Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Шеметов, Антон Александрович

• Шеметов, Антон Александрович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Шеметов, Антон Александрович

Список использованных сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1. Структура малых белков теплового шока.

Суперсемейство вНэр.

Структура мономеров малых белков теплового шока.

Олигомерная структура малых белков теплового шока.

Образование гетероолигомерных комплексов малыми белками теплового шока.

2. Функции малых белков теплового шока.

2.1. Шаперонная активность.

2.1.1. Взаимодействие малых белков теплового шока с белками-субстратами.

2.1.2. Взаимодействие вНэр с шаперонной системой клетки.

2.2. Участие малых белков теплового шока в протеолитической деградации частично денатурированных белков.

2.3. Участие малых белков теплового шока в апоптозе и канцерогенезе.

3. Регуляция активности малых белков теплового шока.

II. Материалы и методы.

Препаративные методы.

1.1. Экспрессия генов точечных мутантов рекомбинантного Нзр22.

1.2. Получение компетентных клеток.

Получение клеток, компетентных для химической трансформации.

Получение клеток, компетентных для электропорации.

1.3. Выделение рекомбинантного Нзр22.

2. Фосфорилирование НБр22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой протеинкиназой.

3. Фосфорилирование Нзр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЫК1.

4. Флуоресцентная спектроскопия.

5. Спектроскопия кругового дихроизма.

6. Метод ограниченного протеолиза.

7. Аналитическое ультрацентрифугирование.

8. Гель-фильтрация.

9. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата.

10. Химическое «сшивание» при помощи глутарового альдегида.

11. Определение шаперонной активности.

11.1. Определение шаперонной активности с инсулином.

11.2. Определение шаперонной активности с роданазой.

Аналитические методы.

Электрофорез в полиакриламидном геле.

ЗБЗ-электрофорез.

Электрофорез в нативных условиях.

Изоэлектрофокусирование.

Окрашивание полиакриламидных гелей серебром.

Авторадиография.

Спектрофотометрическое определение концентрации белка.

III. Результаты и обсуждение.

1. Экспрессия генов рекомбинантного Нэр22 в клетках Е.соН.

2. Выделение рекомбинантного №р22.

3. Фосфорилирование Шр22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы.

4. Фосфорилирование Нвр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЯК1.

5. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру Нзр22.

5.1. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на вторичную структуру Нзр22.

5.2. Влияние фосфорилирования на третичную структуру Нвр22.

5.2.1. Изучение собственной триптофановой флуоресценции.

5.2.2. Ограниченный протеолиз.

5.3. Влияние фосфорилирования на четвертичную структуру Нэр22.

5.3.1. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата и глутарового альдегида.

5.3.2. Гель-фильтрация.

5.3.3. Аналитическое ультрацентрифугирование.

6. Шапероноподобная активность Нзр22.

6.1. Шапероноподобная активность Нзр22 с использованием инсулина в качестве модельного белка-субстрата.

6.2. Шапероноподобная активность с использованием роданазы в качестве модельного белка-субстрата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22»

Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) - широко распространенная группа белков с молекулярной массой мономера от 12 до 43 кДа. Отличительной чертой всех белков этого семейства является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, состоящего из 80-90 аминокислотных остатков и получившего свое название от белка а-кристаллина, в составе которого он был впервые обнаружен. sHsp склонны к образованию крупных олигомерных комплексов, размер которых может достигать 600-700 кДа.

Все члены семейства обладают так называемой шапероноподобной активностью, т.е. способны связывать частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации. Помимо этого малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции протеолитической деградации денатурированных белков, тем самым защищая клетку от накопления агрегатов поврежденных белков. Кроме того, считается, что sHsp могут участвовать в регуляции сократительного аппарата и цитоскелета, клеточной подвижности, а также в защите клетки от окислительного стресса, регуляции процессов пролиферации и апоптоза. Функционирование малых белков теплового шока может регулироваться разными способами, в частности, путем фосфорилирования, катализируемого различными протеинкиназами. Фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние sHsp, их взаимодействие с белками-партнерами и шапероноподобную активность.

В настоящее время в геноме человека найдено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока, и свойства некоторых представителей этого семейства белков (аА- и аВ-кристаллины, Hsp27) достаточно подробно изучены. Сравнительно недавно описанный белок Hsp22 (HspB8, HI 1 киназа, продукт гена E2IG1) на начальных этапах исследования относили к классу протеинкиназ, однако позднее было показано наличие в его структуре а-кристаллинового домена и отсутствие протеинкиназной активности. Данные двумерного электрофореза свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих Hsp22, который является типичным представителем семейства малых белков теплового шока, может находиться в фосфорилированном состоянии. В условиях in vivo в разных тканях фосфорилированию могут подвергаться остатки Ser24 и Thr/Ser87 Hsp22.

Помимо этого несколько протеинкиназ (протеинкиназа С, казеинкиназа второго типа и ERK1 киназа) способны фосфорилировать Hsp22 в условиях in vitro. Кроме того, анализ первичной структуры Hsp22, проведенный с использованием программы NetPhos 2.0, свидетельствует о том, что в структуре этого белка есть остатки (Ser24 и Ser57), расположенные в последовательностях, узнаваемых и фосфорилируемых протеинкиназой А. Таким образом, к настоящему моменту накоплено большое количество экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о том, что Hsp22 может подвергаться фосфорилирования). В то же время в литературе нет данных о том, каким образом фосфорилирование влияет на структуру и свойства этого белка. В связи с этим главной целью нашей работы являлось исследование влияние фосфорилирования на физико-химические свойства Hsp22, а также на его шапероноподобную активность.

Научная новизна и.практическая ценность работы. Проанализирован процесс фосфорилирования Hsp22 под действием двух протеинкиназ. Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа в условиях in vitro фосфорилирует Ser57 Hsp22. Протеинкиназа ERK1 в условиях in vitro фосфорилирует остатки Ser24, Ser27 и Thr87, при этом остатки Ser24 и Thr87 могут находиться в фосфорилированном состоянии в условиях in vivo. Данные спектроскопии кругового дихроизма свидетельствуют о том, что значительная часть структуры Hsp22 неупорядочсна, при этом разведение приводит к дальнейшему разупорядочиванию структуры белка. Этот эффект может быть связан с происходящей при разведении диссоциацией димеров Hsp22. Используя методы гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования, установили, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) увеличивают вероятность образования димеров Hsp22. Фосфорилирование (или мутации, имитирующее фосфорилирование) остатков, расположенных в N-концевой части Hsp22 (Ser24, Ser27, Ser57), уменьшают шапероноподобную активность Hsp22, в то время как фосфорилирование Thr87, расположенного в центральной части белка, приводит к увеличению шапероноподобной активности Hsp22. Таким образом, установлено, что фосфорилирование влияет на структуру и шапероноподобную активность Hsp22. Полученные экспериментальные данные позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования Hsp22, что особенно важно, учитывая существенную роль, которая отводится Hsp22 в регуляции процессов протеолиза, пролиферации и апоптоза, а также тот факт, что точечные мутации Hsp22 коррелируют с развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний.

I. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Шеметов, Антон Александрович

Выводы

1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать Ser57 Hsp22.

2. Установлено, что протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22 in vitro, поэтому ERK1 может быть тем ферментом, который фосфорилирует Hsp22 в условиях in vivo.

3. Выявлено изменение спектров кругового дихроизма, происходящее при уменьшении концентрации белка, что может быть связано с диссоциацией олигомеров и дестабилизацией структуры освобождающихся мономеров.

4. Мутации, имитирующие фосфорилирование, а также фосфорилирование влияют на вторичную и третичную структуру Hsp22, что отражается в изменении собственной триптофановой флуоресценции и чувствительности к протеолизу.

5. Данные гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования свидтельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) способствуют ассоциации мономеров Hsp22.

6. Фосфорилирование (или мутирование) расположенных в N-конце остатков Ser24, Ser27 и Ser57 уменьшает шапероноподобную активность Hsp22, в то время как мутирование расположенного в центральной части молекулы Thr87 увеличивает шапероноподобную активность Hsp22.

Заключение

Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует 8ег57, а протеинкиназа ЕШС1 8ег24, 8ег27 и Т1зг87 в структуре Нзр22. Белок дикого типа представлен в виде равновесной смеси мономеров и димеров. Вследствие этого разведение сопровождается смещением равновесия в сторону мономеров, обладающих менее упорядоченной вторичной структурой. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на равновесие между димерами и мономерами Шр22. Использование методов флуоресцентной спектроскопии, ограниченного протеолиза, химического «сшивания», гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования позволило показать, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или киназы ЕККЛ сопровождаются изменениями третичной и четвертичной структуры Ызр22. Мутации, имитирующие фосфорилирование остатков, расположенных в Ы-концевой части белка (8ег24, 8ег27 или 8ег57), приводят к уменьшению шапероноподобной активности Нзр22. В то время как мутация (и возможно, фосфорилирование) ТЬг87, расположенного в центральной части белка, сопровождается значительными изменениями структуры и увеличением шапероноподобной активности Нзр22. Таким образом, фосфорилирование влияет на структуру Нзр22 и его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Шеметов, Антон Александрович, 2010 год

1. Aquilina JA, Benesch JL, Bateman OA, Slingsby C, and Robinson CV.

2. Polydispersity of a mammalian chaperone: mass spectrometry reveals the population of oligomers in alphaB-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA 100: 10611-10616, 2003.

3. Aquilina JA, Beiiesch JL, Ding LL, Yaron O; Horwitz J, and Robinson CV. Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Cheni 279: 28675-28680, 2004.

4. Aquilina JA, and Watt SJ. The N-terminal domain of alphaB-crystallin is protected from proteolysis by bound substrate. Biochem Biophys Res Commim 353: 1115-1120, 2007.

5. Arndt V, Dick N, Tawo R, Dreiseidler M, Wenzel D, Hesse M, Furst DO, Saftig P, Saint R, FJeischmann BK, Hoch M, and Hohfeld J. Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle maintenance. Carr Biol 20: 143-148, 2010.

6. Assimakopoulou M, Sotiropoulou-Bonikou G, Maraziotis T, and Varakis I.

7. Prognostic significance of Hsp-27 in astrocytic brain tumors: an immunohistochemical study. Anticancer Res 17: 2677-2682, 1997.

8. Badri KR, Modem S, Gerard HC, Khan Bagchi M, Hudson AP, and Reddy TR.

9. Regulation of Sam68 activity by small heat shock protein 22. J Cell Biochem 99: 1353-1362, 2006.

10. Bagneris C, Batetnan OA, Naylor CE, Cronin N, Boelens WC, Keep NH, and? Slingsby C. Crystal structures of alpha-crystallin domain dimers of alphaB-crystallin and Hsp20. JMolBiol 392: 1242-1252, 2009.

11. Baranova EV, Beblen S, Gusev NB, and Strelkov SV. The taming of small heat-shock proteins: crystallization of the alpha-crystallin domain from human Hsp27. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commim 65: 1277-1281, 2009.

12. Beall A, Bagwell D, Woodrum D, Stoming ТА, Kato K, Suzuki A, Rasinussen H, and Brophy CM. The small heat shock-related protein, HSP20, is phosphorylated on serine 16 during cyclic nucleotide-dependent relaxation. J Biol Chem 21 A: 11344-11351, 1999.

13. Bellyei S, Szigeti A, Pozsgai E, Boronkai A, Gomori E, Hocsak E, Farkas R, Sumegi B, and Gallyas F, Jr. Preventing apoptotic cell death by a novel small heat shock protein. Eur J Cell Biol 86: 161-171,2007.

14. Benesch JL, Aybiib M, Robinson CV, and Aquilina JA. Small heat shock protein activity is regulated by variable oligomeric substructure. J Biol Chem 283: 28513-28517, 2008.

15. Berengian AR, Btfva MP, and Mchaourab HS. Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystaliin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry 36: 9951-9957, 1997.

16. Bhattacharyya J, PadmanabhaUdupa EG, Wang J, and Sharma KK. Mini-alphaB-crystallin: a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-like activity. Biochemistry 45: 3069-3076, 2006.

17. Bolhuis S, and Richter-Landsberg C. Effect of proteasome inhibition by MG-132 on HSP27 oligomerization, phosphorylation, and aggresome formation in the OLN-93 oligodendroglia cell line. JNeurochem 2010.

18. Bova MP, Ding LL, Horwitz J, and Fung BK. Subunit exchange of alphaA-crystallin. J Biol Chem 272: 29511 -29517, 1997.

19. Bova MP, Huang Q, Ding L, and Horwitz J. Subunit Exchange, Conformational Stability, and Chaperone-like Function of the Small Heat Shock Protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem 277: 38468-38475, 2002.

20. Brophy CM, Lamb S, and Graham A. The small heat shock-related protein-20 is an actin-associated protein. J Vase Surg 29: 326-333, 1999.

21. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, and Garrido C. Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol 2: 645-652, 2000.

22. Bukach OV, Glukhova AE, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock pioteins HspBl (Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim BiophysActa 1794: 486-495, 2009.

23. Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Ear J Biochem 271: 291-302, 2004.

24. Cantin GT, Yi W, Lu B, Park SK, Xu T, Lee JD, and Yates JR, 3rd. Combining protein-based IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. JProteome Res 7: 1346-1351, 2008.

25. Carra S. The stress-inducible HspB8-Bag3 complex induces the eIF2alpha kinase pathway: implications for protein quality control and viral factory degradation? Autophagy 5: 428-429, 2009.

26. Carra S, Brunsting JF, Lambert H, Landry J, and Kampinga HH. HspB8 participates in protein quality control by a non-chaperone-hke mechanism that lequires eIF2 {alpha} phosphorylation. J Biol Chem 284: 5523-5532, 2009.

27. Carra S, Seguin SJ, and Landry J. HspB8 and Bag3: a new chaperone complex targeting misfolded proteins to macroautophagy. Autophagy 4: 237-239, 2008.

28. Carra S, Sivilotti M, Chavez ZobeLAT, Lambert H, and Landry J. HspB8, a small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Hum Mol Genet 14: 1659-1669, 2005.

29. Chabaud S, Lambert H, Sasseville AM, Lavoie H, Guilbault C, Massie B, Landry J, and Langelier Y. The. R1 subunit of herpes simplex virus ribonucleotide reductase has chaperone-like activity similar to Hsp27. FEBSLett 545: 213-218, 2003.

30. Charpentier AH, Bednarek AK, Daniel RL, Hawkins KA, Laflin KJ,- Gaddis S, MacLeod MC, and Aldaz CM. Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res 60: 5977-5983, 2000.

31. Ghauhan^ D, Li G, Shringarpure R, Podar K, Ohtake Y, Hideshima T, and Anderson KG. Blockade of Hsp27 overcomes Bortezomib/proteasome inhibitor PS-341 resistance in lymphoma cells. Cancer Res 63: 6174-6177, 2003.

32. Chavez Zobel AT, Loranger A, Marceau N, Theriault JR, Lambert H, and Landry

33. J. Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet 12: 1609-1620, 2003.

34. Chen J, Feige MJ, Franzmann TM, Bepperling A, and Buchner J.' Regions outside the alpha-crystallin domain of the small heat shock protein Hsp26 are required for its dimerization. J Mol Biol 398: 122-131,2010.

35. Chowdary TK, Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM: Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem J 381: 379-387, 2004.

36. Chu G, Egnaczyk GF, Zhao W, Jo SH, Fan GC, Maggio JE, Xiao RP, and Kranias

37. EG. Phosphoproteome analysis of cardiomyocytes subjected to beta-adrenergic stimulation: identification and characterization of a cardiac heat shock protein p20. Circ Res 94: 184-193, 2004.

38. Ciocca DR, and Calderwood SK. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. Cell Stress Chaperones 10: 86-103, 2005.

39. Clark JI, and Huang QL. Modulation of the chaperone-like activity of bovine alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA 93: 15185-15189, 1996.

40. Claxton DP, Zou P, and McHaourab HS. Structure and orientation of T4 lysozyme bound to the small heat shock protein alpha-crystallin. J Mol Biol 375: 1026-1039, 2008.

41. Crippa V, Carra S, Rusmini P, Sau D, Bolzoni E, Bendotti C, De Biasi S, and Poletti A. A role of small heat shock protein B8 (HspB8) in the autophagic removal of misfolded proteins responsible for neurodegenerative diseases. Antopliagy 6: 2010.

42. Das KP, Petrash JM, and Surewicz WK. Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperone alpha-crystallin. J Biol Chem 271: 10449-10452, 1996.

43. Dephoure N, Zhou C, Villen J, Beausoleil SA, Bakalarski CE, Elledge SJ, and Gygi

44. SP. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA 105: 1076210767, 2008.

45. Depre C, Hase M, Gaussin V, Zajac A, Wang L, Hittinger L, Ghaleh B, Yu X, Kudej RK, Wagner T, Sadoshima J, and Vatner SF. Hll kinase is a novel mediator of myocardial hypertrophy in vivo. Circ Res 91: 1007-1014, 2002.

46. Depre C, Kim SJ, John AS, Huang Y, Rimoldi OE, Pepper JR, Dreyfus GD, Gaussin V, Pennell DJ, Vatner DE, Camici PG, and Vatner SF. Program of cell survival underlying human and experimental hibernating myocardium. Circ Res 95: 433-440, 2004.

47. Depre C, Tomlinson JE, Kudej RK, Gaussin V, Thompson E, Kim SJ, Vatner DE, Topper JN, and Vatner SF. Gene program for cardiac cell survival induced by transient ischemia in conscious pigs. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9336-9341, 2001.

48. Dreiza CM, Komalavilas P, Furnish EJ, Flynn CR, Sheller, MR, Smoke CC, Lopes LB, and Brophy CM. The small heat shock protein, HSPB6, in muscle function and disease. Cell Stress Chaperones 15: 1-11, 2010.

49. Ehrnsperger M, Graber S, GaestelsM, and Buchner J. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J 16: 221-229,1997.

50. Fan>GC, Chu G, and KraniasEG. Hsp20 and its cardioprotection. Trends Cardiovasc Med 15: 138-141,2005.

51. Fan GC, Chu?G, Mitton B, Song Q, Yuan Q, and Kranias EG. Small heat-shock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis. Circ Res 94: 1474-1482, 2004.

52. Fan GC, Ren X, Qian >J, Yuan Q, Nicolaou P, Wang Y, Jones WK, Chu G, and Kranias' EG. Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusioninjury. Circulation 111: 1792-1799, 2005.

53. Fan GC, Yuan Q, Song G, Wang Y, Chen G, Qian J; Zhou X, Lee YJ, Ashraf M, and Kranias EG. Small heat-shock protein Hsp20 attenuates beta-agonist-mediated cardiac remodeling through apoptosis signal-regulating kinase 1. Circ Res 99: 1233-1242, 2006.

54. Fan GC, Zhou X, Wang X, Song G, Qian J, Nicolaou P, Chen G, Ren X, and Kranias EG. Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity. Circ Res 103: 1270-1279, 2008.

55. Fontaine JM, Sun X, Benndorf R, and Welsh MJ. Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun 337: 1006-1011, 2005.

56. Fontaine JM, Sun X, Hoppe AD, Simon S, Vicart P, Welsh MJ, and Benndorf R.

57. Abnormal small heat shock protein interactions involving neuropathy-associated HSP22 (HSPB8) mutants. Faseb J 20: 2168-2170, 2006.

58. Fontanella B, Birolo L, Infusini G, Cirulli C, Marzullo L, Pucci P, Turco MC, and Tosco A. The co-chaperone BAG3 interacts with the cytosolic chaperonin CCT: new hints for actin folding. Int J Biochem Cell Biol 42: 641-650, 2010.

59. Fuchs M, Poirier DJ, Seguin SJ, Lambert H, Carra S, Charette SJ, and Landry J.1.entification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem /425: 245-255, 2010.

60. Furnish EJ, Brophy CM, Harris VA, Macomson S, Winger J, Head GA, and Shaver

61. EG. Treatment with transducible phosphopeptide analogues of the small heat shock-related protein, HSP20, after experimental subarachnoid hemorrhage: prevention and reversal of delayed decreases in cerebral perfusion. JNeurosurg 112: 631-639, 2010.

62. Gaestel M, Schroder W, Benndorf R, Lippmann C, Buchner K, Hucho F, Erdmann VA, and Bielka H. Identification of the phosphorylation sites of the murine small heat shock protein hsp25. J Biol Chem 266: 14721-14724, 1991.

63. Ghosh JG, and Clark JI. Insights into the domains required for dimerization and assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci 14: 684-695, 2005.

64. Ghosh JG, Estrada MR, and Clark JI. Interactive domains for chaperone activity in the small heat shock protein, human alphaB crystallin. BiochemisUy 44: 14854-14869, 2005.

65. Ghosh JG, Estrada MR, and Clark JI. Structure-based analysis of the beta8 interactive sequence of human alphaB crystallin. Biochemistry 45: 9878-9886, 2006.

66. Ghosh JG, Estrada MR, Houck SA, and Clark JI. The function of the beta3 interactive domain in the small heat shock protein and molecular chaperone, human alphaB crystallin. Cell Stress Chaperones 11: 187-197,2006.

67. Gober MD, Smith CC, Ueda K, Toretsky JA, and Aurelian L. Forced expression of the HI 1 heat shock protein can be regulated by DNA methylation and trigger apoptosis in human cells. J Biol Chem 278: 37600-37609, 2003.

68. Gober MD, Wales SQ, and Aurelian ,L. Herpes simplex virus type 2 encodes a heat shock protein homologue with apoptosis regulatory functions. Front Biosci 10: 2788-2803, 2005.

69. Gonzalez FA, Radenf DL, and'Davis RJ: Identification of substrate recognition determinants for human ERK1 and ERK2 protein kinases. J Biol Chem 266: 22159-22163, 1991.

70. Halaby DM, and Mornon JP. The immunoglobulin superfamily: an insight on its tissular, species, and functional diversity. JMolEvol 46: 389-400, 1998.

71. Hase M, Depre C, Vainer SF, andSadoshima J. Hll has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. Biochem J388: 475-483,2005.

72. Haslbeck M. sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci 59: 16491657, 2002.

73. Haslbeck M; Ignatiou A, Saibil H, Helmich S, Frenzl E, Stromer T, and Buchner J.'

74. A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J Mol Biol 343: 445-455, 2004.

75. Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR, and Buchner J. Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J18: 6744-6751, 1999.

76. Havasi A, Li Z, Wang Z, Martin JL, Botla V, Ruchalski K, Schwartz JH, and Borkan SC. Hsp27 inhibits Bax activation and apoptosis via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. J Biol Chem 283: 12305-12313, 2008.

77. Hayes D, Napoli V, Mazurkie A, Stafford WF, and Graceffa P. Phosphorylation dependence of hsp27 multimeric size and molecular chaperone function. J Biol Chem 284: 18801-18807, 2009.

78. Hedhli N, Wang L, Wang Q, Rashed E, Tian Y, Sui X, Madura K, and Depre C.

79. Proteasome activation during cardiac hypertrophy by the chaperone Hll Kinase/Hsp22. Cardiovasc Res 77: 497-505, 2008.

80. Horwitz J, Bova MP, Ding LL, Haley DA, and Stewart PL. Lens alpha-crystallin: function and structure. Eve 13 ( Pt 3b): 403-408, 1999.

81. Horwitz J, Huang QL, Ding L, and Bova MP. Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol 290: 365-383, 1998.

82. Hu Z, Yang B, Lu W, Zhou W, Zeng L, Li T, and Wang X. HSPB2/MKBP, a novel and unique member of the small heat-shock protein family. J Neurosci Res 86: 2125-2133, 2008.

83. Huang Q, Ye J, Chen W, Wang L, Lin W, Lin J, and Lin X. Heat shock protein 27 is over-expressed in tumor tissues and increased in sera of patients with gastric adenocarcinoma. Clin Chem Lab Med48: 263-269, 2010.

84. Ito H, Kamei K, Iwamoto I, lnaguina Y, Nohara D, and Kato K. Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha B- crystallin. J Biol Chem 276: 5346-5352, 2001.

85. Jakob U, Gaestel M, Engel K, and Buchner J. Small heat shock proteins are molecular chaperones. J Biol Chem 268: 1517-1520, 1993.

86. Jaya N, Garcia V, and Vierling E. Substrate binding site flexibility of the small heat shock protein molecular chaperones. Proc Natl Acad Sci U SA 106: 15604-15609, 2009.

87. Kampinga HH, Hageman J, Vos MJ, Kubota H, Tanguay RM, Bruford EA, Cheetham ME, Chen B, and Hightower LE. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones 14: 105-111, 2009.

88. Kappe G, Boelens WC, and de Jong WW. Why proteins without an alpha-crystallin domain should not be included in the human small heat shock protein family HSPB. Cell Sti ess Chaperones 2009.

89. Kappe G, Franck E, Verschuure P, Boelens WC, Leunissen JA, and de Jong WW.

90. The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8: 53-61, 2003.

91. Kasakov AS, Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll). FehsJllA: 5628-5642, 2007.

92. Kato K, Goto S, Inaguma Y, Hasegawa K, Morishita R, and Asano T. Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha B crystallin. J Biol Chem 269: 15302-15309, 1994.

93. Kato K, Ito IT, Kamei K, Inaguma Y, Iwamoto I, and Saga S. Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphoiylation. J Biol Chem 273: 28346-28354, 1998.

94. Kazakov AS, Markov DI, Gusev NB, and Levitsky DI. Thermally induced structural changes of intrinsically disordered small heat shock protein Hsp22. Biophys Chem 145: 79-85, 2009.

95. Kim KK, Kim R, and Kim SH. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394: 595-599, 1998.

96. Kim MV, Kasakov AS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch Biochem Biophys 454: 32-41, 2006.

97. Kim MV, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. The problem of protein kinase activity of small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem Biophys Res Commiin 325: 649-652, 2004.

98. Kim MV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem Biophys Res Comnnm 315: 796-801, 2004.

99. Kiss AJ, Mirarefi AY, Ramakrishnan S, Zukoski CF, Devries AL, and Cheng CH. Cold-stable eye lens crystallins of the Antarctic nototheniid toothfish Dissostichus mawsoni Norman. J Exp Biol 207: 4633-4649, 2004.

100. Kostenko S, and Moens U. Heat shock protein 27 phosphorylation: kinases, phosphatases, functions and pathology. Cell Mol Life Sci 66: 3289-3307, 2009.

101. Kumar A, and Singh S. Interaction of chaperone alpha-crystallin with unfolded state of alpha-amylase: Implications for reconstitution of the active enzyme. Int J Biol Macromol 45: 493-498, 2009.

102. Kumar MS, Koteiche HA, Claxton DP, and McHaourab HS. Disulfide cross-links in the interaction of a cataract-linked alphaA-crystallin mutant with betaBl-crystallin. FEBS Lett 583: 175-179,2009.

103. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970.

104. Lambert H, Charette SJ, Bernier AF, Guimond A, and Landry J. HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem 274: 9378-9385, 1999.

105. Landry J, Lambert H, Zhou M, Lavoie JN, Hickey E, Weber LA, and Anderson

106. CW. Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II. J Biol Chem 267: 794-803, 1992.

107. Laskovvska E, Matuszewska E, and Kuczynska-Wisnik D. Small heat shock proteins and protein-misfolding diseases. Ctirr Pharm Biotechnol 11: 146-157, 2010.

108. Latham JC, Stein RA, Bornhop DJ, and McHaourab HS. Free-solution label-free detection of alpha-crystallin chaperone interactions by back-scattering interferometry. Anal ChemU: 1865-1871,2009.

109. Lee GJ, Roseman AM, Saibil HR, and Vierling E. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBOJX6: 659-671, 1997.

110. Lehr S, Kotzka J, Avci H,'Sickmann A, Meyer HE, Herkner A, and MuIIer-Wieland"

111. D. Identification of major ERK-related phosphorylation sites in Gabl. Biochemistry 43: 1213312140, 2004.

112. Lelj-Garolla B, and Mauk AG. Self-association and chaperone activity of Hsp27 are thermally activated. J Biol Chem 281: 8169-8174, 2006.

113. Leroux MR, Ma BJ, Batelier G, Melki R, and Candido EP. Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J Biol Chem 272: 12847-12853, 1997.

114. Leroux MR, Melki R, Gordon B, Batelier G, and Candido EP. Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J Biol Chem 272: 24646-24656, 1997.

115. Lindner RA, Kapur A, and Carver JA. The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin. J Biol Chem 272: 27722-27729, 1997.

116. Lindner RA, Kapur A, Mariani M, Titmuss SJ, and Carver JA. Structural alterations of alpha-crystallin during its chaperone action. Eur J Biochem 258: 170-183, 1998.

117. Lindner RA, Treweek TM, and Carver JA. The molecular chaperone alpha-crystallin is in kinetic competition with aggregation to stabilize a monomelic molten-globule form of alpha- lactalbumin. Biochem J 354: 79-87,2001.

118. Mao YW, Liu JP, Xiang H, and Li DW. Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Bax and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis. Cell Death Differ 11: 512-526, 2004.

119. Markov DI, Pivovarova AV, Chernik IS, Gusev NB, and Levitsky DI. Small heat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPasc inactivation. FEBSLett 582: 1407-1412, 2008.

120. McColIum AK, Casagrande G, and Kohn EC. Caught in the middle: the role of Bag3 in disease. Biochem J425: el-3, 2010.

121. McHaourab HS, Godar JA, and Stewart PL. Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry 48: 3828-3837, 2009.

122. Muchowski PJ, Hays LG, Yates JR, 3rd, and» Clark JI. ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J Biol Chem 274: 3019030195, 1999.

123. Mymrikov EV, Bukach OV, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. The pivotal role of the beta 7 strand in the intersubunit contacts of different human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones 15: 365-377, 2010.

124. Panasenko OO, Seit Nebi A, Bukach OV, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys Acta 1601:64-74, 2002.

125. Paul C, Manero F, Gonin S, Kretz-Remy C, Virot S, and Arrigo AP. Hsp27 as a negative regulator of cytochrome C release. Mol Cell Biol 22: 816-834, 2002.

126. Permyakov EA, and Burstein EA. Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys Chem 19: 265-271, 1984.

127. Peschek J, Braun N, Franzmann TM, Georgalis Y, Haslbeck M, Weinkauf S, and Buchner J. The eye lens chaperone alpha-crystallin forms defined globular assemblies. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 13272-13277,2009.

128. Pipkin W, Johnson JA, Creazzo TL, Burch J, Komalavilas P, and Brophy C.1.calization, macromolecular associations, and function of the small heat shock-related protein HSP20 in rat heart. Circulation 107: 469-476, 2003.

129. Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM. Rapid refolding studies on the chaperone-like alpha-crystallin. Effect of alpha-crystallin on refolding of beta- and gamma-crystallins. J Biol Chem 270: 19888-19892, 1995.

130. Reddy GB, Das KP, Petrash JM, and Surewicz WK. Temperature-dependent chaperone activity and structural properties of human alphaA- and alphaB-crystallins. J Biol Chem 275: 4565-4570, 2000.

131. Santhoshkumar P, and Sharma KK. Analysis of alpha-crystallin chaperone function using restriction enzymes and citrate synthase. Mol Vis 7: 172-177, 2001.

132. Schaub MC, and Perry SV. The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. BiochemJ 115: 993-1004, 1969.

133. Scopes RK. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Anal Biochem 59: 277-282, 1974.

134. Sharma KK, Kaur H, and Kester K. Functional elements in molecular chaperone alpha-crystallin: identification of binding sites in alpha B-crystallin. Biochem Biophys Res Commun 239: 217-222, 1997.

135. Sharma KK, Kumar GS, Murphy AS, and Kester K. Identification of l,l'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid binding sequences in alpha-crystallin. J Biol Chem 273: 15474-15478, 1998.

136. Sharma KK, Kumar RS, Kumar GS, and Quinn PT. Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J Biol Chem 275: 3767-3771, 2000.

137. Sreerama N, and Woody RW. Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol 3 83: 318-351, 2004.

138. Stamler R, Kappe G, Boelens W, and; Slingsby C. Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. JMol Biol 353: 68-79, 2005.

139. Stetler RA, Gao Y, Signore AP, Cao G, and'Chen J. HSP27: mechanisms of cellular protection against neuronal injury. Curr Mol Med 9: 863-872,2009.

140. Sun X, Fontaine JM, BartI I, Behnam B, Welsh MJ, and Benndorf R. Induction of Hsp22 (HspB8) by estrogen and the metalloestrogen cadmium in estrogen receptor-positive breast cancer cells. Cell Stress Chaperones 12: 307-319, 2007.

141. Sun X, Fontaine JM, Rest JS, Shelden EA, Welsh MJ, and Benndorf R. Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J Biol Chem 279: 2394-2402, 2004.

142. Sun X, Welsh MJ, and Benndorf R. Conformational changes resulting from pseudophosphorylation of mammalian small heat shock proteins—a two-hybrid study. Cell Stress Chaperones 11: 61-70, 2006.

143. Takayama S, and Reed JC. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol 3: E237-241, 2001.

144. Taylor RP, and Benjamin IJ. Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J Mol Cell Cardiol 38: 433-444, 2005.

145. Tessier DJ, Komalavilas P, Panitch A, Joshi L, and Brophy CM. The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. J Surg Res 111: 152-157,2003.

146. Theriault JR, Lambert H, Chavez-Zobel AT, Charest G, Lavigne P, and Landry J.

147. Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J Biol Chem 279: 23463-23471, 2004.

148. Trent S, Yang C, Li C, Lynch M, and Schmidt EV. Heat shock protein B8, a cyclin-dependent kinase-independent cyclin D1 target gene, contributes to its effects on radiation sensitivity. Cancer Res 67: 10774-10781, 2007.

149. Treweek TM, Rekas A, Lindner RA, Walker MJ, Aquilina JA, Robinson CV, Horwitz J, Der Perng M, Quinlan RA, and Carver JA. R120G alphaB-crystallin promotes the unfolding of reduced alpha-lactalbumin and is inherently unstable. Febs J 272: 711-724, 2005.

150. Trigon S, Serizawa H, Conaway JW, Conaway RC, Jackson SP, and1 Mo range M. Characterization of the residues phosphorylated in vitro by different C-terminal domain kinases. J Biol Chem 273: 6769-6775, 1998.

151. Veinger L, Diamant S, Buchner J; and Goloubinoff P: The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. J Biol Chem 273: 11032-11037, 1998.

152. Villen J, Beausoleil SA, Gerber SA, and Gygi SP. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sci USA 104: 1488-1493, 2007.

153. Wang L, Zajac A, Hedhli N, and Depre C. Increased expression of Hll kinase stimulates glycogen synthesis in the heart. Mol Cell Biochem 265: 71-78, 2004.

154. Wang X, Zingarelli B, O'Connor M, Zhang P, Adeyemo A, Kranias EG, Wang Y, and Fan GC. Overexpression of Hsp20 prevents endotoxin-induced myocardial dysfunction and apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation. J Mol Cell Cardiol 47: 382-390, 2009.

155. Wilhelmus MM, Boelens WC, Otte-Holler I, Kamps B, de Waal RM, and Verbeek MM. Small heat shock proteins inhibit amyloid-beta protein aggregation and cerebrovascular amyloid-beta protein toxicity. Brain Res 1089: 67-78, 2006.

156. Wilhelmus MM, Otte-Holler I, Wesseling P, de Waal RM, Boelens WC, and Verbeek MM. Specific association of small heat shock proteins with the pathological hallmarks of Alzheimer's disease brains. Neuropathol Appl Neurobiol 32: 119-130, 2006.

157. Ким MB. Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, эксперссируемого при дистальной моторной нейропатии II типа. In: Кафедра биохимии. Москва: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2005.

158. Микулин ВП. Фопгографический рецептурный справочник. Москва: Искусство, 1963.