Сравнительное исследование экспрессии и иммунореактивности NMDA рецепторов при экспериментальной церебральной ишемии и геморрагии мозга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гаппоева, Мадина Умаровна

• Гаппоева, Мадина Умаровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гаппоева, Мадина Умаровна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. Обзор литературы

1.1. Перспективы молекулярной диагностики в неврологии

1.2. Нейротоксичность глутамата как один из механизмов инфаркта 17 мозга

1.3. Ионотропные глутаматные рецепторы - один из ключевых 22 биомаркеров ишемии

1.4. Экспериментальные модели инфаркта мозга

1.1.1. Модели глобальной ишемии

1.1.2. Модели фокальной ишемии ^ д

1.4.3.Модели внутрицеребральной геморрагии

ГЛАВА II. Материалы и методики исследований

1. Экспериментальные модели церебральной ишемии и геморрагии

1.1. Субтотальная ишемия

1.2. Фокальная ишемия ^

1.3. Церебральная геморрагия

1.4. Оценка неврологического дефицита у экспериментальных

2. Подготовка образцов мозга и крови для исследования

3. Биохимические методы

4. Методы изучения экспрессии мРНК NMDA- рецепторов

5. Иммунохимические методы

6. Методы статистического анализа результатов исследования

ГЛАВА III. Результаты исследования

3.1. Экспериментальные модели инфаркта мозга: определение объема инфаркта и неврологического дефицита у крыс

3.2. Изучение экспресии NR2 рецепторов при церебральной ишемии и 65 геморрагии на начальных стадиях образования инфаркта

3.3. Сравнение иммунореактивности NR2 рецепторов при церебральной 77 ишемии и геморрагии в зоне инфаркта и интактной области

3.4. Динамика накопления аутоантител к NR2A и NR2B рецепторам в 83 крови экспериментальных животных

ГЛАВА IV. Обсуждение результатов

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное исследование экспрессии и иммунореактивности NMDA рецепторов при экспериментальной церебральной ишемии и геморрагии мозга»

Актуальность проблемы

Церебральные инсульты приводят к инвалидности и высокой смертности населения. Они подразделяются на ишемические (80-85 %), происходящие за счет резкого снижения мозгового кровообращения, и геморрагические (15-20 %), вызываемые внутримозговым кровоизлиянием (Toole J.F., 1999). В критических ситуациях точная диагностика типа инсульта жизненно важна для определения терапевтической стратегии, которая существенно различается для ишемии и геморрагии (Скоромец А.А., Скоромец Т.А., 2002).

Исследования последнего десятилетия определили основные механизмы трансформации обратимых гемодинамических, клеточных и молекулярных изменений в стойкий морфологический дефект-инфаркт мозга. Выявление последовательности молекулярных событий, происходящих в ткани мозга, лежащих в основе церебральной ишемии и геморрагии, позволяет разрабатывать новые подходы к ранней диагностике мозговых инсультов и осуществлять поиск новых средств для нейропротективной защиты мозга при нарушениях мозгового кровообращения (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001).

Особую значимость приобретают исследования процессов нейротоксичности глутамата и его рецепторов, приводящих к церебральной ишемии и геморрагии (Meldrum B.S., 2000). Известно, что NMDA рецепторы составляют 80% от количества всех возбуждающих рецепторов и представляют собой гетеромерные пентамеры или тетрамеры NR1 и NR2 субъединиц, формирующих функционально активные каналы. Показано, что устойчивые взаимодействия между клетками связаны с генетической детерминированностью синтеза этих рецепторов в определенных нейронах и теми постоянными или временными функциями, которые они обеспечивают (Saper С.В. et al., 2000).

Экспериментальные и клинические данные изучения нарушений мозгового кровообращения у животных и человека свидетельствуют об изменении синтеза NMDA нейрорецепторов, связанного с первичными процессами нейротоксичности (Гусев Е.И. и др., 1996; Дамбинова С.А. и др. 2002). Показано, что существуют корреляции между синтезом NMDA рецепторов, нарушением гематоэнцефалического барьера и появлением пептидных фрагментов NMDA рецепторов в кровотоке (Скоромец А.А. и ДР., 1997).

Многолетними исследованиями нашей лаборатории определены ключевые молекулы нейротоксического каскада или аутоантитела к ним, специфично отражающие нарушение метаболизма при ишемии и геморрагии в определенных структурах мозга и коррелирующие с основной симптоматикой заболевания, которые могут быть измерены в биологических жидкостях пациентов и сопоставлены с неврологическими шкалами и данными прижизненной нейровизуализации (Dambinova S.A. et al., 1997, 1998, 2001). На основе этих исследований разработан гемо-тест для определения мозгового кровообращения (НМК-ИФА-набор), который проходит в настоящее время клинические испытания в МЗ РФ (Хунтеев Г.А. и др., 2001).

Вместе с тем остаются еще не решенными ряд теоретических и практических вопросов, касающихся временных аспектов синтеза, деградации и иммунореактивности NMDA рецепторов в условиях снижения мозгового кровообращения на начальных стадиях. Эти исследования могут быть проведены только у животных на моделях экспериментальной ишемии и геморрагии, у которых можно проследить развитие инфаркта мозга в течение первых минут и часов, что является особенно важным для интенсивной терапии.

Известно, что при моделировании процессов глобальной и фокальной ишемии у животных обнаружены противоречивые результаты: экспрессия NR2A субъединицы в СА1 нейронах понижается (Zhang L. et al., 1997), повышается (Perez-Velazquez J.L., Zhang L., 1994), либо остается неизменной (Pelligrino-Giampietro D.E., et al., 1994). Практически отсутствуют сведения о роли NMDA рецепторов в механизмах церебральной геморрагии (Tang et al., 2001).

Возникают вопросы, какие ключевые биохимические изменения происходят в зоне инфаркта и прилежащих к ней областях мозга при ишемии и геморрагии в первые часы, когда появляются аутоантитела к нейрорецепторам в крови животного и могут ли они отражать объем инфарктной области, а также коррелировать с неврологическим дефицитом, выявляемым на системном уровне?

Мы предположили, что NMDA рецепторы по разному отражают процессы нейротоксичности на ранних стадиях инсульта: экспрессия NMDA рецепторов увеличивается при ишемии и снижается при геморрагии (Дамбинова С.А. и др., 2002). При ишемии избыточные количества глутамата приводят к нарушению функционирования NMDA рецепторов, с последующим их разрушением на пептидные фрагменты и инициацией апоптоза. Нарушенный ГЭБ пропускает деструктивные молекулы из мозга в кровоток, вызывая активацию иммунной системы, продуцирующую аутоантитела к собственным мозговым антигенам. При церебральной геморрагии нейротоксичность, вызванная глутаматом, приводит к некрозу нервной ткани и снижению экспрессии NMDA рецепторов, поэтому образование аутоантител подавляется. Этот феномен может оказаться полезным для разработки экспресс гемо-теста, необходимого в условиях скорой помощи, способного быстро и надежно определить тип инсульта для своевременной интенсивной терапии.

Цель задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение свойств глутаматных NMDA рецепторов на начальных стадиях развития инфаркта мозга при экспериментальной церебральной ишемии и геморрагии.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить изменение экспрессии гена NR2A в очаге инфаркта у экспериментальных животных при церебральной ишемии и геморрагии в первые 6 часов операции.

2. Изучить иммунореактивность NR2A/2B субъединиц в очаге инфаркта мозга у крыс с церебральной ишемией и геморрагией в первые 6 часов индукции инфаркта.

3. Оценить изменение иммунореактивности NMDA рецепторного комплекса в коре мозга у крыс с церебральной ишемией сроком один месяц после операции.

4. Проследить временную динамику накопления аутоантител к NR2A субъединице NMDA-рецептора в крови экспериментальных животных.

Научная новизна

Показано, что NR2 рецепторы являются основными биомаркерами, способными дифференцировать процессы нейротоксичности, которые лежат в основе молекулярных механизмов церебральной ишемии.

Установлены особенности экспрессии гена NR2A и иммунореактивности NR2 подтипов NMDA рецепторов при церебральной ишемии и геморрагии.

Выявлены различия между экспрессией гена NR2A и иммунореактивностью NR2A рецептора при субтотальной и фокальной ишемии.

Показано, что экспрессия гена NR2A рецептора снижена при геморрагии.

Обнаружена разная динамика уровня аутоантител к NR2A рецепторам в крови экспериментальных животных с церебральной ишемией и геморрагией.

Впервые представлен биохимический профиль возрастания аутоантител к NR2A рецепторам при субтотальной и фокальной ишемии, который позволяет, проводить различия между ишемическими и геморрагическими типами инсульта.

На основе вышеуказанных экспериментальных исследований впервые обоснована теоретическая возможность исследования генной экспрессии ключевых биомаркеров нейротоксичности и определения значимости этих показателей для молекулярной (генной) диагностики инсультов.

Научно-практическое значение.

В настоящее время существуют две основные проблемы в диагностике церебральных инсультов. Первая проблема заключается в своевременной оценке состояния мозга в критических ситуациях и дифференциации типа инсульта: субтотальной, фокальная ишемии или геморрагия для точного выбора стратегии нейропротективной терапии. Второй важной проблемой является доклиническая диагностика с целью выявления группы риска для превентивного лечения. Научно-практическая ценность настоящей работы заключается в выявлении ключевых биомаркеров нейротоксичности на ранней стадии инсульта, которые позволяют дифференцировать типы инсультов по анализу крови у экспериментальных животных и человека при нарушении мозгового кровообращения. Представленная работа необходима для перспективной разработки экспресс-теста и усовершенствования лабораторной диагностики и контроля за эффективностью лечения церебральных инсультов. Кроме того, она является одним из теоретических обоснований применения в медицинской практике существующего НМК-ИФА-набора для выявления острых и хронических нарушений мозгового кровообращения, дополняющего существующие методы нейровизуализации и функциональной диагностики.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Сравнительное исследование NMDA рецепторов на моделях субтотальной, фокальной ишемии и геморрагии у крыс выявило изменение их синтеза на ранних сроках развития инфаркта мозга, в то время как аутоантитела к NMDA рецепторам появлялись в крови к концу первой недели реперфузии и служили биомаркерами в определении типа инсульта при нарушениях мозгового кровообращения.

2. Экспрессия гена NR2A субъединицы NMDA рецепторов увеличивается в ишемизированной коре и незначительно снижается в гиппокампе при фокальной и субтотальной ишемиях в первые 6 часов ишемии, которая сопровождается снижением иммунореактивности в пораженной инфарктом коре и интактном гиппокампе. Снижение иммунореактивности в мозгу коррелирует с появлением аутоантител к NR2 субъединицам NMDA рецепторов в крови у крыс с фокальной и субтотальной ишемией, динамика накопления которых различается у этих моделей.

3. Подавление экспрессии гена NR2A субъединицы при церебральной геморрагии не изменяет иммунореактивность этих рецепторов в исследованных структурах мозга. Данные мониторинга аутоантител к NR2 рецепторам в этом случае существенно отличается от церебральной субтотальной и фокальной ишемии и сохраняется на контрольном уровне у ложнооперированных животных. Внедрение в практику результатов исследования Материалы, полученные в настоящей работе, используются в курсах лекций по клинической нейродиагностике и терапии в С.-Петербургском медицинском университете им. И.П.Павлова, в курсах лабораторной и функциональной диагностики Российского государственного медицинского университета, г. Москва и в курсе лекций по молекулярной нейробиологии в Эмори университете г.Атланта, США.

Апробация диссертации. Материалы исследования представлены на III Всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2000), конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, май 2001), «Неврология-иммунология» (Санкт-Петербург, май 2001), симпозиуме "Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders" (Perygia, Italy, May 22-25, 2001), Joint Meeting of the ISN and ASN (Buenos Aires, Argentina, August 26-31, 2001), «Нейроиммунология» (Санкт-Петербург, май 2002). Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных публикаций

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста, состоит из введения, трех глав, обсуждения результатов, выводов, приложения и библиографического указателя использованных литературных источников. Работа проиллюстрирована 13 рисунками и 9 таблицами. Список литературы включает 133 работ, из них 26 - отечественных и 107 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гаппоева, Мадина Умаровна

ВЫВОДЫ

1. Использование единых временных отрезков наблюдения позволило обнаружить разное участие NR2A субъединицы NMDA рецептора в механизмах нейротоксичности на моделях субтотальной, фокальной ишемии и внутрицеребральной геморрагии.

2. На моделях субтотальной и фокальной ишемии показано повышение экспрессии гена NR2A в коре мозга на ранних (6 ч) сроках ишемии.

3. В области «полутени» инфаркта у животных с фокальной ишемией выявляется высокая экспрессия гена NR2A, которая в 2 раза превышала таковую в пораженной инфарктом коре в первые 6 ч ишемии.

4. При экспериментальной геморрагии имеется значительное снижение экспрессии гена NR2A в коре и гиппокампе крыс в первые 6 ч.

5. Снижение иммунореактивности NR2A/2B субъединиц в гиппокампе у животных с субтотальной и фокальной ишемией наблюдается на ранних (6 ч) сроках инсульта без изменения таковой у крыс с внутрицеребральной геморрагией в первые 6 часов.

6. Динамика накопления высоких концентраций NR2A аутоантител в крови животных с фокальной церебральной ишемией более выражена по сравнению с таковой у крыс с субтотальной ишемией.

7. При экспериментальной внутрицеребральной геморрагии не происходит накопления NR2A аутоантител в крови.

8. При окрашивании образцов мозга крыс с субтотальной ишемией (1 месяц эксперимента) выделенными из крови аутоантителами выявлены белковые полосы (180 кДа), соответствующие по размерам NMDA рецепторному комплексу.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гаппоева, Мадина Умаровна, 2003 год

1. Ашмарин И.П., Стукалов П.В. Нейрохимия.- М.: Изд-во Института Био-мед химии РАМН, 1996.

2. Гранстрем O.K., Ван Рин Т., Воскил Р.А., Дамбинова С.А. Аутоантитела к AMP А/ квисквалатному рецептору в моделях эпилепсии. Нейрохимия. 1997, 14:16-22

3. Гранстрем O.K., Дамбинова С.А. Роль глутаматных рецепторов в механизмах формирования эпилепсии. Нейрохимия, 2001; 18: 19-29

4. Громов С.А., Хоршев С.К., Поляков Ю.И., Громова Л.Г., Дамбинова С.А. Клинико-биохимическое исследование при эпилепсии Ж.неврол. психиатрии им. С.С. Корсакова 1997; 97: 46-49

5. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Изыкенова Г.А., Алексеев А.А., Дамбинова С.А.Выявление аутоантител к компонентам NMDA рецептора в сыворотке крови пациентов с острым ишемическим инсультом мозга. Ж.неврол. психиатрии им. С.С.Корсакова. 1996; 96: 68-72

6. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина. 2001,328с.

7. Дамбинова С.А., Городинский А.И. Молекулярная организация глутаматчув-ствительных хемовозбудимых мембран нервной клетки. 1. связывание L-3H.-глутамата с синаптическими мембранами. Биохимия. 1984; 49: 67-4.

8. Дамбинова С.А., Беседин В.И., Демина М.Н. Молекулярная организация глутамат-чувствительных хемовозбудимых мембран нервной клетки. Физико-химическиехарактеристики очищенных глутаматсвязывающих белков. Биохимия. 1984, 49: 216-222.

9. Дамбинова С.А., Городинский А.И. Влияние ионов натрия и кальция на специфическое связывание Ь-3Н-глутамата с мембранами нервной клетки. Нейрохимия. 1986, 5:115-124.

10. Дамбинова С.А. Нейрорецепторы глутамата. Ленинград: Наука. 1989, 183 с.

11. Дамбинова С.А. Экспрессия генов AMP А и NMDA рецепторов в условиях нейротоксичности. В кн.: Успехи функциональной нейрохимии, (под ред. Дамбиновой С.А., Арутюнян А.В.), С.-Петербургский университет, С.-Петербург, в печати, 2002

12. Илюхина А.Ю., Громова Л.Г., Скоромец А.А., Дамбинова С.А. Уровень аутоантител к глутаматным рецепторам

13. NMDA-типа в крови больных с острым нарушением мозгового кровообращения Нейрохимия. 1997; 14: 420-422

14. Малашхия Ю.А. Иммунный барьер мозга. (Иммунология и иммунопатология спиномозговой жидкости ). М.: Медицина, 1986. 160 с.

15. Одинак М. М., Дыскин Д.Е., Торопов И.А., Емелин А.Ю., Черепанов А.А., Дамбинова С.А. Диагностика эпилепсии с помощью анализа крови на содержание аутоантител к нейрорецепторам глутамата. Ж.Неврол. психиатрии им. С.С. Корсакова. 1996; 96: 4548.

16. Одинак М. М., Дыскин Д.Е. Эпилепсия: патология, диагностика и лечение. СПб: Политехника. 1997, 233 с.

17. Пронькинова М.Е. Диагностика эпилептических пароксизмов у детей на основе модифицированного метода биохимического тестирования. Авт. на соискание ученой степени к.м.н. СПб, 1998.

18. Поляков Ю.И. Диагностика эпилепсии и оценка степени компенсации болезни в процессе терапии методом биохимического тестирования пароксиз-мальной активности головного мозга Авт. на соискание ученой степени к.м.н. СПб, 1998

19. Сергеев П. В., Шимановский Н. JL, Петров В. И. Рецепторы физиологически активных веществ: монография. -Волгоград.-Семь ветров.- 1999

20. Скоромец А.А., Дамбинова С.А., Илюхина А.Ю., Сорокоумов В.А. Аутоантитела к глутаматным рецепторам NMDAтипа в крови пациентов с острым ишемическим и геморрагическим инсультом. Ж.неврол. психиатрии им. С.С.Корсакова 1997; 97: 53-58

21. Скоромец А.А., Скоромец Т.А. Топическая диагностика заболеваний нервной системы. Учебник., Медицина, Москва, 2002

22. Смирнова Т.М., Орлова Е.А., Дамбинова С.А. Поиск и изучение ДНК, кодирующей синтез глутаматных рецепторов мозга человека. Докл. Асад. Наук СССР. 1988, 302:102-105.

23. Смирнова Т.М., Орлова Е.А., Дамбинова С.А. Клонирование фрагмента кДНК каинатного рецептора мозга человека. Докл.Акад.Наук СССР. 1989, 309: 745-748.

24. Тотолян А.А. Цереброспинальная жидкость как материал для иммунологичес-кого анализа. Мед.иммунология, 1999,T.l, N.1-2.

25. Anderson D., Wells P. D-dimer for the diagnosis of venous thromboembolism Cur.Opinion in Hematology. 2000, 7: 296-301

26. Bederson J.B., Pitts L.H., Tsuji M., Nishimura M.C., Davis R.L., Bartkowski H. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation ofthe model and development of a neurologic examination. Stroke. 1986; 17: 472-476

27. Bernabeu R, Sharp F.R. NMDA and AMPA/Kainate Glutamate Receptors Modulate Dentate Neurogenesis and CA3 Synapsin-I in Normal and Ischemic Hippocampus. J.Cereb.Blood Flow & Metab. 2000; 20: 1669-1680

28. Bernbaumer L, Campbell KP, Catterall WA, et al. The naming of voltage-gated calcium channels. Neuron. 1994;13:505-506

29. Bird T.D. Risks and benefits of DNA testing for neurogenic disorders. Seminars in Neurology. 1999, 19: 253-259

30. Black M.A, Tremblay R, Mealing G, et al. N-methyl-D-aspartate- or glutamate-mediated toxicity in cultured cortical neurons is antagonized by FPL 15896AR. J. Neurochem. 1995;65: 2170-2177

31. Block F. Global ischemia and behavioral deficits. Prog. Neurobiol. 1999; 58: 279-29535. de Boer A.G, Breimer, D.D. Cytokines and blood-brain barrier permeability. Prog Brain Res. 1998, 115:425-451

32. Brightman M.W. Morphology of blood-brain interfaces. Exp. Eye. Res. (Suppl.) 25:1-25, 1977.

33. Bullock R, Fujisawa H. The role of glutamate antagonists for the treatment of CNS injury. J. Neurotrauma. 1992; 9 : S443-S462

34. Bumol T.F, Watanabe A.M. Genetic information, genomic technologies, and future of drug discovery. JAMA. 2001, 285: 551-555

35. Capdeville C, Pruneau O, Allix M, Plotkine M, Baulu R.G. Model of global forebrain ischemia in the unanesthetized rat. J.Pharmacol. 1986; 17: 553-560

36. Chai S.K., Mantovani L., Kasaian M.T., Casali P. Natural autoantibodies. In: Immunobiology of Proteins and Peptides. 7th ed. M.Z. Atassi Ed. New York: Plenum Press. 1994, 147-159

37. Choi D. W. Possible mechanisms limiting N-methyl-D-aspartate receptor overactivation and therapeutic efficacy of N-methyl-D-aspartate antagonists. Stroke 1990; 21 : 20-22

38. Choi D. W. Excitotoxic cell death. J. Neurobiol. 1992; 23:1261-1276

39. Combs D.J., D'Alecy L.G. Motor perfomance in rats exposed to severe forebrain ischemia: effect of fasting and 1,3-butanediol. Stroke 1987;18:503-511

40. Collins F.S., McKusick V.A. Implications of the human genome project for medical science. JAMA. 2001, 285: 540-544

41. Condorelli D. F., Belluardo N., Mudo G., Del'Albani P., Jiang X., Giufirida S. A. Changes in gene expression of AMPA-selective glutamate receptor subunits induced by status epilepticus in rat brain. Neurochem. 1994; 25: 367-376.

42. Crone C. The blood-brain barrier as a tight epithelium: where is information lacking? Annals NY Acad. Sci. 1986; 481:174-185

43. Dambinova SA, Izykenova GA, Burov SV, Grigorenko EV, Gromov SA. The presence of autoantibodies to N-terminus domain of GluRl subunit of AMPA receptor in the blood serum of patients with epilepsy. J Neurol Sci. 1997;152: 93-97. (B)

44. Dambinova S.A., Izykenova G.A. Immunosorbent for use in the diagnosis of neuro-psychological disorders, and use there of Patent of Japan 1998 No. 2782695

45. Dambinova S.A., Gorodinskii A.I., Demina M.N. Immunosorbent for epilepsy diagnosis European patent 1998 No. 0558747

46. Dambinova S.A. Rapid multiple panel of biomarkers in laboratory blood tests for TIA/stroke, International Application No.PCT/US01/24248, from August, 2001

47. Dambinova SA, Khounteev GA, Skorometz AA. Multiple panel of biomarkers for TIA/stroke evaluation. Stroke 2002, 33 (5): 11811182

48. Dingledine R., McBain C.J. Glutamate and aspartate. In: Basic Neurochemistry. Molecular, cellular and medical aspects. 6th edition. (Siegel G.J., Agranoff B.W. et al., Eds.). Philadelphia: Lippincott-Raven, 1999,316-333

49. Douglas A., Montine Т., Valentine W., Graham D. Toxic responses of the nervous system. In: Toxicology. 6 edition. Klaassen C.D. ed. NewYork, USA: McGraw-Hill. 2001, 535-563

50. Dunah A.W., Yasuda R.P., Luo J., Wang Y.-H., Prybylowski K.L., Wolfe B.B. Biochemical studies of the structure and function of the N-methyl-D-aspartate subtype of glutamate receptors. Mol.Neurobiol. 1999;19: 151-159

51. During MJ, Symes CW, Lawlor PA, Lin J, Dunning J, Fitzsmons HL, Poulsen D, Leone P, Xu R, Dicker BL, Lapski J, Yoing D.

52. An oral vaccine against NMDAR1 with efficacy in experimental stroke and epilepsy. Science, 2000, 287: 1453-1459

53. Farrant M., Feldmeyer D., Takahashi Т., Cull-candy S.G. NMDA receptor single channel diversity in the developing cerebellum. Nature 1994; 368: 335-339.

54. Fisher M. The ischemic penumbra and the therapeutic time window. In: Cerebrovascular Disease. 4th edition. Fisher M., Bogousslavsky J. eds. Philadelphia: Current Medicine, Inc. 1999, 35-43

55. Frei K., Fontana, A. Neuroimmune Networks: Physiology and Diseases, Alan R.Liss, New York, 1989, pp. 127-132

56. Gagliardi R.J, Neuroprotection, excitotoxicity and NMDA antagonists. Arq Neuro-Psiquiatr. 2000;58:4-10.

57. Garthwaite J. Glutamate, nitric oxide and cell—cell signaling in the nervous system. Trends Ncurosci. 1991; 14: 60—67

58. Gingrich MB, Traynelis SF. Serine proteases and brain damage is there a link? Trends Neurosci. 2000; 23:399-407.

59. Ginsberg M. D., Graham D. I., Busto R. Regional glucose utilization and blood flow following graded forebrain ischemia in the rat. Correlation with neuropathology. Ann. Neurol. 1985; 18: 470-481

60. Ginsberg MD., Busto R. Rodent models of cerebral ischemia. Stroke. 1989; 20: 1627-1642

61. Globus M. К-Г., Busto R, Martinez L., Valdes ., Dietrich W. D. Ischemia induces release of glutamate in regions spared from histopathologic damage in the rat. Stroke. 1990; 21: 43-46

62. Gold S., Hennegriff M., Lynch O., Gall С. M. Relative concentrations and seizure-induced changes in mRNAs encoding three AMPA receptor subunits in hippocampus and cortex. J.Comp.Neurol. 1996; 365: 541-555.

63. Granstrem O.K., van Rijn Т., Voskuyl R.A., Dambinova S.A. Autoantibodies to fragment of AMPA/quisqualate glutamate receptor in rat model of epilepsy. Neirokhimia, 14(2):75-87, 1997.

64. Gusev E.I., Skvortsova V.I., Dambinova S.A., Raevskiy K.S., Alekseev A.A., Bashkatova V.G., Kovalenko A.V., Kudrin V.S., Yakovleva E.V. Neuroprotective effects of glycine for therapy of acute ischaemic stroke. Cerebrovasc. Dis. 2000; 10:49-60

65. Hatashita S., Hoff JT. and Ishii S. Focal brain edema associated with acute arterial hypertension. J. Neurosurg.1986; 64:643649

66. Harada M., Fuse A., Tanaka Y. Measurement of nitric oxide in the rat cerebral cortex during hypercapnoe. NeuroReport. 1997; 8: 9991002

67. Hill M.D, Jackowski G, Bayer N, Lawrence M, Jaeschke R. Biochemical markers in acute ischemic stroke Can.Med.Assoc.J. 2000; 162: 1139-1140

68. Hockfield S, Carlson S, Evans C, Levitt P, Pintar J. and Silberstein L. Selected methods for antibody and nucleic acid probes, Cold Springs Harbor Laboratory Press, New York, p. 344, 1993.

69. Honnorat J., Antoine JC, Derrington E, Aguera M. and Belin MF. Antibodies to a subpopulation of glial cells and a 66 kDa developmental protein in patients with paraneoplastic neurological syndromes. .J.Neurol, Neurosur.& Psychiatry. 1996, 61:270-278

70. Hopp T.P. and Woods K. R. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 1981;6: 3824-3828.

71. Hossman K-A. Animal models of cerebral ischemia. 1. Review of literature. Cerebrovasc.Dis. 1991; l(Suppl. 1):2-15

72. Hua Y, Xi G„ Keep R.F, Wu J, Jiang Y„ Hoff J.T. Plasminogen activator inhibitor-1 induction after experimental intracerebral hemorrhage. Cereb. Blood Flow & Met. 2002; 22: 55-61

73. Iadecola C, Zhang F, Xu S, Casey R, Ross M. E. Inducible nitric oxide syntheses gene expression in brain following cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow& Metab. 1995; 15: 378-384

74. Johansson В. Hardebo JE. Cerebrovascular permeability and cerebral blood flow in hypertension induced by gammahydroxybutyric acid. An experimental study in the rat. Acta Neurol. Scand. 1982; 65:448457

75. Johansson BB. Fredriksson K. Cerebral arteries in hypertension: structural and hemodynamic aspects. J.Cardiovasc.Pharm. 1985; Suppl 2:S90-93

76. Kamphuis W., De Rijk Т. C., Talamini L. M., Lopes da Silva F. H. Hippocampal kindling induces changes in the glutamate receptor mRNA expression patterns in dentate granule neurons. Eur. J. Neurosci. 1994; 6: 1119-1127.

77. Kamphuis W., Hendriksen H., Diegenhach P. C., Lopes de Silva F.H. N-Methyl-D-aspartate and kainate receptor gene expression in hippocampal pyramidal and granular neurons in the kindling model of epileptogenesis. Neuroscience 1995; 67: 551-559.

78. Kingman T.A., Mendelow A.D., Graham D.I., Teasdale G.M. Experimental intracerebral mass: description of model6 intracranial pressure changes and neuropathology. J.Neuropath.& Exp.Neurol. 1988; 48: 128-137

79. Lee K.R., Betz A.L., Kim S., Keep R.F., Hoff J.T. The role of the coagulation cascade in brain edema formation after intracerebral hemorrhage. Acta Neurochir. (Wien). 1996; 138: 396-401

80. Li F., Fisher M. Animal modeling for developing stroke therapy. In book: Fisher M. (ed) Stroke therapy, 2nd ed. Butterworth-Heinemann, Boston, MA, US. 2001, pp 83-96

81. Liberman A.P., Puis I., Fishbeck R.H. Mining the gemone for causes and cures of neurological disease. Trends Pharmacol. Sci. 2001; 22: 161-162

82. Lin .S.-Zl., Chiou JI.-L, Wang Y. Ketamine antagonizes nitric oxide release from cerebral cortex after middle cerebral artery ligation in rats. Stroke. 1996; 27: 747-752

83. Marler J.R. Early stroke diagnosis saves time. Annl. Emerg. Med. 1999,33:450-451

84. McNamara J.O. Cellular and molecular basis of epilepsy. J.Neurosci. 1994; 14: 3413-3422.

85. Meldrum B.S.The role of glutamate in epilepsy and other CNS disorders. Neurology. 1994, 44: 14-23.

86. Meldrum B.S. Glutamate as a neurotransmitter in the brain: review of physiology and pathology. JNutr. 2000; 130: S1007-S1015.

87. Monyer, H., Sprengel, R., Schoepfer, R., Herb, A., Higuchi, M., lomeli, H., Bunashev, N., Sakmann, В., Seeburg P. H. Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of subtypes. Science 1992; 256: 1214-1221

88. Newby LK. The emerging role of myoglobin for risk stratification. Editorial. American Heart Journal. 2001, 142: 4-6

89. Neumar R.W. Molecular mechanisms of ischemic neuronal injury. Ann Emergence Med. 2000; 36: 483-506

90. Ogura A., Akita K., Kuodo Y. Non-NMDA receptor mediates cytoplasmatic Ca 2+ elevation in cultured hippocampal neurons. NeurosciRes. 1990,9: 103-113.

91. Onodera H., Araki Т., Kogure K. Excitatory amino acid binding sites in the rat hippocampus after transient forebrain ischemia. J Cereb Blood Flow Metab 1989; 9:623-628

92. Parsons C.G., Danysz W., Quack G. Glutamate in CNS disorders as a target for drug development: An update// Drug News Perspect. -1998. -Vol. 11.- P.523-569.

93. Pelligrini-Giampietro D.E., Zukin R.S., Bennett M.V., Cho S., Pulsinelli W.A. Switch in glutamate subunit gene expression in CA1 subfield of hippocampus following global ischemia in rats. Proc Natl Acad Sci USA. 1992, 89: 10499-10500.

94. Pelligrini-Giampietro, D.E., Pulsinelli W.A., Zukin R.S. NMDA and non-NMDA receptor gene expression following global brain ischemia in rats: effect of NMDA and non-NMDA receptor antagonists. J Neurochem. 1994; 62: 1067-1073

95. Pellegrini-Giampietro D.E., Gorter J.A., Bennett M.V., Zukin R.S. The gluR-2 hypothesis: Ca2+-permeable AMP A receptors in neurological disorders. Trends Neurosci 1997; 20:464-470

96. Perez-Velazquez, J.L., Zhang L. In vitro hypoxia induces expression of NR2C subunit of the NMDA receptor in rat cortex and hippocampus. J Neurochem. 1994; 63: 1171-1173

97. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable. Anal.Biochem. 1977; 83: 346-356

98. Petralia R.S., Wang Y.OC, Wenthold R.J. The NMDA receptor subunits NR2A and NR2B show histological and ultrastructural localization patterns similar to those of NR1. J.Neurosci. 1994; 14:61026120

99. Pollard H., Heron A., Moreau J., Ben-Ari Y., Alteration of the GluR-B AMPA receptor subunit flip/flop expression in kainate-induced epilepsy and ischemia. Neuroscience. 1993, 57: 545-554.

100. Prince H. K., Conn P.S., Blackstone C. D., Huganir R. L., Levey A. I. Down-regulation of AMPA receptor subunit GluR2 in amygdaloid kindling. J. Neurochem. 1995; 64: 462-465.

101. Pulsinelli W.A., Brierley J.B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke. 1979; 10: 267-272

102. Pulsinelli W.A., Brierley J.B., Plum F. Tempora: profile of neuronal damage in a model of transient forebrain ischemia. Ann.Neurol. 1982;11:491-498

103. Pulsinelli W.A., Buchan A.M. The four-vessel occlusion rat model: method of complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation. Stroke. 1988; 19: 913-914

104. Rogers S.W., Andrews P.I., Gahring L.C., Whisenand Т., Cauley K., Crain В., Hughes B.E., Heinemann S.F., McNamara J.O.

105. Antibodies to glutamate receptor GluR3 in Rasmussen's encephalitis. Science. 1994, 265: 648-652.

106. Rosenbaum D. M., Grotta J. C„ Pettigrew L C., Ostrow P., Strong ., Rhoades H. Picone C.M., Grotta A.T. Balcofen does not protect against cerebral ischemia in rats. Stroke 1990; 21 : 138- 140

107. Rothman SM, Olney JW. Glutamate and the pathophysiology of hypoxic—ischemic brain damage. Ann Neurol. 1986;19:105-111.

108. Seabrook, T.J., Johnston, M. Hay, J.B. Cerebral spinal fluid lymphocytes are part of the normal recirculating lymphocyte pool. J. Immunol. 1998,91:100-107

109. Simmons M. L, Murphy S. Induction of nitric oxide synthase in glial cells. J. Neurochem. 1992; 59: 897-905

110. Smith M-L., Auer R.N., Siesjo B.K. The density and distribution of ischemic brain injury in the rat following 2-10 min of forebrain ischemia. Acta Neuropathol. 1984; 64: 319-332

111. Smith M-L., Bendek G., Dahlgreen N., et al. Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in rats. 2. A 2-vessel occlusion model. Acta Neurol.Scand. 1984; 69: 385-401

112. Schenone A. Mancardi GL. Molecular basis of inherited neuropathies Current Opinion in Neurology. 1999, 12: 603-616

113. Sugimoto A., Takeda A., Kogura K., Onodera H. NMDA receptor (NMDR1) expression in the rat hippocampus and forebrain ischemia. Neurosci Lett. 1994; 170:39-42.

114. Takeda H., Spatz M., Ruetzler C., McCarron R., Becker K., Hallenbeck J. Induction of mucosal tolerance to e-selectin prevents ischemic and hemorrhagic stroke in spontaneously hypertensive genetically stroke-prone rats. Stroke 2002; 33:2156-2164

115. Tagami M. Kubota A. Sunaga T. Fujino H. Maezawa H. Kihara M. Nara Y. Yamori Y. Increased transendothelial channel transport of cerebral capillary endothelium in stroke-prone SHR. Stroke. 1983; 14: 591-596

116. Toole JF. Cerebrovascular Disorders. 5 ed. New York, NY: Lippincott, Williams & Wilkins; 1999:542.

117. Twyman R.E., Gahring L.C., Spiess J., Rogers S.W. Glutamate receptor antibodies activate a subset of receptors and reveal an agonist binding site. Neuron 1995, 14: 755-762

118. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al. The sequence of the human genome. Science 2001, 291:1304-1351

119. Welling O. W., Weijer W. 3., van der Zee R., and Welling-Wester S. Choice of peptide and peptide length for the generation of antibodies reactive with intact protein. FEBS Lett. 1985; 188: 215-218

120. Wilmes FJ. Garcia JH. Conger KA. Chui-Wilmes E. Mechanisms of blood-brain barrier breakdown after microembolization of the cat's brain. J. Neuropath. & Exp. Neurol. 1983; 42: 421-438

121. Yang G.Y, Betz A.L., Hoff J.T. The effects of blood or plasma clot on brain edema in the rat with intracerebral hemorrhage. Acta Neurochir. (Wien). 1994; 60: 555-557109

122. Young, A.J, Hay, J.B. MacKay, C.R. Lymphocyte recirculation and life span in vivo. Curr.Top. Microbiol. Immunol. 1993, 184:161-173

123. Zea Longa E.L, Weinstein P.R. Carlson S, Cummins R. Reversible middle cerebral artery occlusion without cranirctomy in rats. Stroke. 1989; 20: 84-91