama A. (1991) aB-crystallin is small heat shock protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3652-3656.

70. Kokke B.P., Leroux M.R., Candido E.P., Boelens W.C., de Jong W.W. (1997) Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBSLett. 433, 228-232.

71. Kremneva E., Nikolaeva O., Maytum R., Arutyunyan A.M., Kleimenov S.Yu., Geeves M.A., and Levitsky D.I. (2006) Thermal unfolding of smooth muscle and nonmuscle tropomyosin a-homodimers with alternatively spliced exons. FEBS J. 272, 588-600.

72. Kumar L.V., Ramakrishna Т., Rao C.M. (1999) Structural and functional consequences of the mutation of a conserved arginine residue in alphaA-crystallin and alphaB-crystallins. J. Biol Chem. 274, 24137-24141.

73. Kumarapeli A.R., Wang,X. (2004) Genetic modification of heart: chaperones and the cytoskeleton. J. Mol. Cell Cardiol. 37, 1097-1109.

74. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

75. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A., and Landry J. (1999) HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J. Biol. Chem. 274, 9378-9385.

76. Lebowitz J., Lewis M.S., Schuck P. (2002) Modem analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079.

77. Lelj-Garolla В & Mauk AG (2005) Self-association of a small heat shock protein. J. Mol. Biol. 345, 631-642.

78. Leroux M.R., Ma B.J., Batelier G., Melki R., and Candido E.P.M. (1997) Unique Structural Features of a Novel Class of Small Heat Shock Proteins. J. Biol. Chem. 272, 12847-12853.

79. Leroux M.R., Melki R., Gordon В., Batelier G., and Candido E.P. (1997) Structurefunction studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J. Biol. Chem. 272, 24646-24656.

80. Liang J.J. (2000) Interaction between beta-amyloid and alpha B-crystallin. FEBS Lett. 484, 98-101.

81. Lindner R.A., Kapur A., and Carver J.A. (1997) The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin. J. Biol. Chem. 272, 27722-27729.

82. Litt M., Kramer P., LaMorticella D.M., Murphey W., Lovrien E.W., Weler R.G. (1998) Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA. Human Mol. Genet. 7, 471-474.

83. Markov D.I., Pivovarova A.V., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2008) Small heat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPase inactivation. FEBS Lett. 582, 1407-1412.

84. Makhatadze G.I., Privalov P.L. (1990) Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect. J. Mol. Biol. 213, 375-384.

85. Makhatadze G.I., Medvedkin V.N., Privalov P.L. (1990) Partial molar volumes of polypeptides and their constituent groups in aqueous solution over a broad temperature range. Biopolymers 30, 1001-1010.

86. Makhatadze G.I., Privalov P.L., (1995) Energetics of protein structure. Adv. Protein Chem. 47, 307-425.

87. Markovich R.J., Pidgeon C. (1991) Introduction to Fourier transform infrared spectroscopy and applications in the pharmaceutical sciences. Pharm. Res. 8, 663-75.

88. Meador W.E., Means A.R., and Quiocho F.A. (1992) Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science 257, 1251-1255.106.107.108.109.110.111.112.113,114,115,116117118119

89. Merrill A.R., Cohen F.S., and Cramer W.A. (1990) On the nature of the structural change of the colicin El channel peptide necessary for its translocation-competent state. Biochemistry 29, 5829-5836.

90. Morimoto R.I. (1998). Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Gen. Dev. 12, 3788-3796.

91. Muchowski P.J., Hays L.G., Yates J.R., Clark G.I. (1999) ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J. Biol. Chem. 274, 30190-30195.

92. Panasenko O.O., Seit Nebi A., Bukach O.V., Marston S.B., and Gusev N.B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophys. Acta 1601, 64-74.

93. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B., and Gusev N.B. (2003) Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem. 270, 892-901.

94. Pappu R.V., Srinivasan R., and Rose G.D. (2000) The Flory isolated-pair hypothesis is not valid for polypeptide chains: Implications for protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 12565-12570.

95. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., and

96. Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation andaggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1548-1553.

97. Pivovarova A.V., Chebotareva N.A., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2007)

98. Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by formingsoluble complexes with denatured actin. FEBSJ. 274, 5937-5948.

99. Plater M.L., Goode D., and Crabbe M.J. (1996) Effects of site-directed mutations on thechaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem. 271, 28558-28566.

100. Privalov P.L. and Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studyingtemperature-induced changes in proteins. Methods Enzyrnol. 131, 4-51.

101. Ptitsyn O.B. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Protein Chem. 47, 83-229.

102. Romero P., Obradovic Z., Kissinger C., Villafranca J.E, Garner E., Guilliot S., and

103. Dunker A.K. (1998). Thousands of proteins likely to have long disordered regions. Рас.

104. Symp. Biocomput. 3, 437-448.

105. Romero P., Obradovic Z., and Dunker A.K. (2001) Intelligent data analysis for protein disorder prediction. Artif. Intell. Rev. 14, 447-484.

106. Sabelko J, Ervin J, Gruebele M. (1999) Observation of strange kinetics in protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6031-6036.

107. Sadqi M., de Alba E., Perez-Jimenez R., Sanchez-Ruiz J.M., Munoz V. (2009) A designed protein as experimental model of primordial folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106,4127-4132.

108. Santhoshkumar P. and Sharma K.K., (2001) Phe71 is essential for chaperone-like function in aA-crystallin. J. Biol. Chem. 276, 47094-47099.

109. Sharma K.K., Kumar R.S., Kumar G.S., and Quinn P.T. (2000) Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J. Biol. Chem. 275, 3767-3771.

110. Schwarz P.M., Liggins J.R., Luduena R.F. (1998) P-Tubulin isotypes purified from bovine brain have different relative stabilities. Biochemistry 37, 4687—4692.138.139.140.141.142.143.144.145.146.147,148.149150,151152

111. Schweers О., Schonbrunn Hanebeck E., Marx A., and Mandelkow E. (1994) Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J. Biol. Chem. 269, 24290-24297.

112. Solomaha E. and Palfrey H.C. (2005) Conformational changes in dynamin on GTP binding and oligomerization reported by intrinsic and extrinsic fluorescence. Biochem. J. 391, 601-611.

113. Sreelakshmi Y. and Sharma K.K. (2005) Recognition sequence 2 (residues 60-70) plays a role in oligomerization and exchange dynamics of aB-crystallin. Biochemistry 44, 1224512252.

114. Sreerama N. and Woody R. W. (2004) Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol. 383, 318-51

115. Sreerama N., Woody R.W. (2000) Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal. Biochem. 287, 252-60.

116. Stamler R., Kappe G., Boelens W., and Slingsby C. (2005) Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. J. Mol. Biol. 353, 68-79.

117. Studer S., Obrist M., Lentze N., and Narberhaus F. (2002) A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial alpha-heat shock proteins. Eur. J. Biochem. 269, 3578-3586.

118. Sudhakar K. and Fay P.J. (1996) Exposed hydrophobic sites in factor VIII and isolated subunits. J. Biol. Chem. Ill, 23015-23021.

119. Sun X., Fontaine J.-M., Rest J.S., Shelden E.A., Welsh M.J. (2004) Interaction of human Hsp22 (HspB8) with other small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 279, 2394-2402.

120. Syme C.D., Blanch E.W., Holt C., Jakes R., Goedert M., Hecht L., Barron L.D. (2002) A Raman optical activity study of rheomorphism in caseins, synucleins and tau. Eur. J. Biochem. 269, 148-156

121. Taylor R.P. and Benjamin I.J. (2005) Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J. Mol. Cell Cardiol. 38, 433-444.

122. Theriault J.R., Lambert H., Chavez-Zobel A.T., Charest G., Lavigne P., and Landry J. (2004) Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J. Biol. Chem. 279, 23463-23471.

123. Tompa P. (2002) Intrinsically unstructured proteins. Trends in Biochem. Sci. 27, 527-533.

124. Turoverov K.K., Khaitlina S.Yu., Pinaev G.P. (1976) Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62, 4-7.

125. Turoverov K.K. and Kuznetsova I.M. (2003) Intrinsic fluorescence of actin, J. Fluoresc. 13,41-57.

126. Uversky V.N. and Ptitsyn O.B. (1996a) Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": Four-state GdmCl-induced unfolding of carbonicanhydrase В at low temperature. J. Mol. Biol. 255, 215-228.

127. Uversky V.N., Winter S., and Lober G. (1996b) Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transitions in proteins which unfold through the molten globule state. Biophys. Chem. 60, 79-88.

128. Uversky V.N. (1997) Diversity of compact forms of denatured globular proteins. Protein Pept. Lett. 4, 355-367.

129. Uversky V.N., Gillespie J.R., and Fink A.L. (2000a) Why are "natively unfolded" proteins unstructured under the physiological conditions? Proteins Struct. Funct. Genet. 41,415-427.

130. Uversky V.N. Gillespie J.R., and Fink A.L. (2000c) Why are 'natively unfolded' proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins 41, 415—427

131. Uversky V.N. (2002) Natively unfolded proteins: A point where biology waits for physics. Prot. Sci. 11, 739-756.

132. Wandingerl S.K., Richter K., and Buchner J. (2008) The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477.

133. Wang K., Spector A. (1994) The chaperone activity, of bovine alpha crystalline. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. J. Biol. Chem. 269, 13601-13608.

134. Wang L., Zajac A., Hedhli N., and Depre C. (2004) Increased expression of Hll kinase stimulated glycogen synthesis in the heart. Mol. Cell Biochem. 265, 71-87.

135. Weast R. (1976-1977) Handbook of chemistry and physics, 57th edition, CRC Press, Cleveland.

136. Weeds A.G. and Taylor R.S. (1975) Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. Nature 257, 54-56.

137. Weinreb P.H., Zhen W., Poon A.W., Conway K.A., and Lansbury P.T., Jr. (1996) NACP, a protein implicated in Alzheimer's diseases and learning, is natively unfolded. Biochemistry 35, 13709-13715.

138. Williamson M.P. (1994) The structure and function of proline-rich regions in proteins. Biochem. J. 297, 249-260

139. Wright P.E. and Dyson H.J. (1999) Intrinsically unstructured proteins: Reassessing the protein structure-function paradigm. J. Mol. Biol. 293, 321-331.

140. Yang C, Trent S, Ionescu-Tiba V, Lan L, Shioda T, Sgroi D, Schmidt EV. (2006) Identification of cyclinDl and estrogen-regulated genes contributing to breast carcinogenesis and progression. Cancer Res. 66, 11649-11658.

141. Zwanzig R. (1995) Simple model of protein folding kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9801-9804.1. БЛАГОДАРНОСТИ

142. Я искренне признателен своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дмитрию Ивановичу Левицкому за внимательное, чуткое и доброжелательное руководство, а также плодотворное участие в моей судьбе.

143. Я благодарен своим коллегам и друзьям из Института биохимии им. А. Н. Баха РАН за неоценимую помощь в работе, поддержку и доброту.

144. Я благодарен моим родным и близким за моральную поддержку даже в самые смутные времена.

145. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.