Вирусы папиллом человека при раке мочевого пузыря: методы детекции, частота обнаружения, морфологические и клинические особенности заболевания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Головина, Дарья Андреевна

• Головина, Дарья Андреевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Головина, Дарья Андреевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Краткая характеристики вирусов папиллом. Основные 12 механизмы опухолеродного действия ВПЧ типов высокого онкогенного риска

1.1.1. Таксономия и структура вирусов папиллом

1.1.2. Строение генома ВПЧ

1.1.3. Пути заражения ВПЧ

1.1.4. Этапы инфицирования эпителиальной клетки ВПЧ

1.1.5. Основные свойства онкобелков Е6 и Е7 вирусов папиллом 22 человека типов высокого онкогенного риска

1.1.6. Формы злокачественных опухолей, этиологически связанные 25 с ВПЧ высокого риска

1.1.7. Клинические особенности ВПЧ-позитивных инвазивных 25 карцином по сравнению с ВПЧ-негативными карциномами тех же локализаций

1.2. Вирусы папиллом человека и рак мочевого пузыря

1.2.1. ВПЧ как фактор риска при РМП

1.2.2. Источники противоречивости данных о роли ВПЧ в 34 индукции РМП

1.2.3. Попытки исследовать роль вирусов папиллом в 35 уротелиальном канцерогенезе на экспериментальных моделях

1.2.4. Возможные перспективы для практической онкоурологии 38 1.3. Феномен гиперэкспрессии клеточного белка р 1 бШК4а в

опухолях, индуцированных ВПЧ

1.3.1. р 16ШК4а - диагностический маркер рака шейки матки

1.3.2. Использование иммуногисто-/цитохимической детекции

белка р161Ж4а в качестве маркера при других ВПЧ-ассоциированных формах рака

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клинические материалы

2.2. Выделение ДНК и РНК

2.2.1. Выделение ДНК и РНК из образцов ткани

2.2.2. Определение концентрации и качества ДНК и РНК

2.2.3. Выделение ДНК из парафиновых блоков

2.3. Скрининг образцов уротелия мочевого пузыря на присутствие 49 ДНКВПЧ

2.3.1 Полимеразная цепная реакция

2.3.2 Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР в агарозном 56 геле

2.3.3 Определение типа вируса в ДНК ВПЧ-позитивных образцах: 56 рестрикционный анализ

2.4 Изучение экспрессии вирусных генов Е6 и Е7 ВПЧ 16 типа и 58 клеточного гена, кодирующего р16шк4а, на уровне мРНК

2.4.1 Реакция обратной транскрипции

2.4.2 Полуколичественная полимеразная цепная реакция

2.4.3 Проявление продуктов ПЦР с помощью радиоактивной 63 метки

2.5 Иммуногистохимическая детекция вирусного онкобелка Е7 64 ВПЧ 16 и клеточного белка р161МС4а

2.5.1 Гистологические образцы

2.5.2 Иммуногистохимическое окрашивание белка р16ШК4а

2.5.3 Иммуногистохимическая детекция онкобелка Е7 ВПЧ 16

2.5.4 Интерпретация результатов

2.6 Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Скрининг образцов РМП на наличие генетического материала 69 ВПЧ; типирование вируса в положительных образцах

3.1.1 Скрининг образцов уротелия мочевого пузыря на присутствие 69 ДНК ВПЧ

3.1.2 Типирование ВПЧ в образцах РМП, содержавших ДНК 70 вируса

3.1.3 ПЦР-анализ присутствия гена Е7 ВПЧ16 в образцах РМП

3.1.4 Исследование образцов нормального уротелия на 73 присутствие генетического материала ВПЧ

3.2 Изучение экспрессии вирусных онкогенов Е6 и Е7 на уровне 74 мРНК в ДНК ВПЧ 16-позитивных образцах РМП

3.2.1 Изучение экспрессии онкогена Еб ВПЧ 16

3.2.2. Изучение экспрессии онкогена Е7 ВПЧ16

3.3 Экспрессия белка Е7 ВПЧ 16 типа в образцах РМП

3.4 Экспрессия клеточного гена ШК4а в образцах ракового и 79 условно-нормального уротелия мочевого пузыря

3.4.1 Результаты изучения экспрессии ШК4а на уровне мРНК 79 3.4.2. Результаты иммуногистохимической детекции белка р16ГКК4а 83 в ДНК ВПЧ 16-позитивных образцах РМП

3.5. Клинический случай с утратой ВПЧ-позитивности РМП 86 3.6 Морфологические и клинические особенности ВПЧ-позитивного 89 РМП

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101 ВЫВОДЫ 105 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВПЧ - вирусы папиллом человека РШМ - рак шейки матки РМП - рак мочевого пузыря ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией БПВ - бычий папилломавирус

CIN 1 - слабая дисплазия (mild dysplasia, cervical intraepithelial neoplasia) CIN 2 - умеренная дисплазия (moderate dysplasia) CIN 3 - тяжелая дисплазия (severe dysplasia) ТУР - трансуретральная резекция

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вирусы папиллом человека при раке мочевого пузыря: методы детекции, частота обнаружения, морфологические и клинические особенности заболевания»

ВВЕДЕНИЕ

По последним оценкам, каждый пятый случай злокачественного новообразования человека возникает с участием инфекционного агента — вируса, бактерии, паразитического гельминта [141, 68]. Около 70 % таких случаев ассоциировано с вирусами. Согласно прогнозам, квота онкологических заболеваний, причинно связанных с инфекционными агентами, может в будущем достигнуть ~ 35 % [68, 143].

Вирусы папиллом человека (ВПЧ) определенных типов, т.н. типов высокого риска, являются этиологическими агентами рака шейки матки (РШМ), а также рака влагалища, полового члена, ротовой полости и некоторых других форм злокачественных опухолей [67]. Перечень форм рака, в возникновении которых доказано участие ВПЧ, постоянно пополняется [66, 67, 68]. В целом онкогенные ВПЧ ответственны за ~ 50% всех онкологических заболеваний, индуцируемых биологическими агентами у женщин, и 5 % - у мужчин [141]. Вопрос о роли ВПЧ в возникновении инвазивных карциномам нескольких локализаций остается открытым; именно к этой категории международные группы экспертов относят и рак мочевого пузыря (РМП), [67, 68].

ВПЧ двух типов высокого онкогенного риска, 16-го и 18-го, обнаруживаются в -70% образцов РШМ; помимо них признаны канцерогенами для человека ВПЧ одиннадцати типов: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 и 66; а еще для восьми типов ВПЧ получены ограниченные свидетельства их канцерогенности [140, 68]. Для превращения нормальной клетки, зараженной ВПЧ высокого риска, в раковую необходима экспрессия вирусных генов Е6 и Е7. Кодируемые ими белки взаимодействуют со многими белками клетки, участвующими в контроле пролиферации, апоптоза, репарации генома и других важнейших процессов жизнедеятельности; в результате нарушается нормальное функционирование этих клеточных белков [138, 67, 140].

Для онкологической клиники в этой связи важно следующее. Все формы рака, в возникновении которых доказана роль ВПЧ типов высокого риска, этиологически гетерогенны: только определенная часть карцином ротовой полости, вульвы, полового члена возникает с участием ВПЧ, другая же часть опухолей той же локализации ВПЧ-негативна. В каждом из этих органов, включая шейку матки, ВПЧ-позитивный рак отличается от ВПЧ-негативного по молекулярно-биологическим, гистологическим и клиническим характеристикам [96, 59].

Следует отметить, что, несмотря на невысокую заболеваемость РМП в России (ниже средних европейских показателей), Россия отнесена экспертами ВОЗ к группе стран с высокой смертностью от РМП. Высокие показатели смертности от РМП в России обусловлены всецело высокой смертностью среди мужчин, - в большинстве регионов она выше максимальных показателей смертности в странах, представленных в статистике ВОЗ; у российских женщин показатели смертности не выше таковых в европейских странах [9].

Известно много факторов, повышающих риск развития РМП. К их числу относятся: географическое положение, профессиональная деятельность, курение, характер питания, применение определенных лекарств, паразитарное заболевание, вызываемое гельминтами из рода Schistosoma [7, 9, 14, 49, 70].

До недавнего времени РМП выявлялся, в основном, у пожилых людей, но в последние годы наметились тенденции к его «омоложению», которая сопровождается изменением характерного для данной формы рака спектра молекулярных маркеров [107, 89], что может указывать на появление новых факторов риска его развития, в т.ч. инфекционных агентов.

Вопрос о том, принимают ли участие ВПЧ типов высокого риска в уротелиальном онкогенезе, длительное время остается предметом дискуссий. Отсутствие единого мнения - результат систематического несовпадения данных, получаемых разными исследовательскими группами при детекции ВПЧ в раковом уротелии. Так, Международная группа экспертов отобрала более двадцати работ, выполненных в 1991-2001г.г. в разных лабораториях

мира; доля ВПЧ-позитивных образцов РМП в этих сообщениях варьировала в пределах от 0 до 83% [67]. Вероятные источники неоднородности данных о роли ВГТЧ в этиологии РМП исследователи обычно относят к одной из двух категорий: (1) объективная этно-географическая неоднородность РМП и (2) методические особенности работ.

Изучение участия ВПЧ в генезе РМП актуально и в теоретическом, и практическом плане. В ходе выполнения настоящей работы будет проведена проверка способности известных биологических канцерогенов, ВПЧ, участвовать в канцерогенезе эпителия особого типа, - уротелия. Результаты исследования важны и для совершенствования способов профилактики (например, с помощью вакцинаций мальчиков), для поиска новых молекулярных маркёров, а также для индивидуализации методов лечения РМП.

Цель и задачи исследования.

Целью работы было проверить гипотезу о возможной ассоциации ВПЧ типов

высокого риска с возникновением РМП.

Исходя из поставленной цели, в задачи работы входило:

1. Провести скрининг образцов уротелия на присутствие ДНК ВПЧ, определить тип вируса в позитивных образцах (в случае обнаружения таковых).

2. Исследовать экспрессию онкогенов Е6 и Е7 ВПЧ в ДНК-ВПЧ-позитивных образцах на уровне мРНК и белка.

3. Исследовать экспрессию клеточного белка р16ШК4а в образцах уротелия мочевого пузыря. Оценить возможную ассоциацию между гиперэкспрессией белка р16ШК4а, являющегося ранним диагностическим маркёром папилломавирусного канцерогенеза в эпителии шейки матки, и ВПЧ-позитивностью РМП.

4. Изучить особенности морфологии и клинического течения ВПЧ-позитивного и ВПЧ-негативного РМП.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

История изучения опухолеродных свойств вирусов папиллом восходит к работе итальянского врача Rigoni-Stern (1842), который проанализировал свидетельства о смерти женщин в Вероне за 70 лет. Оказалось, что РШМ с высокой частотой поражал замужних женщин, вдов и женщин легкого поведения, однако у девственниц и монахинь выявлялся крайне редко. Rigoni-Stern пришел к заключению, что этот тип рака как-то связан с сексуальным поведением.

Инфекционная (и, именно, вирусная) природа бородавок человека была продемонстрирована экспериментально (Ciuffo, 1907). Позднее была показана инфекционная природа генитальных бородавок и папиллом гортани человека, а также папиллом кроликов и крупного рогатого скота [67, 142]. Дальнейший прогресс в этой области решающим образом зависел от методических возможностей вирусологии и онкологии.

В 1976 г. немецкий исследователь Herald zur Hausen высказал гипотезу, что вирусы папиллом, по-видимому, являются этиологическим агентом РШМ, второго по частоте заболеваемости рака женщин 500000 вновь заболевших в мире ежегодно), [137]. Последовавшее за этим стремительное накопление фактов полностью подтвердило этиологическую роль ВПЧ при РШМ и увенчалось разработкой вакцин для профилактики РШМ [51, 31, 124, 108, 140].

Признание ВПЧ как этиологического фактора РШМ зафиксировано в пресс-релизе Всемирной организации здравоохранения в 1996 г. Следует отметить, что в настоящее время содержание понятия "вирус как этиологический фактор развития опухоли" подразумевает комплекс следующих фактов: вирусная ДНК (как в интегрированной, так и в эписомальной форме) регулярно обнаруживается в опухолевых клетках; клонированные вирусные гены в системах in vitro способны индуцировать злокачественную трансформацию клеток, включая клетки человека; вирусные гены регулярно экспрессируются в опухолевых клетках; в природе существуют сходные

вирусы, способные индуцировать опухоли у экспериментальных животных; эпидемиологические данные подтверждают связь между опухолевым процессом и наличием вирусного генетического материала в опухолевых клетках [67].

За открытие вирусов папилломы человека, вызывающих РШМ, пионеру исследований канцерогенных свойств ВПЧ Херальду Цурхаузену в 2008 г. была присуждена Нобелевская премия.

Биологии ВПЧ, механизмам канцерогенного действия ВПЧ типов высокого риска, методам диагностики и профилактики РШМ посвящены многочисленные обзоры и монографии [138, 140, 67, 68, 34, 30, 10, 12, 5]. В настоящем обзоре,

1.) представлена краткая характеристика ВПЧ и основные механизмы опухолеродного действия ВПЧ типов высокого онкогенного риска,

2.) проанализированы данные литературы о ВПЧ как факторе риска при РМП, 3.) рассмотрен феномен гиперэкспрессии клеточного белка р! 6шк4а, признанный «суррогатным маркёром» вирусного онкогена Е7, в индуцированных ВПЧ опухолях. Этот феномен нашел широкое применение в ранней диагностике РШМ [78]. В последние годы этот маркер внедряется для подтверждения экспрессии генома ВПЧ высокого риска не только в эпителии шейки матки, но и в эпителии других органов [28, 74, 75, 106].

1.1. Краткая характеристики вирусов папиллом.

Основные механизмы опухолеродного действия ВПЧ типов высокого онкогенного риска

Вирусы папиллом - чрезвычайно разнообразная группа эпителиотропных видоспецифичных вирусов. Они обнаружены у подавляющего большинства видов млекопитающих, а также у некоторых птиц и рептилий. Количество известных науке папилломавирусов быстро увеличивается: так, в 2004 г. сообщалось о 118 типах, геном которых был полностью охарактеризован [47], а в 2010 г. - уже о 189 типах [29].

1.1.1. Таксономия и структура вирусов папиллом

Вирусные частицы ВПЧ имеют небольшие размеры - 50-60 нм в диаметре. Геном представляет собою кольцевую двуспиральную молекулу ДНК размером около 8 т.п.н. Зрелая вирусная частица содержит ДНК, заключенную в белковый капсид из 72 капсомеров.

В соответствии с решением Международного комитета по таксономии вирусов (International Committee on the Taxonomy of Viruses, ICTV), папилломавирусы выделены в самостоятельное семейство Papillomaviridae, включающее 29 родов, обозначенных буквами греческого алфавита. В основу таксономии ВПЧ положен генетический принцип, а именно, степень несовпадения нуклеотидной последовательности в наиболее консервативной, т.е. наименее различающейся у разных вирусов этой группы, области их генома - гене L1. Новые типы, подтипы и варианты папилломавирусов описывают в случае, когда последовательность гена L1 у вновь выделенного вируса отличается от уже известных на 10% нуклеотидов (тип), на 2-10% (подтип) или на менее чем 2% (вариант) [47]. Последовательность консервативной области гена L1 ВПЧ служит критерием для классификации вирусов, а также используется при разработке методов их детекции, включая выявление до

настоящего времени не описанных членов семейства Papillomaviridae. Мы остановимся на этом в разделе «Материалы и методы». Представления о филогенетических связях внутри этого многочисленного семейства вирусов отражены на рис. 1.1

Среди Papillomaviridae наиболее детально изучаются ВПЧ. Количество известных ВПЧ достигло 120 [29]. ВПЧ образуют 5 родов: а, ß, у, ц и v. ВПЧ, относящиеся к роду а, инфицируют преимущественно слизистые оболочки ротовой полости и аногенитальной сферы, а также эпителий наружных половых органов. Все известные на сегодня ВПЧ типов высокого онкогенного риска относятся именно к роду а. Филогенетические отношения в этой группе ВПЧ отражены на рис. 1.2. ВПЧ четырех остальных родов обычно обнаруживают на коже, а также на слизистых оболочках, не относящихся к половым органам. ВПЧ до настоящего времени не обнаружены в эпителии желудка и толстой кишки человека.

Как уже было отмечено во Введении, вопрос об участии ВПЧ в канцерогенезе в ряде органов остается предметом дискуссий. К этой категории относится не только РМП. Сообщения о детекции ВПЧ многих типов, включая типы высокого риска, в образцах опухолей молочной железы [48] и лёгких [61] дают основание предполагать, что папилломавирусы, возможно, имеют отношение к генезу и этих распространенных форм рака. С учетом задач, которые предстоит решить в настоящей работе, важно отметить, что в исследовании, посвященном детекции ДНК ВПЧ в молочной железе, авторы трактуют полученные результаты как указание на распространение ВПЧ по протокам этого органа в направлении против тока молока ("retrograde") [48].

Genus

AI pha-papi il omavirus

Beta-

papiilomavirus

Delta-papiMomavirus

Epsilon-papillomavirus Zeta-papillomavirus

^sf //¡¡\\

rv X X/ / / \

# ECPV1 / / / / j I

ЩГ*- У ' " ■' ' '

"™'\ai>v '1 63

/ / MmPV

Eta-papillomavirus

Theta-papillomavirus

J СУКУ 1 »J j

ICRfVVFdPV*- X \8PV - -W

* 4 Ч^Хрзру Pi-papiliomavirus

/ ih w-4

^ X Omikron-papiilomavirus

Mu-papiMomavirus T Xi-papHlomavirus

СГ,

Lambda-papiliomavtrus Kappa-papillomavirus Nu-papiliomav»rus lota-papillomavirus

Рисунок 1.1 Филогенетическое древо вирусов семейства Papillomaviridae по представлениям на 2004 г. (А) и на 2011 г. (Б).

А - 118 типов ВПЧ [Е-М de Villiers et.al., 2004]. Б - 189 типов ВПЧ [H-U Bernard et.al., 2010].

1.1.2. Строение генома ВПЧ

Геномная ДНК всех папилломавирусов содержит 3 области: (1) длинную регуляторную область (long control region, LCR или, иначе, upstream regulatory region, URR), с последовательностями, ответственными за контроль репликации и транскрипции вируса; (2) раннюю (early, Е) область, включающую открытые рамки считывания (open reading frames, ORFs) El, E2, E4, E5, E6 и E7, необходимые вирусу для осуществления «ранних», не связанных с продукцией зрелых вирусных частиц, функций, таких как репликация и транскрипция вирусного генома, а также придание инфицированной клетке черт злокачественности, - у ВПЧ тех типов, которые обладают канцерогенным потенциалом, и (3) позднюю (late, L) область, кодирующую структурные белки LI и L2 вирусного капсида, которые определяют структуру зрелой вирусной частицы. Наибольшее клиническое значение имеют ВПЧ двух типов высокого онкогенного риска: ВПЧ 16 и ВПЧ18; они ответственны за возникновение -50% и -20% случаев РШМ по всему миру, соответственно [122]. Строение генома ВПЧ16 представлено на схеме (Рис. 1.3). Из двух нитей ДНК в геноме ВПЧ кодирующей является только одна [67, 34].

НКР 1

HPV15 HPVM _

Hpvn J*-<i11

ВКР

................ILL I

"**1 Iпищит мл»

у— www

Г***1!-ил»

1 p— J

>«S

HKP 2

Рисунок 1.2 Филогенетические древо а-ВПЧ [Burk R.D. et.al., 2009]. К а-ВПЧ относятся группы: НКР 1 (аЮ, а8, al and а13), НКР 2 (а2, аЗ, а4, а15) и ВКР (а5, аб, а7, а9 and all). Группа ВКР содержит все известные типы ВПЧ, связанные с РШМ.

ВКР - ВПЧ высокого канцерогенного риска НКР - ВПЧ низкого канцерогенного риска

Рисунок 1.3 Структура генома ВПЧ высокого риска (16 тип) [М. J. Lace et.al. 2011]. Пояснения - в тексте.

1.1.3. Пути заражения ВПЧ

Что касается способов заражения ВПЧ, то наиболее подробно они изучены для аногенитальных вирусов. Основным путем заражения такими ВПЧ является горизонтальная передача от человека к человеку при половом контакте, т.е. при контакте с инфицированным цервикальным, вагинальным, перианальным эпителием, эпителием вульвы и полового члена. Заражение возможно и при нетрадиционных способах половых контактов. Доказана также возможность вертикальной передачи ВПЧ от инфицированной матери ребенку до рождения или во время родов, но такой способ заражения оценивается как редкий, имеющий небольшое значение в масштабах популяции [67].

Современные представления о путях заражения ВПЧ, очевидно, нельзя считать окончательно сформировавшимися. Так, заслуживает упоминания работа группы финских исследователей, проведенная на беременных женщинах: ВПЧ нескольких типов, в т.ч. 16-го, они обнаружили в плаценте и в

крови пупочного канатика, причем наличие вируса в крови пупочного канатика положительно коррелировало с последующим выявлением его в ротовой полости и на гениталиях новорожденного [117]. Значение сенсационных результатов, опубликованных исследовательским коллективом из Италии, по-видимому, в полной мере будет оценено в ходе дальнейших исследований, однако их данные, также целесообразно упомянуть. Методом флуоресцентной гибридизации in situ они показали присутствие ДНК ВПЧ в головках сперматозоидов ВПЧ-инфицированных мужчин, однако была ли интегрирована вирусная ДНК в ядро клеток, авторам выяснить не удалось [56]. Далее в модельной системе «человек-хомячок» они продемонстрировали перенос с помощью сперматозоидов, трансфицированных генами Е6 и Е7 ВПЧ16 в составе рекомбинантной плазмиды, этих вирусных онкогенов в ооцит хомячка, а также транскрипцию их в ооците [57].

1.1.4. Этапы инфицирования эпителиальной клетки ВПЧ

На примере эпителия шейки матки упомянем основные события, следующие за попаданием в клетку ВПЧ типа высокого риска. ВПЧ инфицирует базальные эпителиальные клетки. На этом этапе геном вируса присутствует в клетке в виде эписомы. Репликация вирусного генома происходит в клеточном ядре. Транскрипция области ранних генов, трансляция ранних белков и репликация вирусной ДНК начинается в делящихся клетках, находящихся на базальной мембране, а затем, по мере того как вирусный генетический материал в ходе деления этих клеток попадает в дочерние супрабазальные клетки, эти процессы охватывают и супрабазальный слой эпидермиса. Жизненный цикл вируса тесно связан со стадиями дифференцировки эпителиальных клеток. Транскрипция поздней области вирусного генома, наработка капсидных белков, сборка вирионов, разрушение клеточного ядра и лизис инфицированной клетки, завершающиеся освобождением вируса, происходят только в полностью дифференцированных

клетках. Поскольку эти клетки, находящиеся на поверхности эпителия, со временем слущиваются и заменяются более молодыми, на этом этапе вирусная инфекция протекает бессимптомно. В последние годы было показано, что мишенью для внедрения и размножения ВПЧ высокого канцерогенного риска являются стволовые полипотентные клетки, находящиеся в переходной зоне, -между плоским и цилиндрическим эпителием, а также под цилиндрическим эпителием в зоне эктопии и в цервикальном канале (Рис.1.4) [30, 11]. Именно в этих клетках в условиях персистирующей ВПЧ-инфекции вирус вызывает плоскоэпителиальную метаплазию с неконтролируемой пролиферацией дочерних клеток. Эта переходная зона получила название зоны трансформации; установлено, что все патологические изменения эпителия, имеющие риск перехода в РШМ, возникают именно в этой зоне.

поверхностные промежуточные ЯВЬ-парабазальные база/1 ьные

точка стыка многослойного ПЛОСКОГО II цилиндрического эшггешя

Рисунок 1.4 Зона трансформации в шейке матки расположена на стыке многослойного плоского и цилиндрического эпителия. Перечислены слои клеток плоского эпителия.

До определенного момента геном ВПЧ типа высокого риска сохраняется в инфицированной клетке в виде эписомы, однако во многих тяжелых дисплазиях и большинстве инвазивных карцином шейки матки он оказывается интегрирован в хозяйскую хромосому в виде линейного фрагмента ДНК, ковалентно связанного с ДНК хромосомы (Рис. 1.5).

А

эписомальная форма ДНК ВПЧ

интегрированная форма ДНК ВПЧ

Е4

12 и 1ЖЯЕ6 Е7 Е1 Е5

клеточная ДНК клеточная ДНК

Рисунок 1.5 Структура генома ВПЧ 16/18 до интеграции в хромосому хозяйской клетки (А) и после интеграции (Б). [КЛаеэ Я, е!.а1. 1999]. Подробности - в тексте.

Интеграция происходит в результате возникновения разрывов в ДНК вируса и ДНК клетки; при этом происходит утрата генов Е2, Е4, Е5 и, частично, Ь2. Таким образом, продукция зрелых вирусных частиц в опухолевых клетках отсутствует. Интеграция вирусного генома в хромосому клетки хозяина приводит к прогрессии новообразования. Причинами ускорения прогрессии после интеграции генома ВПЧ в геном клетки являются, во-первых,

структурные перестройки в геноме вируса, сопровождающие интеграцию и приводящие к нерегулируемой усиленной экспрессии вирусных онкогенов Еб и Е7, продукты которых нарушают пролиферацию клетки, вмешиваются в механизмы апоптоза, репарации генома и ряд других процессов (эти активности вирусных онкобелков мы рассмотрим далее). Во-вторых, акт интеграции вирусной ДНК отражается на целостности и функционировании определенных клеточных генов [77, 20, 119].

Итак, индукции предраковых изменений эпителия (т.н. дисплазий), а также инвазивных карцином под действием ВПЧ определенных типов обычно предшествует длительная инфекция этими вирусами. Установлено, что канцерогенный потенциал папилломавирусов коррелирует с накоплением мутаций (оно происходило на протяжении миллионов лет совместной эволюции человека и вируса) в ранней области вирусного генома, прежде всего в генах Еб и Е7, получивших поэтому название вирусных онкогенов [34, 30, 134]. Активности белковых продуктов генов Еб и Е7 у ВПЧ разных типов существенно различаются; эти различия и обусловили разделение ВПЧ на типы «низкого» и «высокого» онкогенного риска. Поскольку экспрессия генов Еб и Е7 признана необходимым условием превращения зараженной ВПЧ клетки из нормальной в раковую [138, 67], рассмотрим основные свойства белковых продуктов этих генов.

1.1.5. Основные свойства онкобелков Еб и Е7 вирусов папиллом человека типов высокого онкогенного риска

Небольшие короткоживущие вирусные онкобелки Еб и Е7 ВПЧ типов высокого риска способны взаимодействовать с десятками важнейших клеточных белков, нарушая их нормальное функционирование. Среди активностей этих белков принято выделять способность Е7 связываться с белком ретинобластомы рШэ [52], а также способность Еб взаимодействовать с белком р53 [133].

р16Шк4а

1

Циклины О Свк4,6

Е2Р-0Р

Е2Г-ОР

Рисунок 1.6 Сигнальный путь рКВ/р161Ж4а при ВПЧ-позитивном раке шейки матки. Подробности в тексте.

При связывание Е7 с белком рШз происходит разрушение комплекса, в который входят транскрипционные факторы Е2Р-ОР и рКЬ, в результате чего нарушается регуляция вхождения клетки в 8-фазу клеточного цикла (Рис. 1.6). Помимо этого, Е7 способен связываться с гомологами рЯВ, белками р107 и р130, вызывая аналогичное нарушение контроля клеточного цикла [53].

Белок Е7 обладает также способностью связываться с комплексом Е2Р/сусПп А, образующимся в 8-фазе клеточного цикла [22]. В в2/М фазе клеточного цикла Е7 взаимодействует с киназой гистона Н1 [43]. Реализация всех перечисленных эффектов онкобелка Е7 приводит к бесконтрольной пролиферации клеток.

аг

Белок Е6 ВПЧ высокого канцерогенного риска связывается с Е6-ассоциированным белком (Е6-АР) [118]; образующийся при этом комплекс Е6-АР вызывает полиубиквитинирование и последующую деградацию белка р53 [133]. Деградация р53 ведет к нарушению функционирования контрольных точек G1/S и G2/M клеточного цикла, иными словами, - к бесконтрольному делению клетки. Помимо этой активности Е6, связанной с деградацией р53, описано еще несколько функций данного онкобелка, способствующих злокачественной трансформации клеток. Так, Е6, взаимодействуя с проапоптотическим белком Bäk, ингибирует его функции и подавляет апоптоз [133,125,126]. Онкобелок Е6 активирует каталитический компонент теломеразы hTERT, что приводит к прекращению укорочения теломер и к иммортализации клеток [80].

Экспрессия онкобелков Е6 и Е7 приводит к повышению генетической нестабильности, поскольку эти белки индуцируют многополюсные митозы, возникновение анафазных мостов и задержку расхождения хромосом в митотической анафазе [50]. Задержка расхождения хромосом, по-видимому, обусловлена способностью Е7 взаимодействовать с ядерным белком митотического аппарата NuMA [105]. Многополюсные митозы принято рассматривать как один из гистологических признаков предраковых изменений и инвазивного рака, вызванных ВПЧ высокого риска [50].

Таким образом, каждый из двух онкобелков ВПЧ, Е6 и Е7, вносит вклад в онкогенный потенциал ВПЧ типов высокого риска. Этот потенциал существенно возрастает при совместном функционировании этих вирусных белков в эпителиальной клетке [138].

Представляется важным отметить, что в случае РШМ помимо хронической инфекции ВПЧ типа высокого онкогенного риска независимыми факторами риска признаны также следующие: курение, статус HLA, генетический полиморфизм ряда генов, в частности, генов, имеющих отношение к созреванию чужеродных антигенов [67].

1.1.6. Формы злокачественных опухолей, этиологически связанные с ВПЧ высокого риска

Как уже было отмечено во Введении, с момента установления роли ВПЧ типов высокого риска в генезе РШМ перечень форм рака, в возникновении которых участие ВПЧ доказано, неуклонно удлиняется [66, 67, 68]. Помимо РШМ установлено участие ВПЧ в индукции рака вульвы, влагалища, прямой кишки, ануса, полового члена, ротовой полости, ротоглотки (миндалин и основания языка). Имеются ограниченные данные о вовлечении ВПЧ в канцерогенез гортани и слизистой оболочки глаза. Объём информации, имеющейся для рака пищевода, яичника, легкого, молочной железы, предстательной железы, мочевого пузыря, носовой полости и носовых синусов, оценивается как недостаточный.

Пополнился и перечень типов ВПЧ, признанных канцерогенами для человека, - помимо ВПЧ 16 и ВПЧ 18 (по состоянию на 1995 г.) в настоящее время в него включают также вирусы следующих типов: 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58,59, 66.

1.1.7. Клинические особенности ВПЧ-позитивных инвазивных карцином по сравнению с ВПЧ-негативными карциномами тех же локализаций

Обнаружение ВПЧ-негативного РШМ оказалось задачей, сложной с методической точки зрения. Наиболее рациональное объяснение того факта, что ДНК ВПЧ выявляется менее чем в 100% опухолевых образцов (как явствовало из сообщений многих авторов) таково: группа папилломавирусов крайне гетерогенна, а система детекции в конкретном исследовании оказалась недостаточно специфичной для обнаружения вирусного генетического материала, иными словами, имел место ложно-негативный результат.

В этой связи заслуживает упоминания сообщение группы американских исследователей, специально занимавшихся ретроспективным поиском ВПЧ-

негативного РШМ в крупной медицинской клинике [96]. Среди сотен историй болезни пациенток с РШМ они обнаружили 5 случаев, когда у больных, имевших диагноз, не связанный с РШМ, - «лейомиома матки», «влагалищный свищ» и т.п., - непосредственно на операционном столе в ходе хирургической операции обнаруживались очень крупные сильно кератинизированные (т.е. сохранившие некоторые черты дифференцировки плоского эпителия, обычно отсутствующие в ВПЧ-позитивном РШМ) инвазивные карциномы шейки матки. Все пять пациенток оказались неоперабельными из-за выраженной инвазии опухоли в окружающие органы; при этом у всех пяти полностью отсутствовали признаки прорастания опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды, метастазы также не были обнаружены ни у одной из пяти пациенток. Такие черты биологии опухоли, как выраженная инвазия в соседние органы при отсутствии метастазирования, нетипичны для ВПЧ-позитивного РШМ. У всех пяти больных в цервикальном эпителии отсутствовали диспластические изменения, обычно сопутствующие хронической ВПЧ-инфекции; все пятеро имели благоприятную предысторию цитологических обследований на РШМ (т.н. ПАП-тест). Было проведено комплексное молекулярно-биологическое исследование архивных образцов опухолей от этих больных с использованием трех методов: гибридизации in situ с зондами к ~30 типам ВПЧ высокого риска, ПЦР-гибридизации in situ, а также ПЦР с обратной транскрипцией in situ. Результаты его свидетельствовали об отсутствии генетического материала ВПЧ в этих образцах. По косвенным оценкам, частота такой разновидности РШМ не превышает 0,5% среди всех случаев РШМ. Таким образом, была описана редкая, крайне трудно диагностируемая цитологически и патоморфологически, разновидность плоскоклеточного РШМ, заболевания, являющегося «золотым стандартом» в области, посвященной изучению папилломавирусного канцерогенеза. Подобные разновидности известны также для карцином вульвы и полового члена [59].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Головина, Дарья Андреевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андреева Ю.Ю., Завалишина Л.Э., Морозов A.A. и др. Выявление ДНК вируса папилломы человека в поверхностной уротелиальной карциноме мочевого пузыря // Онкоурология. - 2008. - Т.1. - С. 34-5.

2. Бабаян А.Ю., Андреева Ю.Ю., Залетаев Д.В., и др. Клональное происхождение множественных очагов рака мочевого пузыря // Архив патологии - 2012. - Т. 74 - С. 44-50

3. Бойчук Н.В., Исламов P.P., Кузнецов С.Л. Гистология, эмбриология, цитология: Учебник для вузов (под ред. Улумбекова Э.Г., Челышева Ю.А.) Изд. 3-е, перераб. - доп. 2007 г.. - 408 стр.

4. Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э., Франк Г.А., и др. Экспрессия белкового маркера р16шк4а в раке шейки матки // Архив патологии . - 2002. - Т. 64. -№1. - С. 22-24.

5. Волгарева Г.М., Завалишина Л.Э, Андреева Ю.Ю., и др. Гиперэкспрессия клеточного белка pl6INK4a в эпителиальных злокачественных опухолях, индуцированных вирусами папиллом человека (обзор) // Архив патологии. - 2008. - Т. 70. - №5. - С.57-61.

6. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2007 г. // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - Т. 20. - №3 (77). - прил. 1, июль — сентябрь 2009 г.

7. Заридзе Д.Г., Некрасова Л.И., Басиева Т.Х. Факторы повышенного риска возникновения рака мочевого пузыря // Вопросы онкологии. - 1992. — Т. 38.-№7/9.-С. 1066-1073.

8. Заридзе Д.Г. В кн.: Канцерогенез (под ред. Заридзе Д.Г.). Медицина, Москва. - 2004. - С. 29-85.

9. Заридзе Д.Г. Профилактика рака // М., «ИМА-ПРЕСС». - 2009. - 224 с.

10. Киселёв Ф.Л. Вирус-ассоциированные опухоли человека: рак шейки матки и вирусы папиллом (обзор) // Биохимия. - 2000. — Т. 65. - №1. — С. 79-91.

11. Короленкова Л.И., Ермилова В.Д. Зона трансформации шейки матки как объект канцерогенного действия вирусов папилломы человека при

возникновении цервикальных интраэпителиальных неоплазий и инвазивного рака // Архив патологии. - 2011. - Т. 73. - №6. - С. 33-37.

12. Мазуренко Н.Н. Роль вирусов папиллом в канцерогенезе шейки матки // Современная онкология. - 2003. - Т.5. - №1. - С. 7-10.

13. Матвеев Б.П., Фигурин К.М., Романов В.А., и др. Наш опыт лечения больных поверхностным раком мочевого пузыря // Урология и нефрология. -1995.-Т.5- С. 35-38.

14. Матвеев Б.П. Статистика, эпидемио-логия и генетическая детерминация ракамочевого пузыря. В кн.: Клиническая онкоурология. Под ред. Б.П.Матвеева //М.:Вердана. - 2003.- С. 197-206.

15. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). НПФ Литех, Москва. - 1997. -16 стр.

16. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2009 г. Под ред. М.И. Давыдова, Е.М. Аксель. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2011. - Т. 22. - №3. приложение1.- 170 с.

17. Фигурин К.М. Внутрипузырная БЦЖ-терапия при мышечно-неинвазивном раке мочевого пузыря // Онкоурология. — 2012. — Т. 1 — С. 14-22.

18. Франк Г.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Иммуногистохимическая характеристика и степень дифференцировки рака мочевого пузыря // Архив патологии. - 2002. - Т. 64. - №6. - С. 16-18.

19. Adami J., Gabel Н., Lindelof В. et al. Cancer risk following organ transplantation: a nationwide cohort study in Sweden // Br J Cancer. - 2003. - V. 89.-P. 1221-7.

20. Alazawi W., Pett M., Arch В., et al. Changes in cervical keratinocyte gene expression associated with integration of human papillomavirus 16// Cancer Res. -2002. - V. 62. - N23. - P. 6959-6965.

21. Alexander RE, Hu Y, Kum JB, et al. pi6 expression is not associated with human papillomavirus in urinary bladder squamous cell carcinoma // Mod Pathol. -2012. - V. 25. - N11. - P. 1526-1533.

22. Arroyo M, Bagchi S, Raychaudhuri P. Association of human papillomavirus type 16 E7 protein with the S-phase-specific E2F-cyclin A complex // Mol Cell Biol. - 1993. - V. 13. - P. 6537-6546.

23. Astori G, Arzese A, Pipan C, et al. Characterization of a putative new HPV genomic sequence from a cervical lesion using LI consensus primers and restriction fragment length polymorphism // Virus Res. - 1997. - V. 50. - N1. - P. 57-63.

24. Aveyard J.S., Knowles M.A. Measurement of relative copy number of CDKN2A/ARF and CDKN2B in bladder cancer by real-time quantitative PCR and multiplex ligation-dependent probe amplification // J. Mol. Diagn. - 2004. - Vol. 6. -N4.-P. 356-364.

25. Badawi H., Ahmed H., Ismail A. et al. Role of human papillomavirus types 16, 18 and 52 in recurrent cystitis and urinary bladder cancer among Egyptian patients // Medscape J Med. - 2008. - V. 10. - P. 232.

26. Bailar J.C. The incidence of independent tumors among uterine cancer patients // Cancer. - 1963. - V. 16. - P. 842-53.

27. Barghi M.R., Hajimohammadmehdiarbab A., Moghaddam S.M., et al. Correlation between human papillomavirus infection and bladder transitional cell carcinoma // BMC Infect Dis. - 2005. - V. 5. - P. 102.

28. Begum S., Gillison M.L., Nicol T.L., et al. Detection of human papillomavirus-16 in fine-needle aspirates to determine tumor origin in patients with metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck // Clin. Cancer Res. - 2007. -V. 13.-N4.-P. 1186-1191.

29. Bernard HU, Burk RD, Chen Z, et al. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments // Virology. -2010.-V. 401.- Nl.-P. 70-9.

30. Bodily J., Laimins L. Persistence of human papillomavirus infection: keys to malignant progression // Trends Microbiol. - 2011. - V. 19. - N1. - P. 33-39.

31. Boshart M., Gissmann L., Ikenberg H., et al. A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer // Embo J. - 1983. - V. 3. - P. 1151-1157.

32. Boyer S.N., Wazer D.E., Band V. E7 protein of human papilloma virus-16 induces degradation of retinoblastoma protein through the ubiquitin-proteasome pathway // Cancer Res. - 1996. - V.56. - P. 4620-4624.

33. Broker T.R., Burk R.D., Chen Z., et al. Classification of papillomaviruses based on 189 types and proposal of taxonomic amendments // Virology. - 2010. - V. 401 - P. 70-79.

34. Burk R.D., Chen Z., Van Doorslaer K. Human papillomaviruses: genetic basis of carcinogenicity // Public Health Genomics. - 2009. - V.12. - P. 281-290.

35. Cai T, Mazzoli S, Meacci F, et al. Human papillomavirus and non-muscle invasive urothelial bladder cancer: potential relationship from a pilot study // Oncol Rep.-2011.-V. 25.- N2.-P. 485-489.

36. Campo M.S., Jarrett W.F., Barron R. et al. Association of bovine papillomavirus type 2 and braken fern with bladder cancer in cattle // Cancer Res. -1992. - V. 52. - P. 6898-6904.

37. Campo M.S. Animal models of papillomavirus pathogenesis // Virus Res. -2002.-V. 89.-P. 249-261.

38. Cheng S., Hsiao L., Volgareva G., et al. Detection of HPV E6 and E7 oncoproteins in bladder cancers // 25-th International Papillomavirus Conference. Malmo. Sweden. - May 2009. - Abstract book. - P-14.09.

39. Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease // Biochemistry. - 1979. - V. 18. - N24. - P. 5294-5299.

40. Corry J, Rischin D. Induction chemotherapy in head and neck cancer: closer to an answer? // Lancet Oncol. - 2011. - V. 12. - N2. - P. 113-114.

41. D'Abramo C., Archambault J. Small molecule inhibitors of human papillomavirus protein-protein interactions // The Open Virology Journal. — 2011. — V. 5. - P.80-95.

42. Dallenbach-Hellweg G., Trunk M.J., von Knebel Doeberitz M. // Arkhiv Patologii (the Russian Journal of Pathology). - 2004. - V.66. - N5. - P. 35-39.

43. Davies R, Hicks R, Crook T, et al. Human papillomavirus type 16 E7 associates with a histone HI kinase and with pi07 through sequences necessary for transformation // J Virol. - 1993. - V. 67. - P. 2521-2528.

44. De Gaetani C., Ferrari G., Righi E. et al. Detection of human papillomavirus DNA in urinary bladder carcinoma by in situ hybridization // J Clin Pathol. - 1999. -V. 52. - P. 103-6.

45. Delia Torre G, Donghi R, de Campos Lima PO, et al. Human papillomavirus genomes in male urethral cells // Am J Pathol. - 1992. - V. 141. - N5. - P.1181-1186.

46. Del Mistro A., Koss L.G., Braunstein J. et al. Condyloma acuminata of the urinary bladder. Natural history, viral typing, and DNA content // Am J Surg Path. -1988.-V. 12.-P. 205-12.

47. De Villiers E-M., Fauquet C., Broker T.R., et al. Classification of papillomaviruses. Minireview // Virology. -2004.- V. 324. - P. 17-27.

48. De Villiers E.M., Sandstrom R.E., zur Hausen H., et al. Presence of papillomavirus sequences in condylomatous lesions of the mamillae and in invasive carcinoma of the breast // Breast Cancer Res. - 2005. - V. 7. - N1. - P. 1-11.

49. Dinney C.P.N., McConcey D.J., Millikan R.E, et al. Focus on bladder cancer // Cancer Cell. - 2004. - V.6. - P. 111-116.

50. Duensing S, Lee LY, Duensing A, et al. The human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncoproteins cooperate to induce mitotic defects and genomic instability by uncoupling centrosome duplication from the cell division cycle // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. -V. 97.-N18.-P. 10002-7.

51. Durst M., Gissmann L., Ikenberg H., et al. A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from different geographic regions // Proc Natl Acad Sci USA. - 1983. - V. 80. - P. 3812-5.

52. Dyson N, Howley PM, Miinger K, et al. The human papilloma virus-16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product // Science. — 1989. — V. 243.-N4893.-P. 934-7.

53. Dyson N, Guida P, Miinger K, et al. Homologous sequences in adenovirus El A and human papillomavirus E7 proteins mediate interaction with the same set of cellular proteins // J Virol. - 1992. - V. 66. - N12. - P. 6893-902.

54. Fiedler M., Muller-Holzner E., Viertler H.-P. Widschwendter A, et al. High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies // FASEB J. - 2004. - V. 18. - N10. - P. 1120-1122.

55. Fiedler M., Ressler S., Campo-Fernandez B, et al. Expression of the high-risk human papillomavirus type 18 and 45 E7 oncoproteins in cervical carcinoma biopsies // J Gen Virol. - 2005. - V.86. - P. 3235-3241.

56. Foresta C., Garolla A., Zuccarello D., et al. Human papillomavirus found in sperm head of young adult males affects the progressive motility // Fertil Steril. -2010.-V. 93.-N3.-P. 802-806.

57. Foresta C., Patassini C., Bertoldo A., et al. Mechanism of human papillomavirus binding to human spermatozoa and fertilizing ability of infected spermatozoa // PloS One. - 2011. - V.6. - N3.

58. Gallucci M., Vico E., Merola R. et al. Adverse genetic prognostic profiles define a poor outcome for cystectomy in bladder cancer // Exp. Mol. Pathol. - 2007. -Vol. 83.-P. 385-391.

59. Gillison M.L., Shah K.V. Role of mucosal human papillomavirus in nongenital cancers // Journal of the National Cancer Institute Monographs. - 2003. - N31.- P. 57-65.

60. Giovannelli L., Migliore M.C., Capra G., et al. Penile, urethral and seminal sampling for diagnosis of human papillomavirus infection in men // J. Clin. Microbiol. - 2007. - V.45. - N1. - P.248-251.

61. Giuliani L., Jaxmar T., Casadio C., et al. Detection of oncogenic viruses SV40, BKV, JCV, HCMV, HPV and p53 codon 72 polymorphism in lung carcinoma // Lung Cancer. - 2007. - V. 57. - N3. - P. 273-281.

62. Gould VE, Schmitt M, Vinokurova S, et al. Human papillomavirus and pi6 expression in inverted papillomas of the urinary bladder // Cancer Lett. - 2010. - V. 292.-N2.-P. 171-175.

63. Helal Tel A., Fadel M.T., El-Sayed N.K. Human papilloma virus and p53 expression in bladder cancer in Egypt: correlation to schistosomiasis and clinicopathologic factors // Pathol Oncol Res. - 2006. - V. 12. - N3. - P. 173-8.

64. Helt A.M.,Galloway D.A. Mechanisms by which DNA tumor virus oncoproteins target the Rb family of pocket proteins // Carsinogenesis. - 2003. - V. 24.-P. 159-169

65. Hoffmann M, A S Ihloff, T Gorogh, et al. pl6INK4a overexpression predicts translational active human papillomavirus infection in tonsillar cancer // Int J Cancer. - 2010. - V. 127. - N7. - P. 1595-602.

66. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. -Vol. 64. Human Papillomaviruses. - Lyon. - 1995.

67. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. -Vol. 90. Human Papillomaviruses. - Lyon. - 2007.

68. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. -Vol.100. A review of human carcinogens. Part B. Biological agents. - Lyon. - 2011.

69. Janzen V, Forkert R, Fleming HE, et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor pl6INK4a // Nature. - 2006. - V. 443. - N7110. -P. 421-6.

70. Joshi A., Preslan, E. Risk factors for bladder cancer: challenges of conducting a literature search using PubMed // Perspectives in Health Information Management. - 2011.-P. 1-19.

71. Kaneko S., Nishioka J., Tanaka M., et al. Transcriptional regulation of the CDK inhibitor pl6INK4a gene by a novel pRb-associated repressor, RBAR1 // Biochem Mol Biol Int. - 1999. - V. 47. - P.205- 215.

72. Kawaguchi S, Shigehara K, Sasagawa T, et al. Liquid-based urine cytology as a tool for detection of human papillomavirus, Mycoplasma spp., and Ureaplasma spp. in men // J Clin Microbiol. - 2012. - V.50. - N2. - P. 401-406.

73. Khleif S.N., DeGregori J., Yee C., et al. Inhibition of cyclin D-CDK4/CDK6 activity is associated with an E2F-mediated induction of cyclin kinase inhibitor activity // Proc Natl Acad Sci USA. - 1996. - V. 93. - P. 4350-4354.

74. Kim S.H., Koo B.S., Kang S., et al. HPV integration begins in the tonsillar crypt and leads to the alteration of pi6, EGFR and c-myc during tumor formation // Int. J. Cancer. - 2007. - V. 120. - N.7. - P. 1418-1425.

75. Kim T.W., Choi S.Y., Ko Y.H., et al. The prognostic role of pi 6 expression in tonsil cancer treated by either surgery or radiation // Clin. Exp. Otorhinolaryngol. -2012.- V.5. — N4.- P. 207-212.

76. Kitamura T., Yogo Y., Ueki T. et al. Presence of human papillomavirus type 16 genome in bladder carcinoma in situ of a patient with mild immunodeficiency // Cancer Res. - 1988. - V. 48. - P. 7207-11.

77. Klaes R, Woerner SM, Ridder R, et al. Detection of high-risk cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer by amplification of transcripts derived from integrated papillomavirus oncogens // Cancer Res. - 1999. - V. 59. - N24. -P. 6132-6136.

78. Klaes R., Friedrich T., Spitkovsky D., et al. Overexpression of pl6(INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri // Int J Cancer. - 2001. - V. 92. - P. 276-284.

79. Klaes R., Benner A., Friedrich T., et al. pl6INK4a immunohistochemistry improves interobserver agreement in the diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia // Am J Surg Pathol. - 2002. - V. 26. - P.1389-1399.

80. Klingelhutz AJ, Foster SA, McDougall JK. //Telomerase activation by the E6 gene product of human papillomavirus type 16 // Nature. - 1996. — V. 380. - P. 79-82.

81. Kong CS, Narasimhan B, Cao H, et al. The relationship between human papillomavirus status and other molecular prognostic markers in head and neck squamous cell carcinomas // Int J Radiat Oncol Biol Phys. - 2009. - V. 74. - N2. -P. 553-61.

82. Kresowik TP, Griffith TS. Bacillus Calmette-Guerin immunotherapy for urothelial carcinoma of the bladder // Immunotherapy. - 2009. - V. 2. - P. 281-8.

83. Krishnamurthy J, Ramsey MR, Ligon KL, et al. pl6INK4a induces an age-dependent decline in islet regenerative potential // Nature. - 2006. - V. 443. -N7110.-P. 453-7.

84. Kuo KT, Hsiao CH, Lin CH, et al. The biomarkers of human papillomavirus infection in tonsillar squamous cell carcinoma-molecular basis and predicting favorable outcome // Mod Pathol. - 2008. - V. 21. - N4. - P. 376-86.

85. Lace MJ, Anson JR, Klussmann JP, et al. Human papillomavirus type 16 (HPV-16) genomes integrated in head and neck cancers and in HPV-16-immortalized human keratinocyte clones express chimeric virus-cell mRNAs similar to those found in cervical cancers//J Virol. - 2011.-V. 85.-N4.-P. 1645-54.

86. Lambert A.P., Anschau F., Schmitt V.M. pl6INK4A expression in cervical premalignant and malignant lesions // Exp Mol Pathol. - 2006. - V. 80. - P. 192196.

87. LaRue H., Simoneau M., Fradet Y. Human papillomavirus in transitional cell carcinoma of the urinary bladder // Clin. Cancer Research. - 1995. - V.l. - P. 435-440.

88. Li Y., Nichols M.A., Shay J.W., et al. Transcriptional repression of the D-type cyclin-dependent kinase inhibitor pi6 by the retinoblastoma susceptibility gene product pRb // Cancer Res. - 1994. - V. 54. - P. 6078-6082.

89. Litlekalsoy J., Vatne V., Hostmark J.G., et al. Immunohistochemical markers in urinary bladder carcinomas from paraffin-embedded archival tissue after storage for 5-70 years//Br J Urol Int. - 2007.- V.99. - P. 1013-1119.

90. Lopes-Beltran A., Escudero A.L., Vicioso L. et al. Human papillomavirus DNA as a factor determining the survival of bladder cancer patients // Br J Cancer. -1996.-V. 73.-P. 124-7.

91. Lorch JH, Goloubeva O, Haddad RI, et al.; TAX 324 Study Group. Induction chemotherapy with cisplatin and fluorouracil alone or in combination with docetaxel in locally advanced squamous-cell cancer of the head and neck: long-term results of the TAX 324 randomised phase 3 trial // Lancet Oncol. - 2011. - V. 12. -N2.- P. 153-159.

92. Maloney K.E., Wiener J.S., Walther P.J. Oncogenic human papillomaviruses are rarely associated with squamous cell carcinoma of the bladder: evaluation by differential polymerase chain reaction // J Urol. - 1994. - V. 151. -P. 360-4.

93. Milde-Langosch K., Riethdorf S., Kraus-Poppinghaus A. et al. Expression of cyclin-dependent kinase inhibitors pl6MTSl, p21WAFl, and p27KIPl in HPV-positive and HPV-negative cervical adenocarcinomas // Virchows Arch. - 2001. -V. 439.-P. 55-61.

94. Molofsky AV, Slutsky SG, Joseph NM, et al. Increasing pl6INK4a expression decreases forebrain progenitors and neurogenesis during ageing // Nature. - 2006.- V. 443.-N7110.- P. 448-52.

95. Moonen P.M., Bakkers J.M., Kiemeney L.A. et al. Human papilloma virus DNA and p53 mutation analysis on bladder washes in relation to clinical outcome of bladder cancer // Eur Urol. - 2007. - V. 52. - N2. - P. 468-9.

96. Morrison C., Catania F., Wakely P. Jr., et al. Highly differentiated keratinizing squamous cell cancer of the cervix. A rare, locally aggressive tumor not associated with human papillomavirus or squamous intraepithelial lesions // Am J Surg Path. - 2001.-V.25.-P. 1310-1315.

97. Murphy N., Ring M., Killalea A.G. et al.pl6INK4A as a marker for cervical dyskaryosis: CIN and cGIN in cervical biopsies and ThinPrep smears // J Clin Pathol. - 2003. - V. 56. - P. 56-63.

98. Murphy N., Ring M., Heffron C.C. et al. pl6INK4A, CDC6, and MCM5: predictive biomarkers in cervical preinvasive neoplasia and cervical cancer // J Clin Pathol. - 2005. - V. 58. - P. 525-534.

99. Qiao X., Bhuiya T.A., Spitzer M. Differentiating high-grade cervical intraepithelial lesion from atrophy in postmenopausal women using Ki-67, cyclin E, and pi6 immunohistochemical analysis // J Lower Genital Tract Disease. - 2005. -V.9. - P. 100-107.

100. Negri G., Vittadello F., Romano F. et al. pl6INK4a expression and progression risk of low-grade intraepithelial neoplasia of the cervix uteri // Virchovs Arch. - 2004. - V. 445. - P. 616-620.

101. Newell G.R., Rawlings W., Krementz E.T., et al. Multiple primary neoplasms in blacks compared to whites. III. Initial cancers at the female breast and uterus // J Natl Cancer Inst. - 1974. - V. 53. - P. 369-73.

102. Newell G.R., Krementz E.T., Roberts J.D. Exess occurrence of cancer of the oral cavity, lung, and bladder following cancer of the cervix // Cancer. - 1975. -V. 36.-P. 2155-8.

103. Nieh S., Chen S.-F., Chu T.-Y. et al. Is pl6(INK4A) expression more useful than human papillomavirus test to determine the outcome of atypical squamous cells of undetermined significance-categorized Pap smear? A comparative analysis using abnormal cervical smears with follow-up biopsies // Gynecol Oncol. -2005.-V. 97.-P. 35-40.

104. Nguyen T.T., Nguyen CT, Gonzales FA, et al. Analysis of cyclin-dependent kinase inhibitor expression and methylation pattern in human prostate cancers // Prostate 2000. - V. 43. - P. 233-242.

105. Nguyen CL, Mtinger K. Human papillomavirus E7 protein deregulates mitosis via an association with nuclear mitotic apparatus protein 1 // J Virol. - 2009. - V. 83.-N4.- P. 1700-7.

106. Pannone G., Rodolico V., Santoro A., et al. Evaluation of a combined triple method to detect causative HPV in oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas: pl6 immunohistochemistry, consensus PCR HPV-DNA, and in situ hybridization // Infect. Agent Cancer. - 2012. - V. 7. - N4. - P. 1-14.

107. Parkin D.M., Whelean S.L., Ferlai J. IARC Press, Lyon. - 2003. - N155.

108. Parkin D.M., Bray F. Chapter 2. The burden of HPV-related cancers // Vaccine. - 2006. - V. 24 (suppl.3). - P. 11-25.

109. Resnick RM, Cornelissen MT, Wright DK, et al. Detection and typing of human papillomavirus in archival cervical cancer specimens by DNA amplification with consensus primers // J Natl Cancer Inst. - 1990. - V. 82. -N18. - P. 1477-84.

110. Reznikoff C.A., Belair C., Savelieva E. et al. Long-term genome stability and minimal genotypic and phenotypic alterations in HPV16 E7-, but not E6-, immortalized human uroepithelial cells // Gen Dev. - 1994. - V. 8. - P. 2227-40.

111. Romagosa C, Simonetti S, Lopez-Vicente L, et al. pl6(Ink4a) overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors // Oncogene. - 2011. - V. 30. - N18. - P. 2087-97.

112. Ruas M.,Peters G. The pl6INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives // Biochim Biophys Acta. - 1998. - V. 1378. - P. 115-177.

113. Querci della Rovere G., Oliver R.T., McCance D.J., et al. Development of bladder tumor containing HPV type 11 DNA after renal transplantation // Br J Urol. -1988.- V. 62.-P. 36-8.

114. Sano T., Oyama T., Kashiwabara K., et al. Immunohistochemical ovrexpression of pi 6 protein associated with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia // Pathol Int. - 1998. - V. 48. - P. 580-685.

115. Sano T., Oyama T., Kashiwabara K., et al. Expression status of pl6 protein is associated with human papillomavirus oncogenic potential in cervical and genital lesions // Am J Pathol. - 1998. - V. 153. - P. 1741- 1748.

116. Santin A.D., Zhan F., Bignotti E. et al. Gene expression profiles of primary HPV 16- and HPV18-infected early stage cervical cancers and normal cervical epithelium: identification of novel candidate molecular markers for cervical cancer diagnosis and therapy // Virology. - 2005. - V. 331. - P. 269-291.

117. Sarkola M.E., Grenman S.E., Rintala M.A., et al. Human papillomavirus in the placenta and umbilical cord blood // Acta Obstet Gynecol Scand. - 2008. -V.87. - P. 1181-1188.

118. Scheffner M, Huibregtse JM, Vierstra RD, et al. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53 // Cell. - 1993.-V. 75.-P. 495-505.

119. Schmitz M., Driesch C., Jansen L., et al. Non-random integration of the HPV genome in cervical cancer // PloS One. - 2012. - V. 7. - N6.

120. Serrano M., Hannon G.J., Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4 // Nature. - 1993. - V. 366. - P. 704-707.

121. Shigehara K, Sasagawa T, Kawaguchi S, et al. Etiologic role of human papillomavirus infection in bladder carcinoma // Cancer. - 2011. - V. 117. - N10. — P. 2067-76.

122. Smith J.S., Lindsay L., Hoots B., et al. Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical lesions: a metaanalysis update // Int. J. Cancer. - 2007. - V.121. -N3. - P. 621-632.

123. Snijders P.J., van den Brule AJ, Schrijnemakers HF, et al. The use of general primers in the polymerase chain reaction permits the detection of a broad spectrum of human papillomavirus genotypes // J. Gen. Virol. - 1990. - V. 71. - P. 173-181.

124. The Current Status of Development of Prophylactic Vaccines Against Human Papillomavirus Infection. - 1999.- WHO Press. - P. 1-18.

125. Thomas M, Banks L. Inhibition of Bak-induced apoptosis by HPV-18 E6 // Oncogene. - 1998. - V. 10. - P. 2943-54.

126. Thomas M, Banks L. Human papillomavirus (HPV) E6 interactions with Bak are conserved amongst E6 proteins from high and low risk HPV types // J Gen Virol. - 1999. - V. 80. - P. 1513-7.

127. Tringer B., Gup C.J., Singh M., et al. Evaluation of pl6INK4a and pRb expression in cervical squamous and glandular neoplasia // Hum Pathol. - 2004. -V.35.-P. 689-696.

128. Trofimova O., Kuevda D., Shipulina O., et al. Development of HPV genotyping and expression methods and validation on group of urinary bladder cancer // 25-th International Papillomavirus Conference. Malmo. Sweden. - May 2009. - Abstract book. - P-29.58.

129. Trunk M.J., Dallenbach-Hellweg G., Ridder R. et al. Morphologic characteristics of pl6INK4a-positive cells in cervical cytology samples // Acta Cytol. - 2004. - V. 48. - P.771-782.

130. Volgareva G, Zavalishina L, Andreeva Y, et al. Protein pl6 as a marker of dysplastic and neoplastic alterations in cervical epithelial cells // BMC Cancer. -2004.-V. 4.-P. 58.

131. Volgareva G., Zavalishina L Golovina D, et al. The protein pl6INK4a as a reliable indicator of the HPV-induced carcinogenesis. In: New Research on Cervical Cancer (Rolland GZ, ed.) // Nova Science Publishers, N.Y. - 2006. - P. 129-147.

132. Wang J.-L., Zheng B.-Y., Li X.-D. et al. Predictive significance of the alterations of pl6INK4A, pl4ARF, p53, and proliferating cell nuclear antigen expression in the progression of cervical cancer // Clin Cancer Res. - 2004. - V. 10. -P. 2407-2414.

133. Werness BA, Levine AJ, Howley PM. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53 // Science. - 1990. - V. 248. -N4951.-P. 76-9.

134. White E.A., Sowa M.E., Tan M.J., et al. Systematic identification of interactions between host cell proteins and E7 oncoproteins from diverse human papillomaviruses // Proc. Natl Acad Sei USA. - 2012. - V. 109. - N5. - P. 260-267.

135. Yang H., Yang K., Khafagi A. et al. Sensitive detection of human papillomavirus in cervical, head/neck, and schistosomiasis-associated bladder malignancies // Proc Natl Acad Sei USA. - 2005. - V. 102. - N21. - P. 7683-8.

136. Zandberg DP, Bhargava R, Badin S, et al. The role of human papillomavirus in nongenital cancers // CA Cancer J Clin. -2013. -V. 63. -Nl. -P. 57-81.

137. zur Hausen H. Condylomata acuminata and human genital cancer // Cancer Res. - 1976. - V. 36. - P.794.

138. zur Hauzen H. Papillomaviruses causing cancer: evasiom from host-cell control in early events in carcinogenesis // J Natl Cancer Inst. - 2000. - V. 92. - P. 690-8.

139. zur Hausen H. Perspectives of contemporary papillomavirus research // Vaccine. - 2006.-V. 24.

140. zur Hauzen H. Papillomaviruses - to vaccination and beyond. Biochemistry 2008;73(5):498-505.

141. zur Hausen H. The search for infectious causes of human cancers: where and why // Virology. - 2009. - V. 392. -Nl. - P. 1-10.

142. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancer - a brief historical accaunt. Minireview // Virology. - 2009. - V. 384. - P. 260-265.

143. zur Hauzen. HPV vaccines: what remains to be done? Expert Rev. // Vaccines. - 2011.- V. 10.-Nil. - P. 1505-1507.

Больные РМП и полученные от них во время ТУР образцы опухоли

Больной Образец РМП: результат гистологического анализа

№№ п/п возраст пол первичный (п) РМП или рецидив (р) степень анаплазии инвазия в мышечный слой

1 76 м Р III +1

2 68 м п II _2

3 50 м п II X*

4 58 м п II -

5 70 ж п II -

6 53 м п I -

7 56 м п II -

8 61 м р III -

9 68 м р III +

10 58 м р III X

11 61 м р III +

12 53 м п I X

13 46 ж п II -

14 80 м п III -

15 78 м п II -

16 71 ж п I -

17 66 м п II X

18 72 м р II +

19 65 м п III +

20 74 м п III +

21 68 м п I -

22 61 м п II X

23 60 ж п I X

24 57 ж п II -

25 49 м п III +

26 69 м п III +

27 65 ж п II -

28 54 м п III +

29 55 м п II -

30 76 м п III +

31 59 м п II X

32 59 м п III +

33 66 м п III +

34 59 м п III +

35 67 м р III X

36 76 м п II +

37 49 ж п III X

38 47 м р III -

39 52 м п II -

40 75 м п II -

41 62 м п II -

42 53 м п II -

43 56 м п II +

44 77 ж р II -

45 44 м р II X

46 66 ж п II -

47 66 ж п II -

48 60 м р I -

49 42 м п II -

50 52 м п III X

51 65 ж п III -

52 49 м п III +

53 58 м п I -

54 54 м п III X

55 49 ж п III X

56 47 м р III -

57 64 м п II +

58 64 м п II +

59 70 м п III +

60 49 м р II X

60Н условно-нормальная ткань

61 59 м Р III +

61Н условно-нормальная ткань

62 79 м п II -

63 47 м п II +

64 68 м Р II -

65 66 м Р II -

66 59 м п III X

67 72 м р III +

68 59 м п II -

69 66 м р I -

70 73 м р I X

70Н 73 м условно-нормальная ткань

71 64 м п II X

71Н 64 м условно-нормальная ткань

72 49 м р III +

72Н 49 м условно-нормальная ткань

73 59 м п II X

74 62 м п II -

75 67 м п II X

76 64 ж п III +

77 84 ж п II +

78 67 м п II -

79 71 ж п III -

80 35 м п II -

81 70 м п III +

82 58 м п I X

83 52 м р I X

84 55 м п III +

85 71 м р III -

86 66 ж р II X

87 68 м п III +

88 62 м р II -

89 72 ж п II X

90 62 м п II -

90Н 62 м условно-нормальная ткань

91 64 м Р III X

92 65 м п II X

92Н 65 м условно-нормальная ткань

93 65 м Р III X

93 Н 65 м условно-нормальная ткань

94 44 м Р II X

94Н 44 м условно-нормальная ткань

95 59 м п III X

96 61 м п I X

96Н 61 м условно-нормальная ткань

97 66 м Р III X

98 67 м Р III X

99 55 м п III X

100 63 м п II -

101 42 м р II -

1 - мышечно-инвазивный РМП

- поверхностный РМП (нет инвазии в мышечный слой) 3 - образцы РМП, для которых наличие инвазии определить не удалось из-за отсутствия мышечных клеток на препарате.

124

Приложение 2 Использованные реактивы

Буфер ТАЕ, 50х 2 М трис-ацетат 0,1 МЭДТА

Буфер 8ТЕ, 10х 1 MNaCl 100 мМ трис-HCl pH 8,0 10 мМ ЭДТА pH 8,0

Буфер для ПЦР, 10х 0,16 М сульфат амония 0,6 М трис-HCl pH 8,0 1% Tween 20 или 0,1% Triton X - 100

Буфер для обратной транскрипции, 5х 250 мМ трис-HCl pH 8,3 375 мМ KCl 15 MMMgCl2

ГТЦ-буфер 4,2 М гуанидинизотиоцианат натрия ("Roth") 0,02 М ацетат натрия 0,05 М трис-HCl pH 7,4 0,7% v/v лаурилсаркозид 2% v/v меркаптоэтанол

Буфер для блот-гибридизации по Саузерну, 1х 7% (w/v) SDS (Sigma) 0,5 М NaH2P04 (pH 7,2) (Serva) 1 ОмМ ЭДТА

Буфер ББРЕ, 20х 3,6 NaCl 0,2 М Na2P04 * 7Н20 0,02 М ЭДТА

Буфер рестрикционный в, 10х 10 тМТпв НС1 (рН 7,6 при 25°С) ЮшМ MgCl2 1шМ БТТ 50шМ ИаС1

Буфер рестрикционный О, 10х 10 тМГпв НС1 (рН 7,6 при 25°С) ЮтМ М§С12 1тМОТТ 100тМЫаС1

Буфер рестрикционный В, 10х 10 тМТпв НС1 (рН 7,6 при 25°С) 1 ОшМ М§С12 1тМ БТТ

Результаты исследований

№ днквпч тип впч мРНК Е6/Е7 Белок Е7 Р16шк4а*

ы Е7

Му09/11 6Ь, 11,16,18 Му09/11 31,33,3511 вР5/6

1 - - - Н. 0. - Н. 0. Н. 0. Н. 0.

2 + + + Н. 0. 16 - Н. 0. +

3 + - + + 16 - Н. 0. +

4 - - - Н. 0. - Н. 0. Н. о. н. о.

5 - - - Н. 0. - Н. 0. н. о. Н. о.

6 + - + + 16 - Н. о. +

7 + - + + 16 - - +

8 + - + н. о. 16 - Н. 0. +

9 - - - Н. 0. - - - +

10 - - н. 0. н. о. - Н. 0. Н. о. Н. 0.

11 - - - Н. 0. - Н. о. Н. 0. Н. о.

12 - - - Н. о. - - - Н. о.

13 + - н. 0. + 16 - Н. 0. +

14 - - - Н. 0. - Н. о. Н. 0. Н. 0.

15 + - + + 16 - Н. 0. +

16 - - - - - Н. о. Н. 0. Н. 0.

17 + + н. 0. + 16 - Н. 0. +

18 - - н. 0. Н. 0. - н. о. Н. 0. Н. 0.

19 - - - Н. о. - Н. о. Н. о. Н. 0.

20 + + + + 16 + + +

21 - - н. о. Н. о. - Н. о. Н. о. Н. 0.

22 + + н. 0. + 16 - Н. о. +

23 - - н. о. Н. 0. - Н. 0. Н. о. Н. о.

24 + + + + 16 + + +

25 - - н. 0. Н. 0. - Н. 0. Н. о.

26 - - - н. о. - н. о. Н. о.

27 + + н. о. + 16 + + +

28 -ь + н. о. + 16 - - +

29 + - Н. 0. + 16 + - +

30 - - Н. 0. Н. о. - Н. 0. Н. о. Н. о.

31 - - Н. 0. Н. 0. - н. о. Н. 0. н. о.

32 + + Н. о. + 16 н. о. - +

33 - - Н. 0. Н. 0. - Н. 0. Н. 0. Н. о.

34 + + Н. 0. + 16 - Н. о. +

35 - - н. о. - - н. о. Н. 0. н. 0.

36 + + + + 16 - + +

37 - - н. 0. н. 0. - н. о. Н. 0. Н. 0.

38 - - н. 0. н. 0. - н. 0. Н. 0. Н. 0.

39 + + + + 16 - - +

40 + - + + 16 + - +

41 + + н. 0. + 16 - - +

42 - - н. 0. н. о. - н. о. Н. 0. Н. 0.

43 - - н. о. н. о. - н. о. н. о. Н. о.

44 - - - н. о. - - - Н. о.

45 - - н. 0. н. о. - н. о. Н. 0. Н. 0.

46 + + н. о. + 16 + Н. 0. Н. 0.

47 + + н. о. + 16 - - +

48 - - - - - н. о. Н. о. Н. 0.

49 - - - н. о. - н. о. Н. о. Н. о.

50 - - - н. 0. - н. 0. н. о. Н. 0.

51 + + н. о. + 16 - + +

52 + + н. 0. н. о. 16 - н. о. +

53 + + н. 0. + 16 + + +

54 - - н. 0. н. 0. - н. 0. н. 0. Н. 0.

55 - - - н. 0. - н. 0. - Н. о.

56 - - - н. 0. - н. о. н. 0. Н. 0.

57 + - н. 0. + 16 + + +

58 - - Н. 0. - - н. о. н. о. н. о.

59 + - + + 16 + - +

60 - - н. 0. - - н. о. н. о. +

61 - - - н. о. - н. о. н. о. +

62 + + н. 0. + 16 + - +

63 - - - - - н. о. н. о. Н. 0.

64 - - Н. 0. н. о. - н. о. н. о. Н. 0.

65 + - н. 0. + 16 - - +

66 - - н. о. н. о. - н. о. н. о. Н. о.

67 - - - - - н. о. н. 0. Н. 0.

68 + + н. 0. + 16 - н. о. +

69 - - н. 0. н. 0. - н. о. н. 0. Н. о.

70 - - - н. о. - н. 0. н. 0. +

71 - - Н. 0. - - н. о. н. о. +

72 + - + + 16 - + +

73 + + н. 0. + 16 - н. о. Н. 0.

74 + + н. о. + 16 - н. о. +

75 + + н. 0. н. 0. 16 - н. о. Н. о.