Экспериментальная модель фокальной ишемии головного мозга для изучения терапевтической эффективности клеточной терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.11, кандидат медицинских наук Таирова, Раиса Таировна

• Таирова, Раиса Таировна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Таирова, Раиса Таировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие вопросы разработки моделей острой фокальной ишемии го 14 ловного мозга у животных

1.2. Роль нейрогенеза в процессах восстановления функций головного 17 мозга

1.3. Клеточные технологии в лечении ишемических повреждений мозге

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Лабораторные животные

2.1.2.Стволовые клетки

2.2. Методы

2.2.1. Методики моделирования фокальной ишемии головного мозга

2.2.2. Методика культивирования и нагрузки парамагнетиком МСК

2.2.3. Методики введения стволовых клеток

2.2.4.Методики оценки неврологического дефицита

2.2.5. Технические характеристики томографа.

Методика получения и обработки МР-изображений

2.2.6. Методика иммуногистохимического анализа

2.2.7. Статистическая обработка данных

2.3. Протоколы эксперимента

ГЛАВА 3 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

3.1. Анализ летальности животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга

3.2. Динамика массы тела животных с разными моделями фокальной ишемии головного мозга>

3.3. Анализ функционального восстановления животных с разными мо делями фокальной головного ишемии мозга

3.4. Анализ локализации объема зоны ишемического поражения у животных с разными моделями ишемического инсульта

3.5. Сравнительный анализ вариантов реканализации СМА на эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга

3.6. Динамика объема ишемического поражения мозга крыс с эндоваску лярной моделью фокальной'ишемии по результатам проведения мультипараметрической МРТ

3.7. Результаты?измерения вычисленного коэффициента диффузии в* острейшем периоде фокальной ишемии головного мозга

3.8. Анализ динамики тканевого контраста и вычисления объема Т2—shine эффекта у животных эндоваскулярной моделью фокальной ишемии головного мозга

3.9. Результаты гистологического исследования головного мозга животных с разными моделями фокальной ишемии

3.10. Анализ характера и частоты возникновения послеоперационных осложнений у крыс с разными моделями фокальной ишемии головного мо га

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальная модель фокальной ишемии головного мозга для изучения терапевтической эффективности клеточной терапии»

Ишемический инсульт - одна из важнейших причин заболеваемости, инвалидизации и смертности населения во всем мире. Смертность от ишемического инсульта в России одна из. самых высоких [2,5]. В течение первого месяца показатель летальности при ишемическом инсульте составляет 28-35%. В течение последующих 5 лет 45-60% больных, выживших в остром периоде, умирают от повторных инсультов. До 60% больных после ишемического инсульта становятся тяжелыми инвалидами, 30% имеют стойкие резидуальные изменения и только 10% возвращаются к полноценной жизни. Вследствие этого резко ухудшается качество жизни не только больного, но и проживающих с, ним родных и близких. Кроме того, государство несет экономические и финансовые потери из-за сокращения национального валового продукта, недополученного вследствие убыли заболевших инсультом в трудоспособном возрасте, а также затрат на медико-социальную поддержку инвалидов [6].

Актуальность поиска препаратов, обладающих нейропротективным действием в, условиях ишемии головного мозга, а также регенераторно-репаративных технологий не вызывает сомнения.

Однако на сегодняшний день нейропротекторные препараты, испытанные в клинических исследованиях, оказались недостаточно эффективными [136]. Поэтому разработка новых подходов к терапии и профилактике инсульта является важной задачей медицины.

Многочисленные экспериментальные работы посвященные изучению возможностей клеточной терапии* в лечении цереброваскулярных заболеваний внушают большие надежды. В связи с этим, использование возможностей регенеративной медицины и, в частности, клеточной терапии как метода, стимулирующего структурно-функциональное восстановление ЦНС, является чрезвычайно актуальным, а дальнейшее исследование механизмов действия стволовых клеток приобретает особую научно-практическую значимость [20,53].

Цель исследования:

Провести сравнительный анализ двух моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс и оценить возможность их использования для изучения терапевтической эффективности мезенхимальных стволовых клеток с использованием магнитно-резонансной томографии и гистохимических показателей.

Задачи исследования:

1. Сопоставить клинические, МРТ и гистохимические показатели двух экспериментальных моделей острой фокальной ишемии головного мозга у крыс: модель электрокоагуляции средней мозговой артерии и модель эндоваскулярной окклюзии СМА с контролируемой длительностью реперфузии.

2. Оптимизировать протокол исследования терапевтической эффективности МСК на экспериментальных моделях фокальной ишемии головного мозга.

3. Оптимизировать МРТ исследование и способы анализа получаемых изображений для оценки тканевых изменений при острой фокальной ишемии головного мозга.

4. Оценить эффекты МСК при разных способах их введения на выраженность неврологических проявлений и на динамику объема очага церебрального ишемического поражения с помощью прижизненной МРТ-морфометрии.

Научная новизна

Усовершенствована эндоваскулярная модель фокальной ишемии головного мозга для ее использования при изучении патогенеза ишемического инсульта, проведения доклинических исследований новых методов репер-фузионной, нейропротективной и регенераторно-репаративной терапии.

Проведен мультипараметрический анализ двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга, впервые продемонстрированы характер и частота интра-/постоперационных осложнений. Отмечены положительные характеристики эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Изучен процесс формирования.зоны инфаркта головного мозга у крыс по данным динамического МРТ исследования с использованием различных режимов сканирования:

Впервые показано положительное влияние терапии MGK, выделенных из плаценты человека, на восстановление нарушенных неврологических функций и поведения животных, достоверное уменьшение зоны ишемического поражения головного мозга, по данным нейровизуализации, при экспериментальной ишемии головного мозга у крыс.

Впервые выявлена стимуляция эндогенного нейрогенеза под влиянием интацеребрального и системного введения МСК крысам с моделью фокальной ишемией головного мозга. Установлен факт дифференцировки МСК, выделенных из плаценты человека, в нейрональном направлении при экспериментальной ишемии головного мозга (визуализация скопления МСК экс-прессирующих человеческий нейрональный белок NeuN).

Проведена оценка эффективности методики мечения МСК магнитными флуоресцирующими микрочастицами для визуализации миграции данных клеток после их трансплантации животным. Установлено, что метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции стволовых клеток при проведении МРТ.

Показано, что использование МРТ режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить миграцию трансплантированных МСК меченных магнитными микросферами с флуоресцентной меткой, что подтверждено иммуногистохимическим анализом.

Научно-практическая* значимость: Разработаны практические рекомендации по усовершенствованию экспериментальной эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга.

Уточнены характер и динамика развития тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга при двух экспериментальных моделях острой фокальной ишемии мозга у крыс, что позволяет рекомендовать модель с эндоваскулярной окклюзией СМА для дальнейшего использования при изучении патогенеза и доклинической оценке терапевтической эффективности новых способов лечения ишемического инсульта.

Обоснована необходимость, при проведении МРТ исследования в острейшем периоде фокальной ишемии головного мозга у крыс, измерения, вычисленного коэффициента диффузии и его сопоставления с другими показателями, влияющими на спин-спиновую (Т2) релаксацию.

Выработаны методические рекомендации по культивированию и нагрузке парамагнетиком МСК выделенных из плаценты человека в условиях in vitro.

Отработан протокол исследования эффективности и безопасности клеточных продуктов при экспериментальном ишемическом инсульте у крыс. Структурами объем диссертации: диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, благодарности. Диссертационная, работа изложена на 172 страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц и проиллюстрирована 40 рисунками. Список литературы включает 21 источник отечественной и 127 источников зарубежной литературы.

Заключение диссертации по теме «Нервные болезни», Таирова, Раиса Таировна

ВЫВОДЫ

1. Сопоставление двух экспериментальных моделей фокальной ишемии головного мозга выявило существенные недостатки модели, требующей краниотомии с последующей электрокоагуляцией СМА: небольшой объем зоны ишемического поражения мозга, преимущественно корковой локализации, наличие воспаления и отека мягких тканей головы, развитие церебрита, а в дальнейшем - формирование абсцесса головного мозга с выраженным перифокальным отеком. Показатель суммарной летальности животных с моделью электрокоагуляции СМА к 14-м суткам после операции существенно превышал данный показатель в группе животных с эндоваску-лярной моделью ишемии мозга.

2. Применение эндоваскулярной модели фокальной ишемии головного мозга с контролируемой длительностью окклюзии 1 час позволило воспроизвести сопоставимую по локализации и объему зону ишемического поражения (область базальных узлов, гиппокамп, теменно-височная область) с низкой частотой послеоперационных осложнений.

3. Для контроля за динамикой тканевых изменений в зоне ишемического поражения головного мозга необходимо использование мультипара-метрического протокола МРТ исследования, включающего: Т2 ВИ, ДВИ, Т2* ВИ, Т1 ВИ. Использование MP-ангиографии в острейшем периоде эндоваскулярной модели фокальной ишемии мозга позволяет контролировать степень окклюзии и определять последующий характер реканализации СМА.

4. Степень невосстановления кровотока по СМА у крыс после удаления силиконового монофиламента с использованием экспериментальной эндоваскулярной модели инсульта коррелирует с 24-часовой летальностью животных (R=0,47; р<0.03), по данным МР-ангиографии.

5. Результаты оценки неврологического дефицита и тестирования поведенческих реакций крыс в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга указывают, что как внутривенное, так и внутримозговое введение МСК сопровождается повышением способности к адаптации и меньшему неврологическому дефициту, уровень выживаемости животных с введением МСК был выше по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию. Применение МСК в условиях экспериментальной фокальной ишемии мозга связано с более быстрым уменьшением объема зоны ишемического поражения по сравнению с животными, не получавшими клеточную терапию.

6. Метод нагрузки МСК магнитными микросферами диаметром 0,96 мкм с флуоресцентной меткой Dragon Green пригоден для прижизненного исследования миграции клеток при проведении МРТ. Использование MP режима Т2* ВИ на основе градиентного эха позволяет проследить трекинг трансплантированных МСК, что подтверждается иммуногистохимическим анализом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор работы выражает глубокую признательность и благодарность: научному руководителю, член. корр. РАМН, профессору кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, - Веронике Игоревне Скворцовой.

Автор особо признателен куратору работы, профессору кафедры фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РГМУ, д.м.н. -Леониду Васильевичу Губскому за постоянное внимание и неоценимую помощь на всех этапах работы над диссертацией.

Автор глубоко признателен Константину Никитичу Ярыгину, руководителю лаборатории клеточной биологии НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, за предоставление клеточного материала для проведения данной работы.

Особенно хочется поблагодарить профессора, д.м.н. медицинского факультета Университета' Хайдельберга, Jlomapa Шилленга (Lothar Schilling) и Наталью Евгеньевну Лапину за помощь в освоении методики моделирования экспериментальной фокальной ишемии мозга у крыс на основе эндоваскулярной микрохирургии.

Выражаю большую благодарность Юрию Андреевичу Пирогову, директору учебно-научного межфакультетского и междисциплинарного центра магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова, и его сотрудникам за предоставленную возможность проведения прижизненной морфометрии экспериментальным животным.

Автор признателен Оксане Викторовне Поваровой, старшему научI ному сотруднику кафедры фундаментальной медицины МГУ им. М. В. Ломоносова, за моделирование экспериментальной фокальной ишемии мозга при помощи электрокоагуляции средней мозговой артерии.

Практические рекомендации

Для прижизненной нейровизуализации (МРТ, режим Т2* ВИ) и постмортальной (флюорицентная микроскопия) оценки распределения и перемещения (хоуминга) трансплантированных МСК, рекомендовано осуществление нагрузки трансплантированных клеток магнитными микросферами ME02F с флуоресцентной меткой, диаметром 0,96 мкм.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Таирова, Раиса Таировна, 2011 год

1. Беленичев И.Ф:, Колесник Ю.М., Павлов С.В. и соав. Митохон-' дриальная дисфункция при церебральной патологии. Нейропротекция цереброкурином. Международный неврологический журнал 4(20) 2008. Оригинальные исследования.

2. Верещагин Н.В., Суслина З.А. Инсульт в зеркале медицины и общества. Вестник РАМН. -2003.№11. С.48-50.

3. Ганнушкина И.В. Патоморфологические механизмы нарушения мозгового кровообращения и новые направления в их профилактике илечении. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова.-1996.-№1.-С.14-18.

4. Е.И. Гусев, В.И. Скворцова Ишемия головного мозга 2001; 130192.

5. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Стаховская JI.B. Проблема инсульта в Российской Федерации: время активных современных действий // Журн. неврол. и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2007. -107(6). -С.4-10.

6. Скворцова В.И., Стаховская Л.В., Пряникова H.A. и др. Индивидуализированная вторичная профилактика ишемического инсульта. Методические рекомендации. М: Минздравсоцразвития РФ 2006; 15.

7. Каменский A.A., Савельева К.В. Оксид азота и поведение. 2002; 59-71.

8. Корочкин Л.И., Михайлов А.Т. Введение в нейрогенетику. М. Наука. 2000.312. С.

9. Мусина P.A., Егоров Е.Е., Стволовые клетки: свойства и перспективы использования в медицине. Мол. биология. 2004; 38(4): 536-577.I

10. Поварова О.В., Городецкая Е.И., Медведев О.С. Антиоксиданты! как нейропротекторы при ишемическом инсульте //Экспер. и клин.' фарм.2003. 66, ЖЗ-С. 69-73. '5

11. Силачев Д.Н. Диссертационная работа на соискание ученой степени к.б.н. Изучение новых нейропротектеров на модели фокальной ишемии мозга. Москва. 2009. С. 61-64.

12. Скворцов И.А. 2008г. Неврология развития. Москва. Издательство «Литтерра». С. 80.

13. Скворцова В.И., Губский Л.В., Таирова Р.Т., Поварова О.В., Чеглаков И.Б., Холоденко Р.В., Холоденко И.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н. // Клеточн. технол. в биол. и мед. 2008, № 1, 14-20.

14. Суздалыдева Ю.Г., Бурунова В.В., Пертракова Н.В., Вахрушев И.В., Ярыгин К.Н., Ярыгин В.Н. Клеточные технологии в биологии и медицине 2007; 1: 3-10.

15. Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Вахрушев И.В., Ярыгин В.Н., Ярыгин К.Н. // Клеточн. технологии биологии и мед. 2007, № 1, 3-10.)

16. Уэбб С. Физика визуализации изображений в медицине, (перев. с анг.) М, 1991.

17. Фундаментальная и клиническая физиология под редакцией Камкина А.Г. 2004. С. 498-511.

18. Чеглаков И.Б., Рытенков А.Н., Ярыгин К.Н. // Клеточн. технол. в биол. и мед. 2008, № 2, 73-79.

19. Чехонин В. П., Лебедев С. В., Петров С. В. и др. Моделирование фокальной ишемии головного мозга. Вестник Российской Академии медицинских наук 2004; 3: С. 47-54.

20. Ярыгин В.Н. Доклад на президуему Российской академии медицинских наук 24 октября 2001г. «Стволовые клетки: разработка программы по приоритетному направлению медицинской науки».

21. Ярыгин К.Н. //Пат. физиол. и экспер. тер., 2008, 1, С. 2-8.

22. Abedin М., Tintut Y.,Demer L.L. Mesenchymal stem cells and the artery wall // Circ. Res.-2004.-Vol.95.-P.671-676.

23. Anthony, Т. E., Klein, C., Fishell, G. & Heintz, N. Radial glia serve as neuronal progenitors in all regions of the central nervous system. Neuron 2004; 41, 881-890.

24. Arvidsson A., Collin Т., Kirik D, et al. Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat Med. 2002; 8: 963-70.

25. Aronowski J., Strong, R., and Grotta, J.C. (1997). Reperfusion injury: demonstration of brain damage produced by reperfusion after transient focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab 17, 1048-56.

26. Bagly J., LaRocca G., Jimenez DA, Urban NN. Adult neurogenesis and specific replacement of interneuron subtypes in the mouse main olfactory bulb. BMC Neurosci. 2007 Nov 9;8:92.

27. Baird AE, Benfield A, Schlaug G, Siewert B, Lovblad KO, Edelman RR. 1997. Enlargement of human cerebral ischemic lesion volumes measured by diffusion-weighted magnetic resonance imaging. Ann Neurol 41: 581-589.

28. Barth T.M., Jones, T.A.," and Schallert, T. (1990). Functional subdivisions of the rat somatic sensorimotor cortex. Behav Brain Res 39, 73-95.

29. Bederson J.B., Pitts, L.H., Tsuji, M., Nishimura, M.C., Davis, R.L., and Bartkowski, H. (1986). Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 17, 472-6.

30. Belayev L., Alonso, O.F., Busto, R., Zhao, W., and Ginsberg, M.D. (1996). Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture. Neurological and pathological evaluation of an improved model. Stroke 27, 1616-22; discussion 1623.

31. Belluzzi O., Benedusi M., Ackman J., and Lo Turco JJ. Electrophysiological differentiation of new neurons in the olfactory bulb. J. Neurosci. 23:10411-10418, 2003.

32. Berry I, Brant-Zawadzki M. & Manelfe C. MRI study of a feline model of acute cerebral ischemia. Contribution of paramagnetic contrast media to the diagnosis. J Neuradiol 1988; 15: 95-107.

33. Borlongan C. V., Cahili D. W., Sanberg P. R. Locomotor and passive avoidance deficits following occlusion of the middle cerebral artery. Phisi-ol. Behav. 1995; 58: 909-917.

34. Boldoran C.V., Hadman M., Sanberg P.R. Central nervous system entry of peripherally injected umbilical cord blood ceels is not required for neuroprotection in stroke. Stroke 2004; 35;2385.

35. Borlongan C.V., Tajima Y., Trojanowski J.Q., Lee V.M., Sandberg P.R. Early assessment of motor dysfunctions aids in successful occlusion of the middle cerebral artery. Neuroreport. 1998; 9(16): 3615-3621.

36. Brinker G., Franke, C., Hoehn, M., Uhlenkuken, U., and Hossmann, K.A. (1999). Thrombolysis of cerebral clot embolism in rat: effect of treatment delay. Neuroreport 10, 3269-72.

37. Buchan A.M., Xue, D., and Slivka, A. (1992). A new model of temporary focal neocortical ischemia in the rat. Stroke 23, 273-9.

38. Buchan A.M., Xue, D., and Slivka, A. (1992). A new model of temporary focal neocortical ischemia in the rat. Stroke 23, 273-9. .

39. Buchhold B., Mogoanta L., Suofu Y. et al.Environmental enrichment improves functional and neuropathological indices following stroke in young and aged rats.Restor Neurol Neurosci. 2007; 25:467-484.

40. Bulte, J. W. M., Douglas, T., Witwer, B., Zhang, S.-C., Strable, E., Lewis, B. K., Zywicke H., Miller, B., van Gelderen, P., Moskowitz, B. M., et al. (2001) Nat.Biotechnol. 19, 1141-1147.neocortical ischemia in the rat. Stroke 23, 273-9.

41. Bulte J. W. M., Zhang, S.-C., van Gelderen, P., Herynek, V., Jordan, E. K., Duncan, I. D.&Frank, J. A. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 15256-15261.

42. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // J. Orthop. Ress.-1991.-Vol.9.-P.641-650.

43. Carano R.A., Li, F., Irie, K., Helmer, K.G., Silva, M.D., Fisher, M., and Sotak, C.H. (2000). Multispectral analysis of the temporal evolution of cerebral ischemia in the rat brain. J Magn Reson Imaging 12, 842-58.

44. Carleton A., Petreanu LT, Lansford R., Alvarez-Buylla A. and Lledo PM. Becoming a new neuron in the adult ilfactory bulb. Nat neurosci 6: 507-518, 2003.

45. Chen J., Sanberg P.R., Li Y. et. al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682.

46. Chen F, Suzuki Y, Nagai N, Peeters R, Coeneqrachts K, Coudyzer W, Marchal G, Ni Y. 2004. Visualization of stroke with clinical MR imagers in rats: a feasibility study. Radiology. 2004; 233(3): 905-11.

47. Chen S.T., Hsu C.Y., Hogan E.L. et al. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke 1986; 17: 738-745.

48. Chu WJ, Simor T, Elgavish GA. In vivo characterization of Gd(BME-DTTA), a myocardial MRI contrast agent: tissue distribution of its MRI intensity enhancement, and its effect on heart function. NMR Bio-med 1997; 10:87-92.

49. Connolly ES, Jr, Winfree CJ, Springer TA et al. Cerebral protection in homozygous null ICAM-1 mice after middle cerebral artery occlusion. Role of neutrophil adhesion in the pathogenesis of stroke. J Clin Invest. 1996 1;97(1):209-216.

50. Connolly ES, Jr, Winfree CJ, Springer TA et al. Exacerbation of cerebral injury in mice that express the P-selectin gene: identification of P-selectin blockade as a new target for the treatment of stroke. Circ. Res. 1997 Sep; 81 (3): 304-310.

51. Cohen MS, DuBois RM, Zeineh MM. Rapid and effective correction of RF inhomogeneity for high field magnetic resonance imaging. Hum Brain Mapp 2000; 10(4):204-211. PubMed: 10949058.

52. Caplan A.I., Dennis J.E. // J. Cell. Biochem. 2006, 98, 1076-1084.

53. Chen J., Zhang Z. G., Li Y. et all. Intravenous administration of human bone marrow stromal cells induces angiogenesis in the ischemic boundary zone after stroke in rats. Circ Res. 2003 Apr 4; 92(6):692-9. Epub 2003 Feb 27.

54. Dan Ehninger & Gerd Kempermann. Neurogenesis in the adult hippocampus. Cell Tissue Res (2008) 331:243-250.

55. De Ryck M., Van Reempts, J., Borgers, M., Wauquier, A., and. Janssen, P.A. (1989). Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats. Stroke 20, 1383-90.

56. Dirnagl U., Iadecola, C., and Moskowitz, M.A. (1999). Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci 22, 391-7.

57. Dominici M., Le Blanc K., Slaper-Cortenbach I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International society for cellular therapy position statement // Cytotherapy.-2006.-Vol.8.-P.315-317.c.

58. Donald G. Phinney, Darwin J. Prockop. Concise review: mesenchymal stem/multipotent stromal cells: the state of transdifferentiation and modes of tissue repair—current views. Stem Cells Vol. 25 No. 11 November 2007, pp. 2896 -2902.

59. Donnan G.A. A new Road Map for Neuroprotection. The 2007 Feinberg Lecture. Stroke 2008; 39: 242.

60. Donnan G.A., Rajinder K Dhamija, Geoffrey A The role of neuroima-ging in acute stroke. Official journal of Indian academy of neurologu: 2008; Vol.11; Issue:5; P. 12-23.

61. Ekdahl C.T., Kokaia Z., Lindvall O. Brain inflammation and adult neurogenesis: The dual role of microglia. Neuroscience 2008 Jul.3.

62. Eklof B. and Siesjo, B.K. (1972). The effect of bilateral carotid artery ligation upon the blood flow and the energy state of the rat brain. Acta Physiol Scand 86, 155-65.

63. Friedenstein A.J. , Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers // Cell Tissue Kinet.-1987.-VoL20.-P.263-272.

64. Friedenstein A .J., Gorskaya J.F.,Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs // Exp. Hematol.-1976.-Vol.4.-P.267-274.

65. Fuxe K., Bjelke, B., Andbjer, B., Grahn, H., Rimondini, R., and Ag-nati, L.F. (1997). Endothelin-1 induced lesions of the frontoparietal cortex of the rat. A possible model of focal cortical ischemia. Neuroreport 8, 2623-9.

66. Hartl R., Schurer, L., Schmid-Schonbein, G.W., and del Zoppo, GJ. (1996). Experimental antileukocyte interventions in cerebral ischemia. J CerebBlood Flow Metab 16, 1108-19.

67. Horwitz E.,Le Blanc K., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy.-2005.-Vol.7.-P.393-395.

68. Garcia J. H, Liu K-F, Yoshida Y. Brain micro vessels: factors altering their potency following the occlusion of a middle cerebral artery (Wistar rat). Am J Pathol. 1994; 145:728-740.

69. Ginsberg M.D., Busto, R. (1989). Rodent models of cerebral ischemia. Stroke 20, 1627-42.

70. Grotta J. (1998). Stroke treatment in the human versus animal models. In Cerebrovascular disease: pathophysiology, diagnosis, and management. M. Ginsberg and J. Bogousslavsky, eds. (Blackwell Scientific Publications), pp. 1901-6.

71. Gursoy-Ozdemir Y., Can, A., and Dalkara, T. (2004). Reperfusionin-duced oxidative/nitrative injury to neurovascular unit after focal cerebral ischemia. Stroke 35, 1449-53.

72. Jessberger S, Romer B, Babu H, Kempermann G (2005) Seizures induce proliferation and dispersion of doublecortin-positive hippocampal progenitor cells. Exp Neurol 196:342-351.

73. Jones T.A., Chu, C.J., Grande, L.A., and Gregory, A.D. (1999). Motor skills training enhances lesion-induced structural plasticity in the motor cortex of adult rats. J Neurosci 19, 10153-63.

74. Johnson GA, Cofer GP, Fubara B, Gewalt SL, Hedlund LW, Maron-pot RR. Magnetic resonance histology for morphologic phenotyping. J Magn Reson Imaging 2002; 16:423-429.

75. Imitola J., Comabella M., Chandraker A.K. et all. Neural stem/progenitor cells express costimulatory molecules that are differentially regulated by inflammatory and apoptotic stimuli. Am J Pathol. 2004; 164(5): 1615-25.

76. Kaneko D;, Nakamura, N., and Ogawa, T. (1985). Cerebral infarctioniin rats using homologous blood emboli: development of a new experimental model. Stroke 16, 76-84.

77. Keating A. Mesenchymal stromal cells // Curr.Opin.Hematol.-2006.-Vol.l3.-P.419-425.

78. Kim D.K., Rordorf, G., Nemenoff, R.A., Koroshetz, W.J., and Bon-ventre, J.V. (1995). Glutamate stably enhances the activity of two cytosolic forms ofphospholipase A2 in brain cortical cultures. Biochem J 310 ( Pt 1), 83-90.

79. Koizumi J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., and Ooneda, G. (1986). Experimental studies of ischemic brain edema. 1. A new experimental model, of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke 8, 1-8.

80. Kondziolka D,Wechsles L, Goldstein S, et al. Nransplantation of cultured human neural cells for patient wish stroke. Neurologu 2000; 55:565.

81. Knight R. A., M. O. Dereski, J. A. Helpern, R. J. Ordridge, andM. Chopp. 1994. Magnetic resonance imaging assessment of evolving focal cerebral ischemia: Comparison with histopathology in rats. Stroke 25: 1252-1262.

82. Kucia M., Reca R., Jala V.R. et al. Bone marrow as a home of hetero-genouse populations of nonhematopoietic stem cells // Leukemia.- 2005.-Vol.l9.-P.l 118-1127.

83. Kuge Y., Minematsu K., Yamaguchi T., Miyake Y. Nylon Monofilament for Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. Stroke, September 1, 1995; 26(9): 1655 1658.

84. Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L. et al. Human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells cannot be recovered from peripheral blood progenitor cell collections // J.Hematother.-1997.-Vol.6.-P.447-455.

85. Liu H. Honmou O., Harada K. et all. Neuroprotection by PIGF gene-modified human mesenchymal- stem cells after cerebral ischaemia. Brain 2006; 129(10): 2734-45.

86. Li Z., Schallert T.et al. A test for detectivy long tern» sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of neuroscience Methods 117(2002) 207-214.

87. Lois C., Alvarez-Buy 11a A. Proliferating subventricular zone cell? in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and §lia.

88. Proc. Natl. Sci. USA. 1993;90:2074-2077.

89. Lois C., Alvarez-Buylla A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 1994; 264:1145-1148.

90. Locatelli F., Bersano A., Ballabio E. et all. Stem cell therapy in stroke. Cell Mol. Life Sci. 2008;8.

91. Markgraf C.G., Green, E.J., Hurwitz, B.E., Morikawa, E., Dietrich, W.D., McCabe, P.M., Ginsberg, M.D., and Schneiderman, N. (1992). Sensorimotor and cognitive consequences of middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res 575, 238-46.

92. Mathias Hoehn, Ekkehard Ku" stermann, James Blunk et al. Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: A highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat. PNAS 2002; 99(25): 16267-16272.

93. Mayzel-Oreg O., Omae, T., Kazemi, M., Li, F., Fisher, M., Cohen, Y., and Sotak, C.H. (2004). Microsphere-induced embolic stroke: an MRI study. Magn Reson Med 51, 1232-8.

94. Menzies S.A., Hoff, J.T., and Betz, A.L. (1992). Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery 31, 100-6; discussion 106-7.

95. Mirzadeh Z., Merkle F.T., Soriano-Navarro M., Garcia-Verdugo J.M., Alvarez-Buylla A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell 2008; 3(3): 265-78.

96. Modo M., Stroemer R.P., Tang E. et al Effects of implantation site of dead stem cells in rats with stroke damage. Neuroreport. 2003;20;14(l):39-42.

97. Modo M., Stroemer R.P., Tang E. et al. Effects of implantation side of stem cell grafts on behavioral recovery from stroke damage. Stroke. 2002 Sep; 33(9):2270-8.

98. Morigi M., Imberti B., Zoja C. et al. Mesenchymal■ stem cells are renotropic, helping to repair the kidney and improve function in acute renal failure // J. Am. Soc. Nephrol.-2004.-Vol. 15.-P. 1794-1804.

99. Noctor S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L. & Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. 2004; 7, 136-144.105. Norman D

100. Odorico J., Kaufman D., Thomson J. Multilineage differentiation from human embryonic stem lines. Stem cells.-2001.-19.-193-204.

101. Petreanu L, Alvarez-Buy 11a A (July 2002). «Maturation and death of adult-born olfactory bulb granule neurons: role of olfaction». J. Neurosci. 22 (14): 6106-13.

102. Pittenger, M.F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells / M.F. Pittenger et al. // Science.-1999.-Vol. 284.-P. 143-146.

103. Prado R., Kuluz J.W., He D. Stroke 2007; 38:1932-1937Role of the contralateral cortex. Neuroscience 139:1495-1506. Sharkey J, Ritchie I, Kelly P. 1993.

104. Ramon Y Cajal S. et al. Degeneration and regeneration of the nervous system. Oxford University Press, American Branch, 1928, Vol.1, pp 396, Vol. 2, pp 369-769.

105. Recommendations for advancing development of acute stroke therapies. Stroke therapy academic industry roundtable 3. Stroke; 34:1539.

106. Reglodi D., Tamas A., Lengvari I. Examination of sensorimotor performance following middle cerebral artery occlusion in rats. Brain Res Bull. 2003; 59:459-466.

107. Rice H., Hsu E., Evenson D. et al. Superparamagnetic Iron Oxide Labeling and Transplantation of Adipose-Derived Stem Cells in Middle Cerebral Artery Occlusion-Injured Mice. Molecular Imaging • Original Research. 2007; 188:1101-1108.

108. Riquelme P.A., Drapeau, E., and Doetsch, F. (2008). Brain micro-ecologies: neural stem cell niches in the adult mammalian brain. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 363, 123-137.

109. Robinson M.J., Macrae, I.M., Todd, M., Reid, J.L., and McCulloch, J. (1990). Reduction of local cerebral blood flow to pathological levels byendothelin-1 applied to the middle cerebral artery in the rat. Neurosci Lett 118, 269-72.

110. Rochefort G.Y., Delorme B., Lopez A. et al. Multipotential mesenchymal stem cells are mobilized into peripheral blood by hypoxia // Stem Cells.-2006.-Vol.24.-P.2202-2208.

111. Sahay A., Hen R. Adult hippocampal neurogenesis in depression. Nature Neuroscience 2007; 10: 1110-1115.

112. Schwamm LH, Koroshetz WJ, Sorensen G, Wang B, Copen WA. 1998. Time course of lesion development in patients with- acute stroke. Serial diffusion- and hemodynamic-weighted magnetic resonance imaging. Stroke 29: 2268-2276.

113. Shake J.G., Gruber P.J. ,Baumartner W.A. et al. Mesenchymal stem cell implantation in a swine myocardial infarct model: engraftment and functional effects//Ann. Thorac. Surg.-2002.-Vol.73.-P.1919-1925.

114. Snapyan M., Brill M.S., Blais M., Massouh M., Ninkovic J. et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. The Journal of Neuroscience, 29 (13): 4172-4188, 2009.

115. Shyu W., Chen C., Lin S., Lee Y., Li H. // Stroke 2007, 38, 367-374.

116. Stocum D.L. // Regenerative Biology and Medicine. Burlington-San Diego-London, Elsevier, 2006, 89-123.

117. Sugawara T., Kawase, M., Lewen, A., Noshita, N., Gasche, Y., Fuji-mura, M., and Chan, P.H. (2000). Effect of hypotension severity on hippo-campal CA1 neurons in a rat global ischemia model. Brain Res 877, 281-7.

118. Sykova E. , Vargona L., Kubinova S. et all. The relationship between changes in intrinsic optical signal and cell swelling in rat. Neurol-mage 2003. 18:214-230.

119. Taguchi A., Soma T., Tanaka H. et. al. Intravenous versus intra-striatal cord blood administration in rodent model of stroke. J. Neurosci. Res. 2003; 73 (3): 296-307.

120. Takeda A., Onodera H., Yamasaki D.I. et al. Br J Pharmacol 1997; 122: 1251-1256.

121. Takizawa S., Hogan, M., and Hakim, A.M. (1991). The effects of a competitive NMDA receptor antagonist (CGS-19755) on cerebral blood flow and pH in focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 11, 786-93.

122. Tamaki S., Eckert K., He D., Sutton R., Doshe M., Jain G., Tushins-ki R., Reitsma M., Harris B., Tsukamoto A., Gage F., Weissman I., Uchida N. // J. Neurosci. Res. 2002, 69, 976-986.

123. Tamura A., Graham, D.I., McCulloch, J., and Teasdale, G.M. (1981). Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab 1, 53-60.

124. Tong D.S., Adami A., Moseley M.E. et al. Predictor of hemorrhagic transformation following acute stroke: role of diffusion and perfusionweight magnetic resonance imaging // Arch. Neurol. 2001.-Vol.58, №4.-P.587-593.

125. Twichell T.E. Brain 1951; 74; 443-480.

126. Veizovic T., Beech J.S., Stroemer R.P.,Watson W.P, Hodges H. Resolution of stroke deficits following contralateral grafts of conditionally immortal neuroepithelial stem cells. Stroke. 2001; 32(4): 1012-9.

127. Vendrame M., Cassady J., Newcomb J. et. al. Infusion of human umbilical cord blood cells in rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390.

128. Wahlgren NG, Ahmed N. Neuroprotection in cerebral ischaemia: facts and fancies the need for new approaches. Cerebrovasc Dis 2004; 17 (Suppl/1): 153-66.

129. Wages A.J., Weissman I.L. Plasticity of adult stem cells // Cell. 2004.-Vol.116.-P.639-648.

130. Wester, P., Watson, B.D., Prado, R., and Dietrich, W.D. (1995). A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke 26, 444-50.

131. Wiling A.E., Lixian J.,Miliken M. et. al. Intravenous versus intra-striatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J. Neurosci. Res. 2003; 73 (3): 296-307.

132. Woitzik J., Weinzierl N., Schilling L. Early administration* of a second-generation perfluorochemical decreases ischemic brain. Newrol. Res. 2005 Jul;27(5):509-15.

133. Wong K.S., Lam W.W., Liang E.et al. Variability of magnetic resonance angiography and computed tomography angiography in grading middle cerebral artery stenosis. /Stroke. 1996.-Vol. 27, №6. P. 1084-1087.

134. Yasuhara T., Hara K., Maki M. et all. Intravenous grafts recapitulate the neurorestoration afforded by intracerebrally delivered multipotent adult progenitor cellsin neonatal hypoxic-ischemic rats. J. Cerebr. B1.F1. and Me-tab. 2008; 28(11): 1804-10.

135. Zhang R., Li Y., Chen J. et all. Expression of insulin-like growth fa-cor 1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromal cells. Brain Res. 2004; 24; 1030 (1): 19-27.

136. Zhang R., Zhang Z., Wang L. et all. Activated neural stem cells contribute to stroke-induced neurogenesis and neuroblast migration toward the infarct boundary in adult rats. J. Cerebral blood flow metab. 2004; 24(4):441-8.

137. Zhang Y., Li C.D., Jiang X.X., Li H.L., Tang P.H., Mao N. Comparison of mesenchymal stem cells from human placenta and bone marrow. Chin. Med. J., 2004; 117(6): 882-887.

138. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G. et al. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals // Arthritis Res.-2000.-Vol.2.-P.477-488.