Разработка средств и методов лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита кур тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Конвисарева, Туяна Содномовна

• Конвисарева, Туяна Содномовна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Конвисарева, Туяна Содномовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Характеристика вирусов семейства Herpesviridae

2.2. Патогенез болезни ИЛТ.

2.3. Характеристика вируса ИЛТ.

2.4. Структурная организация генома вируса ИЛТ.

2.5. Полипептидный состав вируса ИЛТ.

2.6. Диагностика болезни.

2.7. Методы идентификации герпесвирусов на основе анализа генома

2.7.1. Рестрикционный анализ ДНК герпесвирусов.

2.7.2. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот.

2.7.3. Определение первичной последовательности ДНК.

2.7.4. Амплификация ДНК герпесвирусов с помощью ПЦР.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка средств и методов лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита кур»

В системе мер, направленных на борьбу с инфекционными болезнями птиц, важное значение имеет быстрая идентификация патогенных возбудителей. Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ)- остро протекающая болезнь птиц, вызываемая вирусом семейства Herpesviridae, характеризующаяся поражением дыхательных путей, образованием геморрагических или казеозных пробок в гортани и в трахее, конъюктивитами и высокой смертностью цыплят от удушья (до 40%). С появлением умеренно вирулентных штаммов вируса болезнь часто протекает латентно, поэтому актуальной остается проблема разработки чувствительных и специфичных тест-систем для диагностики этого заболевания [11, 39].

Существующие ныне методы обнаружения вируса ИЛТ основаны на использовании куриных эмбрионов и цыплят для выделения возбудителя из патологического материала, а также серологических методов диагностики-реакции диффузионной преципитации (РДП) и реакции нейтрализации (РН ). Однако, РДП является недостаточно чувствительной, а РН является трудоемкой, длительной в исполнении и требующей значительных материальных затрат [1, 83].

Поэтому разработка и усовершенствование, внедрение высокочувствительных и специфичных методов экспресс-диагностики ИЛТ имеет важное научное и практическое значение [8,12, 93].

По данным отечественных и зарубежных исследователей, одним из наиболее эффективных методов диагностики вирусных болезней животных и птиц, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью, является метод иммуноферментного анализа (ИФА), в частности ТФ ИФА [6, 12, 24, 67].

Однако, при использовании ИФА, на основе пероксидазных конъюгатов для выявления специфических антигенов вируса ИЛТ и антител к ним отмечаются отдельные случаи появления неспецифических реакции [15, 92].

Недавно Y.Okubo et all.(1988) разработали чувствительный и специфичный метод ИФА для обнаружения специфических антител к вирусу ИЛТ с помощью авидин-биотинового комплекса [71].

Одним из наиболее характерных свойств герпесвирусов является их способность оставаться в латентном состоянии в организме восприимчивого животного [19]. Механизм, обеспечивающий латентность, определяется действием специальных вирусных генов, а также ассоциацией вирусов с некоторыми клетками организма животных. Поэтому в последнее время для идентификации латентных и персистирующих вирусов широко применяют высокочувствительные методы амплификации фрагментов генома [24,58].

В мировой практике для идентификации возбудителей различных болезней птиц широко применяют такие высокочувствительные методы, как иммуноферментный анализ, рестрикционный анализ, методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции, которые позволяют исследовать молекулярную структуру генома и выявлять генетическую вариабельность. Эти методы также используют для дифференциации вирулентных, авирулентных и вакцинных штаммов, особенно при обнаружении инфицированных животных или животных-носителей [13, 24].

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы.

Основной целью данной работы явилось разработка методов ТФ ИФА для определения специфических антител и полимеразной цепной реакции при обнаружении ДНК вируса ИЛТ.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1 .Разработать условия получения, стандартизации иммунореагентов и определения оптимальных параметров постановки метода твердофазного ИФА для обнаружения специфических антител к вирусу ИЛТ;

2.Определить специфичность праймеров, оптимизировать условия постановки ПЦР и оценить чувствительность метода при выявлении ДНК вируса ИЛТ в клинических образцах;

3.Оценить эффективность разработанных методов при диагностике ИЛТ кур.

Научная новизна работы состоит в том, что:

Впервые рзработаны условия получения специфического антигена и постановки непрямого варианта ТФ ИФА для выявления антител к вирусу ИЛТ у вакцинированных и зараженных цыплят ;

Изучена динамика накопления вируса ИЛТ и его ДНК в органах вакцинированных и зараженных цыплят с помощью разработанного нами метода ПЦР;

Предложен метод рестрикционного анализа вирионной ДНК вакцинного штамма «НТ» эндонукпеазами рестрикции (BamHI, PstI, Smal, Kpnl, EcoRI), который может быть применен при паспортизации производственных штаммов этого вируса.

Практическая значимость. Разработаны «Набор препаратов для выявления ДНК вируса ИЛТ методом ПЦР» и методические указания, которые прошли комиссионную проверку и одобрены методическим советом и утверждены директором института (протокол № 3 от 26.04.2001 г.).

В соответствии с задачами исследования на защиту выносятся следующие основные положения:

1. Отработка оптимальных условий получения иммунореагентов и разработка непрямого варианта ТФ ИФА для определения специфических антител к вирусу ИЛТ;

2. Разработка и испытание «Набора препаратов.» для обнаружения ДНК вируса ИЛТ в пробах патматериала методом ПЦР;

3. Оценка диагностической ценности разработанных методов непрямого варианта ТФ ИФА и ПЦР при лабораторной диагностике ИЛТ.

Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ, ВНИТИБП (1995, 1996, 2001 г.г.), научных конференциях: ВНИИВиМ (1994, 1995,2000 г.г.), ВНИТИБП (2001 г.).

Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в сборниках тезисов докладов и статей научных конференций.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-2001 г.г. во ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, ВНИ технологическом институте биологической промышленности, РАСХН, а также на кафедре вирусологии и микробиологии Бурятского сельхозинститута в соответствии с плановыми заданиями Российской научно-технической программы «Изучить молекулярно-генетические и клеточные механизмы создания экологически безоопасных методов и средств профилактики и борьбы с болезнями животных, обеспечивающие устойчивое 9 ветеринарное благополучие, высокое санитарное качество продуктов, сырья животного происхождения», утвержденные Россельхозакадемией.

В выполнении отдельных разделов работы принимали участие научные сотрудники: ВНИИВВиМ- д.б.н. Н.А. Власов, к.б.н. Цыбанова Л.Я., к.б.н. Перзашкевич B.C., к.б.н. В.В. Кадетов В.В., к.в.н. Мавликаев Р.Г., к.в.н. Ю.В. Зуев, а также ВНИТИБП- к.б.н. Бобровская И.В., к.б.н. Еремец Н.К. Всем сотрудникам, помогавшим в выполнении работы, автор выражает искреннюю признательность.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Конвисарева, Туяна Содномовна

6. ВЫВОДЫ

6.1. Отработаны параметры получения из гомогената хорионаллантоисных оболочек куриных эмбрионов очищенного антигена клона «НТ» вакцинного штамма ЦНИИПП вируса ИЛТ методами дифференциального центрифугирования и гель-фильтрации, пригодного для постановки непрямого варианта ТФ ИФА.

6.2. Разработаны условия постановки непрямого варианта твердофазного ИФА, обеспечивающие выявление специфических к вирусу ИЛТ антител в сыворотках крови цыплят, начиная с 10 суток после вакцинации.

6.3. Разработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных последовательности гена тимидинкиназы, позволяющие при температуры отжига 50°С (для «наружных» праймеров) и 55°С (для «внутренних» праймеров) определять ДНК вакцинных и вирулентных штаммов вируса ИЛТ.

6.4. Разработан «Набор препаратов для выявления ДНК вируса ИЛТ методом ПЦР» обеспечивающий обнаружение 10 и выше ЭИД50/см вируса в пробах органов инфицированных цыплят.

6.5. Предложен метод рестрикционного анализа вирионной ДНК вируса ИЛТ (клон «НТ») эндонуклеазами рестрикции (BamHI, PstI, Smal, Kpnl, EcoRI), который может быть применен при паспортизации производственных штаммов этого вируса.

2.8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что основные усилия ученых в развитии диагностики инфекционных болезней направлены на разработку методов на основе анализа генома, которые позволяют не только выявлять возбудитель в объектах окружающей среды, но и типировать их, а также устанавливать эволюционную взаимосвязь различных изолятов, вызывающих эпизоотии. При изучении вариабельности генома ряда герпесвирусов все большее распространение получают методы рестрикционного анализа ДНК, молекулярной гибридизации и амплификации ДНК. Полученные данные используются при характеристике штаммов и учитываются при эпизоотических исследованиях герпесвирусных инфекций.

3. Собственные исследования 3.1 .Материалы и методы 3.1.1.Материалы

3.1.1.1.Вирусы

В работе использовали вирулентные штаммы «Богатищевский» и «24А», вакцинные штаммы: ВНИИБП, клон «НТ» вакцинного штамма ЦНИИ!Ill вируса ИЛТ кур с биологической активностью 7,0-7,5 lg ЭИД 50/см3, полученные из лаб. «Музейных штаммов» ВНИИВВиМ, а также вирусы ИРТ КРС (штамм «ТК-А») и болезни Ауески (штамм «БУК») с активностью 7,0 -7,5 lg ТЦД 50/см .

Пробы органов от цыплят с клиническими признаками ИЛТ, эксудат из трахеи от павших цыплят после заражения вирулентным вирусом.

3.1.1.2.Куриные эмбрионы 9-11 дневного возраста, цыплята 20-25 дневные, полученные из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням.

3.1.1.3.Среды и растворы, полученные из лаб. «Культур клеток с музеем клеточных штаммов» ВНИИВВиМ.

3.1.1.4.Реактивы и ферменты

В работе использовали реактивы отечественного производства (осч): борная кислота, уксусная кислота, фенол, спирт этиловый ,хлороформ, натрий хлористый, магний хлористый.

Импортные реактивы: трис основной, ЭДТА-Ыа2 соль, бромистый этидий, додецил сульфат натрия, бычий сывороточный альбумин, ацетат натрия, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты («Pharmacia»,Швеция, «Promega», США). Ферменты: Рестриктазы Kpnl, Sail, PstI, BamHI, EcoRI, Hindlll, Taq-полимераза, фрагмент Кленова, производства фирм «Fermentas», (Литва); «Promega» (США).

3.1.1.5. Оборудование

Холодильники: низкотемпературные (минус 80°С) фирмы «Sanyo», Япония и бытовой (+ 4 и минус 20 С) отечественного производства «Минск»; термостат; ультразвуковой дезинтегратор (MSE); амплификатор «Touch Down», Hybaid, Англия ; комплект типа Эппендорф, состоящий из центрифуги, термостата, миксера; набора автоматических микропипеток «Gilson», (Франция) ; система для электрофоретического разделения ДНК «Hoeffer Scientific Instruments», (США); трансиллюминатор , (США); ультрацентрифуги «Sorvall, DuPownt» , (США), «Весктап», (Австрия).

3.1.2.Методы 3.1.2.1. Заражение куриных эмбрионов 9-12 дневные куриные эмбрионы заражали на ХАО 0,1-0,2 см3 осветленной суспензии материала из трахеи. Эмбрионы инкубировали при 33° - 37° С в течение 5-7 дней.

3.1.2.2. Определение инфекционной активности вируса

Инфекционную активность вируса ИЛТ оценивали по поражениям ХАО куриных эмбрионов. Титр вируса высчитывали по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина, выражая его в эмбриональных л инфицирующих дозах (ЭИД50/СМ ).

3.1.2.3. Заражение цыплят

Осветленную суспензию вирусного материала вводили в трахею в дозе 1000 ЭИД. Клинические признаки появлялись через 2-7 дней и л максимальный титр вируса на 3-4 сутки составлял 5,0-7,0 lg ЭИД50/СМ . Эксудат в трахее появлялся на 10 день после заражения.

3.1.2.4. Отбор патматериала

Через различные сроки после заражения цыплят убивали, отбирали пробы со стенок трахеи, глотки и бронхов, гомогенизировали и готовили 10% суспензию на ФСБ (рН 7,2). Суспензию осветляли центрифугированием при 800 об/мин в течение 10 мин, добавляли антибиотики и инкубировали при комнатной температуре 40-мин.

3.1.2.5. Постановка РДП

Специфический антиген готовили из ХАО зараженных куриных эмбрионов. Гомогенат ХАО, полученный после шаровой мельницы, осветляли при 2000 об/мин и надосадок использовали в качестве специфического антигена. В лунки добавляли гипериммунную сыворотку цыплят и учет реакции проводили через 24 часа.

3.1.2.6. Реакция нейтрализации

Реакцию нейтрализации ставили по ГОСТ 25582-83. В качестве вируса ИЛТ использовали материал, полученный из гомогената ХАО куриных эмбрионов, зараженных клоном «ИТ» вакцинного штамма ЦНИИ! 111.

10-кратные разведения вируса ИЛТ смешивали с исследуемой сывороткой, инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре и заражали на ХАО 9-12 дневных куриных эмбрионов. Учет реакции проводили через 7 дней.

3.1.2.7. Концентрирование и очистка вируса

Для приготовления вируссодержащего материала у зараженных вирусом ИЛТ куриных эмбрионов отбирали ХАО, гомогенизировали и готовили 20% вирусную суспензию и хранили при минус 70° С.

Вирусный материал, после осветления центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин, концентрировали полиэтиленгликолем (Пэг-6000), добавляя его к вируссодержащей суспензии до конечной концентрации 7%. Смесь выдерживали при 4° С 18-20 часов и центрифугировали (3000 об/мин, 30 минут).

В отдельных случаях, вирус из осветленной вируссодержащей жидкости осаждали центрифугированием при 24 000 об/мин в течение 2,5 часов при 4° С.

Осадок ресуспендировали в 0,1 от исходного объема в буфере СТЕ, рН 7,5 и центрифугировали через слой 30%-ного раствора сахарозы (24 000 об/мин, 1,5 часа). Далее вирус очищали в ступенчатом градиенте плотности

25, 35, 45% растворов сахарозы и фракцию вируса, расположенную на границе 45% -ного раствора сахарозы отбирали шприцом.

3.1.2.8. Выделение ДНК из препаратов очищенного вируса Л

К 0.5 см вирусной суспензии в буфере ТЕ (20 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ л

ЭДТА) добавляли протеиназу К (100 мкг/см ) и инкубировали 30 минут при температуре 56° С. Затем в эту смесь добавляли 10 % раствор ДСН до конечной концентрации 0,5 % и выдерживали при температуре 56° С в течение 20 минут. К суспензии добавляли равный объем 80 % свежеперегнанного фенола (рН 8,0) и тщательно смешивали водную и фенольную фазы. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 5 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, осторожно отбирали и повторно обрабатывали фенолом и смесью фенол-хлороформ в том же режиме. Вирионную ДНК переосаждали 2,5 объемами перегнанного этанола при минус 20° С. Полученные препараты ДНК хранили при минус 20° С.

3.1.2.9. Рестрикция ДНК, разделение продуктов гидролиза электрофорезом в геле агарозы Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили по методу, описанному Маниатисом Т., применяя 10-кратный рестрикционный буфер согласно паспорту, прилагаемому изготовителем для каждой рестриктазы. В реакционную смесь (50 мкл) эндонуклеазу вносили из расчета 2-5 ед. на 1 мкг ДНК. Смесь выдерживали при 37° С в течение 2-4 часов. Для проверки полноты расщепления ДНК отбирали аликвоты по 5-10 мкл и проводили электрофорез на минигеле агарозы в течение 30 мин. Электрофоретическое разделение вирусной ДНК и ее фрагментов проводили в гелях 0,6 - 1,0 % агарозы (длина геля 25 см), приготовленных на трис-ацетатном буфере (ТАБ), в течение 16-18 часов при 4° С.

3.1.2.10. Приготовление пероксидазных конъюгатов Для выделения иммуноглобулинов (IgG) из сывороток крови использовали аффинную хроматографию на protein-A sepharose CL 4В (из сывороток кролика) и ионообменную хроматографию на ДЕ-целлюлозе ДЕ-52 (Whatmann). Приготовление пероксидазных конъюгатов с поликлональными IgG проводили по методу Wilson и Nakane (боргидридный метод). Антивидовые сыворотки получали иммунизацией кроликов препаратами чистых иммуноглобулинов кур. Специфические сыворотки получали от вакцинированных кур после контрольного заражения их вирулентным штаммом, а также от кроликов и морских свинок, иммунизированных очищенным вакцинным вирусом. В качестве контрольных использовали сыворотки от незараженных СПФ цыплят.

3.1.2.11. Постановка ПЦР Пробу исследуемой ДНК в объеме 10 мкл амплифицировали в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 пикоМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 10 mM Tris НС1 рН 8,3, 50 тМ КС1, 3,0 тМ MgCl2 и 2,5 ед. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили в термоцикл ере Hybaid (Англия) по следующим программам: 3 цикла (денатурация ДНК при 94° С -30-60 сек, отжиг ДНК при 50° С - 30 - 90 сек, синтез при 72° С - 60 - 90 сек), следующие 30 циклов (денатурация 94° С - 30 сек, отжиг 50° С - 40 сек, синтез 72° С - 50 сек). Аликвоты ПЦР продуктов объемом 5-10 мкл разделяли в 1,5% агарозном геле.

3.1.2.12. Компьютерный анализ первичных структур нуклеиновых кислот Обработку информации первичной структуры ДНК проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS версия 3.00 и PC Gene, версия 5.15 1988. Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе "OLIGO".

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4.1. Культивирование вируса ИЛТ кур Для получения высокоактивного вирусного сырья, пригодного для очистки вируса, выделения полноразмерной вирионной ДНК и специфического антигена для постановки серологических реакций использовали 9-10 дневные куриные эмбрионы.

При применении куриных эмбрионов (КЭ) для получения вирусного материала учитывали максимальное накопление вируса, а также влияние условий и сроков хранения на его активность. Установлено, что средняя л активность клона «НТ» вируса ИЛТ с ХАО составила 7,0 - 7,5 lg ЭИД50/ см , о а шт. «ВНИИБП» - 5,5 - 6,0 lg ЭИД50/СМ , соответственно.

Биологическая активность вируса в вируссодержащей аллантоисной жидкости была значительно ниже и в среднем равнялась 3,5- 4,5 lg ЭИД з

5 о/см .

Изучение условий и сроков хранения вируссодержащего материала показало, что при хранении осветленного гомогената ХАО при 4° С в течение 7 суток инфекционная активность клона «НТ» вакцинного штамма «ЦНИИ1Ш» в среднем снижалась на 1,5-2,5 lg ЭИД50/СМ . Аналогичные результаты получены при определении срока хранения шт. «ВНИИБП».

Вирулентный штамм «Богатищевский» вируса ИЛТ кур имел более л низкую инфекционную активность 5,0-5,5 lg ЭИД50/см .

Пробы гомогената ХАО, хранившиеся при минус 65° -70° С, в течение 6 месяцев сохраняли исходную активность вируса ИЛТ кур.

Таким образом, в результате проведенных исследований в качестве системы культивирования, обеспечивающей получение высокоактивного о вируса ИЛТ кур ( 7,0- 7,5 lg ЭИД50/см ) были выбраны 9-10 дневные куриные эмбрионы, а также клон «НТ» вакцинного штамма «1ЩИИПП» вируса ИЛТ.

4.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ кур Получение достаточных количеств высокоочищенного вируса ИЛТ кур из гомогената хориоиаллантоисных оболочек инфицированных эмбрионов представляет собой довольно сложную проблему из-за наличия большого количества балластных эмбриональных белков. Поэтому целью первого этапа работы явилась отработка схемы получения очищенных препаратов вируса ИЛТ птиц, пригодных для выделения нефрагментированной вирионной ДНК и приготовления иммунореагентов.

В качестве исходной вируссодержащей суспензии использовали гомогенаты хориоиаллантоисных оболочек куриных эмбрионов, инфицированных вакцинным клоном «НТ» вакцинного штамма «ЦНИИПП» вируса ИЛТ кур. Инфекционный титр вируса составлял 7,0-7,5 lg ЭИД50/СМ3.

Первоначально промытые в стерильном, холодном ФСБ вируссодержащие хорионаллантоисные оболочки разрушали в гомогенизаторе на холоду в течение 20 мин. Далее клеточный гомогенат ресуспендировали в небольшом объеме стерильного буфера СТЕ (20 мМ Tris-HCl, рН 7,5 , 150 mM NaCl, 1 тМ EDTA-Na2) до конечной концентрации 10%.

Затем исходную вируссодержащую суспензию разделяли низкоскоростным центрифугированием (2000 х g, 15 мин) на две фракции: клеточный детрит и надосадочную жидкость.

Вирус из надосадочной жидкости осаждали ультрацентрифугированием при 20000 g, в течение 3 часов, либо преципитацией 7%-ным ПЭГ-6000. Концентрирование вируса из надосадочной жидкости преципитацией ПЭГ-6000 показало, что при этом теряется от 36 до 85% его инфекционности за счет образования прочных агрегатов, что значительно осложняло дальнейшую очистку вируса.

На следующей стадии предварительно сконцентрированные ультрацентрифугированием препараты вируса центрифугировали через слой 30% сахарозы при 25 000 об/мин в течение 150 мин (бакет-ротор 6 х 36 см3).

Результаты центрифугирования показали, что данный режим очистки позволяет практически без потерь инфекционности очистить вирусные препараты от 65-80% балластных белков. Полученные таким образом препараты были обозначены как частично очищенный концентрированный вирус.

Дальнейшую очистку вируса ИЛТ кур проводили центрифугированием в градиентах плотности сахарозы, глицерин-К,№-тартрата и перкола. При зональном центрифугировании в линейном градиенте концентраций сахарозы (25-45%) частично очищенного концентрированного вируса в бакет-роторе 6 х 17 см (200000 g, 5 часов) установлено, что основная часть очищенного вируса локализована в нижней части пробирки (фракция 4), соответствующей концентрации сахарозы - 30 -35%. Однако сопоставление данных по количеству инфекционного материала, нанесенного на градиент препарата частично очищенного л концентрированного вируса

7,75 lg ЭИД50/СМ) и полученных после центрифугирования фракций (максимальный титр в 4-ой фракции - 7,5 lg ЭИД50/СМ ) свидетельствует об утрате более 96% исходной активности.

Эти данные свидетельствуют о больших потерях вируса ИЛТ кур при центрифугировании в градиенте концентраций сахарозы. Применение данного подхода для получения очищенных препаратов вируса ИЛТ оказалось недостаточно эффективным.

Поэтому на следующей стадии для очистки вируса ИЛТ использовали линейный градиент концентраций глицерина-КДа-тартрата [9]. Изопикническое центрифугирование частично очищенного концентрированного вируса проводили в смешанном линейном градиенте плотности 30% глицерина и 55% К, Na-тартрата в бакет-роторе 6x5 см3 (200000 g, 16 часов). Было показано, что основная часть очищенного вируса л локализована в 4 фракции (плотность 1,18 г/см ), полностью отделенной от соседних пиков белков (3 и 5 фракции, соответственно).

Сопоставление показателей исходного вирусного препарата, нанесенного на градиент плотности и очищенного вируса, полученного после центрифугирования (4 фракция), показало, что выход вируса по инфекци-онности составляет 5,0-10,0% при очистке по белку на 99%.

Поэтому данный подход был использован нами в дальнейшем для очистки вируса ИЛТ.

На следующей стадии были проведены опыты по очистке вируса ИЛТ в перколе [72]. С этой целью предварительно сконцентрированные из осветленного гомогената ХАО (250 см3) ультрацентрифугированием через слой 30% сахарозы препараты вируса тщательно ресуспендировали в 10 см3 ФСБ. После осветления частично концентрированного вируса при 2000 об/мин в течение 15 мин к 10 см вирусной суспензии добавляли 25 см перкола (Percoll, Pharmacia) и по 10 мкл маркеров плотности от 1,061 до 1,101 г/см3 (Density Marker Beads, Pharmacia, DMB-4 , DMB-5, DMB-6, з

DMB-7). Смесь перемешивали , разливали в пробирки по 35 см (ротор 8 х 50, «MSE-65») и центрифугировали при 4° С в течение 60 мин при 20 000 об/мин. Фракцию вируса, расположенную на границе маркера DMB-6 о плотность 1,087 г/см ), отбирали шприцем и титровали на ХАО куриных эмбрионов [60].

После первого центрифугирования в перколе было отмечено нечеткое разделение полос белка. Поэтому фракцию вируса (1-2 см ) разводили ФСБ до 10 см3 и повторно центрифугировали в перколе вместе с маркерами в том же режиме.

Для отделения очищенного вируса от перкола вирусную суспензию в

3 з объеме 4 см наносили на 1 см 80% раствора сахарозы и центрифугировали в роторе 6 х 5 мл в течение 3 часов при 60 000 об/мин.

При сопоставлении показателей исходного вирусного препарата, нанесенного на градиент перкола, и очищенного вируса, полученного после центрифугирования, отмечено, что выход вируса по инфекционности составляет 1,0% при очистке по белку на 99,6%.

Препараты вируса, очищенные в перколе, в основном были использованы для получения гипериммунных сывороток.

Представленные в табл.2 данные показывают, что разработанная схема очистки вируса в градиенте глицерин-тартрата калия позволяет получать препараты вируса, достигая освобождения его от более чем 99% балластных белков. При этом выход по инфекционности вируса намного выше, хотя кратность очистки и степень чистоты (удельная активность) - значительно ниже.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Конвисарева, Туяна Содномовна, 2001 год

1. Герасимова Н.И., Бурцев В.И., Дутко Ю.С. Оценка напряженности иммунитета у птиц, аэрозольно вакцинированных против инфекционного ларинготрахеита.// Актуальные вопросы вет. Вирусологии. Тезисы докладов 5 Всесоюзной конференции: Казань, 1980, с.98-99.

2. Зуев Ю.В., Норкина С.Н., Смоленский В.И., ОсидзеН.Г., Глазова Г.В. Антигенная активность вакцины против инфекционного ларинготрахеита при аэрозольной вакцинации.// Современные аспекты ветеринарной патологии животных, Владимир, ВНИИЗЖ, 1998, с.238-245.

3. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Ассоциированная вирусвакцина против инфекционного ларинготрахеита и нюъкаслской болезни.//Ветеринария, 1995, №3, с.22-24.

4. Зуев Ю.В. Разработка ассоциированной вакцины против инфекционного ларинготрахеита и нъюкаслской болезни птиц.// Диссертация кандидата ветеринарных наук, ВНИИВВиМ, Покров, 1995 г.

5. Дутко Ю.С. Иммунологическая эффективность вирусвакцины против ИЛТ кур (из клона НТ) при разных методах вакцинации.//Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ, г. Покров, 1987, с. 104-106.

6. Котляр П.Ю., Сковородкин В.А. Получение антисыворотки к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц.// Тез.докл.Всесоюз.конф. молод.ученых и аспирантов по птицеводству, Загорск, 1989, с. 93-94.

7. Ю.Слободенюк М.И. , В.В. Малушко, В.В. Шорников, Н.Д. Предыбайло. Эффективность одновременной вакцинации цыплят против Нъюкаслской болезни и инфекционнго ларинготрахеита.// Ветеринария, 1994, № 1, с.30-34.

8. П.Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных.// Москва, ВНИТИБП, 1998, с. 294-319.

9. Abbas F., J.R.Andreasen, M.W. Jackwood. Development of a Polymerase Chain Reaction and a Nonradiactive DNA Probe for Infectious Laringotracheitis Vims.//Avian Disease, 1996, v. 40, 1, p.56-62.

10. Aini I., Shih L.M., Castro A.E., Zee Y.C. Comparison of herpesvirus isolates from falcons , pigeons and psitaccines by restriction endonuclease analysis.//!Wild life Dis., 1993,v. 29, p.196-202.

11. Adair B.M., Todd D., McKillop, Birns K. Comparison of serological tests for detection of antibodies to infectious laryngotracheitis virus .//Avian Dis., 1985, v.14, p.461-469.

12. Andreasen J.R., Glisson J.R., Villegas P. Differentiation of vaccine strains and Georgia field isolates of infectious laryngotracheitis virus by their restriction endonuclease fragment patterns.// Avian Dis., 1990, v. 34, p.646-655:

13. Andreasen J.R., Glisson J.R., Goodwin M.A., Ressureccion R.S., Villegas P., Brown J. Studies of infectious laryngotracheitis vaccines: immunity in broilers.//Avian Dis., 1989, v.33, p.516-523.

14. Andreasen J.R., Brown J.R., Glisson J.R., Villegas P.Reproducibility of a virus-neutralization test for infectious laryngotracheitis virus.// Avian Dis., 1990, v.34, p.185-192.

15. Bagust T.J. Laryngotracheitis herpesvirus infection in the chickens .4 Latency establishment by wild and vaccine strains of ILT virus.//Avian Pathol., 1986 v.15, p. 581-592.

16. Bagust T.J. B.W.Calnek, and K.J.Fahey. Gallid-I herpesvirus infection in the chickens .3. Reinvestigation of the pathogenesis of infection laringotracheitis in acute and early post-acute respiratiry disease.// Avian Dis., 1986 v.30, p. 179-190.

17. Caughmann G.B., Staczek J., OxCallaghan D.J. Equine herpesvirus type I infected cell polipeptides : evidence for immediate aerly/late regulation of viral gene expression .// Virology, 1985, v. 145, p.49-61.

18. Gardner R., Wilkerson-J Johnson-JC. Molecular Characterization of the DNA of Anatid Herpesvirus-1.// INTERVIROLOGY,1993, v.36, p. 99-112.

19. Calner B. W., Fahey K. G., Bagust T. G. In vitro infection studies with infectious laringotracheitis virus.// Avian Diseases, 1986, v.30, p. 327-336.

20. Clavijo A., Nagy E. Differentiation of Infectious Laryngotracheitis Virus Strains by Polymerase Chain-Reaction// Avian Disease, 1997, v.41, p. 241246.

21. Chang P.C., Lee Y.L., Shien J.H., Shieh H.K. Rapid Differentiation of Vaccine Strains and Field Isolates of Infectious Laryngotracheitis Virus by Restriction-Fragment-Length-Polymorphism of PCR Products// J.Virol.Methods 1997, v.66, p. 179-186.

22. Goodwin M.A., Smeltzer M.A., Brown J., Resurreccion R.S., Dickson T.G. Comparison of Histopathology to the Direct Immunofluorescent Antibody-Test for the Diagnosis of Infectious Laryngotracheitis in Chickens.// Avian Diseases, 1991, v. 35, p. 389-391.

23. Gelenczey E.F., Marty E.W. Studies tudduer-culture modified infectious laryngotracheitis virus.//AvianDis., 1961, v. 8, p.105-122 .

24. Griffin H.G. Attenuated Salmonella as Live Vaccines Prospects for Multivalent Poultry Vaccines.// Worlds Poultry Science J., 1991, v. 47, p. 129-140.

25. Griffin A.M. The Nucleotide-Sequence of the Glycoprotein GB Gene of Infectious Laryngotracheitis Virus Analysis and Evolutionary Relationship to the Homologous Gene from Other Herpesviruses.// J. Gen. Virology, 1991, v. 72, p. 393-398.

26. Griffin A.M., Boursnell M.E. Analysis of the nucleotide sequence of DNA from the region of the thymidine kinase gene of Infectious Laringotracheitis

27. Virus; potential evolutionary relation ships between the Herpes Virus subfamilies.//J.Gen. Virology, 1990,v. 71, p. 841-856.

28. Griffin A.M. Identification of 21 genes of infectious laryngotracheitis virus using random sequencing of genomic DNA.// J.Gen. Virol., 1989, v.70, p.3085-3089.

29. Gander J.E., Thayer S.G. Evaluation of ELISA Titers to Infectious Laryngotracheitis.// Avian disease, 1997, v. 41, p. 429-432.

30. Guy J.S., Barness H.J., Smith L. Increased virulence of modified -live infectious laryngotracheitis vaccine virus following bird-to-bird passage.// Avian Dis., 1991, v. 35, p. 348-355.

31. Guy J.S., Barnes H.J., Smith L.G. Rapid Diagnosis of Infectious Laryngotracheitis Using a Monoclonal Antibody-Based Immunoperoxidase Procedure.// Avian Pathology, 1992, v. 21, p. 77-86.

32. Guy J.S., Barness H.J., Munger L.L., Rose L. Restriction endonuclease analysis of infectious laryngotracheitis viruses: comparison of modified-live vaccine viruses and North Carolina field isolates.// Avian Disease. 1990 v.33, p. 316-323.

33. Gunter B.M., Klupp B.G., Gravendyck M., Lohr J.E., Mettenleiter T.C., Kaleta E.F. Comparison of the genomes of 15 herpesvirus isolates by restriction endonuclease analysis.// Avian Pathology, 1997, v.26, p.305-316.

34. GuoP.X., ScholzE., Maloney В., Welniak E. Construction of Recombinant Avian Infectious Laryngotracheitis Virus Expressing the Beta- Galactosidase Gene and DNA-Sequencing of the Insertion Region.// Virology, 1994, v. 202, p. 771-781.

35. Hanson L.E., Bagust T.J. Laryngotracheitis. In: Diseases of poultry, 9-th., Ed.Calnek B. Iowa State University Press, Ames, 1991, p.485-495.

36. Hitchner S.B., Winterfield R.W. Revaccination procedures for infectious laryngotracheitis.//Avian Dis., 1960, v.4, p.291-303.

37. Hughes C.S., Williams R.A., Gaskell R.M., Jordan F., Bradbury J.M., Bennett M., Jones R/C. Latency and Reactivation of Infectious Laryngotracheitis Vaccine Virus.// Arch. Virology,1991, v. 121, p. 213-218.

38. Hughes C.S., Jones R.C., Gaskell F.T., Jordan W. , Bradberry J.M. Demonstration in live chickens of the carrier state in infections laryngotracheitis .//Res.Vet.Sci., 1987, v. 42, p.407-410.

39. Honegger К.A., and S.Klopp. Use of viral neutralization test for laryngotracheitis.//Proc.37-th Western Poultry Disease Conference, Davis, 1988,130-133.

40. Johnson M.A., Prideaux C.T., Kongsuwan K., Sheppard M., Fahey K.J. Gallid Herpesvirus-1 (Infectious Laryngotracheitis Virus) Cloning and Physical Maps of the SA-2 Strain.//Arch. Virology, 1991, v.119, p. 181-198.

41. Johnson M.A., Tyack S.C. Molecular evolution of infectious laryngothracheitis virus: An ancient example of the Alphaherpesviridae?.// Vet.Microbiol., 1995, v.46, p.221-231.

42. Johnson M.A., Prideaux C.T., Kongsuwan K., Sheppard M., Fahey K.J. Gallid herpesvirus I: cloning and phisical maps of the SA-2 strain./ Arch. Virol., 1991, v.119, p. 181-198.

43. Johnson M.A., Tyack S.G., Prideaux C.T., Kongsuwan K., Sheppard M. Nucleotide sequence of the left-terminus of infectious laryntracheitis virus (Gallid herpesvirus 1) SA-2 strain.//Arch.Virol., 1997, v.142, p.1903-1910.

44. Jones R.C., Williams R.A., Savage C.E., Thorp B.H. Isolation of Infectious Laryngotracheitis Virus from Proximal Femora of Lame Broiler-Chickens.// Res. Vet. Science, 1993, v. 55, p. 377-378.

45. Kaleta E.F., Redmann Т.Н., Huffels-Redmann U., Freze K. Zum Nachweis der Latenz des attenulerten virus der infektiosen laryngotracheitis des Huhnes in tregimenus ganglion.// Dische.Tieraerztl.Wochenschr., 1986, v.93, p.40-42 .

46. Kaleta E.F. Herpesviruses of birds- a rewiev.//Avian Pathol., 1990, v. 19, p. 193-211.

47. Keam L, York J.J., Sheppard M., Fahey K/J. Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus in Chickens Using a Nonradioactive DNA Probe.// Avian Diseases, 1991, v. 35, p. 257-262.

48. Keeler C.L., Kingsley-DH Burton-CRA. Identification of the Thymidine Kinase Gene of Infectious Laryngotracheitis Virus.// Avian Diseases, 1991, v. 35, p. 920-929.

49. Keeler C.L., Hazel Jr., Hastings J.E., Rosenberger J.K. Restriction endonuclease analysis of Delmarva fields isolates of infectious laryngotracheitis viruses.//Avian Disease, 1993, v.37, p. 418-426.

50. Key D.W., Gough B.C., Derbyshire J.B., Nagy E. Development and Evaluation of a Non-Isotopically Labeled DNA-Probe for the Diagnosis of Infectious Laryngotracheitis.// Avian Diseases, 1994, v. 38, p. 467-474.

51. Kingsley D.H., Hazel J.W., Keeler CL. Identification and Characterization of the Infectious Laryngotracheitis Virus Glycoprotein-C Gene.// Virology, 1994, v. 203, p. 336-343.

52. Klingeborn В., H. Pertoft. Equine Abortion (Herpes) Virus: Purification and Concentration of Enveloped and Deenveloped Virus and Envelope Material by Density Gradient Centrifugation in Cooloidal Silica.// Virology, 1972, v.48, p.618-623.

53. Kotiw M., Wilks C.R., May J.T. Differentiation of infectious laryngotracheitis virus strains using restriction endonucleases.// Avian Dis., 1982, v.81, p.718-731.

54. Kotiw M., Wilks C.R., May J.T. The Effect of Serial in-Vivo Passage on the Expression of Virulence and DNA Stability of an Infectious Laryngotracheitis Virus-Strain of Low Virulence.// Vet. Microbiology, 1995, v. 45, p. 71-80.

55. Kongsuwan K., Prideaux C.T., Johnson M.A., Sheppard M., Fahey K.J.Nucleotide-Sequence of the Gene Encoding Infectious Laryngotracheitis Virus Glycoprotein-B.// Virology, 1991, v. 184, p. 404-410.

56. Kongsuwan K., Johnson-MA Prideaux-CT Sheppard-M. Use of Lambda-Gtll and Monoclonal-Antibodies to Map the Gene for the 60,000 Dalton Glycoprotein of Infectious Laryngotracheitis Virus.// Virus Genes, 1993, v. 7, p. 297-303.

57. Kongsuwan K., Johnson-MA Prideaux-CT Sheppard-M.// Identification of an Infectious Laryngotracheitis Virus Gene Encoding an Immunogenic Proteinwith a Predicted M(R) of 32 Kilodaltons.// Virus Research, 1993, v. 29, p. 125-140

58. Leib D.A., Bradbury J.M., Gaskell R.M., Hughes C.S., Jones R.C. Restriction endonuclease patterns of some European and American isolates of avian infectious laryngotracheitis virus .// Avian Dis., 1986, v.30, p.835-837.

59. Leong V.Y., Glisson J.R., Resurreccion R.S., Cheng I.H.N. Infectious Laryngotracheitis Virus in Commercial Hens -A Serological Study Based on Enzyme-Linked-Immunosorbent- Assay.// Avian Diseases,1994, v. 38, p. 304-307.

60. Маскет S., Roizmann B. Regulation of herpesvirus macromolecular sinthesis :transcription-initiation sites and domains of alpha genes.// PNAS, 1980, v.77, p. 7112-7126.

61. Percoll. For density gradient centrifugation.// Pharmacia, 1988.

62. Poulsen D.J., Burton-CRA Obrian-JJ Rabin-SJ Keeler-CL. Identification of the Infectious Laryngotracheitis Virus Glycoprotein-GB Gene by the Polymerase Chain-Reaction.// Virus Genes,1991, v. 5, p. 335-347.

63. Prideaux C.T., Kongsuwan K., Johnson M.A., Sheppard M., Fahey K.J. Infectious laryngotracheitis virus growth, DNA replication , and protein synthesis.//Arch. Virol., 1992, v. 123, p. 181-192.

64. Remolds H.A., Watrach A.M., Hanson L.E. Development of the nuclear inclusion bodies of infectious laryngotracheitis.//Avian Dis., 1968, v. 12, p.332-347.

65. Roizmann В. ,Sears A.E. Herpes Simplex Viruses and their replication . In : Fields Virology, vol.2, Raven Press, New-York, 1983, p. 1795-1841.

66. Roizman В., Tognon M. Restriction enzyme analysis of herpesvirus DNA.Stability of restriction endonuclease patterns.// Lancet, 1982, v.l, p. 677 .

67. Sheppard M. DNA Fingerprint Analysis of 3 Infectious Laryngotracheitis Viruses.// Austr. Vet. J., 1991, v, 68, p. 188-188.

68. Schnitzlein W.M., J.Radzevicius, D.N.Tripathy. Propagation of infectious laryngotracheitis virus in an Avian Liver cell line.// Avian Dis., 1994, v.38, p.211-217.

69. Scholz E., Porter R.E., . Guo P.X. Differential-Diagnosis of Infectious Laryngotracheitis from Other Avian Respiratory-Diseases by a Simplified PCR Procedure.// J.Virol. Methods, 1994, v. 50, p. 313-321.

70. Shirley M.W., Kemp D.J., Sheppard M., Fahey K.J. Detection of DNA from Infectious Laryngotracheitis Virus by Colourimetric Analyses of Polymerase Chain-Reactions.// J. Virol. Methods, 1990, v. 30, p 251-259.

71. Taneno A., Honda-T Sakai-E Kawai-T Tokuyama-Y Eto-M. Safety and Efficacy of the Cell-Associated Vaccine Prepared by an Attenuated Infectious Laryngotracheitis Virus.//J.Vet.Med. Sci. 1991, v. 53, p. 671-676.

72. Tripathy D.N., Hanson L.E. Laryngotracheitis. In: A laboratory manual for the isolation and identification of avian pathogens, 3-th., Ed.Purchase H.G., Kendall/Hunt Publishing Co, Dubuque, Iowa, 1989, p.85-88.

73. Williams R.A., Bennett-M Bradbury-JM Gaskell-RM Jones-RC Jordan TW. Demonstration of Sites of Latency of Infectious Laryngotracheitis Vims Using the Polymerase Chain Reaction. J. Gen. Virology, 1992, v. 73, p. 2415-2420.

74. Williams R.A., Alafaleq-AI Jordan-FTW Bradbury-JM Gaskell-RM Bennett-M Jones-RC. Pathogenicity of Latent Infectious Laryngotracheitis Virus in Chickens.// Avian Pathology,l992, v. 21, p. 287-294.

75. York J.J., Fahey-KJ. Humoral and Cell-Mediated Immune-Responses to the Glycoproteins of Infectious Laryngotracheitis Herpesvirus.// Arch. Virology, 1990, v. 115, p. 289-297.

76. York J.J., Sonza-S Brandon-MR Fahey-KJ. Antigens of Infectious Laryngotracheitis Herpesvirus Defined by Monoclonal-Antibodies.// Arch. Virology, 1990, v. 115, p. 147-162.

77. York J.J., Fahey-KJ. Vaccination with Affinity-Purified Glycoproteins Protects Chickens Against Infectious Laryngotracheitis Herpesvirus.// Avian Pathology,1991, v. 20, p. 693-704.

78. York J.J., Fahey KJ. Humoral and Cell-Mediated Immune-Responses to the Glycoproteins of Infectious Laryngotracheitis Herpesvirus.// Arch. Virology, 1990, v. 115, p. 289-297.

79. York J.J., Fahey K.J. Diagnosis of infectious laryngotracheitis using a monoclonal antibody ELISA.//Avian Pathol., 1988, v. 17, p.173-182.

80. YorkJ.J., Sonza S., Fahey K.J. Immunogenic glycoproteins of infectious laryngotracheitis herpesviruses.// Virology,1987 v. 161, p. 340-347.

81. Young P.L., Smith G.A. Genetically altered herpesviruses as vaccines.// Vet. Microbiology, 1995, v. 46, p. 175-179.

82. Yurov G.K., Naroditsky-BS, Ganiyev-A. Surface Polypeptides of Chicken Infectious Laryngotracheitis Virus Intermolecular Disulfide Bonds.//Bonpocbi вирусологии, 1993, том 38, н. 4, с. 174-176.

83. Wild М.А., Cook S., Cochran M. A Genomic Map of Infectious Laryngotracheitis Virus and the Sequence and Organization of Genes Present in the Unique Short and Flanking Regions Source.// Virus gene, 1996, v. 12, p. 107-116.

84. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

85. Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

86. УТВЕРЖДАЮ: Директор ВНИТИБП член-корреспондент РАСХН1. А.Я. Самуйленко» 2001 г.1. Методические указанияпо выявлению ДНК вируса инфекционного ларинготрахеита птиц с помощью полимеразнойцепной реакции1. Щелково-2001