Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Матыс, Светлана Владимировна

• Матыс, Светлана Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Матыс, Светлана Владимировна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФОСФОНАТЫ И ИХ ДЕГРАДАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМАМИ.

1.1. Фосфонаты - фосфорорганические соединения с С-Р связью.

1.1.1. Природные и синтетические фосфонаты.

1.1.2. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов.

1.1.3. Ферменты, разлагающие фосфонаты с активированной С-Р связью.

1.2. Алкилфосфонаты с прямой неактивированной С-Р связью.

1.2.1. С-Р лиаза, разлагающая С-Р связь алкилфосфонатов.

1.2.2. Микроорганизмы - деструкторы алкилфосфонатов.

1.3. Физиологическая и генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов.

1.3.1. Физиологическая регляция разложения алкилфосфонатов.

1.3.2. Генетическая регуляция разложения алкилфосфонатов со стороны Pho регул она.

1.3.3. Гены, кодирующие разложение алкилфосфонатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Деградация метилфосфоната E.COLI: физиологические и биохимические аспекты»

Актуальность проблемы, Фосфорорганические соединения, имеющие углерод-фосфорную связь (С-Р) - фосфонаты, широко распространены среди природных соединений во всех царствах живых существ, а также среди химических веществ антропогенного происхождения - ксенобиотиков (гербицидов, компонентов химического оружия и т.д.)» бесконтрольно поступающих в окружающую среду и становящихся ее токсикогенным фактором. Углерод-фосфорная связь, особенно неактивированная С-Р связь алкилфосфонатов, очень устойчива к химическому гидролизу, термальному разрушению и фотолизу, и расщепляется только прокариотическими микроорганизмами за счет функционирования фермента С-Р лиазы. В отличие от ферментов, разлагающих фосфонаты с активированной С-Р связью (такие как фосфоноацетат и аминоэтилфосфонат), которые выделены и хорошо охарактеризованы, функционирование С-Р лиазаы выявлено только в интактных клетках. Обнаружить ее активность в бесклеточных экстрактах пока достоверно не удалось. Поэтому фермент до сих пор не выделен и не изучен, а механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути не известен и мало понятен, являясь лишь предметом теоретических дискуссий.

Поиск путей биодеградации алкилфосфонатов с прямой связью С-Р и понимание молекулярных механизмов этого процесса является актуальной проблемой физико-химической биологии, исследование которой необходимо и для решения практических задач биотехнологии защиты окружающей среды. Потребность в решении этих задач возросла в связи с всемирной программой уничтожения химического оружия, в состав которого входят и соединения с С-Р связью. Сказанное определяет как теоретическую, так и практическую значимость исследования проблемы разложения алкилфосфонатов бактериями.

Состояние проблемы. Способность бактерий использовать алкилфосфонаты в качестве единственного источника фосфора известна сравнительно давно (Zeleznick et al., 1963; Harkness, 1966; Cook et al, 1978; Wackett et al, 1987; Lee et al, 1992). Однако особенно большой интерес к процессу деградации Рп возник лишь в последние годы в связи с экологическими проблемами и с задачами ликвидации химического оружия. До недавнего времени исследователи уделяли внимание лишь скринингу микроорганизмов, способных разлагать алкилфосфонаты, типичным представителем которых является метилфосфонат (Рп), а также изучению генетической характеристики системы. В результате выявлены микроорганизмы способные к деградации Рп (Hidaka et al., 1990; Kamigiri et al, 1992; Nakashita et al, 2000). Проведено картирование и молекулярное клонирование phnipsiD) генов, ответственных за С-Р лиазную активность и разложение Рп у Е. coli (Wanner and Boline, 1990; Metcalf and Wanner, 1993) и у Rhisobium (Parker et al, 1999). Показано, что за использование фосфонатов клетками Е. coli отвечает кластер из 14 генов - одна из наиболее крупных транскрипционных единиц Е. coli, а экспрессия некоторых из этих генов контролируется РЬо-регулоном и экзогенным ортофосфатом (Wackett et al, 1987). Эти данные являются основой для изучения различных аспектов проблемы, ранее практически не рассматривавшихся. Так локализация С-Р лиазы в клетке, специфичность этого фермента и механизм его действия практически неизвестны, а немногочисленные попытки обнаружить С-Р лиазную активность in vitro пока не увенчались успехом (McMullan et al, 1991; Murata et al, 1988; Murata et al, 1989). Однако иденитифицировать С-Р лиазную активность in vitro, понять механизм разложения алкилфосфонатов по С-Р лиазному пути невозможно без знания физиологической и биохимической регуляции этого процесса в клетках бактерий. Оно позволило бы так же оптимизировать процесс разложения и послужило бы основой для развития биотехнологий детоксификации этих соединений в окружающей среде. Однако сколько-нибудь систематических исследований в этой области до сих пор не проводилось.

Цель настоящей работы - выявить физиологические и биохимические особенности разложения алкилфосфонатов бактериями на примере грамотрицательной бактерии Escherichia coli.

У этой бактерии впервые была выявлена способность разлагать метилфосфонат (Рп) и хорошо изучена генетическая система, контролирующая этот процесс.

В задачи исследования входили:

1) сравнительный анализ разложения Рп различными штаммами Е. coli;

2) изучение особенностей адаптации клеток Е. coli к Рп;

3) селекция и характеристика клеток, адаптированных к Рп;

4) поиск физиологических и биохимических факторов, влияющих на разложение Рп различными штаммами Е. coli;

5) изучение разложения Рп рекомбинантными штаммами Е. coli, содержащими клонированные гены С-Р лиазного комплекса, кодирующие этот процесс;

6) выявление белков С-Р лиазного комплекса и изучение их локализации.

Научная новизна работы. Большинство данных, полученных в настоящей работе, является новыми. Впервые показано, что длительный латентный период при выращивании клеток на среде, содержащей Рп в качестве единственного источника фосфора, связан с адаптацией клеток к Рп, которая подробно изучена. Показано, что адаптация происходит эффективнее при 30°С, чем при 37°С, но не зависит от концентрации Рп и сопровождается изменением физиологических и морфологических характеристик клеточной популяции. Впервые проведена селекция адаптированных клеток, что существенно повышает скорость разложения Рп и рост клеток на этом субстрате. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli: возраст культуры, температура культивирования, аэрация, рН среды и УФ-лучи. Определены оптимальные условия для разложения Рп: низкое парциальное давление кислорода, 30°С, рН=8 и логарифмическая фаза роста культуры.

Путем анализа белкового состава рекомбинантных штаммов с клонированными в плазмидах генами С-Р лиазного комплекса впервые выявлены белки этого комплекса и их распределение между субклеточными фракциями. Впервые установлено, что повышенный синтез белков С-Р лиазного комплекса в условиях индукции кодирующих генов, не приводит к увеличению активности С-Р лиазы и разложения Рп, что свидетельствует о существовании факторов неизвестной природы, лимитирующих этот процесс и не связанных с количеством белков С-Р лиазного комплекса.

Научно-практическое значение. Полученные в работе новые данные расширяют наше представление о физиологической и биохимической регуляции процесса разложения алкилфософнатов клетками бактерий, что послужит основой для оптимизации биосинтеза С-Р лиазы и ее дальнейшего исследования in vitro с целью понимания механизма разложения алкилфосфонатов. Результаты могут быть полезны при разработке биотехнологий биоремедиации почв.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Матыс, Светлана Владимировна

ВЫВОДЫ

I 1. Различные штаммы Е. coli способны разлагать Рп по С-Р лиазному механизму с образованием метана в отсутствие других источников фосфора. Процессу предшествует длительный период адаптации.

2. Адаптация клеток к Рп происходит эффективнее при 30°С, чем при 37°С, но не зависит от концентрации Рп в среде и сопровождается специфическими изменениями морфологии клеточной популяции.

3. Селекция адаптированных клеток значительно повышает скорость роста клеток на Рп и его разложения. Однако при использовании Рп в качестве единственного источника фосфора этот субстрат потребляется не полностью (не более 50% от внесенного в среду). Pi остается наиболее предпочтительным источником фосфора для роста даже адаптированных к Рп клеток.

4. Выявлены новые факторы, влияющие на разложение Рп клетками Е. coli. Оптимальными условиями для этого процесса являются: низкое парциальное давление кислорода, 30°С, рН=8 и логарифмическая фаза роста культуры.

5. Показано, что увеличение содержания белков С-Р лиазного комплекса при индукции экспрессии их генов в составе плазмид не приводит к повышенному разложению Рп, свидетельствуя о наличии факторов, ограничивающих этот процесс и не связанных с количеством белков С—Р лиазного комплекса.

6. Путем сравнения белкового состава клеток исходных и рекомбинантных штаммов Е. coli выявлены белки С-Р лиазного комплекса, соответствующие по молекулярным массам продуктам р/ш-генов. Белки

Ф локализованы во всех компартментах клетки и являются преимущественно растворимыми.

3.7. Заключение

• В настоящей работе на примере грамотрицательной бактерии Е. coli, у которой ранее впервые была выявлена способность разлагать алкилфосфонаты, проведен систематический анализ физиологических и биохимических факторов, влияющих на динамику процесса и его эффективность. Адаптация к Рп и селекция адаптированных клеток позволила существенно повысить скорость процесса. Оптимальными условиями этого процесса, выявленными в работе, является рост клеток при 30°С, при низком парциальном давлении кислорода и рН среды, равном 8. Процесс стимулируется УФ облучением и происходит более интенсивно в логарифмической фазе роста культуры. Повышенный синтез белков С—Р лиазного комплекса не приводит к повышению С-Р лиазной активности клеток и разложению ими метилфосфоната. Выявленные закономерности, к сожалению, не позволяют ответить на вопрос, почему разложение Рп не т происходит полностью. Вся совокупность фактов свидетельствует о существовании факторов, лимитирующих процесс разложения Рп. Этими факторами не являются: количество белка (С-Р лиазы), проницаемость наружной мембраны, токсичность Рп для клетки. Полученные данные позволяют предположить, что некоторые из этих лимитирующих факторов могут накапливаться при переходе к стационарной стадии роста. Не исключено, что этими факторами являются интермедиаты реакции, или какие-то кофакторы, содержание которых ограничено в данных условиях культивирования. Мы так же, к сожалению, не смогли ответить на вопрос, почему разложение Рп не происходит in vitro, бесклеточными экстрактами этой бактерии. Присутствие большинства белков С-Р лиазного комплекса в растворимом состоянии (в цитоплазме и периплазме) частично снимает остроту вопроса о необходимости сохранения интактности мембраны для функционирования С-Р лиазного комплекса при получении бесклеточного экстракта. Отсутствие положительной зависимости между концентрацией клеток и разложением ими Рп, характерной для ферментных систем, а так же независимость процесса от количества белков, катализирующих этот процесс, подтверждают, что лимитирующим фактором процесса являются какие-то кофакторы, или субстраты систем, сопряженные с С-Р лиазной реакцией, а так же, возможно, интермедиаты самой реакции. Дальнейший поиск этих факторов, который уже проводится в лаборатории, будет способствовать не только дальнейшей оптимизации процесса разложения бактериями алкилфосфонатов, но и выяснению его механизма.

Накопление фундаментальных знаний о механизме биодеградации фосфорорганических соединений с С-Р связью послужат, в свою очередь, основой для создания биотехнологии деградации токсических органофосфорных соединений со стабильной С-Р связью, бесконтрольно поступающих в окружающую среду в виде гербицидов и других продуктов хозяйственной деятельности человека.

87

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Матыс, Светлана Владимировна, 2003 год

1. Вершинина О.А. и Знаменская Л.В. Pho регулоны бактерий. Микробиология, 2002, 71, 581-595.

2. Викторова JI.C., Арзуманов А.А., Широкова Е.А., Ясько М.В., Александрова Л.А., Шипицын А.В., Скоблов А.Ю. и Краевский А.А., Модифицированные нуклеозид-5-трифосфаты с повышенной стабильностью к дефосфорилирующим ферментам. Мол. Биол., 1998, 32, 162-171.

3. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко М.Н. и Октябрьский О.Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli. Микробиология, 1998, 67, 594-600.

4. Досон Р.М.К., Элиот Д.К., Элиот В.Х. и Джонс К.М. Справочник биохимика. Мир, Москва, 1991,354-369.

5. Кононова С.В. и Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами. Биохимия, 2002, 67, 220-233.

6. Нифантьев Э.Е. Химия фосфорганических соединений. Изд-во МГУ, Москва. 1971.

7. Несмеянова М.А., Гонина С.А., Кулаев И.С. и Северин А.И. Метаболическая регуляция некоторых фосфогидролаз Е. coli. Микробиология, 1974,43, 955-960.

8. Allen J.G., Atherton F.R., Hall M.J., Hassall C.H., Holmes S.W., Lambert R.W., Nisbet L.J. and Ringrose P.S. Phosphonopeptides, a new class of synthetic antibacterial agents. Nature, 1978, 272, 56-58.

9. Amemura M., Makino K., Shinagawa A., Kobayashi A. and Nakato A. Nucleotide sequence of the genes involved in phosphate transport and regulation of the phosphate regulon in Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1985, 184, 241-250.

10. O.Ames G.F.-L. Lipids of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structure and metabolism. J. Bacterid., 1968, 95, 833-839.

11. Avila L.Z., Draths K.M. and Frost J.W. Metabolites associated with organophosphonate C-P bond-cleavage — chemical synthesis and microbial-degradation of (P-32) ethylphosphonic acid. Bioorg. Med. Chem. Lett., 1991,1,51-54.

12. Baer E. and Stanacev N.Z. Phosphonolipids. V. Synthesis of phosphonic acid analogues ofL-alphalecithins. J. Biol. Chem., 1965, 240,3754-3759.

13. Bardin S., Dan S., Osteras M. and Finan Т. M. A phosphate transport system is required for symbiotic nitrogen fixation by Rhizobium meliloti. J. Bacterid., 1996, 178, 4540-4547.

14. Bayer E., Gugel K.H., Hagele K., Hagenmaier H., Jessipow S., Konig W.A. and Zahner Z. Phosphonothricin and phosphonothricyl-alanyl-alanine. Helvetica Chimica Acta, 1972, 55,224-239.

15. Bode R. and Birnbaum D. Specificity of glyphosate action in Candida-Maltosa. Biochem. Physiol. Pflanzen., 1989, 184, 163-170.

16. Bowman E.D., Mc Queeney M.S., Barry R.J., and Dunaway-Mariano D. Purification and characterisation os the Tetrahymena pyriformis P-C bond forming enzyme phosphoenolpyruvate phosphomutase. Biochemistry, 1990, 29, 7059-7063.

17. Branum M.E., Reardon J.T. and Sancar A. DNA repair exicision nuclease attacks undamaged DNA. A potential source of spontaneous mutations. J. Biol. Chem., 2001, 276, 25421-25426.

18. Brzoska P., Rimmele M., Brzostek K. and Boos W. The pho regulon-dependent Ugp uptake system for glycerol-3-phosphate in Escherichia coli is trans inhibited by Pi. J. Bacteriology, 1994, 176, 15-20.

19. Bujacz В., Wieczorek P., Krysko-Lupicka Т., Golab Z., Lejczak B. and Kavfarski P. Organophosphonate utilization by the wild type strain of Penicillium notatum. Appl. Envir. Microbiol., 1995, 61, 2905-2910.

20. Chan F.Y. and Torriani A. PstB protein of the phosphate-specific transport system of Escherichia coli is an ATPase. J.Bacteriol., 1996,178,3974-3977.

21. ChaIvardjian A. and Rudnicki E. Determination of lipid phosphorous in the nanomolar range. Anal. Biochem., 1970, 36,225-226.

22. Cook A.M., Daughton C.G. and Alexander M. Phosphanate utilization by bacteria. J. Bacteriol., 1978, 133, 85-90.

23. Cordeiro M.L., Pompliano D.L. and Frost J.W. Degradation and detoxification of organophosphonates: cleavage of the carbon to phosphorus bond. J. Am. Chem. Soc., 1986, 108,332-334.

24. Dumora C., Lacoste A.-M. and Cassaigne A. Purification and properties of 2-aminoethylphosphonate: pyruvate aminotransferase from Pseudomonas aerogenosa. Eur. J. Biochem., 1983, 133, 119-125.

25. Egli T. (An)aerobic breakdown of chelating agents used in household detergents. Microbiol.Sci., 1988, 5, 36-41.

26. Fest C. and Schmidt K.-J. Organophosphorus pesticides. 1982. Springer-Verlag, Berlin Fine, Sprecker. Fleisch W. Bisphosphonates. Pharmocology and use in treatment of tumor-induced hypercalcaemia and metastatic bone disease. Drugs, 1991,42, 919-944.

27. Freedman L.D. and Doak G.O. The preparation and properties of phosphonic acids. Chem. Rev., 1957, 57, 479-523.

28. Frost J.W., Loo S., Cordeiro M.L. and Li D. Radical-based dephosphorylation and organophosphonate biodegradation. J. Am. Chem. Soc., 1987, 109,2166-2171.

29. Garen A. and Levinthal C. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. coli. I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. BBA, 1960, 38, 470-483.

30. Han J.S„ Park J.V., Lee Y.S., Thony B. and Hwang D.S. PhoB-dependent transcriptional activation of the iciA gene during starvation for phosphate in E.coli. Mol.Gen. Genet., 1999, 262, 448-452.

31. Harkness D.R. Bacterial growth on aminoalkylphosphonic acids. J. Bacteriol., 1966, 92, 623-627.

32. Hasegawa S., Tamari M. and Kametaka M. Isolation of diacylglyceryl-2-aminoethylphosphonate from bovine liver. J Biochem (Tokyo), 1976, 80, 531-535.

33. Hayes V.E., Ternan N.G. and McMullan G. Organophophonate metabolism by a moderately halophilic bacterial isolate. FEMS Microbiol. Lett., 2000, 186, 171-175.

34. Hidaka Т., Imai S., Нага O., Anzai H., Murakami Т., Nagaoka K. and Seto H. Carboxyphosphonoenolpyruvate phosphonomutase, a novel enzyme catalyzing C-P bond formation. J Bacteriol., 1990, 172, 3066-3072.

35. Hidaka Т., Hidaka M., Kuzuyama T. and Seto H. Sequence of a P-methyltransferase-encoding gene isolated from a bialaphos-producing Streptomyces hygroscopicus. Gene, 1995, 158, 149-150.

36. Hilderbrand R.L. and Henderson T.G. Phosphonic acids in nature. In: The role of phosphonates in living systems. Ed R.L.HiIderbrand, 1983, 5-30. C.R.C. Press, Inc., Boca Raton, Florida.

37. Horiguchi M., and M. Kandatsu. Isolation of 2-aminoethane phosphonic acid from rumen protozoa. Nature, 1959, 184,901-902.

38. Jaworski E.G. Mode of action of N-phosphonomethylglycine: inhibition of aromatic amino acid biosynthesis. J. Agric. Food Chem., 1972, 20, 11951198.

39. Jiang W., Metcalf W.W., Lee K.S., and Wanner B.L. Molecular cloning of the genes for phosphonate breakdown by the phosphonatase pathway of Salmonella typhimurium LT2. J. Bacterid., 1995, 177, 6411-6421.

40. Kamigiri K., Hidaka Т., Imai S., Murakami T. and Seto H. Studies on the biosynthesis of bialaphos (SF-1293) 12. C-P bond formation mechanism of bialaphos: discovery of a P-methylation enzyme. J. Antibiot (Tokyo), 1992, 45,781-787.

41. Kasahara M., Makino K., Amemura M., Nakata A. and Shinagawa H. Dual regulation of the ugp operon by phosphate and carbon starvation at two interspaced promoters. J. Bacteriol., 1991, 173, 549-558.

42. Kertesz M., Elgorriga A. and Amrhein N. Evidence for two distinct phosphonate-degrading enzymes (C-P lyases) in Arthrobacter sp.GLP-1. Biodegradation, 1991,2, 53-59.

43. Kim S.K., Wilmes-Riesenberg M.R. and Wanner B.L. Involvment of the sensor kinase EnvZ in the in vivo activation of the response-regulator PhoB by acetyl phosphate. Mol. Microbiol., 1996, 22, 135-147.

44. Kitteredge J.S., Roberts E. and Simonsen D.G. Occurrence of free 2AEP in he sea anemone, Anthopleura elegantissima. Biochemistry, 1962, 1, 624625.

45. Kittredge J.S. and Roberts E. A carbon-phosphorus bond in nature. Science, 1969,164,37-42.

46. Krzysko-Lupicka Т., Strof W., Kubs K., Skorupa M., Wieczorek P., Lejczak B. and Kafarski P. The ability of soil-borne fungi to degrade organophosphonate arbon-to-phosphorus bonds. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 48, 549-552.

47. Kulakova A.N., Kulakov L.A., Akulenko N.V., Ksenzenko V.N., Hamilton J.T. and Quinn J.P. Structural and functional analysis of the phosphonoacetate hydrolase (phn A) gene region in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacteriol, 2001, 183, 3268-3275.

48. Kulakova A.N., Wisdom G.B., Kulakov L.A. and Quinn J.P. The purification and characterization of phosphonopyruvate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond cleavage enzyme from Variovorax sp Pal2. J. Biol. Chem., 2003, 278, 23426-23431.

49. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, 227, 680-685.

50. La Nauze J.M., Rosenberg H. and Shaw D.C. The enzymic cleavage of the carbon-phosphorus bond: purification and properties of phosphonatase. Biochim Biophys Acta., 1970,212,332-350.

51. La Nauze J.M., Coggins J.R. and Dixon H.B.F. Aldolase-like imine formation in the mechanism of action of phosphonoacetaldehyde hydrolase. J. Biochem., 1977, 165,409-411.

52. Lee P.J., Joy K.W., Ramos J.L. and Guerrero M.G. The action of 2-amino-4-(methylphosphinyl)-butanoic acid (phosphinothricin) and its 2-oxo-derivative on the metabolism of cyanobacteria and higher plants. Phytochemistry, 1984, 23, 1-6.

53. Lee,K.S., Metcalf W.W. and Wanner B.L. Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter aerogenes. J Bacteriol., 1992, 174, 2501-2510.

54. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, 193, 265275.

55. Magbanua J.P., Fujisawa K., Ogawa N. and Oshima Y. The homeodomain protein Pho2p binds at an A/T-rich segment flanking the binding site of the basic-helix-loop-helix protein Pho4p in the yeast Pho promoters. Yeast., 1997, 14, 1299-1308.

56. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kimura S. and Nakata A. Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli: activation of the pstS transcription by PhoB protein in vitro. J. Mol. Biol., 1988,203, 85-95.

57. Makino К., Shinagawa H., Amemura M., Kawamoto Т., Yamada M. and Nakata A. Signal transduction in the phosphate regulon of Escherichia coli involves phosphotransfer between PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol., 1989,210, 551-559.

58. Makino, K., Kim S.-K., Shinagawa H., Amemura M. and Nakata A. Molecular analysis of the cryptic and functional phn operons for phosphonate use in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol., 1991, 173, 26652672.

59. McGrath J.W., Wisdom G.B., McMullan G., Larkin MJ. and Quinn J.P. The purification and properties of phosphonoacetate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond-cleavage enzyme from Pseudomonas fluorescens 23F. Eur.J.Biochem., 1995, 234, 225-230.

60. McGrath J.W., Hammerschmidt F., Quinn J.P. Biodegradation of phosphonomycin by Rhizobium huakuii PMY1. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64,356-358.

61. McMullan G. and Quinn J.P. In vitro characterization of a phosphate starvation independent C-P bond cleavage activity in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacteriol., 1994, 176, 320-324.

62. McMullan G., Watkins R., Harper D.B. and Quinn J.P. Carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of Enterobacter aerogenes ATCC 15038 and Pseudomonas sp. 4ASW. Biochem. Int., 1991, 25, 271279.

63. McMullan G. and Quinn J.P. Detection of a novel carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of an environmental Pseudomonasfluorescens isolate. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, 184, 10221027.

64. Metcalf W.W., Steed P.M. and Wanner B.L. Identification of phosphate starvation-inducible genes in Escherichia coli K-12 by DNA sequence analysis of psi::lacZ(Mudl) transcriptional fusions. J. Bacteriol., 1990, 172, 3191-3200.

65. Metcalf W.W. and Wanner B.L. Involvement of the Escherichia coli phn ipsiD) gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite, Pi esters, and Pi. J. Bacteriol., 1991,173, 587-600.

66. Metcalf W.W. and Wanner B.L. Mutational analysis of an Escherichia coli fourteen-gene operon for phosphonate degradation, using TnphoA elements. J. Bacteriol., 1993, 175,3430-3440.

67. Metcalf W.W. and Wolfe R.S. Molecular genetic analysis of phosphite and hypophosphite oxidation by Pseudomonas stutzeri WM88. J. Bacteriol., 1998, 180,5547-5558.

68. Miura T. and Mizushima S. Separation by density gradient centrifugation of two types of membrane from spheroplast membrane of E. coli. BBA, 1968, 150, 159-161.

69. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F. and Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products. Environ.Health Perspect, 1999, 107, 933-974.

70. Murai and Tomizawa C. Chemical transformation of S-benzyl O-ethyl phenylphosphonothiolate (Inezin) by ultraviolet light. J. Environ. Sci. Health, 1976,11,185-197.

71. Murata K., Higaki N. and Kimura A. Detection of carbon-phosphorus lyase activity in cell extracts of Enterobacter aerogenes. Biochem. and Biophis. Res.Communs., 1988, 157, 190-195.

72. Murata K., Higaki N. and Kimura A. A microbial carbon-phosphorus bond cleavage enzyme requires twu protein components for activity. J. Bacteriol., 1989, 171,4504-4506.

73. Nakashita H., Shimazu A., Hidaka Т., and Seto H. Purification and characterisation of phosphoenolpyruvate phosphomutase from PseudomonasgladioliB-l. J. Bacteriol., 1992, 174, 6857-6861.

74. Pancrazio J.J., Keefer E.W., Ma W., Stenger D.A., Gross G.W. Neurophysiologic effects of chemical agent hydrolysis products on cortical neurons in vitro. Neurotoxicology, 2001,22,393-400.

75. Parker G.F., Higgins T.P., Hawkes T. and Robson R.L. Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti phn genes: characterization and identification of their protein products. J Bacteriol, 1999, 181,389-395.

76. Pipke R., Amrhein N., Jacob G.S. and Kishore G.M. Metabolism of glyphosate by an Arthrobacter sp. GLP-1. European Journal of Biochemistry, 1987, 165, 267-273.

77. Pipke R. and Amrhein N. Carbon-phosphorus lyase activity in permeabilized cells of Arthrobacter sp. GLP-1. FEMS Microbiol Lett., 1988,236, 135-138.

78. Pollack S.J., Freeman S., Pompliano D.L. and Knowles J.R. Cloning, overexpression and mechanistic studies of carboxyphosphonoenolpyruvate muase from Streptomyces hydros copicus. European Journal of Biochemistry, 1992,209, 735-743.

79. Quinn J.P., Peden J.M.M. and Dick R.E. Carbon-phosphorus bond cleavage by gram positive soil bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 31, 283287.

80. Radicella J.P., Park P.U., Fox V.S. Adaptive mutation in Escherichia coli: a role for conjugation. Science, 1995, 268, 418-420.

81. Rao N.N., Torriani A. Utilization by Escherichia coli of a high-molecular-weight, linear polyphosphate: roles of phosphatases and pore proteins. J. Bacteriol., 1988,170, 5216-5223.

82. Rao N.N. and Kornberg A. Inorganic polyphosphate regulates responses of Escherichia coli to nutritional stringencies, environmental stresses and survival in the stationary phase. Prog. Mol. Subcell. Biol., 1999, 23, 193195.

83. Reinolds E.S. The use of lead citrate of high pH as an electronopaque stain in electrone microscopy. J. Cell. Biol., 1963,17, 208-212.

84. Sambrook J., Fritch E. and Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989,319.

85. Scnaitman C. Solubilization of the cytoplasmic membrane of E. coli by Triton-ХЮО. J. Bacteriol., 1971, 108, 545-552.

86. Schowanek D. and Verstraete W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples. AppI.Environ.Microbiol., 1990, 56, 895-903.

87. Selvapandiyan A. and Bhatnagar Raj K. Isolation of glyphosate-mQlaboWsmgPseudomonas: detection, partial purification and localization of carbon-phosphorus lyase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994,40, 876-882.

88. Shinabarger D.L. and Braymer H.D. Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. strain PG2982. J Bacteriol., 1986, 168, 702-703.

89. Siedel H.M., Freeman S., Seto H., and Knowles J.R. Phosphonate Biosynthesis Isolation of the Enzyme Responsible for the Formation of a Carbon Phosphorus Bond. Nature, 1988, 335, 457-458.

90. Small M.J. Compounds formed from the chemical decontamination of HD, GB, and VX and their environmental fate. Tech Rpt8304; AD A149515.

91. Fort Detrick, MD:U.S. Army Medical Bioengineering Research and

92. Development Laboratory, 1984.

93. Smith J.D. and Lepak N.M. Purification and characterization of phosphonic acid containing glycoprotein from the cell membranes of Tetrahymena. Arch. Biochem. Biophys., 1982, 213, 565-572.

94. Smith J.D. Metabolism of Phosphonates. In: The role of phosphonates in living systems (Hilderbrand, R.L., ed.) CRC Press, Boca Raton, 1983, 3154.

95. Steed P.M. and Wanner B.L. Use of the rep technique for allele replacement to construct mutants with deletions of the pstSCAB-phoU operon: evidence of a new role for the PhoU protein in the phosphateregulon. J Bacteriol., 1993,175, 6797-809.

96. Stevens J.B., de Luca N.G., Beringer J.E., Ringer J.P., Yeoman K.H. and Johnston A.W. The purmn genes of rhizobium-leguminosarum and a superficial link with siderophore production. Mol. Plant Microbe Interact., 2000, 13,228-231.

97. Surin B.P., Rosenberg H. and Cox G.B. Phosphate-specific transport system of Escherichia coli: nucleotide sequence and gene-polypeptide relationship. J. Bacteriol., 1985, 161, 189-198.

98. Tan S.A. and Tan L.G. Distribution of ciliatine (2-aminoethylphosphonic acid) and phosphonoalanine (2-amino-3-phosphonopropionic acid) in humantissues. Clin. Physiol. Biochem., 1989, 7,303-309.

99. Ternan N.G. and McMullan G. The utilization of 4-aminobutyiphosphonate as sole nitrogen source by a strain of Kluyveromyces fragilis. FEMS Microbiol Lett. 2000, 184,237-240.

100. Ternan N.G.1 and Quinn J.P. In vitro cleavage of the carbon-phosphorus bond of phosphonopyruvate by cell extracts of an environmental Burkholderia cepacia isolate. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1998, 248, 378-381.

101. Ternan N.G.2 and Quinn J.P. Phosphate starvation-independent 2-aminoetylphosphonic acid biodegradation in a newly isolated srain of Pseudomonasputida, NG2. Syst. Appl. Microbiol., 1998, 21,346-352.

102. Ternan N.G., McGraff J.W., McMullan G. and Quinn J.P.

103. Organophosphonates: occurrence, synthesis and biodegradation by microorganisms. World J. Microbiol.Biotechnol., 1998, 14, 635-647.

104. Torriani A. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by Escherichia coli. BBA, 1960, 38, 460-466.

105. Torriani A. Alkaline phosphatase from Escherichia coli. In: Procedures in Nucleic Acid Research. Eds Gantoni G., Davis R. New York: Harper and Row, 1966, 224-234.

106. Tyhach R. J., Engel R. and Tropp. B. Metabolic fate of 3,4-dihydroxybutyl-l-phosphonate in Escherichia coli. Formation of novel lipid, the phosphonic acid analogue of phosphotidilglycerophosphate. J. Biol. Chem., 1976,251,6717-6723.

107. Van Bogelen R.A., Olson E.R., Wanner B.L. and Neidhardt F.C. Global analysis of proteins synthesized during phosphorus restriction in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1996, 178,4344-4366.

108. Wackett L.P., Shames S.L., Venditti C.P. and Walsh C.T. Bacterial carbon-phosphorus lyase: products, rates, and regulation of phosphonic and phosphinic acid metabolism. J. Bacteriol., 1987(a), 169, 710-717.

109. Wanner B.L. Is cross regulation by phosphorylation of two-component response regulator proteins important in bacteria. J. Bacteriol., 1992, 174, 2053-2058.

110. Wanner B.L. Gene regulation by phosphate in enteric bacteria. J. Biol. Chem., 1993,51,47-54.

111. Wanner B.L. Molecular genetics of carbon-phosphorus bond cleavage in bacteria. Biodegradation, 1994, 5, 175-184.

112. Wanner B.L. and Boline J.A. Mapping and molecular cloning of the phn (psiD) locus for phosphonate utilization in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1990, 172, 1186-1196.

113. Wanner B.L. and Metcalf W.W. Molecular genetic studies of a 10.9-kb operon in Escherichia coli for phosphonate uptake and biodegradation. FEMS Microbiol Lett., 1992, 79, 133-139.

114. Wanner B.L. and Wilmes-Riesenberg M.R. Involvement of phosphotransacetylase, acetate kinase, and acetyl phosphate synthesis in control of the phosphate regulon in Escherichia coli. J Bacteriol., 1992, 174, 2124-2130.

115. Wassef M.K. and Hendrix J.W. Ceramide aminoethylphosphonate in the fungus Pythium prolatum. BBA, 1976, 486, 172-178.

116. Yakovleva G.M., Kim S.-K. and Wanner B.L. Phosphate-independent expression of the carbon-phosphorus lyase activity of Escherichia coli. Appl. Mocrobiol. Biotechnol., 1998,49, 673-678.

117. MO.Zboinska E., Maliszewska I., Lejczak, B. and Kafarski P. Degradation of organophosphonates by Penicillium citrinum. Lett. Appl. Microbiol., 1992, 15,269-272.

118. Zeleznick L.D., Myers T.C. and Titchener E.B. Growth of E. coli on methyl- and ethyl-phosphonic acids. BBA, 1963, 78, 546-547.