Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Марков, Денис Игоревич

• Марков, Денис Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Марков, Денис Игоревич

Список используемых обозначений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Структура и основные свойства миозина

2. Структура хмиозиновой головки.

3. Легкие цепи миозина.

4. Применение метода ДСК для исследования S1.

5. Новый подход к анализу необратимой тепловой денатурации мультидомен-ных белков (по [Зубов, 2001] с изменениями).

6. Агрегация белков, вызванная их тепловой денатурацией.

7. Малые белки теплового шока.

8. Взаимодействие малых белков теплового шока с миозином.

Глава 1. Материалы и методы

1.1. Разглицеринизация миозина.

1.2. Получение SI [Weeds, Taylor, 1975].

1.3. Определение концентрации белков.

1.4. Определение АТРазной активности.

1.5. Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS.

1.6. Исследование тепловой денатурации S1 методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

1.7. Расчет и вычитание химической базовой линии в ДСК экспериментах

1.8. Исследование температурных зависимостей флуоресцентных свойств S

1.9. Тепловая инактивация АТРазы S1 и миозина.

1.10. Исследование агрегации S1 методом регистрации светорассеяния.

1.11. Метод динамического лазерного светорассеяния (DLS).

1.12. Аналитическое соосаждепис.

1.13. Расчетные процедуры

Глава 2. Результаты и их обсуждение

2.1. Исследование тепловой денатурации изоформ методом ДСК.

2.2. Тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценции изоформ

2.3. Тепловая инактивация АТРазы

2.4. Тепловая агрегация изоформ в условиях высокой ионной силы.

2.5. Тепловая агрегация изоформ в условиях низкой ионной силы.

2.6. Влияние малых белков теплового шока на индуцируемую нагреванием инактивацию АТРазы и миозина.

2.7. Влияние Нзр27-ЗВ на тепловую денатурацию

2.8. Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию Э1.

2.9. Исследование комплексов, образуемых Нзр27-31) с в процессе совместной инкубации при 43 °С, методом аналитического соосаждения.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации»

Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высо-коконсервативиого участка, который получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. Практически все sHsp формируют крупные олигомерные комплексы, различающиеся по своей структуре и количеству мономеров [Haslbeck, 2002]. Показано наличие зависимости шапероноподобной активности sHsp от их четвертичной структуры [Shashidharamurthy et al, 2005; Lelj-Garolla, Mauk, 2006]. Кроме того, эти белки могут подвергаться фосфорилированию под действием различных иротеинкиназ, что также отражается как на их олигомерной структуре, так и на шапероноподобной активности [Haslbeck, 2002; Гусев и др., 2002; Rogalla et al., 1999].

В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них наиболее подробно изучены а А- и агВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl). Как Hsp27, так и аВ-кристаллин экспрессируются в большом количестве в мышечной ткани, и их содержание увеличивается в ответ на различные повреждающие воздействия. Весьма вероятно, что одна из функций этих белков - это взаимодействие с актином и миозином (главными белками сократительного аппарата мышц) при неблагоприятных условиях. Изучению взаимодействия sHsp с актином было посвящено довольно много работ; в частности, было показано, что эти белки не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не влияют на процесс тепловой денатурации актина, но при этом эффективно предотвращают его тепловую агрегацию, образуя небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином [Pivovarova et al, 2005; Pivovarova et al., 2007]. Значительно меньше было известно о взаимодействии sHsp с миозином. К моменту начала наших исследований этому вопросу была посвящена всего одна работа [Melkani et al., 2006], в которой было показано, что в условиях, имитирующих тепловой шок (инкубация при 43 °С), аВ-кристаллин не только предотвращает агрегацию скелетномышечного миозина, но также частично подавляет инактивацию его АТРазы. Исходя из полученных результатов, авторы указанной работы заключили, что в условиях теплового шока эНвр могут взаимодействовать с головками миозина и предотвращать их тепловую денатурацию (приводящую к агрегации и инактивации АТРазы) [Ме1каш еЬ а1., 2006]. Подобные заключения, однако, представлялись нам весьма странными, особенно в-, свете результатов исследований взаимодействия вНвр с актином. Вследствие этого, одной из целей даиной работы стало подробное исследование влияния яНэр на процессы тепловой денатурации и агрегации миозиновой головки. Важно отметить, что сам процесс тепловой агрегации миозиновой головки ранее почти не исследовался (особенно в условиях физиологической ионной силы), поэтому другой не менее важной целью настоящей работы было детальное исследование этого процесса.

Головки миозина могут быть изолированы путем ограниченного протеолиза молекул скелетномышечного миозина. Изолированная головка (называемая субфрагментом 1 миозина (81)) состоит из двух главных структурных доменов - моторного (или каталитического, содержащего активный центр АТРазы и участки связывания с актином) и регуляторного. Последний (в случае 81, полученного путем химотрипсинолиза в отсутствие двухвалентных катионов) представляет собой длинную а-спираль, с которой неко-валентно ассоциирована «существенная» (или «щелочная») легкая цепь. Эта легкая цепь существует в виде двух изоформ: А1 и А2. Основное отличие А1 от А2 - это наличие у нее дополнительной М-концевой последовательности из 41 остатка. Поэтому препарат 81, получаемый из миозина скелетных мышц, представляет собой смесь двух изоформ, содержащих только одну из этих легких цепей: 81 (А1) или 81(А2).

Исследованию тепловой денатурации 81 посвящено довольно много работ. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было установлено, что она полностью необратима; применение подхода «последовательного отжига» позволило выявить три тепловых перехода [Шныров и др., 1989; Ьеуйэку еЬ а1,1990; 1991; 1992]. Были также сделаны попытки идентификации этих калориметрических переходов, т. е. выявления их соответствия определенным структурным доменам 81 [ЬеугЬэку, 1994]. Стоит, однако, отметить, что метод «последовательного отжига» недостаточно строг и дает лишь приблизительную информацию о механизме тепловой денатурации белка. Кроме того, большинство работ было выполнено на смешанном препарате 81 (без его разделения на изоформы). В то же время детальное понимание процесса тепловой агрегации белка невозможно без знания детального механизма его денатурации. Стоит отметить, что относительно недавно в нашей лаборатории был предложен новый, физически более строгий метод анализа данных

ДСК для необратимо денатурирующих белков.В результате еще одной целью данной работы было подробное исследование механизма тепловой денатурации изолированных изоформ S1 и возможный пересмотр полученных ранее результатов.

Итак, целью данной работы стало подробное изучение тепловой,денатурации' и агрегации^ S1' и влияния sHspua эти процессы в условиях, приближенных к условиям теплового шока. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Методом ДСК провести подробные исследования тепловой денатурации препаратов Sl(Al) и S1(A2) при двух значениях ионной силы: «¿20 мМ и «120 мМ. Провести математический анализ полученных данных с целью нахождения калориметрических доменов (т. е. участков молекулы, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга).

2). Исследовать тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценциии S1 и тепловую инактивацию его АТРазы. Сопоставляя полученные результаты с данными-ДСК, попытаться провести идентификацию калориметрических доменов S1, т. е. выявить-их соответствие определенным структурным доменам S1.

3). Методами турбидометрии и динамического лазерного светорассеяния (DLS) исследовать механизм тепловой агрегации изоформ S1 при двух значениях ионной силы: «20 мМ и «120 мМ.

4). Изучить влияние малого белка теплового шока Hsp27-3D (Hsp27 с тремя имитирующими фосфорилирование заменами: S15D, S78D; S82D) на тепловую денатурацию S1, инактивацию его АТРазы, а также на агрегацию S1 в условиях, имитирующих тепловой шок (43 °С), при значениях ионной силы, близких к физиологическим («120 мМ).

Научная новизна и практическая значимость

Впервые детально.исследован механизм тепловой денатурации и агрегации изоформ Sic применением методов химической кинетики. Установлено наличие в молекуле S1 двух калориметрических доменов, причем более термостабильный домен денатурирует в две стадии. Существенные различия между изоформами S1 в кинетических параметрах денатурации выявлены только для первого калориметрического домена независимо от условий ионной силы. Проведена идентификация калориметрических доменов и установлено, что-менее термостабильный домен соответствует регуляторному домену миозиновой головки,. а более термостабильный - моторному домену.

Показано, что в условиях высокой ионной силы (120-130 мМ) тепловая агрегация протекает одинаково у обеих изоформ Б1, не зависит от концентрации белка и лимитируется необратимой денатурацией моторного домена. Более того, в этих условиях механизм тепловой агрегации коренным образом отличается от такового для всех ранее исследованных белков: рост агрегатов осуществляется не за счет слипания стартовых агрегатов, а за счет последовательного налипания на эти агрегаты отдельных молекул Э1, моторный домен которых частично денатурирован. Напротив, в условиях низкой ионной силы (20 мМ Нереэ) обнаружена существенная разница в агрегации между двумя изоформа-ми 81. Необратимая агрегация 81(А2) является следствием тепловой денатурации этой изоформы 81 и мало зависит от концентрации белка, а в случае 81(А1) отсутствуют какие-либо корреляции мел-еду тепловой денатурацией и агрегацией этой изоформы 81 и наблюдается выраженная концентрационная зависимость агрегации. Кроме того, показано, что в условиях низкой ионной силы спонтанная агрегация 81(А1) происходит даже при +4 °С. В последнем случае агрегация является полностью обратимой: образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора. На основании этих данных сделан вывод, что при низкой ионной силе агрегация 81(А1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка и по крайней мере отчасти обусловлена взаимодействиями дополнительного И-концевого сегмента легкой цепи А1 с другими молекулами 81.

Показано, что в условиях ионной силы, близких к физиологическим, вНвр не влияют ни на тепловую денатурацию 81, ни на инактивацию его АТРазы, однако эффективно защищают его от тепловой агрегации, образуя устойчивые комплексы с частично или полностью денатурированным молекулами 81. В зависимости от весового соотношения зНвр/Э! рост агрегатов либо замедляется, либо подавляется вовсе.

Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации и агрегации сложных мультидоменных белков и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Отсутствие концентрационной зависимости и разницы между изоформами в кинетике роста агрегатов в условиях высокой ионной силы делают Э1 особенно удобным объектом для исследования шапероноподоб-ной активности малых белков теплового шока и других агентов, подавляющих тепловую агрегацию белков. Во-первых, отпадает необходимость разделения препарата 81 на изоформы, а во-вторых, эффект шаперона будет зависеть только от молярного (или весового) соотношения шаперон/81.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Марков, Денис Игоревич

Выводы

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проведен детальный сравнительный анализ тепловой денатурации двух изоформ изолированной головки миозина (субфрагмент 1 миозина, 81), содержащих разные «щелочные» легкие цепи: А1 и А2. Показано наличие в молекуле Б1 двух калориметрических доменов (т. е. участков, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга), причем более термостабильный домен денатурирует в 2 стадии.

2. На основании сопоставления данных ДСК, собственной триптофановой флуоресценции и инактивации АТРазы проведена идентификация калориметрических доменов 81. Установлено, что более термостабильпый из них отражает тепловую денатурацию моторного домена миозиновой головки, а менее термостабильный соответствует регуляторнному домену головки. Показано, что две изоформы Э1 различаются лишь по параметрам тепловой денатурации регуляторного домена.

3. Установлено, что в условиях высокой ионной силы (в присутствии 100 мМ КС1) тепловая агрегация двух изоформ протекает с одинаковой скоростью, которая лимитируется первой стадией денатурации моторного домена.

4. Показано, что в условиях низкой ионной силы 81(А1) существенно отличается от 81(А2) по механизму тепловой агрегации. Это обусловлено взаимодействиями дополнительного Ы-концевого сегмента легкой цепи А1, отсутствующего у А2, с другими молекулами Э1. Такие взаимодействия, сопровождаемые обратимой агрегацией 81 (А1), имеют место даже при неденатурирующих условиях.

5. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния на тепловую денатурацию и инактивацию миозиновой АТРазы, однако эффективно подавляют тепловую агрегацию за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами 81.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Марков, Денис Игоревич, 2010 год

1. Гусев Н.Б., Богачева Н.В., Марстон С.Б. (2002) Структура и свойства малых белков теплового шока (sHsp) и их взаимодействие с белками цитоскелета. Биохимия, 67, 613-623.

2. Зубов Е.О. (2001) Новый подход к изучению доменнойструктуры головки миозина. Дипломная работа студента 6 курса кафедры биофизики Физического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

3. Клюева A.B., Левчук Ю.Н., НабокаЮ.Н. (2002) Фотон-корреляционная спектроскопия белков. Укр. биохим. оюурнал., 74, №5, 12-26.

4. Курганов Б.И. (2002) Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков. Успехи биол. химии, 42, 89-138.

5. Левицкий Д.И. (1986) Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения. Успехи биол. химии, 27, 74-101.

6. Левицкий Д.И. (1987) Структурные особенности и функциональная роль молекул, миозина. В кн.: Структура и функции белков сократительных систем (ред. Пинаев Г.П.) Изд-во «Наука», Л., 5-31.

7. Левицкий Д.И. (1991) Структура миозиновой головки. Биохимия, 56, 1539-1566.

8. Левицкий Д.И., Бобков A.A., ГолицынаН.Л., Николаева О.П., Павлов Д.А., Поглазов Б.Ф. (1996) Калориметрические исследования стабильных комплексов субфрагмента 1 миозина с аналогами аденозинтрифосфата и фосфата. Биофизика, 41, 64-72.

9. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А., остко-ва Е.В. (1998) Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63, 381-394.

10. Любарев А.Е., Курганов Б.И. (2000) Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биол. химии, 40, 43-84.

11. Павлов Д.А., Бобков A.A., Николаева О.П., Магретова H.H., Дедова И.В., Левицкий Д.И. (1995а) Влияние модификации остатка лизина-83 на термостабильность субфрагмента 1 миозина и ее изменения, вызываемые связыванием нуклеотидов. Биохимия, 60, 1100-1109.

12. Павлов Д.А., Левицкий Д.И., Дедова И.В., Потехин С.А., Николаева О.П., Погла-зов Б.Ф. (19956) Влияние метилирования остатков лизина на свойства комплексов субфрагмента-1 миозина с АДФ и аналогами фосфата. ДАН, 341, 696-698.

13. Павлов Д.А., Собешек А., Левицкий Д.И. (1998) Калориметрические исследования тепловой денатурации фрагментов миозина гладких мышц и их комплексов с ADP и аналогами фосфата. Биохимия, 63, 1116-1128.

14. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биол. химии, 43, 59-98.

15. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. (1982) Миозин и биологическая подвижность. Изд-во "НаукаМ., 160 С.

16. Пономарев М.А. (2000) Структурные перестройки, происходящие в миозиновой головке при взаимодействии с нуклеотидами и F-актином. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН. Москва, 2000.

17. Филимонов В.В., Потехин С.А., Матвеев C.B., Привалов П.Л. (1982) Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии. 1. Алгоритмы деконволюции сложных кривых теплопоглощения. Молекулярная биология, 16, 551-562.

18. Хворов Н.В., Левицкий Д.И., Букатина А.Е., Шныров В.Л., Поглазов Б.Ф. (1990) Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. Доклады АН СССР, 315, 745-748.

19. Шныров В.Л., Левицкий Д.И., Веденкина Н.С., Николаева О.П., Хворов Н.В., Пермяков Е.А., Поглазов Б.Ф. (1989) Доменная структура субфрагмента 1 миозина. Доклады АН СССР, 304, 1497-1499.

20. Abillon E., Bremier L., Cardinaud R. (1990) Conformational calculations on the Alal4-Pro27 LCI segment of rabbit skeletal myosin. Biochim. Biophys. Acta, 1037, 394-400.

21. Andreev O.A., Saraswat L.D., Lowey S., Slaughter C., Borejdo J. (1999) Interaction of the N-terminus of chicken skeletal essential light chain 1 with F-actin. Biochemistry, 38, 2480-2485.

22. Anson M., Geeves M.A., Kurzawa S.E., Manstein D.J. (1996) Myosin motors with artificial lever arms. EMBO J., 15, 6069-6074.

23. Bagshaw C.R., Trentham D.R. (1974) The characterization of myosin-product complexes and product-release steps during the magnesium ion-dependent adenosine triphosphatase reaction. Biochem. J., 141, 331-349.

24. Barnett V.A., Thomas D.D. (1987) Resolution of conformational states of spin-labeled myosin during steady-state ATP hydrolysis. Biochemistry, 26, 314-323.

25. Berka M., Rice J.A. (2005) Relation between aggregation kinetics and the structure of kaolinite aggregates. Langmuir, 21, 1223-1229.

26. Bobkov A.A., Khvorov N.V., Golitsina N.L., Levitsky D.I. (1993) Calorimetric characterization of the stable complex of myosin subfragment 1 with ADP and beryllium fluoride. FEBS Lett, 332, 64-66.

27. Bobkov A.A., Levitsky D.I. (1995) Differential scanning calorimetric study of the complexes of myosin subfragment 1 with nucleoside diphosphates and vanadate or beryllium fluoride. Biochemistry, 34, 9708-9713.

28. Bobkov A., Sutoh K., Reisler E. (1997) Nukleotide and actin binding properties of isolated motor domain from Dictyostellium discoideum myosin. J. Muscle Res. and Cell Motil., 18; 563-571.

29. Borejdo J., Ushakov D.S., Moreland R., AkopovaI., Reshetnyak Y., Saraswat L.D., Kamm K., Lowey S. (2001) The power stroke causes changes in the orientation and mobility of the termini of essential light chain 1 of myosin. Biochemistry, 40; 3796-3803.

30. Burke M., Rajasekharan K.N., Maruta S., Ikebe M. (1990) A second consensus sequence of ATP-requiring proteins resides in the 21-kDa G-terminal segment of myosin subfragment-1. FEBS Lett., 262, 185-188.

31. Chalovich J.M., Stein L.A., Greene L.E., Eisenberg E. (1984) Interaction of isozymes of myosin subfragment 1 with actin: effect of ionic strength and nucleotide. Biochemistry, 23, 4885-4889.

32. Chaussepied P., Kasprzak A.A. (1989) Isolation and characterization of the G-actin-. myosin head complex. Nature, 342, 950-953.

33. Cheney R.E., Mooseker M.S. (1992) Unconventional myosins. Curr. Opin. in Cell Biol., 4, 27-35.

34. Chernik I.S., Panasenko O.O., Li Y., Marston S.B., Gusev N.B. (2004) pH-Induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27 kDa (HspBl). Biochem. Biophys. Res. Commun., 324, 1199-1203.

35. Cope M.J., Whisstock J., Rayment I., Kendrick-Jones J, (1996) Conservation within the myosin motor domain: implications for structure and function. Structure, 4, 969-987.

36. Dominguez R., Freyzon Y., Trybus K.M., Cohen C. (1998) Crystal structure of a vertebrate smooth muscle myosin motor domain and its complex with the essential light chain: visualization of the pre-power stroke state. Cell, 94, 559-571.

37. Engelgardt V.A., Ljubimova M.N. (1939) Myosin and adenosinetriphosphatase. Nature, 144, 668-669.

38. Fisher A.J., Smith C.A., Thoden J.B., Smith R., Sutoh K., Holden H.M., Rayment I. (1995a) X-ray structures of the myosin motor domain of Dictyostelium discoideum complexed with MgADP.BeFx and MgADP.AlF4-. Biochemistry, 34, 8960-8972.

39. Fisher A.J., Smith C.A., Thoden J., Smith R., Sutoh K., Holden H.M., Rayment I. (1995b), Structural studies of myosin:nucleotide complexes: a revised model for the molecular basis of muscle contraction. Biophys. J., 68, 19s-28s.

40. Prank G., Weeds A.G. (1974) The amino-acid sequence of the alkali light chains of rabbit skeletal-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 44, 317-334.

41. Freire E., Biltonen R.L. (1978) Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous systems. Biopolymers, 17, 463-479.

42. Geeves M.A., Goldmann W.H. (1990) The influence of anions, ionic strength and organic solvents on the interaction between actin and myosin subfragment 1. Biochem. Soc. Trans., 18, 584-585.

43. Golitsina N.L., Shnyrov V.L., Levitsky D.I. (1992) Thermal denaturation of the alkali light chain-20 kDa fragment complex obtained from myosin subfragment 1. FEBS Lett., 303, 255-257.

44. Goodno C.C. (1982) Myosin active-site trapping with vanadate ion. Methods Enzymol., 85, 116-123.

45. Gopal D., Burke M. (1996) Myosin subfragment 1 hydrophobicity changes associated with different nucleotide-induced conformations. Biochemistry, 35, 506-512.

46. Grand R.J., Perry S.V. (1983) Preparation of the alkali and P light chains of chicken gizzard myosin. Amino acid sequence of the alkali light chain. Biochem. J., 211, 267-272.

47. Greaser M.L., Moss R.L., Reiser P.J. (1988) Variations in contractile properties of rabbit single muscle fibers in relation to troponin T isoforms and myosin light chains. J. Physiol., 406, 85-98.

48. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Moll. Life Sci., 59, 1649-1657.

49. Haslbeck M., Franzmann T., Weinfurtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nature Struct. Mol. Biol., 12, 842-846.

50. Hayashibara T., Miyanishi T. (1994) Binding of the ammo-terminal region of myosin alkali 1 light chain to actin and its effect on actin-myosin interaction. Biochemistry, 33, 12821-12827.

51. Henry G.D., Dalgarno D.C., Marcus G., Scott M., Levine B.A., Trayer I.P. (1982) The occurrence of alpha-N-trimethylalanine as the N-terminal amino acid of some myosin light chains. FEBS Lett., 144, 11-15.

52. Henry G.D., Winstanley M.A., Dalgarno D.C., Scott G.M., Levine B.A., Trayer LP. (1985) Characterization of the actin-binding site on the alkali light chain of myosin. Biochim. Biophys. Acta., 830, 233-243.

53. Hernandez O.M., Jones M., Guzman G., Szczesna-Cordary D. (2007) Myosin essential light chain in health and disease. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol, 292, H1643-H1654.

54. Hess J.F., FitzGerald P.G. (1998) Protection of a restriction enzyme, from heat inactivation by alpha]-crystallin. Mol. Vis., 4, 29.

55. Holmes K.C. (1997) The swinging lever-arm hypothesis of muscle contraction. Curr. Biol, 7, R112-R118.

56. Holt J.C., Lowey S. (1977) Distribution of alkali light chains in myosin: isolation of isoenzymes. Biochemistry, 16, 4398-4402.

57. Hook D.W., Harding J.J. (1997) Molecular chaperones protect catalase against thermal stress. Eur. J. Biochem., 247, 380-385.

58. Houdusse A., Kalabokis V.N., Himmel D., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. (1999) Atomic structure of scallop myosin subfragment SI complexed with MgADP: a novel conformation of the myosin head. Cell, 97, 459-470.

59. Houdusse A., Szent-Gyorgyi A.G., Cohen C. (2000) Three conformational states of scallop myosin SI. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 11238-11243.

60. Hozumi T., Muhlard A. (1981) Reactive lysyl of myosin subfragment-1: location on-the 27K fragment and labeling properties. Biochemistry, 20, 2945-2950.

61. Huston E.E., Grammer J.C., Yount R.G. (1988) Flexibility of the myosin heavy chain: direct evidence that the region containing SHI and SH2 can move 10 A under the influence of nucleotide binding. Biochemistry, 27, 8945-8952.

62. International standard ISO 22412:2008(E); Particle size analysis-Dynamic light scattering (DLS); International Organization for Standartization, 2008.

63. Jencks W. P. (1981) On the attribution and additivity of binding energies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 4046-4050.

64. Johnson K.A., Taylor E.W. (1978) Intermediate states of subfragment-1 ATPase: réévaluation of the mechanism. Biochemistry, 17, 3432-3442.

65. Kazmierczak K., Xu Y., Jones M., Guzman G., Hernandez O.M., Kerrick W.G., Szczesna-Cordary D. (2009) The role of the N-terminus of the myosin essential light chain in cardiac muscle contraction. J. Mol. Biol, 387, 706-725.

66. Kendrick-Jones J., Szentkiralyi E.M., Szent-Gyorgyi A.G. (1976) Regulatory light chains in myosins. J. Mol. Biol, 104, 747-775.

67. Koh T.J., Escobedo J. (2003) Cytoskeletal disruption and small1 heat shock protein translocation immediately after lengthening contractions. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 286, C713-C722.

68. Kominz D.R., Carroll W.R., Smith E.N., Mitchell E.R. (1959) A subunit of myosin. Arch. Biochem. and Biophys., 79, 191-199.

69. Kurganov B.I., Lyubarev A.E., Sanchez-Ruiz J.M., Shnyrov V.L. (1997) Analysis of differential scanning calorimetry data for proteins. Criteria of validity of one-step mechanism of irreversible protein denaturation. Biophys. Chem., 69, 125-135

70. Kurzawa S.E., Manstein D.J., Geeves M.A. (1997) Dictyostellium discoideum myosin II: characterisation of functional myosin motor fragments. Biochemistry, 36, 317-322.

71. Labbe J.P., Audemard E., Bertrand R., Kassab R. (1986) Specific interactions of the alkali light chain 1 in skeletal myosin heads probed by chemical cross-linking. Biochemistry, 25, 8325-8330.

72. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature, 227, 680-685.

73. Lelj-Garolla B., Mauk A.G. (2005) Self-association of a small heat shock protein. J. Mol. Biol., 345, 631-642.

74. Lelj-Garolla B., Mauk A.G. (2006) Self-association and chaperone activity of Hsp27 are thermally activated. J. Biol. Chem., 281, 8169-8174.

75. Levitsky D.I. (1994) Domain structure of the myosin head. In Soviet Sci. Rev. Section D: Physico-Chem. Biol. (Skulachev V.P., ed), Harwood Acad. Publ. GmbH: Newark, NJ, USA., vol. 12, Part 1, pp. 1-53.

76. Levitsky D.I., Khvorov N.V., Shnyrov V.L., Vedenkina N.S., Permyakov E.A., Poglazov B.F. (1990) Domain structure of myosin subfragment-1. Selective denaturation of the 50 kDa segment. FEBS Lett., 264, 176-178.

77. Levitsky D.I., Nikolaeva O.P., Vedenkina N.S., Shnyrov V.L., Golitsina N.L., Khvorov N.V., Permyakov E.A., Poglazov B:F. (1991) The effect of alkali light chains on the thermal stability of myosin subfragment 1'. Biomed. Sei., 2, 140-146.

78. Levitsky D.I., Ponomarev M.A., Geeves M.A., Shnyrov V.L., Manstein DlJ. (1998) Differential scanning calorimetric study of the thermal unfolding of the motor domain* fragments of Dictyostelium discoideum myosin II. Eur. J. Biochem., 251, 275-280.

79. Lopez Mayorga 0., Freire E. (1987) Dynamic analysis of differential scanning calorimetry data. Biophys. Chem., 27, 87-96.

80. Lörinczy D., Belagyi J. (1995) Effects of nucleotide on skeletal muscle myosin unfolding in myofibrils by DSC. Biochem. Biophys. Res. Commun., 217, 592-598.

81. Lörinczy D., Belagyi J. (2001) Nucleotide binding induces global and local structural, changes of myosin head in muscle fibers. Eur. J. Biochem., 268, 5970-5976.

82. Lowey S., Benefield P.A., Silberstein L., Lang L.M. (1979) Distribution of light chains in . fast skeletal myosin. Nature, 282, 522-524.'

83. Lowey S., Saraswat L.D., Liu H., Volkmann N., Hanein D. (2007) Evidence for an interaction between the SH3 domain and the N-terminal extension of the essential light chain in class II myosins. J. Mol. Biol., 371, 902-913.

84. Lowey S., Slayter H.S., Weeds A.G., Baker H. (1969) Substructure of the myosin molecule. I. Subfragment of myosin by enzymatic degradation. J. Mol. Biol, 42; 1-29.

85. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (1993a) Function of skeletal muscle myosin heavy and light chain isoforms by an in vitro motility assay. J. Biol Chem., 268, 20414-20418.

86. Lowey S., Waller G.S., Trybus K.M. (1993b) Skeletal muscle myosin light chains are essential for physiological speeds of shortening. Nature, 365, 454-456.

87. Lymn R.W., Taylor E.W. (1971) Mechanism of adenosine triphosphate hydrolysis by actomiosin. Biochemistry, 10, 4617-4624.

88. Mahmood R., Elzinga M., Yount R.G. (1989) Serine-324 of myosin's heavy chain is fotoaffinity-labeled by 3'(2')-0-(4-benzoylbenzoyl)adenosine triphosphate. Biochemistry, 28, 3989-3995.

89. Maita T., Umegane T., Kato Y., Matsuda G. (1980) Ammo-acid sequence of the L-l light chain of chicken cardiac-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 107, 565-575.

90. Maita T., Umegane T., Matsuda G. (1981) Amino-acid sequence of the L-4 light chain of chicken skeletal-muscle myosin. Eur. J. Biochem., 114, 45-49.

91. Margossian S.S., Lowey S., Barshop B. (1975) Effect of DTNB light chains on the interaction of vertebrate skeletal myosin with actin. Nature, 258, 163-166.

92. Marini I., Moschini R., Del Corso A., Mura U. (2000) Complete protection by alpha-crystallin of lens sorbitol dehydrogenase undergoing thermal stress. J. Biol. Chem., 275, 32559-32565.

93. Markossian K.A., Yudin I.K., Kurganov B.I. (2009) Mechanism of suppression of protein aggregation by alpha-crystallin. Int. J. Mol. ScL, 10, 1314-1345.

94. Marsh D.J., Lowey S. (1980) Fluorescence energy transfer in myosin subfragment-1. Biochemistry, 19, 774-784.

95. Marsh D.J., Stein L.A., Elsenberg E., Lowey S. (1982) Fluorescently labeled myosin subfragment 1: identification of the kinetic step associated with the adenosine 5'-triphosphate induced fluorescence decrease. Biochemistry, 21, 1925-1928.

96. Maruta S., Miyanishi T., Matsuda G. (1989) Localization of the ATP-binding site in the 23-kDa and 20-kDa regions of the heavy chain of the skeletal muscle myosin head. Eur. J. Biochem., 184, 213-221.

97. Matsuda G., Maita T., Kato Y., Chen J.I., Uraegane T. (1981) Amino acid sequences of the cardiac L-2A, L-2B and gizzard 17 000-Mr light chains of chicken muscle myosin. FEBS Lett., 135, 232-236.

98. Matsuda G., Maita T., Umegane T. (1981) The primary structure of L-l light chain of chicken fast skeletal muscle myosin and its genetic implication. FEBS Lett., 126,111-113.

99. Melkani G.C., Cammarato A., Bernstein S.I. (2006) alpha-B-Crystallin maintains skeletal muscle myosin enzymatic activity and prevents its aggregation under heat-shock stress. J. Mol Biol., 358, 635-645.

100. Mornet D., Pantel P., Audemard E., Derancourt J., Kassab E. (1985) Molecular movements promoted by metal nucleotides in the heavy-chain regions of myosin heads from sceletal muscle. J. Mol Biol, 183, 479-489.

101. Moss D.J., Trentham D.R. (1983) Distance measurement between the active site and cysteine-177 of the alkali one light chain of subfragment 1 from rabbit skeletal muscle. Biochemistry, 22, 5261-5270.

102. Mrakovcic-Zenic A., Oriol-Audit C., Reisler E. (1981) On the alkali light chains of vertebrate skeletal myosin. Nucleotide binding and salt-induced conformational changes. Eur.J. Biochem., 115, 565-570.

103. Musacchio A., Noble M., Pauptit R., Wierenga R., Saraste M. (1992) Crystal structure of a Src-homology 3 (SH3) domain. Nature, 359, 851-855.

104. Nikolaeva O.P., Bobkov A.A., Orlov V.N., Levitsky D.I. (1997) Thermal stability of myosin subfragment 1 dramatically decreases upon tryptic cleavage in the N-terminal region of myosin heavy chain. J. Muscle Res. Cell Motil., 18, 258.

105. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B., Gusev N.B. (2003) Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem., 270, 892-901.

106. Permyakov E.A., Burstein E.A. (1984) Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys. Chem., 19, 265-271.

107. Phan B.C., Peyser Y.M., Reisler E., Muhlrad A. (1997) Effect of complexes of ADP and phosphate analogs on the conformation of the Cys707-Cys697 region of myosin subfragment 1. Eur. J. Biochem., 243, 636-642.

108. Phan B.C., Reisler E. (1992) Inhibition of myosin ATPase by beryllium fluoride. Biochemistry, 31, 4787-4793.

109. Pivovarova A.V., Chebotareva N.A., Chernik I.S., Gusev N.B., Levitsky D.I: (2007) Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by forming soluble complexes with denatured actin. FEBS J., 274, 5937-5948.

110. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and* agrégation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 331, 1548-1553.

111. Pliszka B., Redowicz M.J., Stepkowski D. (2001) Interaction of the N-terminaJ part of the Al essential light chain with the myosin heavy chain. Biochem. Biophys. Res. Commun., 281, 924- 928.

112. Ponomarev M.A., Timofeev V.P., Levitsky D.I. (1995) The difference between- ADP-beryllium fluoride and ADP-aluminium fluoride complexes of the spin-labeled myosin subfragment 1. FEBS Lett., 371, 261-263.

113. Pope B., Wagner P.D., Weeds A.G. (1981) Studies on the actomyosin ATPase and the role of the alkali light chains. Eur. J. Biochem., 117, 201-206.

114. Prince H.P., Trayer H.R., Henry G.D., Trayer I.P., Dalgarno D.C., Levine B.A., Cary P.D., Turner C. (1981) Proton nuclear-magnetic-resonance spectroscopy of myosin subfragment 1 isoenzymes. Eur. J. Biochem., 121, 213-219.

115. Privalov P.L. (1982) Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Protein Chem., 35, 1-104.

116. Privalov P.L., Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol., 131, 4-51.

117. Rajaraman K., Raman B., Ramakrishna T., Rao C.M. (2001) Interaction of human recombinant alphaA- and alphaB-crystallins with early and late unfolding intermediates of citrate synthase on its thermal denaturation. FEBS Lett., 497, 118-123.

118. Rayment I., Holden H.M., Whittaker M., Yohn C.B., Lorenz M., Holmes K.C., Milligan R.A. (1993b) Structure of the actin-myosin complex and its implications for muscle contraction. Science, 261, 58-65.

119. Rayment I., Rypniewski W.R., Schmidt-Base K., Smith R., Tomchick D.R., Benning M.M., Winkelmann D.A., Wesenberg G., Holden H.M. (1993a) Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science, 261, 50-58.

120. Reedy M.K. (1993) Myosin-actin motors: the partnership goes atomic. Structure, 1, 1-5.

121. Reisler E. (1982) Sulfhydryl modification and labeling of myosin. Methods Enzymol., 85, 84-93.

122. Sanchez-Ruiz J.M. (1995) Chapter 6. Differential scanning calorimetry of proteins. Subcellular biochemistry, volume 24• Proteins: Structure, Function, and Engineering. Edited by B.B. Biswas and Siddhartha Roy. Plenum Pres, New York, 1995.

123. Saraste M., Sibbald P., Wittinghofer A. (1990) The P-loop a common motif in ATP-and GTP-binding proteins. TIBS, 15, 430-434.

124. Schroder R.R., Manstein D.J., Jahn W., Holden H., Rayment I., Holmes K.C., Spudich J.A. (1993) Three-dimensional atomic model of F-actin decorated with Dictyostelium myosin SI. Nature, 364, 171-174.

125. Sellers J.K., Goodson H.V., Wang F. (1996) A miosyn family reunion. J. Muscle Res. Cell Motil., 17, 7-22.

126. Shnyrov V.L., Sanchez-Ruiz J.M., Boiko B.N., Zhadan G.G., Permyakov E.A. (1997) Applications of scanning microcalorimetry in biophysics and biochemistry. Thermochim. Acta, 302, 165-180.

127. Shriver J.W., Kamath U. (1990) Differential scanning calorimetry of the unfolding of myosin subfragment 1, subfragment 2, and heavy meromyosin. Biochemistry, 29, 2556-2564.

128. Silberstein L., Lowey S. (1981) Isolated and distribution of myosin isoenzymes in chicken pectoralis muscle. J. Mol. Biol, 148, 153-189.

129. Singh B.N., Rao K.S., Ramakrishna T., Rangaraj N., Rao Ch.M. (2007) Association of alpha-B-crys t allin, a small heat shock protein, with actin: role in modulating actin filament dynamics in vivo. J. Mol. Biol., 366, 756-767.

130. Sivaramakrishnan M., Burke M. (1982) The free heavy chain of vertebrate skeletal myosin subfragment 1 shows full enzymatic activity. J. Biol Chem., 257, 1102-1105.

131. Smith C.A., Rayment I. (1996) X-ray structure of the magnesium(II).ADP.vanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution. Biochemistry, 35, 5404-5417.

132. Spudich J.A. (1994) How molecular motors work. Nature, 372, 515-518.

133. Sturtevant J.M. (1987) Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annu. Rev. Phys. Chem., 38, 463-488.

134. Sutoh K. (1982) Identification of myosin-binding sites on the actin sequence. Biochemistry, 21, 3654-3661.

135. Sweeney H.L., Kushmerick M.J., Mabuchi K., Sreter F.A., Gergely J. (1988) Myosin alkali light chain and heavy chain variations correlate with altered shortening velocity of isolated skeletal muscle fibers. J. Biol. Chem., 263, 9034-9039.

136. Syrovy I. (1979) Polymorphism and specificity of myosin. Int. J. Biochem., 10, 383-389.

137. Szent-Gyorgyi A.G., Szentkiralyi E.M., Kendrick-Jones J. (1973) The light chains of scallop myosin as regulatory subunits. J. Mol. Biol, 74, 179-203.

138. Taylor U.S., Weeds A.G. (1977) Transient-phase of ATP hydrolysis by myosin sub-fragment-1 isoenzymes. FEBS Lett, 75, 55-60.

139. Timson D.J., Trayer LP. (1997) The role of the proline-rich region in Al-type myosin essential light chains: implications for information transmission in the actomyosin complex. FEBS Lett, 400, 31-36.

140. Timson D.J., Trayer H.R., Smith K.J., Trayer I.P. (1999) Size and charge requirements for kinetic modulation and actin binding by alkali 1-type myosin essential light chains. J. Biol. Chem., 274, 18271-18277.

141. Tong S.W., Elzinga M. (1990) Amino acid sequence of rabbit skeletal muscle myosin. 50 kDa fragment of the heavy chain. J. Biol. Chem., 265, 4893-4901.

142. Trayer H.R., Trayer I.P. (1985) Differential binding of rabbit fast muscle myosin light chain isoenzymes to regulated actin. FEBS Lett, 180, 170-173.

143. Trayer H.R., Trayer LP. (1988) Fluorescence resonance energy transfer within the complex formed by actin and myosin subfragment 1. Comparison between weakly and strongly attached states. Biochemistry, 27, 5718-5727.

144. Uyeda T.Q., Abramson P.D., Spudich J.A. (1996) The neck region of the myosin motor domain acts as a lever arm to generate movement. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 4459-4464.

145. Wagner P.D., Giniger E. (1981) Hydrolysis of ATP and reversible binding to F-actin by myosin heavy chains free of all light chains. Nature, 292, 560-562.

146. Wagner P.D:, Slater C.S., Pope B., Weeds A.G. (1979) Studies on,the actin activation of myosin subfragment-1 isoezymes and the role of myosin light chains. Eur. J. Biochem., 99, 385-394.

147. Wagner P.D., Stone D.B. (1983) Myosin heavy chain-light chain recombinations and interactions between the two classes of light chains. J. Biol. Chem., 258, 8876-8882.

148. Wagner P.D., Weeds A.G. (1977) Studies on the role of myosin alkali light chains. Recombination and hybridization of light chains and heavy chains in subfragment-1 preparations. J. Mol. Biol, 109, 455-473.

149. Wang K., Spector A. (1996) alpha-Crystallin stabilizes actin filaments and- prevents cytochalasin-induced'depolymerization in a phosphorylation-dependent manner. Eur. J. Biochem., 242, 56-66.

150. Weeds A.G. (1969) Light chains of myosin. Nature, 223, 1362-1364.

151. Weeds A.G., Pope B. (1977) Studies on the chymotriptic digestion of myosin. Effect of divalent cations on the proteolytic susceptibility. J. Mol Biol, 111, 129-157.

152. Weeds A.G., Taylor R.S. (1975) Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. Nature, 257, 54-56.

153. Weitz D.A., Huang J.S., Lin M.Y., Sung J. (1985) Limits of the fractal'dimension for irreversible kinetic aggregation of gold colloids. Phys. Review Lett., 54, 1416-1419.

154. Werber M.M., Peyser Y.M., Muhlrad A. (1992) Characterization of stable beryllium fluoride, aluminum fluoride, and vanadate containing myosin subfragment 1-nucleotide complexes. Biochemistry, 31, 7190-7197.

155. Werber M.M., Szent-Gyorgy A.G., Fasman G. (1972) Fluorescence studies on heavy meromyosin-substrate interactions. Biochemistry, 11, 2872-2883.

156. Winstanley M.A., Small D.A., Trayer LP. (1979) Differential binding of myosin subfragment one species to immobilized ADP, and actin: the influence of the alkali light chains. Eur. J. Biochem., 98, 441-446.

157. Winstanley M.A., Trayer H.R., Trayer LP. (1977) Role of the myosin light chains in binding to actin. FEBS Lett., 77, 239-242.

158. Yamamoto K., Sekine T. (1983) Interaction of alkali light chain 1 with actin: effect of ionic strength on the cross-linking of alkali light chain 1 with actin. J. Biochem,., 94,

159. Zhang Y., Liu X., Liu J. (2005) Recombinant human alphaA-crystallin can protect the enzymatic activity of CpUDG against thermal inactivation. FEBS Lett., 579, 2897-2900.2075-2078.