Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Невзоров, Илья Анатольевич

• Невзоров, Илья Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Невзоров, Илья Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Структура тропомиозина

1. Открытие тропомиозина и первоначальные сведения о его структуре

2. Структура соПес1-соП: основные черты и номенклатура

Факторы, определяющие стабильность структуры СС

3. Тропомиозин: распространение и изоформы

4. Особенности первичной структуры ТМ

5. Стабильность молекулы ТМ

6. Атомные структуры тропомиозина 25 И. Функциональные свойства тропомиозина

1. Взаимодействие ТМ с фибриллярным актином

Кооперативностъ взаимодействия и факторы, ее определяющие

Факторы, определяющие сродство ТМкР-актину

Гипотеза Оез1аи~связывания

2. Регуляторная функция ТМ

Общие сведения о механизме мышечного сокращения 43 Регуляция взаимодействия головки миозина с актиновым филаментном

III. Миопатические мутации в тропомиозинах

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Препаративные методы

Приготовление компетентных клеток Е.соИ

Сайт-направленный мутагенез

Экспрессия рекомбинантного ТМ в клетках Е. соИ

Выделение актина га ацетонового порошка

Выделение субфрагмента 1 миозина (Б!)

Выделение тропонина из ацетонового порошка мышц кролика

Получение ТМ, меченого Ы-(1-пиренш)йодацетамидом

2. Аналитические методы

Определение концентрации белков

ЗИБ-Электрофорез в ПААГ 59 Образование дисульфидной связи с помощью

5,5'-дитиобис(2-нитробензоата)

Ограниченный протеолиз тропомиозина трипсином

Соосаждение тропомиозина сР- актином

Определение Са2+ -чувствительностиреконструированного тонкого филомента 62 Исследования тепловой денатурации ТМметодом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)

Спектроскопия кругового дихроизма 64 Исследование температурных зависимостей диссоциации комплекса

ТМ с Г-актином методом светорассеяния 65 Температурные зависимости эксимерной флуоресценции пиренил-меченого тропомиозина

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Исследование структуры и свойств Р-тропомиозина, несущего мутацию 1191С

I. 1. Термостабильность Р-тропомиозина (р-ТМ) и влияние на нее мутации Я9Ш

1.1.1. Гладкомышечный Р-тропомиозин ф-БтТт)

1.1.2. Скелетный Р-тропомиозин (р-БкТт)

I. 2. Способность Р-ТМ к формированию аР-гетеродимеров с а-ТМ и влияние на нее мутации Б191 й

1.2.1. Образование гетеродимеров между а- и р-цепями ТМ

1.2.2. Влияние мутации К9Ю в гладкомышечном р-ТМ на его способность образовывать аР-гетеродимеры с а-ТМ

I. 3. Влияние мутации Ы9Ш в Р-ТМ на его взаимодействие с Б-актином

1.3.1. Гладкомышечный Р-тропомиозин ф-8тТт)

1.3.2. Скелетный Р-тропомиозин ф-БкТт)

Глава И. Роль остатка С1у-126 в структуре и функциях ТМ

II.1. Консервативный неканонический остаток С1у-126 дестабилизирует центральную часть молекулы ТМ

II. 1.1. Изучение локальной стабильности а-БкТт ЖТ и его мутантов а-8кТт а26А и а-5кТт 012611 методом ограниченного протеолиза

II. 1.2. Изучение тепловой денатурации а-БкТт ЖГи его мутантов — а-БкТт в126А и а-БкТт в126Я

II. 1.3. Тепловая денатурация а-ТМ и его мутантов в присутствии

Р-актина

112. Влияние стабилизации центральной части а-БкТМ на его функциональные свойства

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы»

Тропомиозин (ТМ) является одним из ключевых компонентов регуляторного аппарата тонких филаментов во всех типах мышц. Вытянутые молекулы ТМ связываются с семью мономерами актина и тропониновым комплексом в составе тонкого филамента. Современные представления о механизме регуляции сокращения скелетной и сердечной мышцы сформулированы в виде теории «стерического блокирования», согласно которой ТМ способен перемещаться на поверхности актинового филамента, открывая или закрывая участки взаимодействия актина с головками молекул миозина. Положение ТМ на актине зависит от нескольких факторов, ключевыми из которых являются концентрация ионов кальция и наличие головок миозина. Данные кинетических и структурных исследований показывают, что для ТМ характерны три состояния, которые отражают его различные положения на поверхности актинового филамента. Эти состояния принято обозначать как «blocked» (связывание миозина с актином невозможно), «closed» (разрешено только «слабое» связывание) и «ореп» (осуществляется изомеризация актомиозинового комплекса и переход «слабого» связывания в «сильное») [McKillop & Geeves, 1993].

Молекула ТМ представляет собой димер а-спиралей, образующих левозакрученную суперспираль (coied-coil). Это объясняется наличием в первичной структуре ТМ непрерывающихся семичленных повторов (гептад). Соответственно, аминокислотную последовательность ТМ можно изобразить как (a b с d е f g)n, где положения а и d обычно заняты гидрофобными остатками, а в положениях ей g находятся остатки с заряженным радикалом. В целом, гидрофобные взаимодействия образуются в месте контакта спиралей и стабилизируют coiled-coil, тогда как электростатические взаимодействия между остатками ей g обусловливают специфичность образования двойной спирали и ее стабильность. Остатки с, duf обычно гидрофильны и определяют взаимодействие ТМ с другими белками. Таким образом, стабильность молекулы ТМ зависит от природы остатков в положениях a, d, е и g, а также от спиралеобразующей способности всех остальных аминокислотных остатков, включая отмеченные выше.

Для ТМ характерно наличие 4 генов, которые в результате альтернативного сплайсинга дают суммарно более 30 изоформ. В скелетных мышцах человека ТМ присутствует главным образом в виде гомодимеров а- и Р-изоформ, тогда как для гладкой мышцы характерно наличие аР-гетеродимеров.

Ввиду простоты своего устройства, молекула ТМ представляет собой идеальный объект для изучения взаимосвязи структуры и функции в молекулах белков. В этом отношении особый интерес представляют аминокислотные замены (мутации) в ТМ, ассоциированные с различными заболеваниями - например, миопатиями. Как правило, такие мутации имеют ярко выраженный функциональный фенотип, поэтому изучение вызываемых ими структурных изменений ТМ интересно с точки зрения как фундаментальной науки, так и биомедицины. Известно, например, что мутация Arg91 Gly в (3-изоформе ТМ ассоциирована с дистальным артрогриппозом - тяжелым наследственным заболеванием мышц. Кроме того, было установлено, что функциональными последствиями данной мутации является значительное снижение сродства молекул ТМ к актину и слишком высокая сократительная активность мышц. Тем не менее, оставалось непонятным, какие именно изменения в структуре мутантного ТМ приводят к таким эффектам. Выяснение этого вопроса составило одну из главных целей данной диссертационной работы.

Другим подходом в изучении структуры и функций ТМ является направленное изменение первичной структуры его молекулы (например, путем введения точечных мутаций) с последующим анализом свойств таких мутантных белков. В последнее время внимание исследователей стала привлекать центральная часть молекулы ТМ, которая по данным ограниченного протеолиза трипсином является наименее стабильным участком молекулы. Недавно S. Lehrer с соавторами показали, что замена остатка Aspl37 на Leu полностью предотвращает расщепление трипсином центральной части молекулы ТМ [Sumida et al., 2008]. Поскольку Aspl37 является заряженным остатком в положении d (т.е. в гидрофобном коре молекулы), авторы объясняли дестабилизацию центральной части ТМ наличием этого остатка. Тем не менее, заряженные остатки также присутствуют в положении d ив других участках молекулы, однако протеолиз там не происходит, несмотря на наличие множества потенциальных участков расщепления трипсином. Отметим, что при изучении дестабилизации центральной части ТМ от внимания исследователей ускользало наличие в ней консервативного остатка Gly 126, который, предположительно, сильно снижает стабильность двойной a-спирали ТМ. Таким образом, механизм дестабилизации центральной части молекулы ТМ оставался до конца непонятным. Поскольку данные трипсинолиза позволяли судить лишь о локальных изменениях в области участка расщепления, оставалось совершенно неясным, каковы в действительности размеры нестабильной центральной части молекулы ТМ. Кроме того, немалый интерес вызывает вопрос о функциональной значимости дестабилизации центрального участка молекулы. Выяснение этих вопросов составило другую важную цель данной диссертационной работы. Для этого методом сайт-направленного мутагенеза были получены препараты ТМ с заменами интересующих нас остатков и проведен подробный структурно-функциональный анализ свойств таких препаратов.

Итак, целью данной работы стало изучение структуры и свойств мутантных форм ТМ, несущих замены Аг§9Ю1у (1*91 в), С1у126А1а (С126А) и С1у126Ащ (012611). В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1) С помощью сайт-направленного мутагенеза получить рекомбинантные белки: р-изоформы ТМ гладких и скелетных мышц человека, несущие мутацию Я9Ю, и а-изоформу ТМ скелетных мышц человека, несущую мутации 0126А или 012611.

2) Методами ограниченного протеолиза трипсином, дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) и кругового дихроизма (КД) изучить влияние указанных мутаций на структуру и стабильность молекулы ТМ и различных ее участков.

3) Используя метод химического «сшивания», исследовать влияние мутации Я9Ю в Р-изоформе ТМ человека на ее способность к образованию сф-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

4) Изучить влияние мутаций 0126А и 012611. в скелетномышечном а-ТМ человека на его сродство к Б-актину, а также на его регуляторные свойства в составе полностью реконструированных тонких филаментов.

Научная новизна и практическая значимость.

В работе впервые подробно исследован характер тепловой денатурации гладкомышечной и скелетномышечной изоформ Р-ТМ. С помощью метода ДСК установлено наличие в молекуле Р-ТМ двух калориметрических доменов (т.е. участков молекулы, которые денатурируют кооперативно и независимо друг от друга). Для идентификации этих доменов впервые было применено сочетание метода ДСК с измерениями температурных зависимостей флуоресценции эксимеров пирена. С помощью такого подхода установлено, что менее термостабильный домен представляет собой >1-концевую часть молекулы, тогда как более термостабильный домен соответствует ее С-концевой части. Проведено подробное изучение эффекта мутации 11910 на структуру и термостабильность гладкомышечной и скелетной изоформ Р-ТМ человека. Показано, что эта мутация вызывает драматическое снижение термостабильности всего И-концевого домена молекулы ТМ.

Методом химического сшивания показано, что мутация Я9Ш в гладкомышечной изоформе р-ТМ резко снижает ее способность образовывать сф-гетеродимеры с гладкомышечным а-ТМ. Предложен термодинамический механизм, описывающий снижение эффективности образования аР-гетеродимеров ТМ под действием мутации К9Ю.

С помощью метода ДСК впервые показано, что для некоторых участков молекулы скелетномышечного а-ТМ характерно некооперативное плавление, что свидетельствует об их высокой конформационной подвижности. Впервые предложена и проверена идея об участии аминокислотного остатка С1у126 в дестабилизации центральной части молекулы а-ТМ. Использование мутантных форм а-ТМ, несущих замены в126А и С126К, впервые позволило объяснить необычный характер протеолиза молекулы ТМ трипсином и установить, что некооперативное плавление имеет место именно в центральной части молекулы ТМ. Более того, впервые удалось определить приблизительные размеры этой нестабильной части молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков, что соответствует четверти длины молекулы ТМ). На основании полученных данных высказана гипотеза о структурной организации молекулы ТМ, согласно которой молекула состоит из двух доменов разной стабильности (К-концевого и С-концевого) и нестабильного центрального участка между ними.

Продемонстрировано, что конформационная подвижность центральной части ТМ не является, вопреки распространенному мнению, необходимым фактором для связывания ТМ с актиновым филаментом. Кроме того, показано, что стабилизация центральной части молекулы ТМ может оказывать заметное влияние на регуляторные свойства ТМ в полностью реконструированных тонких филаментах, что проявляется в увеличении АТРазной активности актомиозина.

Полученные данные значительно расширяют и углубляют представления об особенностях структурной организации молекулы тропомиозина, а также представляют несомненную важность для понимания тех молекулярных механизмов, которые лежат в основе различных тяжелых заболеваний мышц, ассоциированных с миопатическими мутациями в молекуле тропомиозина.

Обзор литературы

I. Структура тропомиозина

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Невзоров, Илья Анатольевич

Выводы

С использованием методов дифференциальной сканирующей калориметрии, спектроскопии кругового дихроизма, флуоресценции, ограниченного протеолиза трипсином, химического «сшивания» и соосаждения тропомиозина (ТМ) с актином исследовано влияние мутации Arg91Gly в Р-изоформе ТМ гладких и скелетных мышц человека (Р-ТМ) и мутаций Glyl26Ala и Glyl26Arg в а-изоформе ТМ скелетных мышц человека (а-ТМ) на структурные и функциональные свойства тропомиозина. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) Точечная мутация Arg91Gly вызывает значительные структурные изменения в молекуле Р-ТМ, резко снижая термостабильность N-концевой половины молекулы. Показано также, что эта мутация существенно снижает способность р-ТМ к образованию ap-гетеродимеров с а-изоформой ТМ.

2) Мутация Arg91Gly существенно снижает сродство Р-ТМ к F-актину.

3) Замены неканонического остатка Glyl26 в центральной части молекулы а-ТМ на канонические остатки Ala и Arg стабилизируют эту область молекулы. Это выражается в предотвращении расщепления а-ТМ трипсином и в изменении характера тепловой денатурации центральной части а-ТМ с некооперативного на кооперативный.

4) Проведена оценка размера нестабильной центральной области молекулы а-ТМ и установлено, что она включает 60-70 аминокислотных остатков (приблизительно четверть длины молекулы).

5) Стабилизация центральной части молекулы а-ТМ не влияет на сродство тропомиозина к F-актину. При этом мутация Glyl26Arg (но не Glyl26Ala) оказывает заметное влияние на регуляторные свойства тропомиозина в полностью реконструированных тонких филаментах, что проявляется в увеличении АТРазной активности актомиозина при высоких концентрациях ионов кальция.

Заключение

Итак, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что одиночная мутация 119 Ш вызывает дестабилизацию (снижение термостабильности) почти половины молекулы (3-ТМ, тогда как мутации 0126А и С12611 стабилизируют центральную часть молекулы а-ТМ, делая ее исходно некооперативную тепловую денатурацию кооперативной.

Нами было показано, что мутация Я9Ю драматически снижает термостабильность 1Ч-концевой половины молекулы (3-ТМ, вследствие чего вся эта часть молекулы мутантного белка плавится при температурах ниже физиологической. Учитывая то, что р-ТМ 1191 в обладает низким сродством к актиновым филаментам, можно заключить, что в физиологических условиях стабилизация (3-ТМ Я9Ш актином вряд ли возможна. Кроме того, нами было установлено, что (3-ТМ, несущий мутацию Я9Ю, обладает существенно сниженной способностью образовывать оф-гетеродимеры с а-ТМ. Все эти свойства мутантного Р-ТМ могут приводить к изменению соотношения различных изоформ ТМ в мышечной ткани. Отметим, что в литературе имеются описания наследственных миопатий, многие из которых сопровождаются изменением содержания различных изоформ ТМ. Эти изменения, в свою очередь, коррелируют с вариациями в соотношении различных типов волокон в мышечной ткани, что напрямую связано с морфологией мышц и ее изменениями при миопатиях. Вполне вероятно, что подобный механизм развития заболевания может выражаться и в случае дистального артрогриппоза, ассоциированного с мутацией Ы91С в р-ТМ.

Удивительным свойством молекулы ТМ является то, что несмотря на кажущуюся однородность структуры (фибриллярный а-спиральный белок), свойства различных участков молекулы резко отличаются друг от друга. Введение остатка глицина в положение 91 закономерно снижает стабильность а-спирали; интересно, однако, что это дестабилизирующее действие распространяется практически на всю ТЯ-концевую половину молекулы Р-ТМ. Таким образом, можно заключить, что для структуры этой части молекулы характерна высокая кооперативность, которая, видимо, отражает высокую плотность упаковки и низкую конформационную подвижность. Между тем, центральный участок молекулы ТМ (60-70 аминокислотных остатков) содержит в себе консервативный остаток глицина и, как мы показали, характеризуется некооперативной денатурацией. Это свойство является проявлением высокой конформационной подвижности данного участка. Таким образом, подтверждается ранее предложенная модель устройства молекулы ТМ: два относительно стабильных и достаточно жестких домена (ЪГ- и С-концевой) соединены подвижным центральным участком.

Высокая конформационная подвижность молекулы ТМ и ее влияние на функциональные свойства данного белка давно являлись предметом острой дискуссии. Предполагалось, в частности, что конформационная подвижность именно центральной части молекулы ТМ важна для его актин-связывающей функции. Результаты настоящей работы показывают, что увеличение стабильности центральной части ТМ, вызываемое мутациями 0126А и 012611, и, как следствие, уменьшение ее конформационной подвижности, не влияет на параметры связывания ТМ с Б-актином. Между тем, стабилизация центральной части оказывает влияние на регуляторные свойства ТМ. Интересно, что в этом случае наиболее важным оказывается стабильность именно двуспиральной структуры ТМ, а не каждой из его а-спиралей в отдельности.

В заключение отметим, что если раньше ТМ являлся одним из самых типичных представителей в своем классе белков с суперспиральной структурой, то в последнее время данная концепция активно пересматривается. Отмечаются необычные, характерные только для ТМ черты структуры, которые обусловливают выполняемые им важнейшие функции в регуляции мышечного сокращения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Невзоров, Илья Анатольевич, 2011 год

1. Левицкий Д.И. (2004) Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для структурно-функциональный исследований мышечных белков (обзор). Успехи биол. химии, т. 44, с. 133-170.

2. Финкелыптейн А.В., Птицын О.Б. «Физика белка». 2-е изд. Книжный дом «Университет», Москва, 2002.

3. Arndt К.М., Pelletier J.N., Miller К.М., Plickthun A., Alber T. (2002) Comparison of in vivo selection and rational design of heterodimeric coiled coils. Structure 10, 1235— 1248.

4. Bagshaw C.R. and Trentham D.R. (1973) The reversibility of adenosine triphosphate cleavage by myosin. Biochem. J. 133, 323-328.

5. Bamburg J.R. (1999) Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 185-230.

6. Betcher-Lange S.L. and Lehrer S.S. (1978) Pyrene excimer fluorescence in rabbit skeletal aa tropomyosin labeled with N-(l-pyrene)maleimide. J. Biol. Chem. 253, 3757-3760.

7. Betteridge D.R. and Lehrer S.S. (1982) Two conformational states of didansylcystine-labeled rabbit cardiac tropomyosin. J. Mol. Biol. 167,481—496.

8. Blanchoin L., Pollard T.D., and Hitchcock-DeGregori S.E. (2001) Inhibition of the Arp2/3 complex nucleated actin polymerization and branch formation by tropomyosin. Curr. Biol. 11, 1300-1304.

9. Brandt P.W., Cox R.N. and Kawai M. (1980) Can the binding of Ca2+ to two regulatory sites on troponin С determine the steep pCa/tension relationship of skeletal muscle? Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77, 4717-4720.

10. Boussouf S.E. and Geeves M.A. (2007) Tropomyosin and troponin cooperativity on the thin filament. Adv. Exp. Med. Biol. 592, 99-109.

11. Brown H.R and Schachat F.H. (1985) Renaturation of skeletal muscle tropomyosin: Implications for in vivo assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,2359-2363.

12. Brown J.H. (2010) How sequence directs bending in tropomyosin and other two-stranded alpha-helical coiled coils. Protein Sci. 19, 1366-1375

13. Brown J.H., Cohen C., and Parry D. (1996) Heptad breaks in alphahelical coiled coils: stutters and stammers. Proteins 26, 134-145

14. Brown J. H., Kim K.H., Jun G., Greenfield N.J., Dominguez R., Volkmann N., Hitchcock-DeGregori S.E., and Cohen C. (2001) Deciphering the design of the tropomyosin molecule. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 8496-8501.

15. Brown J. H., Zhou Z., Reshetnikova L., Robinson H., Yammani R. D., Tobacman L.S., and Cohen C. (2005) Structure of the mid-region of tropomyosin: bending and binding sites for actin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 18878-18883.

16. Bullough P.A., Hughson F.M., Skehel J.J. and Wiley D.C. (1994) Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371, 37-43

17. Burkhard P., Stetefeld J., and Strelkov S.V. (2001) Coiled coils: a highly versatile protein folding motif. TrendsCellSci. 11, 82-88.

18. Cassell M. and Tobacman L.S. (1996) Opposite effects of myosin subfragment 1 on binding of cardiac troponin and tropomyosin to the thin filament. J. Biol. Chem. 271, 12867-12872.

19. Dabrowska R., Nowak E. and Drabikowski W. (1983) Some functional properties of nonpolymerizable and polymerizable tropomyosin. J. Muscle Res. Cell Motil. 4, 143— 161.

20. Donner K., Ollikainen M., Ridanpaa M., Chricten H.-J., Goebel H., Visser M., de Pelin K., and Wallgren-Petersson C. (2002) Mutations in the P-tropomyosin (TPM-2) gene — a rare cause of nemaline myopathy. Neuromuscular Disorders 12, 151-158.

21. Dragan A.I. and Privalov P.L. (2002) Unfolding of a leucine zipper is not a simple two-state transition. J. Mol. Biol. 321, 891-908.

22. Eaton B.L. (1976) Tropomyosin binding to F-actin induced by myosin heads. Science 192, 1337-1339.

23. Eaton B.L., Kominz D.R., and Eizenberg E. (1975) Correlation between the inhibition of acto-heavy meromyosin ATPase and the binding of tropomyosin to F-actin: effects of Mg2+, KC1, troponin I and troponin C. Biochemistry 14, 2718—2725.

24. Engelhardt W.A. and Liubimova M.N. (1939) Myosin and adenosine triphosphatase. Nature 144, 688.

25. Fatkin D. and Graham R.M. (2002) Molecular mechanisms of inherited cardiomyopathies. Physiol. Rev. 82, 945-980.

26. Freire E. and Biltonen R.L (1978) Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous system. Biopolymers 17, 463^179.

27. Frye J., Klenchin V.A., and Rayment I. (2010) Structure of the tropomyosin overlap complex from chicken smooth muscle: insight into the diversity of N-terminal recognition. Biochemistry 49, 4908 4920.

28. Fujime S. and Ishiwata S. (1971) Dynamic study of F-actin by quasielastic scattering of laser light. J. Mol. Biol. 62, 251-265.

29. Gimona M. (2008) Dimerization of tropomyosins. Adv. Exp. Med. Biol. In: Advances in experimental medicine and biology, vol. 644 "Tropomyosin" (Edited by Peter Gunning), Springer, p. 73-84.

30. Golitsina N., Yougmi A., Greenfield N., Thierfelder L., Iizuka K., Seidman J., Seidman C., Lehrer S., and Hitchkock-DeGregori S.E. (1997) Effects of two FHC-causing mutations on a-Tm structure and function. Biochemistry 36, 4637—4642.

31. Goonasekara C.L., Gallivan L.J., Jackman D.M., and Heeley D.H. (2007) Some binding properties of Omp T digested muscle tropomyosin. J. Muscle Res. Cell Motil. 28, 175-182.

32. Goonasekara C.L. and Heeley D.H. (2008) Conformational properties of striated muscle tropomyosins from some salmonid fishes. J. Muscle Res. Cell Motil. 29, 135— 143.

33. Gorecka A. and Drabikowski W. (1977) Digestion of tropomyosin with trypsin. FEBS Lett. 75, 145-148.

34. Grabarek Z., Grabarek J., Leavis P.C. and Gergely J. (1983) Cooperative binding to the Ca2+-specific sites of troponin C in regulated actin and actomyosin. J. Biol. Chem. 258, 14098-14102.

35. Graceffa P. (1989) In-register homodimers of smooth muscle tropomyosin. Biochemistry 28, 1282-1287.

36. Graceffa P. and Lehrer S.S. (1980) The excimer fluorescence of pyrene-labeled tropomyosin. J. Biol. Chem. 255,11296-11300.

37. Greaser M.L. and Gergely J. (1971) Reconstitution of troponin activity from three protein components. J. Biol. Chem. 246, № 13, 4226^233.

38. Greene L.E. and Eisenberg E. (1980) Cooperative binding of myosin subfragment-1 to the actin-troponin-tropomyosin complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2616-2620.

39. Greenfield N. and Hitchcock-DeGregori S. (1993) Conformational intermediates in the folding of a coiled-coil model peptide of the N-terminus of tropomyosin and aa-tropomyosin. Protein Sci. 2, 1263-1273.

40. Greenfield N .J., Palm T., and Hitchcock-DeGregori S.E. (2002) Structure and interactions of the carboxyl terminus of striated muscle alpha-tropomyosin: it is important to be flexible. Biophys J. 83, 2754-2766.

41. Gunning P.W., Schevzov G., Kee A.J., and Hardeman E.C. (2005) Tropomyosin isoforms: divining rods for actin cytoskeletal function. Trends in Cell Biol. 15, 333341.

42. Hammel R.L., Hitchcock-DeGregori S.E. (1997) The sequence of the alternatively spliced sixth exon of alpha-tropomyosin is critical for cooperative binding but not for interaction with troponin. J. Biol. Chem. 272, 22409-22416.

43. Herrmann H., Haner M., Brettel M., Ku N.-O. and Aebi U. (1999) Characterization of distinct early assembly units of different intermediate filament proteins. J. Mol. Biol. 286, 1403-1420.47