Экспрессия ранних генов вирусов папиллом человека в опухолях шейки матки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Федорова, Мария Дмитриевна

• Федорова, Мария Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Федорова, Мария Дмитриевна

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

Ранние гены вирусов папиллом человека

1.1. Общая характеристика HR-HPV

1.2.Регуляторная область генома

1.3. Характеристика гена Еб

1.4. Характеристика гена Е

1.5. Индукция нестабильности генома онкогенами Е6 и Е

1.6. Характеристика гена Е

1.7. Характеристика гена Е

1.7.1. Е2 - регулятор репликации

1.7.2. Е2 - регулятор транскрипции вирусного генома

1.7.3. Е2 - регулятор транскрипции клеточного генома

1.7.4. Роль Е2 в сегрегации вирусного генома в митозе

1.7.5. Прямое взаимодействие Е2 с вирусными и клеточными белками

1.8. Репликативные факторы Е1 и Е2 и нестабильность клеточного генома

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия ранних генов вирусов папиллом человека в опухолях шейки матки»

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место по частоте смертности среди онкологических заболеваний у женщин. Этиологическим фактором РШМ признаны вирусы папиллом из так называемой группы высокого риска заболевания (HR-HPV). Наиболее распространенными из них являются два онкогенных HPV (типы 16 и 18), совместно на их долю приходится более чем 70 % случаев РШМ в мире.

Инфекции HR-HPV передаются половым путем, в большинстве своем они являются бессимптомными- и транзиторными. Приблизительно в 90% случаев происходит избавление от инфекции-в период от 1 года до 2 лет благодаря иммунному ответу организма. У части пациентов наблюдается длительная инфекция (более 2 лет), во время1 которой инфицированные клетки могут прогрессировать в предраковые поражения (CIN) и/или инвазивный РШМ [Цур Хаузен Г., 2008; Kisseljov et al, 2008; Frazer 2009]. В настоящее время: созданы две профилактические вакцины, которые успешно предотвращают развитие инфекции«четырьмя типами iHPV, в том»числе HR-HPV 16 и 18. Однако их эффективность в борьбе с персистирующей инфекцией и предраковыми поражениями существенно ниже [Цур Хаузен1 Г., 2008, Paavonen, 2011]. В связи с этим продолжаются попытки создания антивирусных препаратов и лечебных вакцин для борьбы с персистирующей инфекцией и раком шейки матки разных стадий.

Исследование механизмов, приводящих к длительной инфекции, нарушению жизненного цикла вируса и злокачественной трансформации, поиск клеточных генов, изменение экспрессии или структуры которых позволяло бы отличить инфицированную клетку от трансформированной клетки, являются важными задачами. Эти исследования необходимы для определения групп риска развития рака среди инфицированных больных, обнаружения мишеней для антивирусной терапии, определения тактики лечения. Решение этих задач невозможно без знаний структуры, функций и регуляции экспрессии генов HR-HPV. Основную роль в злокачественной трансформации играют не структурные белки HR-HPV, а регуляторные - продукты так называемых ранних генов (от Е1 до Е7, от англ. early), с экспрессии которых в клетке начинается жизненный цикл вирусов. Учитывая вышесказанное, исследование экспрессии ранних генов HR-HPV в опухолях шейки матки представляется актуальным.

Цель и задачи исследования.

Цель работы состояла в исследовании экспрессии двух ранних генов Е1 и Е2 вируса папиллом человека типа 16 и их влияния на экспрессию клеточных генов в опухолях шейки матки.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. отобрать группу опухолей шейки матки, позитивных по HPV16 и охарактеризовать форму персистенции вирусного генома (эписомная, интегрированная);

2. провести поиск мРНК с кодирующим потенциалом для раннего гена Е1 в опухолях шейки матки с эписомной формой генома HPV;

3. определить первичную структуру мРНК Е1 и старт транскрипции;

4. исследовать возможность влияния экспрессии раннего гена Е2 HPV на активацию транскрипции клеточного гена матриксной металлопротеиназы 9, ассоциированного с опухолевой прогрессией, в опухолях шейки матки.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Федорова, Мария Дмитриевна

Выводы:

1. Впервые показано, что инициация мРНК ранних генов НРУ 16 может происходить с промотора Р14, который функционирует на всех стадиях прогрессии РШМ.

2. Впервые показано, что в карциномах шейки матки присутствует мРНК с кодирующим потенциалом для гена Е1НРУ16; мРНК Е1 иницируется с промотора Р14 и существует в форме полиаденилированных полицистронных мРНК, сплайсированных в районе гене Е6.

3. Обнаружение мРНК с кодирующим потенциалом для генов Е1 и Е2 НРУ 16 в опухолях шейки матки, полученных от пациентов с I - III клинической стадией заболевания, показывает, что интеграция ДНК вируса в геном клетки и утрата экспрессии генов Е1 и Е2 не являются обязательными для прогрессии опухолей.

4. Показано, что 29% опухолей с эписомной формой персистенции генома НРУ 16 содержат также интегрированные копии НРУ16 (смешанный тип персистенции генома).

5. Показана интеграция ДНК НРУ 16 в одной из опухолей в клеточный ген МАР4, которая сопровождается реаранжировкой экзонов гена МАР4, что подтверждает возможность инсерционного мутагенеза в НРУ-позитивных опухолях.

6. Показаны активация транскрипционного фактора №кВ в 75 % и активация транскрипции матриксной металлопротеиназы 9 (ММР-9) в 45 % НРУ 16-позитивных опухолях шейки матки.

7. Отсутствует корреляция экспрессии гена Е2 НРУ 16 с активацией транскрипции ММР-9 в опухолях шейки матки.

Заключение.

Проявление функций Е1 и Е2, которые могут быть существенными в процессе канцерогенеза, практически не было исследовано в опухолях.

Очевидно, что опухоли, экспрессирующие и не экспрессирующие белки Е1 и Е2, несмотря на общий этиологический фактор (НЯ-ИРУ), могут существенно различаться между собой по своим свойствам. Исследование экспрессии и функций Е1 и Е2 в опухолях может быть полезным для понимания механизмов вирусного канцерогенеза и определения возможностей применения противовирусной терапии.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Список использованных реактивов.

ДМСО - диметилсульфоксид

ДЭПК - Диэтилпирокарбонат

1РТО - Изопропилтио-р-Б-галактозид

Х^а1 - 5-бром-4-хлор-3-индозил-Р-галактозид

ЭДТА - этилендиаминтетрацетат натрия сШТР - смесь четырех дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в равных пропорциях.

ДНК А/-НтсШ1 - ДНК фага лямбда, обработанная эндонуклеазой НтсИП; маркер молекулярной массы ДНК

2.2. Список использованных растворов.

Буфер ТАЕ, 5 Ох трис-ацетат 2М ЭДТА 0,1МрН = 8,0

Буфер 8ТЕ, 10х

С1 1М трис - НС1 (С4НцЖ>3 • НС1) ЮОтМрН = 8,0 ЭДТА 10тМрН= 8,0

Буфер для ПЦР, 10х сульфат аммония ((МН^БС^) 0,16М трис - НС1 (С4Н„>Юз • НС1) 0,6МрН = 8,8 Т\уееп-20 (1%)

Буфер для нанесения ДНК на агарозный гель

50% глицерин 1мМ ЭДТА рН = 8,0 0,025% бромфенол голубой

Буфер ЫЕТ трис - НС1 (С4 НпИОз • НС1) 50шМ рН = 8,0-8.4 ЭДТА 10тМрН=8,0 ШС1 1М

88С, 20х, рН = 7,0 №С1 3,0М цитрат натрия 0,34М Н20 до 1 л.

Среда ЬВ ИаС1 Юг бакто-триптон Юг иами-хришин хиг бакто-дрожжевой экстракт 5 г Н20 до 1 л.

Раствор гуанидин-тиоционата рН=6-7 гуанидинизотиоционат натрия 4,2М ацетат натрия 0,02М

Раствор хлорида цезия CsCl 6,4M Рефрактометри- ЭДТА 0,01М рН=7,5 ческийиндекс 1,41 плотность (р=1,8 г/смЗ)

Буфер для гибридизации

Буфер SSPE, 20х

Связывающий буфер

Na2HP04+NaH2P04 0.5М рН=7.2 SDS 7% ЭДТА ЮмМ

NaCl 3,6М

NaH2P04 0,2М рН=7,4 ЭДТА 0,02М рН=7,4

HEPES ЮмМ (pH 7,5) KCl 80мМ ЭДТА 1мМ Глицерин 6%-ный поли(<1МС) 0,5 мкг

Буфер NEB Трис - НС120тМрН = 8,0

NaCl 400мМ MgCl2 1,5мМ NP-40 0,1%

Перед использованием в буфер добавляется: DTT 1мМ Na3V04 0,ЗмМ NaF ЮмМ

Ингибиторыпротеаз (Protease inhibitor cocktail tablets, «Roche Applied Science» (США) (1 таблетка на 10мл))

2.3. Характеристикаклинического материала.

Образцы опухолей были получены из операционного материала от больных Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН. Клинический диагноз был подтвержден патоморфологическим исследованием в отделении патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Операционный материал был собран научным сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Павловой JI.C.

Банк опухолевого материала хранился в жидком азоте.

Коллекция^ исследованных образцов состояла из 41-ой плоскоклеточной, карциномы I, И, III стадий (по классификации международного союза гинекологов и акушеров, FIGO). Присутствие геномов HPV различных типов-определяли с помощью полимеразной цепной реакции (см. ниже). В работе использовали только HPV 16-позитивные образцы.

2.4.Характеристика клеточных линий.

Клетки SiHa, HeLa и CaSki- клеточные линии карцином шейки матки (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и 2мМ глютамина. Культивирование клеток было выполнено сотрудником лаборатории молекулярной биологии вирусов Александровой Н.М.

2.5. Одновременное выделение ДНК и РНК.

Одновременное выделение ДНК и РНК проводили по классической методике (Chirgwin, 1979) с модификациями (Спитковский, 1986). Замороженные в жидком азоте ткани разрушали до порошкообразного состояния в тефлоновой кювете гомогенизатора фирмы Braun в течение 15-30 секунд. Полученный порошок ресуспендировали в 4,2М гуанидинизотиоционатном буфере с помощью гомогенизатора Даунса (Wheaton). Суспензию прогревали 10 мин при 65°С,-центрифугировали при 3000 об/мин 10 мин, наслаивали на 6,4M раствор CsCl в 0,01М ЭДТА рН=7,5 и центрифугировали при 30 000 об/мин 14-16 часов при 18°С. ДНК, извлеченную из интерфазного слоя, растворяли в 5 объемах смеси 1 STE с 1% SDS, прогревали на водяной бане в течении 5 мин при 65 °С, депротеинизировали смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждали 2 объемами холодного 96% этанола, трижды промывали в 70% этаноле на STE, подсушивали, растворяли в 100-300 мкл бидистиллированной воды при +4°С 24-48 часов. Образцы ДНК хранились при -20° С.

Осадок РНК после удаления ДНК и слоя CsCl растворяли в 200мкл бидистиллированной воды. К полученному раствору добавляли 20мкл ЗМ ацетата натрия рН=5,1 и после растворения осадка - 2,5 объема охлажденного 96% этанола, после инкубации не менее 2 часов при температуре -20°С центрифугировали при 13 000 об/мин 10 мин. Осадок высушивали в вакуумной сушке и растворяли в 30-70 мкл бидистиллированной воды. Образцы РНК хранились при -70С. Часть образцов ДНК были любезно предоставлены Кобзевой В.К.

2.6.Полимеразная цепная реакция.

2.6.1. Праймеры. При выборе праймеров для оценки их структуры мы использовали компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Приблизительную температуру отжига вычисляли по следующей формуле:2°С х (А+Т) + 4°С х (G+C) - 4

Точное значение температуры подбирали опытным путем, используя положительный и отрицательный контр о ли.

Состав используемых праймеров и условия ПЦР приведены в следующих таблицах, (таб. 2 и 3)

Праймеры синтезировали в ООО НПФ «ЛИТЕХ» (www.lytech.ru).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Федорова, Мария Дмитриевна, 2011 год

1. Киселев, Ф.Л. Статус ДНК вируса папиллом человека в опухолях шейки матки /Ф.Л. Киселев, Н.П. Киселева, В.К. Кобзева и др. // Молекулярная биология 2001 — Т. 35,- С. 470-476

2. Спитковский, Д.Д. Транскрипция клеточных онкогенов в опухолях человека / Д.Д. Спитковский, И.Б. Зборовская, Ф.Л. Киселев IIМолекулярная биология 1986 — Т. 20, вып. 5 - С. 1409-1422.

3. Цур Хаузен, Г. Папилломавирусы: к вакцинации и далее. / Г. Цур Хаузен, ТЛ Биохимия — 2008 — Т.73, вып. 5 — С. 619-626.

4. Arias-Pulido, Н. Human-papillomavirus type 16 integration in cervical carcinoma in situ and in invasive cervical cancer / H. Arias-Pulido, CL Peyton; NE Joste et al // J Clin Microbiol 2006 - V. 44, № 5, Pi 1755-62.

5. Barbosa, M: Papillomavirus polypeptides E6 and E7 are zinc-binding proteins. / M. Barbosa, D. Lowy. and J: Schiller // J. Virology 1989 - V.63 -P. 1404- 1407.

6. Barnard, P. The human papillomavirus E7 oncoprotein abrogates signaling mediated1 by interferon-alpha / P. Barnard; NA. McMillan // Virology -1999 V. 259, № 2 - P. 305-313.

7. Bastien, N. Interaction of the papillomavirus E2 protein with mitotic chromosomes / N. Bastien, AA. McBride // Virology 2000 - V. 270 - P. 124-134.

8. Bechtold, V. Human ^papillomavirus type 16 E2 protein has no effect on transcription from episomal viral DNA / V. Bechtold, P. Beard, and K. Raj. // J. Virology 2003 - V. 77 - PJ 2021-2028

9. Beglin, M. Human Papillomaviruses and the Interferon Response./ M. Beglin, M. Melar-New, and' L. Laimins // J. of Interferon & Cytokine Research 2009 - V.29, № 9 - P. 629-35.

10. Behren, A. Papillomavirus E2 Protein Induces Expression of the Matrix Metalloproteinase-9 via the Extracellular Signal-Regulated Kinase/Activator

11. Protein-1 Signaling Pathway / A. Behren, C. Simon, R.M. Schwab, E. Loetzsch, S. Brodbeck, E. Huber, F. Stubenrauch, H.P. Zenner and T. Iftner // Cancer Res.- 2005-V. 65- P. 11613-11621.

12. Bellanger, S. High-risk but not low-risk HPV E2 proteins bind to the APC activators Cdhl and Cdc20 and cause genomic instability / S. Bellanger, S. Blachon, F. Mechali et al. // Cell Cycle 2005 - V.4 - P. 1608-1615

13. Bellanger, S. The Human Papillomavirus Type 18 E2 Protein Is a Cell Cycle-Dependent Target of the SCFSkp2 Ubiquitin Ligase /S. Bellanger, C.L. Tan, W. Nei et al. // J. Virology 2010 - V.84 - P. 437-444.

14. Berg, M. Functional interactions between papillomavirus El and E2 proteins./ M. Berg, and A. Stenlund // J. Virology 1997 - V.71 - P. 38533863.

15. Bergers, G. Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis / G. Bergers, R. Brekken, G. McMahon, et al. // Nat Cell Biol 2000 - V. 2 - P. 737-744

16. Bhattacharjee, B. CpG methylation of HPV 16 LCR at E2 binding site proximal to P97 is associated with cervical cancer in-t presence of intact E2 / B. Bhattacharjee,.S. Sengupta // Virology -2006 V. 354 - P. 280-285.

17. Blakaj, DM. Evolutionary and biophysical relationships among the papillomavirus E2 proteins / DM. Blakaj, N. Fernandez-Fuentes , Z. Chen et al. // Front Biosci. 2009 - V. 14, № 1 - P.900-17.

18. Bodaghi, S. Human papillomavirus type 16 E2 and E6 are RNA-binding proteins and inhibit in vitro splicing of pre-mRNAs with suboptimal splice sites./ S. Bodaghi-, R. Jia, and Zheng Zhi-Ming // Virology 2009 - V. 386, №1-P. 32-43.

19. Brown, C. p53 represses human papillomavirus type 16 DNA replication via the viral E2 protein./ C. Brown, A.M. Kowalczyk, E.RTaylor et al. // BMC Virology Journal 2008 - V.5 - P.5

20. Ghen, E. The primary structure and genetic organization of the^ bovine papillomavirus type 1 genome/ E. Chen, P. Howley, A. Eevinson, and H. Seeburg //Nature 1982 - V. 299 - P. 529 - 534.

21. Chiang, C.-M. Viral El and E2 proteins support replication of homologous and heterologous apillomaviral origins. / C-M1. Chiang, ML Ustav, A. Stenlund et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992 - V.89 - P. 5799-5803.

22. Deng, W Cyclin/CDK regulates the nucleocytoplasmic localization of the human papillomavirus El DNA helicase./ W. Deng, B.Y. Lin, G. Jin et al. // J Virol 2004 - V. 78, № 24 - P. 13954-13965.

23. Deryugina, E.I. Matrix metalloproteinases and tumor metastasis/ E.I. Deryugina, J.P. Quigley // Cancer Metastasis Rev 2006 - V.25 - P. 9-34

24. Desaintes, C. Expression of the papillomavirus E2 protein in HeLa cells leads to apoptosis. / C. Desaintes, C. Demeret, S. Goyat et al. // EMBO J— 1997-V. 16, № 3 P. 504-14

25. De Villiers, E-M. Taxonomic classification of papillomaviruses. / E-M. De Villiers //Papillomavirus Rep. 2001 - V.12 - P.57 - 63.

26. Duensing, S. Cyclin-dependent kinase inhibitor indorubin-3'-oxime selectively inhibits human papillomavirus type 16 E7 induced numerical centrosome anomalies./S. Duensing, A. Duensing., DC. Lee et al. // Oncogene 2004 - V.23 - P. 8206 - 8215.

27. Durst, V. Human papillomavirus type 16 (HPV 16) gene expression and DNA replicaion in cervical neoplasia analysis by in situ hybridization./ M. Durst, D. Glitz., A. Schneider and zur H. Hausen // Virology 1992- V. 189 -P. 132 - 140.

28. Feeney, K.M. Targeting mitotic chromosomes: a conserved mechanism to ensure viral genome persistence. / K.M. Feeney and J.L. Parish // Proc. R. Soc.B- 2009-V.276- P.1535-1544

29. Fouts, E.T. Biochemical and electron microscopic image analysis of the hexameric Elhelicase. / ET. Fouts, X. Yu, EH. Egelman, MR. Botchan // J. Biol. Chem. -1999 -V. 274, № 7 P. 447-4458.

30. Frattini, MG. (1994b). The role of the El and E2 proteins in the replication of human papillomavirus type 31b./ MG. Frattini, and LA. Laimins //Virology -1994 V.204 - P. 799-804.

31. Frazer, I.H. Interaction of human papillomaviruses with the host immune system: A well evolved relationship./ I.H. Frazer // Virology 2009 - V. 384 -P. 410-414.

32. Funk, JO. Inhibition of CDK activity and PCNA-dependent DNA replication by p21 is blocked by interaction with the HPV-16 E7 oncoprotein. / JO. Funk, S. Waga, JB. Harry et al. // Genes Dev 1997 - V.l 1, № 16 - P. 2090-2100.

33. Hadaschik, D: The Papillomavirus E2 protein binds to and synergizes with C/EBP factors involved in keratinocyte differentiation./ D.Hadaschik, K. Hinterkeuser, M. Oldak et al. // J Virol 2003 -V. 77 - P. 5253-5265.

34. Hamid, NA. The regulation of cell proliferation by the papillomavirus early proteins. Review./ NA. Hamid, C. Brown and K. Gaston // Cellular and Molecular Life Sciences 2009 - V. 66, № 10 - p. 1700-17

35. Hawley-Nelson, P. HPV16 E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes./ P. Hawley-Nelson, KH. Vousden, NL. HubbertNL et al. HEMBOJ- 1989- V.8, № 12 P. 3905-3910.

36. Gammoh N, Regulation of Human Papillomavirus Type 16 E7 Activity through Direct Protein Interaction* with the E2 Transcriptional Activator / N Gammoh, HS Grm, P Massimi; L Banks // J. Virology 2006 - V.80, №4-P. 1787-1797

37. Gammoh, N. Inhibition'of HPV-16 E7 oncogenic activity by HPV-16 E2N. / N Gammoh, E Isaacson, V Tomaic et al. !I Oncogene -2009- V. 28, № 23 -P. 2299-2304.

38. Goodwin, E.C. Repression of human papillomavirus oncogenes in HeLa cervical carcinoma cells causes the orderly reactivation of dormant tumor suppressor pathways. / EC. Goodwin and D. DiMaioV/Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 - V.97 — P. 12513-12518

39. Goodwin, EC. Induction of senescence-like state and suppression of telomerase activity through inhibition of HPV E6/E7 gene expression in cellsimmortalized by HPV16 DNA./ EC. Goodwin, E Yang, C-J Lee et al. I I Exp Cell Res -2002 V.277 - P. 173- 82

40. Gray, E. In vitro Progression of Human Papillomavirus 16 Episome-Associated Cervical Neoplasia Displays Fundamental Similarities to Integrant-Associated Carcinogenesis/ E.Gray, M.R. Pett, D. Ward et al. // Cancer Res 2010 - V.70, № 10 - P. 4081-91

41. Grm, H.S. Crosstalk between the human« papillomavirus E2 transcriptional^ activator and the E6 oncoprotein./ H.S. Grm, P. Massimi, N. Gammohuand L. Banks // Oncogene 2005 - V.24 - P.5149-5164.

42. James, V.A. Human papillomavirus type 16 E6 activates NF-kB, induces cIAP-2 expression, and protects against apoptosis in a PDZ binding motif-dependent manner./ V.A. James, J. Lee and A. Klingelhutz // J. Virol. 2006 -V. 80-p.5301 -5307.

43. Jeon; S. Integration of human papillomavirus type 16 into the human* genome correlates with a selective growth advantage of cells. / S. Jeon, B. Allen-Hoffmann, and P. Lambert II J. Virol -1995 -V. 69 P. 2989-2997.

44. Kadaja, M. Genomic instability of the host cellr induced^ by the human, papillomavirus replication machinery./ M. Kadaja; A. Sumerina, T. Verst et al. // Embo J- 2007 V.26 - P. 2180-2191.

45. Kadaja, M. Mechanism of genomic instability in cells infected with the high-risk human papillomaviruses. / Ml Kadaja, H. Isok-Paas Laos, T. Laos et al. IIPLoSPathog. 2009 -V.5, № 4 - el000397 (P.l-16)

46. Kalantari, M. Disruption «of the El and E2 reading frames of HPV 16 in cervical carcinoma is associated with poor prognosis. / M. Kalantari, F. Karlsen, G. Kristensen et al. //Int. J. Gynecol. Pathol. 1998 - V. 17 - P. 146-153.

47. Karin, M. NF-kappaB in cancer: from innocent bystander to major culprit./ M. Karin, Y. Cao, FR. Greten, ZW Li. II Nature Rev. Cancer 2002 -V. 2, №4-P. 301-10.

48. Kijono, T. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. / T. Kijono, S. Foster, J. Koop et al. // Nature -1998- V. 396 P. 84 - 88.

49. Kim B. Jensena. A stem cell gene expression profile of human squamous cell Carcinomas./ Kim B. Jensena, Jones J, Watt FM. // Cancer Lett. — 2008 -V.272, № 1 -P. 23-31

50. Kim, K. Methylation patterns of papillomavirus DNA, its influence on E2 function; and" implications in viral infection./ K. Kim, PA. Garner-Hamrick, C. Fisher et al. II J. Virol 2003 - V. 77 - P. 12450-12459

51. Kim S. Polarized signalling: basolateral receptor localization»in epithelial cells by PDZ-containing'domains./ S. Kim // Curr. Opinion Cell. Biol. -1997 -V.9-P. 853-859.

52. KisseIjov,,F. Cellular and Molecular Biological. Aspects of Cervical Intraepithelial4 Neoplasia./ F. Kisseljov, O. Sakharova, T. Kondratjeva // Int Rev Cell MolBiol.-2008 V. 271! -P.35-95.

53. Kovelman, R. Enhanced1 transcriptional activation by E2 proteins from the oncogenic human papillomaviruses./ R Kovelman, GK Bilter, E Glezer et al. // J Virol 1996 - V. 70 - P.7549-7560,

54. Kristiansen, E. Coexistence of episomal and integrated HPV16 DNA in squamous cell carcinoma of the cervix./ E Kristiansen, A Jenkins, and R Holm IIJ Clin. Pathol. 1994- V.47, № 3 - P. 253-256.

55. Kulmala, S-M A. Early integration of high copy HPV16 detectable in women with normal and low grade cervical cytology and histology./ S-M A Kulmala, S M Syrjanen, U B Gyllensten et al. IIJ Clin Pathol 2006- V. 59 -P. 513-517.

56. Lace, M.J. Functional Mapping of the Human Papillomavirus Type 16 El Cistron./ MJ.Lace, J.R. Anson, L.P. Turek, and T.H. Haugen II J Virol, -2008 V. 82, № 21 - P. 10724-10734

57. Lagunas-Martínez, A. Modulation of apoptosis by early human papillomavirus proteins in cervical cancer./ A. Lagunas-Martínez, V. MadridMarina, P. Ganglio // Biochimica et Biophysica Acta — 2010 — V. 1805, № 1 -P. 6-16

58. Lee, C. Role of the PDZ domain-binding motif of the oncoprotein E6 in the pathogenesis of human papillomavirus type 31. / C. Lee, LA. Laimins // J. Virol 2004 -V.78,№ 22 -P. 12366-12377.

59. Lee, D. Human Papillomavirus E2 Down-regulates the Human1 Telomerase Reverse Transcriptase Promoter./ D. Lee, Kim Hak-Zoo, Jeong Kwi Wan, et al. // J Biol Chem. 2002 - V. 277, № 31 - P. 27748^-27756

60. Lee, SS. Multi-PDZ domain protein MUPP1 is a cellular target for both adenovirus E4-ORF1 and high-risk papillomavirus type 18 E6 oncoproteins./ SS Lee, B Glaunsinger, F Mantovani et al. // J Virol 2000 - V.74, № 20 -P. 9680-9693.

61. Li, H. Repression of MHC class I transcription by HPV16E7 through interaction with a putative RXRbeta motif and NF-kappaB cytoplasmic sequestration./ H. Li, T. Zhan, C. Li et al. // Biochem Biophys Res Commun. 2009 - V.388, № 2 - P.383-8.

62. Lin, BY. HeLa cells are phenotypically limiting in cyclin E-Cdk2 for efficient human papillomavirus DNA replication. / BY. Lin, , T. Ma, J.-S. Liu et al. Ill Biol. Chem. 2000 - V.275 - P. 6167-6174

63. Liu, Y. Multiple functions of human papillomavirus type 16 E6 contribute to the immortalization of mammary epithelial cells./ Y Liu, JJ Chen, Q Gao et al. IIJ Virol -1999 V. 73, № 9 - P. 7297-7307.

64. Longworth, MS. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia./ MS Longworth, LA Laimins. // Microbiol Mol Biol Rev 2004 -V. 68, № 2 - P. 362-372

65. Longworth, MS. HPV31 E7 facilitates replication by activating E2F2 transcription through its interaction with HDACs./ MS Longworth, R-Wilson, LA Laimins // EMBO J- 2005 V.24, № 10 - P. 1821-1830

66. Loo, YM. Recruitment of replication protein A by the papillomavirus El protein and modulation by single-stranded DNA./ YM Loo, T.Melendy // J Virol 2004 - V.78 - P. 1605-1615

67. Lopez-Otin, C. Emerging roles of proteases intumour suppression./ C. Lopez-Otin and L.M. Matrisian // Nature Rev. Cancer 2007 - V.7 - P. 800808

68. Ma, T. Interaction between cyclin-dependent kinases and human papillomavirus replicationinitiation protein El is required for efficient viral replication./ T Ma; N Zou, BY Lin et al. // Proc Natl Acad Sci USA 1999 -V. 96-P. 382-387.

69. Malcles, M-H. Regulation of Bovine Papillomavirus Replicative Helicase El by the Ubiquitin -Proteasome Pathway./ M-H Malcles, N Cueille, F Mechali et al. II J. Virol, Nov. 2002 -V. 76, № 22 - P. 1135011358

70. Matovina, M. Identification of human papillomavirus type 16 integration sites in high-grade precancerous cervical lesions./ M. Matovina, I. Sabol, G. Grubisic et al. // Gynecologic Oncology 2009 - V. 113 - P. 120-127

71. Matsukura, Т. Both episomal and integrated forms of human papillomavirus type 16 are involved in invasive cervical cancers./ T. Matsukura, S. Koi<, M. Sugase // Virology 1989 - V. 172, № 1 - P.63-72.

72. McPhillips, M.G. Brd4 Is Required for E2-Mediated Transcriptional Activation but Not Genome Partitioning of All Papillomaviruses./ MlG. McPhillips, J.G. Oliveira, J. Spindler // J. Virol 2006 - V.80 - P. 95309543

73. Moody, C.A. Human papillomavirus oncoproteins: pathways to* transformation. / Gary A Moody and Laimonis A Laimins // Nature Reviews Cancer 2010 - V. 10, № 8 - P.550-560'

74. Mole, S. Human papillomavirus type 16 E2 protein transcriptionally activates the promoter of a key cellular splicing factor, SE2/ASF./ S. Mole, SG. Milligan; SV. Graham // J Virol- 2009 V, 83 - P. 357-367.

75. Miihlen, SI Influence of HPV16 E2 and its localisation on the.expression of matrix metalloproteinase-9. / S Miihlen, A Behren, T Iftner, G Simon Hint J Oncol. -2010-V.37,№2-P. 337-45.

76. Munger, K. The E6 -and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and suffi cient for transformation of primary human keratinocytes./ К Munger, WC Phelps, V Bubb et al. // J Virol 1989 - V. 63, № 10-P. 4417-4421.

77. Nair, A. NF-kappaB is constitutively activated in high-grade squamous intraepithelial lesions and squamous cell carcinomas of the human uterine cervix./ A Nair, M Venkatraman, TT Maliekal // Oncogene 2003 -V. 22, №1-P. 50-8.

78. Nakagawa, S. Human scribble (Vartul) is targeted for ubiquitin-mediated degradation by the high-risk papillomavirus E6 proteins and the E6APubiquitin-protein ligase. / S Nakagawa, JM Huibregtse // Mol Cell Biol -2000 — V. 20, № 21 P.8244-8253.

79. Paavonen, J. HPV vaccination trials: the critical results are now available / J. Paavonen II HPV Today- 2011 -№22-P. 1-3'

80. Parish, J. The E2 proteins from high- and low-risk HPV types differ in their ability to bind p53 and induce apoptotic cell death./ J. Parish, AM Kowalczyk, H Chen et al.///. Virol 2006-V. 80-P. 4580-4590

81. Park, P The cellular DNA polymerase a-primase is required for papillomavirus DNA replication and associates with the viral; El helicase. /

82. P.Park, W. Copeland, L. Yang et al. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994 -V.91-P. 8700-8704.

83. Patel, D. The E6 protein of human papillomavirus type 16 binds to and inhibits co-activation by CBP and p300./ D. Patel, S-M.Huang, L.A. Baglia and D J. McCance // EMBO J. 1999 - V. 18 - P. 5051- - 5072

84. Peter, M. MYC activation associated with the integration .of HPV DNA at the MYC locus in genital tumors./ M. Peter, C.Rosty, J.Couturier, et al. // Oncogene 2006 -V.25 - P.,5985 - 5993.

85. Peter, M. Frequent genomic structural alterations at HPV insertion sites in- cervical carcinoma. / M Peter, № Stransky, J Couturier et al. // The Journal of Pathology 2010 - V.221, № 3— P.320-330

86. Pett, M. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis?/ M Pett and N Coleman IIJ Pathol. 2007 -V. 212, № 4 - P! 356-67. Review.

87. Psyrri, A. Role of the Retinoblastoma Pathway in Senescence Triggered by Repression of the Human Papillomavirus E7 Protein in Cervical Carcinoma5 Cells. / A. Psyrri, R.A. DeFilippis, A.P.B Edwards et al.// Cancer Res. 2004 -V. 64 - P. 3079-3086

88. Remm, M. Human Papillomavirus Type 18 ElProtein Is Translated from Polycistronic mRNA by a Discontinuous Scanning Mechanism./ M. Remm, A.Remm and M. Ustav // J. Virol 1999 - V. 73, № 4 - p. 30623070

89. Riley, RR. Dissection of. human papillomavirus E6 and E7 function in transgenic mouse models of cervical carcinogenesis./ RR Riley, S Duensing, T Brake et al.// Cancer Res 2003 -V. 63, № 16 - P. 4862-4871.

90. Ronco, LV. Human papillomavirus 16 E6 oncoprotein binds to interferon regulatory factor-3 and. inhibits its transcriptional activity./ LV Ronco, AY Karpova, M Vidal et al. II Genes Dev 1998 - V. 12, № 13 -P.2061-2072.

91. Samoylova, EV. HPV infection in cervical-cancer cases in Russia./EV Samoylova, GO Shaikhaiev, SV Petrov, et al. // Int J Cancer 1995 - V.61, № 3 - PI337-41.

92. Smith, J.A. Genome-wide siRNA' screen identifies SMCX, EP400, and Brd4 as E2-dependent regulators of human papillomavirus oncogene expression./ J.A. Smith, E.A. White, M.E. Sowa et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. 2010 - V. 107, № 8 - P.3752-3757

93. Soeda, E. Repression of HPV16 early region transcription by the E2 protein./ E. Soeda, M.C. Ferran, C.C. Baker, et al. // Virology 2006 - V.351 -P. 29-41.

94. Spardy. N. Human papillomavirus 16 E7 oncoprotein attenuates DNA damage checkpoint control by increasing the proteolytic turnover of claspin. / Spardy N, Covella K, Cha E, et al.// Cancer Res. 2009 - V. 69 - P. 70227029

95. Spitkovsky, D. The human papillomavirus oncoprotein E7 attenuates NF-kappa B activation by targeting the Ikappa B kinase complex./D. Spitkovsky, SP. Hehner, TG. Hofmann et al. // J Biol Chem. 2002 - V.277, №28 -P. 25576-82.

96. Steger, G. Dose-dependent regulation of the early promoter of human papillomavirus type 18 by the viral E2 protein./ G. Steger, S. Corbach // J Virology 1997 - V.71 - P. 50-58

97. Stoler, MH. Human papillomavirus type 16 and 18 gene expression in cervical neoplasias./ MH. Stoler, CR. Rhodes, A. Whitbeck et al.// Hum. Pathol 1992 - V.23 - P. 117 -128.

98. Terenzi, F. Interferon-inducible protein, P56, inhibits HPV DNA replication by binding to the viral protein El. / F.Terenzi, P. Saikia, and G. C. Sen //EMBO J 2008 - V. 27 - P. 3311 -3321

99. Thain, A. CpG methylation directly inhibits binding of the human papillomavirus type 16 E2 protein to specific DNA sequences./ A. Thain, O. Jenkins, AR. Clarke, K. Gaston // J. Virology -1996 V.70 - P. 7233-7235

100. Thierry, F. Functional analysis of E2-mediated repression of the HPV18 PI05 promoter./ F. Thierry, and P. M. Howley.// New Biology -1991 V.3 - P. 90-100

101. Thomas, Mi Oncogenic human papillomavirus E6 proteins target the MAGI-2 and MAGI-3 proteins for degradation./ M. Thomas, R. Laura, K. Hepner et.al. // Oncogene 2002 - Y.21, № 33 - P. 5088-5096.

102. Thomas, MC. E6 oncoprotein represses p53-dependent gene activation via; inhibition of protein, acetylation independently of inducing p53 degradation. / MC. Thomas, CM.Chiang //Mol Cell 2005 - V.17, № 2 - PI 251-264.

103. Tommasino, M. HPV16 E7 protein associates with the protein kinase p33CDK2 and cyclin A. / Mi Tommasino; JP. Adamczewski, F. Carlotti et al. // Oncogene -1993 V. 8, №4 -P; 195-202.

104. Von-Knebel Doeberitz, M. Inhibition of tumorigenicity by cervical tumor cells in nude mice by HPV E6-E7. anti-sense- RNA. / Mi Von- Knebel Doeberitz, C.Rittmuller, DiGlitz et al.// Int. -Jf. Cancer 1992s- V.51 - Pi 831-834.

105. Weintraub, SJ. Mechanism of active transcriptional repression by the retinoblastoma protein. / SJ. Weintraub, KN. Chow, RX. Luo et al. // Nature -1995 -V. 375, № 6534 -P. 812-815.

106. Werness, BA. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53./ BA Werness, AJ Levine, PM. Howley IIScience -1990 -V. 248;№4951-P. 76-79.

107. Wu, SY. Brd4 links chromatin targeting to- HPV transcriptional silencing: / SY. Wu-, A-Y. Lee, S.Y. Hou et all I Genes Dev 2006 - V.20 -P. 2383-2396.

108. Xu, M. NFX1 Plays a Role in Human-Papillomavirus Type 16 E6 Activation of NFkB Activity./ M. Xu, R.A. Katzenellenbogen, C. Grandori et al.// J. Virology 2010 - V84, № 21. — P. 11461-11469

109. You, J. Interaction, of the bovine papillomavirus.E2 protein'with Brd4 tethers the viral DNA to host mitotic chromosomes./ J1. You, JL. Croyle, A. Nishimuraet al.// Cell 2004-V.117-P. 349-360

110. Zerfass-Thome, K. Inactivation of the cdk inhibitor p27KIPl by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. / K. Zerfass-Thome, W. Zwerschke, B. Mannhardt et al.// Oncogene 1996 - V. 13, № 11 P. 23232330.

111. Zheng, Z.M. Papillomavirus genome structure, expression, and post-transcriptional regulation./ Z.M. Zheng, and C.C. Baker// Front: Biosci. -2006 V. 11 - P. 2286-2302

112. Ziegert, C. A comprehensive analysis of HPV integration loci in anogenital lesions combining transcript and genome-based amplificationfantechniques./ C. Ziegert, N. Wentzensen, S. Vinokurova et al. // Oncogene — 2003 V.22 - P. 3977 - 3984.

113. Zimmermann, H. The human papillomavirus type 16 E6 oncoprotein can downregulate p53 activity by targeting the transcriptional coactivator CBP/p300./ H. Zimmermann, R. Degenkolbe, HU. Bernard et al.// J. Virology 1999 - V. 73, № 8 - P. 6209-6219

114. Zobel, T. The papillomavirus E8-E2C protein represses DNA replication from extrachromosomal origins. / T. Zobel, T.Ifltner, F. Stubenrauch. H Mol. Cell Biol -2003 -V. 23, № 22 P. 8352-8362