Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кремнева, Елена Валериевна

• Кремнева, Елена Валериевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кремнева, Елена Валериевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Введение

Обзор литературы

1) Структура мышцы и основы мышечного сокращения.

2) Миозин.

3) Актин.

4). Молекулярный механизм подвижности.

5) Регуляция мышечного сокращения.

5.1. Миозиновый тип регуляции.

5.2. Актиновый тип регуляции.

6) Регуляторные белки тонкого филамента.

6.1. Тропомиозин.

6.1.1. Сходство и различие тропомиозинов из скелетных, сердечных и гладких мышц.

6.1.2 Немышечные тропомиозины.

6.1.3. Миопатии, связанные с мутациями в тропомиозине.

6.2. Тропонин.

6.2.1. Тропонин С

6.2.2. Тропонин I

6.2.3. Тропонин Т

7) Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для структурных исследований мышечных белков.

7.1. Миозин.

7.2. Актин

7.3. Тропомиозин.

7.4. Тропонин.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования.

1) Получение препаратов белков

1.1. Получение субфрагмента 1 миозина из скелетных мышц кролика.

Получение миозина. Разглицеринизация миозина. Получение субфрагмента 1 миозина (S1)

1.2. Выделение актина из скелетных мышц кролика.

Получение ацетонового порошка Выделение актина из ацетонового порошка

1.3. Приготовление препарата гладкомышечного тропомиозина

1.4. Приготовление препаратов скелетного тропомиозина и скелетного тропонина

1.5. Стабилизация F-актина фторидом алюминия

1.6. Экспрессия и очистка рекомбинантных ТМ.

1.7. Получение окисленных и восстановленных препаратов ТМ.

2) Используемые методы исследования

2.1. Определение АТРазной активности миозина

2.2. Градиентный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS

2.3. Исследования термодинамических характеристик белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии.

Стандартный метод измерения.

Модифицированный метод измерения для некооперативных тепловых переходов.

2.4. Вискозиметрический метод.

2.5. Метод кругового дихроизма.

2.6. Соосаждение ТМ с F-актином.

2.7. Исследование диссоциации комплекса ТМ с актином методом светорассеяния.

Результаты и их обсуждение.

1) Взаимодействие скелетного тропомиозина с актином и тропонином.

1.1. Тепловая денатурация скелетного ТМ.

1.2. Взаимодействие ТМ с актином.

1.3. Регулируемый актиновый филамент.

2) Эффекты кардиомиопатических мутаций в тропомиозине.

2.1. Влияние FHC мутаций на тепловую денатурацию рекомбинантного ТМ.

2.2. Сродство ТМ к актину.

2.3. Тепловая денатурация мутантных форм ТМ в их комплексах с актином.

3) Предполагаемый механизм тепловой денатурации тропомиозина на поверхности актиновых филаментов.

4) Влияние структуры тропомиозина на характер его тепловой денатурации.

4.1. Влияние сегментов 2 и 3 на тепловую денатурацию дрожжевых ТМ.

4.2. Особенности тепловой денатурации немышечных ТМ.

4.2.1. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод ДСК.

4.2.2. Исследование концевых взаимодействий: вискозиметрия.

4.2.3. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод кругового дихроизма.

4.2.4. Исследование методом ДСК тепловой денатурации связанного с актином рекомбинантного ТМ.

4.2.5. Вызванная нагревом диссоциация комплекса ТМ-актин.

4.2.6. Суммарный анализ различий в тепловой денатурации гладкомышечного и фибробластных ТМ.

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина»

В основе биологической подвижности всего живого лежит всего несколько молекулярных механизмов. В случае эукариотических клеток наиболее распространенной считается актомиозиновая система подвижности, основанная на взаимодействии миозина и актина. Именно это взаимодействие ответственно за сокращение мышц и многие процессы клеточной подвижности.

В основе молекулярного механизма сокращения мышц лежат структурные изменения, происходящие в миозиновой головке при гидролизе АТР и при взаимодействии с актиновым филаментом. В процессе этого взаимодействия происходит превращение химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения. Для регуляции этого взаимодействия в мышцах существуют специальные белковые системы. Необходимость существования системы регуляции сократительной активности объясняется тем, что мышца не могла бы выполнять свои функции, если бы она постоянно находилась в сокращенном состоянии. Регуляция взаимодействия миозиновых и актиновых филаментов в мышце осуществляется ионами Са2+. Иначе говоря, основная задача регуляторных систем состоит в отслеживании изменения концентрации Са2+ внутри клетки (с 10"7 до 10~5 М). Регуляторные белки могут располагаться либо на тонких, либо на толстых филаментах. В поперечнополосатых и сердечных мышцах основным является актиновый тип регуляции, главную роль в котором играют тропомиозин и тропонин, ассоциированные с тонким (актиновым) филаментом. В состоянии расслабления, когда концентрация свободного Са2+ в мышце очень мала, тропомиозин закрывает сайты связывания миозина на актиновом филаменте, стерически блокируя взаимодействие миозина с актином. Связывание Са2+ с тропониновым комплексом позволяет сдвинуть тропомиозин из этого положения, что делает возможным связывание миозина с актином, приводящее к генерации силы. Таким образом, тропомиозин (ТМ) играет ключевую роль в регуляции сокращения поперечнополосатых и сердечных мышц. Помимо этого, во всех типах мышц и во многих немышечных клетках эукариот ТМ связан с актином, сильно повышая кооперативность актиновых филаментов. Однако многие особенности структурного состояния ТМ на поверхности актиновых филаментов остаются до сих пор неясными. Одним из подходов, применяемых для выяснения таких особенностей, является исследование характера тепловой денатурации ТМ непосредственно на поверхности актиновых филаментов с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами [Levitsky et al., 2000].

Важно отметить, что до настоящего времени метод ДСК применялся исключительно для изучения мышечных изоформ ТМ, тогда как тепловая денатурация его немышечных изоформ оставалась совершенно неизученной. Неясным оставался также вопрос о том, как именно происходит тепловая денатурация ТМ на поверхности актиновых филаментов и как влияют на нее различные модификации белка. В связи с этим, целью данной работы было исследование методом ДСК в сочетании с другими методами характера тепловой денатурации разных изоформ ТМ в отсутствие и в присутствии актина, включая мышечные ТМ с мутациями в молекулах и немышечные ТМ различной длины, а также влияние на него других регуляторных белков. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Методом ДСК изучить влияние актина и тропонина на тепловую денатурацию ТМ.

2. Исследовать влияние кардиомиопатических мутаций (D175N и E180G) в ТМ на характер его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии F-актина.

3. Используя дрожжевые ТМ различной длины, изучить влияние структуры ТМ на характер его тепловой денатурации.

4. Используя ТМ фибробластов в сравнении с гладкомышечным ТМ, изучить влияние замен участков, кодируемых определенными экзонами, на характер тепловой денатурации ТМ.

5. Провести сравнительный анализ тепловой денатурации связанного с актином ТМ, исследуемой методом ДСК, и температурных зависимостей диссоциации ТМ с поверхности актинового филамента, исследуемых по изменениям светорассеяния. На основании такого анализа представить механизм тепловой денатурации связанного с актином ТМ.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработаны новые подходы на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для регистрации изменений характера тепловой денатурации ТМ, происходящих в результате его связывания с F-актином. Это позволило впервые описать механизм тепловой денатурации ТМ в присутствии F-актина, а также впервые объяснить существенную разницу в физиологических эффектах двух кардиомиопатических мутаций в молекуле ТМ, D175N и E180G. Помимо этого, методом ДСК в сочетании с другими методами (КД, светорассеяние) впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных ТМ фибробластов и дрожжей. Работа имеет важное значение для дальнейших исследований влияния различных факторов, таких как точечные мутации или изменения целых участков в молекуле ТМ, на тепловую денатурацию ТМ в отсутствие и в присутствии актина.

Обзор литературы.

В основе биологической подвижности всего живого лежит всего несколько молекулярных механизмов. В случае эукариотических клеток наиболее распространенной считается актомиозиновая система подвижности, основанная на взаимодействии миозина и актина. Именно это взаимодействие ответственно за сокращение мышц и многие процессы клеточной подвижности. Таким образом, мышцы являются высоко специализированными органами, способными за счет гидролиза АТР генерировать механические усилия и обеспечивать перемещение животных в пространстве.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кремнева, Елена Валериевна

Выводы.

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии впервые исследовано одно из структурных состояний тропомиозина, расположенного на актиновом филаменте, — состояние «blocked», которое реализуется в комплексе, состоящем из актина, тропомиозина и тропонина. Показано, что при переходе в это состояние заметно увеличивается кооперативность тепловой денатурации связанного с актином тропомиозина.

2. Предложен механизм тепловой денатурации тропомиозина в присутствии F-актина. Согласно этому механизму, влияние актина на тепловую денатурацию тропомиозина зависит от разницы между температурой полумаксимальной диссоциации комплекса тропомиозин-Р-актин и температурой денатурации свободного тропомиозина. Эффект актина на тепловую денатурацию тропомиозина (значительное увеличение термостабильности белка) выражен ярче всего для тех белков, которые денатурируют в отсутствие актина при более низких температурах, чем температура полумаксимальной диссоциации комплекса.

3. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии в сочетании с измерениями температурных зависимостей диссоциации комплексов тропомиозин— актин исследовано влияние двух кардиомиопатических мутаций в молекуле тропомиозина, D175N и E180G, на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. В результате удалось впервые объяснить существенную разницу в физиологических проявлениях этих мутаций, одна из которых (D175N) вызывает лишь легкую сердечную недостаточность, а другая (E180G) зачастую приводит к летальному исходу. При повышении температуры (например, при простуде или при интенсивной мышечной деятельности) тропомиозин с мутацией E180G (но не с мутацией D175N) диссоциирует с поверхности актиновых филаментов и денатурирует, что и приводит, по-видимому, к серьезному поражению сердечной мышцы.

4. При исследованиях тепловой денатурации «сверхкоротких» рекомбинантных дрожжевых тропомиозинов показано, что термостабильность белка и прочность его связывания с актином зависят не только от длины тропомиозина, т. е. от количества актин-связывающих участков - повторяющихся сегментов в аминокислотной последовательности тропомиозина, но и от взаимного расположения этих сегментов в молекуле белка.

5. Впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных тропомиозинов фибробластов. Обнаружены существенные различия в характере тепловой денатурации между мышечными и немышечными изоформами тропомиозина, обусловленные различиями в структуре N-концевой части молекулы белка. Показано, что замена N-концевых участков, кодируемых мышечными экзонамиТа и 2а на участок, кодируемый немышечным экзоном lb, оказывает существенное влияние на тепловую денатурацию всей молекулы тропомиозина, заметно увеличивая термостабильность белка и значительно снижая калориметрическую энтальпию его тепловой денатурации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кремнева, Елена Валериевна, 2005 год

1. Гусев Н.Б. (1998). Внутриклеточные Са-связывающие белки. Соросовскийобразовательный журнал, 5:2-16

2. Гусев Н.Б. (2000). Молекулярные механизмы мышечного сокращения.

3. Соросовский образовательный журнал, 6(8): 24-32

4. Кремнева Е.В., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Влияниетропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Биохимия, 68: 976-984

5. Левицкий Д.И. (1987). Структурные особенности и функциональная рольмолекул миозина. В книге «Структура и функции белков сократительных систем» (под ред. Пинаев, Г. П.), Л. Наука, 5-31

6. Левицкий Д.И. (1991) Структура миозиновой головки. Биохимия, 56: 1539-1566

7. Левицкий Д.И. (2004). Применение метода дифференциальной сканирующейкалориметрии для структурно-функциональный исследований мышечных белков (обзор). Успехи биол. химии, 44: 133-170

8. Левицкий Д.И., Бобков А.А., Голицына Н.Л., Николаева О.П., Павлов Д.А.,

9. Поглазов Б.Ф. (1996). Калориметрические исследования стабильных комплексов субфрагмента 1 миозина с аналогами аденозинтрифосфата и фосфата. Биофизика, 41 (1): 64-72

10. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А.,

11. РостковаЕ.В. (1998). Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63 (3): 391-394

12. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995). Белки актомиозиновойсистемы подвижности. В книге "Белки и пептиды", 1: 249-293, (под ред. Иванова Б.Т., Липкина В.М.), Наука, Москва

13. Морозова Л.А., Гусев Н.Б., Шныров В.Л. Пермяков Е.А. (1988) Изучениефизико-химических свойств тропонинов I и Т из сердечных и скелетных мышц методами белковой флуоресценции и калориметрии. Биохимия, 53: 531-540

14. Поглазов Б.Ф., Билуши В., Баев А.А. (1958). О сульфгидрильных группахмиозиновой аденозинтрифосфатазы. Биохимия, 23 (2): 269-284

15. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. (1982). Книга Миозин и биологическаяподвижность, (под ред. Кретович, В. Л.), Наука, Москва

16. Татунашвили Л.В., Привалов П.Л. (1984) Калориметрические исследованияденатурации G-актина. Биофизика, 29: 583-585

17. Филатов В.Л., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Гусев Н.Б. (1999). Тропонин:

18. Строение, свойства и механизм функционирования. Биохимия, 64 (9): 11551174

19. Хворов Н.В., Левицкий Д.И., Букатина А.Е., Шныров В.Л., Поглазов Б.Ф. (1990).

20. Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. Доклады АН СССР, 315 (3): 745-748

21. Basi G.S. and Storti R.V. (1986) Structure and DNA sequence of the tropomyosin Igene from Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 261(2): 817-27

22. Bertazzon A. and Tsong T.Y. (1990) Effects of ions and pH on the thermal stability of

23. Thin and Thick filaments of skeletal muscle: high-sensitivity differential scanning calorimetric study, Biochemistry, 29: 6447-6452

24. Bertazzon A. and Tsong T.Y. (1990) Study of effects of pH on the stability of domainsin myosin rod by high-resolution differential scanning caloiimetry. Biochemistry, 29: 6453-6459

25. Bobkov A.A., Khvorov N.V., GolitsinaN.L., Levitsky D.I. (1993) Calorimetriccharacterization of the stable complex of myosin subfragment 1 with ADP and beryllium fluoride. FEBS Letters. 332: 64-66

26. BogatchevaN.V. and Gusev N.B. (1995) Interaction of smooth muscle calponin withphospholipids. FEBS Lett. 371: 123-12622