Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор химических наук Скоблов, Юрий Самойлович

• Скоблов, Юрий Самойлович
• доктор химических наук
• 2010

Оглавление диссертации доктор химических наук Скоблов, Юрий Самойлович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Методы синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

1.1.Методы синтеза [у-32(33)Р] NTP.

1.1.1. Химические методы.

1.1.2. Химико-ферментативные методы.

1.1.3. Ферментативные методы.

1.2.Синтез нуклеозид-5'-[а-32(33)Р]трифосфатов.

1.2.1. Синтез нуклеозид [5' -32(33)Р]монофосфатов.

1.2.1.1. Химические методы синтеза нуклеозид -[5'-32(33)Р]монофосфатов.

1.2.1.2. Ферментативные методы синтеза нуклеозид -[5'-32(33)Р]монофосфатов.

1.2.2. Методы фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33)Р]монофосфатов до нуклеозид-5' - [а-32(33)Р]трифосфатов.

1.2.2.1. Химические методы.

1.2.2.2. Ферментативные методы.

2. Нуклеотидкиназы - ферменты, фосфорилирующие (d)NMP.

2.1.Бактериальные АТФ: нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы.

2.2.АТФ: нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы млекопитающих.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

1.1 Синтез нуклеозид-5'-[у-32(33)Р] трифосфатов.

1.1.1. Синтез [у-32Р]АТР реакцией «обмена».

1.1.2. Синтез [у-32Р]АТР по прямой реакции из ADP.

1.1.3. Синтез [y-32P]NTP конверсией из [у-32Р]АТР.

1.2 Синтез нуклеозид-5'-[а-32(33)Р] трифосфатов.

1.2.1 Синтез нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов химическим фосфорилированием.

1.2.2 Ферментативный синтез нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов.

1.2.3. Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов.

1.3 Очистка нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

2. Разработка критериев качества нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

2.1 Основные критерии качества меченых соединений.

2.2 Биологическая активность - дополнительный критерий качества меченых соединений.

3. Создание ферментативной базы для производства нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

3.1. Ферменты для синтеза [у- Р]АТР.

3.2. Ферменты для синтеза [5'-32(33)P](d)NMP.

3.3 Ферменты для фосфорилирования [5'-32(33)P](d)NMP.

3.3.1 Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli.

3.3.2 Свойства нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

3.3.3 Свойства дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5.

3.4 Фермент для фосфорилирования [5'-32(33)P](d)NDP.

4. Радиопротектор для 32(33)Р-меченых нуклеотидов.

5. Технологическая линия по получению нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6. Получение модифицированных нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6.1 Синтез модифицированых нуклеозид-5'-[а-32(33)Р] трифосфатов терминаторов биосинтеза ДНК.

6.2. Синтез нуклеозид-5'-[Р~ Р] (ди)трифосфатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы и ферменты.

1.2. Хроматографические сорбенты и колонки.

1.3. Непромышленные препараты.;.

2. Методы.

2.1. Приготовление раствора триэтиламмоний бикарбоната (ТЕАВ).

2.2. Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ Е. coli.

2.3. Определение активности нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.4. Определение нуклеотиддефосфорилирующих примесей в препаратах нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.5. Определение оптимума рН для реакций, катализируемых нуклеозидмонофосфаткиназами.

2.6. Определение влияния ионов двухвалентных металлов на активность нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.7. Изучение субстратной специфичности нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.8. Определение концентрации белка.

2.9. Очистка цитидилаткиназы Е. coli MRE-600 до гомогенного состояния.

2.10. Методы электрофореза.

2.10.1. Электрофорез белков.

2.10.2. Электрофорез нуклеиновых кислот.

2.11. Тестирование биологической активности [у-32Р] NTP и [а-32Р] (d)NTP.Ill

2.11.1. Тестирование биологической активности у- Р] NTP

2.11.2. Тестирование биологической активности [а- Р] NTP.

2.11.3. Тестирование биологической активности [а-Р] dNTP.

2.11.3.1. Метод «ник-трансляции».

2.11.3.2. Метод случайной затравки.

2.12. Ферментативный синтез [а-32Р] (d)NTP.

2.13. Хроматографическая очистка [у-32(33)Р] NTP и [a-32(33)P](d)NTP.

2.13.1. Хроматографическая очистка на колонках с PEI-целлюлозой.

2.13.2. Ионообменная ВЭЖХ.

2.13.3. Обратно-фазовая ВЭЖХ.

2.14. Химическое фосфорилирование нуклеозидов.

2.14.1 Общая методика синтеза 3,-азидо-2',3'-дидезокситимидин-[5'- Р]-фосфата ([5'-32Р] AzTMP) активацией TPSC1, TCN, DCC и МСС.

2.13.2. Синтез З'-азидо^'З'-дидезокситимидин-^'- Р]-фосфата активацией

BrCN.

2.13.3 Препаративное химическое фосфорилирование нуклеозидов.

ВЫВОДЫ.

Список сокращений.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора»

Использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в биологических, исследованиях начиналось в середине XX века с применения Р-ортофосфата для введения радиоактивной «метки» в нуклеиновые кислоты. С помощью радиоактивного фосфора была однозначно показана роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче генетической информации [1,2,3]. Вместе с другими вирусологическими и рентгеноструктурными исследованиями в этой области был дан мощный импульс к возникновению и развитию молекулярной биологии. Одновременно расширились сферы применения и номенклатура соединений, меченных фосфором-32, а позднее - и фосфором-33. Благодаря исследованиям матричного синтеза ДНК и РНК на первое место среди используемых соединений, меченных фосфором-32, вышли предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот — нуклеозид-5'-трифосфаты. Разработка и развитие методов секвенирования ДНК в 70-х годах значительно изменили объем и характер исследований, проводимых в области молекулярной генетики, молекулярной биологии и биотехнологии [4,5,6]. Потребление нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, в первую очередь аденозин-5'- [у- Р] трифосфата, 2'-дезоксиаденозин-5'- [а- Р] трифосфата и 2'-дезоксицитидин-5'- [а- Р] трифосфата, в мире в 80-х годах достигло очень большой величины — до 10 Ки ежемесячно. Создание флуоресцентных автоматических секвенаторов и внедрение их в рутинную повседневную практику существенно снизило потребление меченых фосфором нуклеотидов, однако, в целом, разнообразные исследования с использованием радиоактивных изотопов фосфора остаются в методическом арсенале ученых.

Главными преимуществами методов, в которых используются соединения, меченные радиоактивным фосфором, являются их высокая чувствительность и специфичность. Краткие характеристики радионуклидов

32 33

Р и Р, приведенные в табл.1, показывают, что оба радиоактивных изотопа фосфора обладают энергией излучения р-частиц, достаточной для уверенной регистрации и количественного измерения с эффективностью 90-95%. Высокая молярная активность, как теоретически возможная, так и практически достижимая, позволяют достигать достоверного обнаружения и измерения 10"15 моль меченого вещества. Для изучения метаболизма соединений в клетке или организме, исследования специфичности взаимодействия молекул и молекулярных механизмов ферментативных реакций не менее важным фактором является идентичность меченых и немеченых соединений. Использование радиоактивных «меток» в таких исследованиях предпочтительнее флуоресцентных или других химических модификаций, так как замена атома фосфора-31 на радиоактивный фосфор-32 (или 33) вносит минимальные изменения в структуру «меченой» молекулы и, как правило, не приводит к искажению изучаемых молекулярных процессов.

Таблица 1. Характеристики радионуклидов фосфора.

Физические характеристики Фосфор-32 Фосфор-33

Период полураспада, сутки 14.3 25.4

Максимальная энергия р-излучения, Мэв 1.7 0.2

Теоретическая молярная активность, Ки/мАт 9130 5200

Максимальная практическая молярная активность меченных фосфором соединений, Ки/ммоль 7000-8000 4500-5000

Высокая чувствительность в сочетании с высокой специфичностью и простотой реализации делают использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, по-прежнему, важнейшим и распространенным инструментом исследователей.

Технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, имеют свои специфические проблемы и ограничения.

1. Высокая молярная активность вынуждает проводить синтезы с

8 9 количеством радиоактивного изотопа 10" — 10" моля, что соответствует активности 10-100 мКи.

2. Реакции, используемые для синтеза меченых соединений, не должны приводить к неконтролируемому изотопному разбавлению нерадиоактивным фосфором-31, и местоположение радиоактивного атома должно быть строго зафиксировано.

3. Фосфор-32 и фосфор-33 являются реакторными изотопами, т.е. нарабатываются в результате облучения соответствующих мишеней в нейтронном потоке ядерного реактора, и, при получении этих изотопов с максимально высокой молярной активностью, в ходе первичной переработки облученного радиоактивного сырья получается ортофосфорная кислота, меченная фосфором-32 или фосфором-33, соответственно. Следовательно, схемы получения любых соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, основываются на использовании в качестве исходного радиоактивного соединения (радиоактивного сырья) 32(33)Р-ортофосфорной кислоты.

4. Низкая концентрация радиоактивного вещества требует использования большого избытка нерадиоактивных компонентов для увеличения скорости и выхода реакции, что часто приводит к появлению побочных соединений.

5. При высокой объемной активности (1-10 Ки/мл) в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать.

6. Количество синтезируемых веществ слишком мало, чтобы использовать классические методы органического синтеза (перегонка, кристаллизация, осаждение и т.д.) и существенно ограничивает возможности использования физико-химических методов анализа: ЯМР-спектрометрию, масс-спектрометрию, УФ и ИК-спектроскопию.

7. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению техники радиационной безопасности и вынуждает проводить технологический процесс в соответствующих защитных боксах.

Среди методов синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, можно выделить химические, химико-ферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментом для проведения сложных радиохимических синтезов. Основным ограничением ферментативных и химико-ферментативных методов синтеза является отсутствие высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными энзимологическими исследованиями.

Следует подчеркнуть, что по уровню радиохимических работ, включая производство различных радионуклидов, к концу 70-х годов XX века наша страна занимала лидирующее положение в мире. База, имеющаяся в стране по наработке и выделению из мишеней реакторных и циклотронных изотопов, охватывала широкий спектр радионуклидов и не имела аналогов. Однако, биохимические аспекты получения соединений, меченных радиоактивными изотопами, существенно отставали от радиохимических разработок.

Целью настоящего исследования было создание технологий серийного производства нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, для обеспечения исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе не менее 100 мКм по радиоактивному сырью.

2. Разработка методов очистки целевых соединений.

3. Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта.

4. Создание ферментативной технологической базы, необходимой для реализации технологии получения нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

5. Внедрение разработанных методов в серийное производство.

6. Создание эффективного радиопротектора, обеспечивающего увеличение срока годности синтезированных меченых соединений.

7. Разработка, согласование и утверждение нормативно-технической документации, необходимой для серийного производства.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Скоблов, Юрий Самойлович

выводы

1. На основании проведенных исследований создана и внедрена в серийное производство ферментативная технология синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33 в альфа- и гамма-положении.

2. Разработана и внедрена технология очистки меченых нуклеотидов с использованием обратно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме.

3. Разработаны критерии качества и методы контроля качества для производимых нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, которые были закреплены в ТУ 95 2665-97 ЛУ. Впервые для контроля качества радиохимической продукции был введен критерий биологической активности меченых соединений.

4. Создана ферментативная база для синтеза и контроля качества меченых нуклеозид-5'-трифосфатов.

5. Показана возможность применения ферментов для синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, модифицированных по углеводной части молекулы и меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6. Разработаны методы введения радиоактивных изотопов фосфора в синтетические аналоги нуклеозидов.

7. Разработан и внедрен новый радиопротектор на основе цианкобаламина (витамин В12), обеспечивающий увеличение срока годности нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33.

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Скоблов, Юрий Самойлович, 2010 год

1. Tessman J.// Virology - 1959 - Vol. 7 - P. 263.

2. Rubenstein J., Thomas C.A. Jr., Hershey A.D. // Proc.Nat. Acad. Sci. U.S. -1961 Vol. 8-P. 1113.

3. Hershey A.D., Kamen M. D., Kennedy J. W., Gest H., (1951), The mortality of bacteriophages containing assimilated radioactive phosphorous, // J.Gen.Physiol. — 1951-Vol. 34-P. 305.

4. Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA.// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1977 - Vol. 74 - P. 560

5. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977 - Vol. 74 - P. 5463.

6. A.C. Краев, К.Г. Скрябин Методы изучения первичной структуры нуклеиновых кислот. В сб. Итоги науки и техники. Молекулярная биология. М. 1980 т.12 - ч.П - С. 141-195.

7. Левин В.И. Получение радиоактивных изотопов. Атомиздат, М., 1972.

8. Т. Форстер, JI. Буршич «Получение нуклеотидов, меченных 32Р, путем биосинтеза».: Тез. докл. II Симпозиум стран-членов СЭВ «Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами» Ленинград, 1981, ЦНИИ Атоминформ, Москва, 1982 С. 157.

9. R.B. Hurlert and N.B. Furlong Biosyntetic preparation of 32P labeled nuecleoside-5 '-triphosphates// Methods Enzymology 1967 - XII Part A - P. 192202.

10. A.M. Moffat Chemical syntheses of specifically a-, P- and у- 32P labeled nuecleoside-5'-triphosphates// Methods Enzymology 1967 - XII Part A - P. 182192.

11. A. Janecka, H. Panusz, J. Pankowski and W. Koziolkiewicz Chemical Synthesis of Nucleoside- y- 32p. Triphosphates of High Specipic Activity// Preparative Biochemistry and Biotechnology 1980 - Vol. 10 - (1) - P. 27 — 35.

12. S.M. Hecht J.W. Kozarch A Chemical synthesis of adenosine 5'-y-32P. triphosphate// Biochimica et Biophysca Acta 1973 - Vol. 331 - P. 307-309.

13. Lucien Bettendorff, Hoang-Oanh Nghiem, Pierre Wins, Bernard Lakaye A general method for the chemical synthesis of y-32P-labeled or unlabeled nucleoside 5'-triphosphates and thiamine triphosphate// Analytical Biochemistry — 2003-Vol. 322-P. 190-197.

14. I.M.Glynn, J.B.Chappell A Simple Method for the Preparation of 32P-Labelled Adenosine Triphosphate of High Specific Activity// Biochem.J. 1964 - Vol. 90 -P. 147-149

15. A.M. Maxam, W. Gilbert Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.// Methods Enzymology, Part I 1980 - Vol. 65 - P. 499-518

16. M.Stupar, V.Leskovac // Jogoslav. Physiol. Pharmacol. Acta 1982 - Vol.18 -P. 269.

17. K.Schendel, M.Wells The Synthesis and Purification of y-32P. -Adenosine Triphosphate with High Specific Activity// J. Biol. Chem. 1973 - Vol. 248 - P. 8319

18. Walseth TF, Johnson RA. The enzymatic preparation of alpha-32P.nucleoside triphosphates, cyclic [32P]AMP, and cyclic [32P] GMP// Biochim. Biophys. Acta 1979-Vol. 562-(1)-P. 11-31.

19. Banschke K.G. Patent DDR № 212391, 1984.

20. J. Linn Patent PCT № 0577 255 A2, 1994.

21. Symons R.H. Modified procedure for the synthesis of 32P-labelled ribonucleoside 5'-monophosphates of high specific activity.// Biochim. Biophys. Acta 1968 - Vol. 155 - (2) - P. 609-610.

22. Biebricher С.К. A simple procedure for the synthesis of a-32P.-nucleoside triphosphates.// Anal. Biochem. 1979 - Vol. 95 - (2) - P. 429-432.

23. Anthony E. Reeve and Ru Chih C.Huang A method for the enzymatic synthesis and purification of a-32P. nucleoside triphosphates.// Nucleic Acids Res. 1979 -Vol. 6-(1)-P. 81-90.

24. Symons R.H. Preparation of a-32P.nucleoside and deoxynucleoside 5'-triphosphates from 32Pi and protected and unprotected nucleosides.// Biochim. Biophys. Acta 1969 - Vol. 190 - (2) - P. 545-557.

25. Пумпен П.П., Тауринь В.Э., Грен Э.Я. Синтез нуклеотидов in vitro ферментами бесклеточного экстракта Escherihia coli. // Биохимия — 1974 — т.39 №3 - С. 504-511.

26. Рихтер В.А., Рабинов И.В., Кузнецов С.А., Павлий Т.Б., Скоблов Ю.С. Выделение и некоторые свойства нуклеозидмонофосфаткиназ из ESCHERICHIA COLI.// Приклад, биохим. микробиол.- 1988 т. XXIV - №3 -С. 310-318

27. Lehman I.R.,Bessman M.J., Simms E.S., Komberg A. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherihia coli.// J.Biol.Chem. 1958 - Vol. 233 - (1) - P. 163-170.

28. Correction and Addition Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB).// Eur.J.Biochem. 1980 - Vol. 104 - (1) - P. 3.

29. Lehman I.R., Bessman M.J., Simms E.S., Kornberg A. Preparation of substrates and partial purification of an enzymes from Escherihia coli.// J. Biol. Chem. 1958 - Vol. 233 - (1) - P. 163-170.

30. Hurwits J. The enzymatic incorporation of ribonucleosides into polydeoxynucleotides material.// J. Biol. Chem. 1959 - Vol. 234 - (9) - P. 2351-2358.

31. Bresler A.E., The preparation of labelleduridine-5'-triphosphates by the action of mono- and diphosphokinase from Escherihia coli.// Biochem. Biophys. Acta -1962 Vol. 61 - (1) - P. 29-33.

32. Hiraga S., Sugino Yu. Nucleoside monophosphokinases of Escherihia coli infected and uninfected with an RNA phages.// Biochem. Biophys. Acta 1969 — Vol. 119-(2)-P. 416-418.

33. M.P. Oescher and M.J. Bessman Purification and properties of guanylate kinase from E. coli.// J. Biol. Chem. 1966 - Vol. 241 - (2) - P. 5453-5460

34. Gentry D., Bengra C., Ikehara K. & Cashel M. Guanylate kinase of Escherichia coli K-12.// J. Biol. Chem. 1993 - Vol. 268 - P. 14316-14321.

35. Nelson D.J., Carter Ch.E. Purification and characterization of thymidine 5'-monophosphate from Escherihia coli B.// J. Biol. Chem. 1969 - Vol. 244 - (19) -P. 5254-5262.

36. Holmes,R.K. and Singer,M.F. Purification and characterization of adenylate kinase as an apperent adenosine triphosphate dependnt inhibitor of ribonuclease II in Escherchia coli.// J. Biol. Chem. - 1973 - Vol. 246 - P. 2014-2021.

37. M.Brune, R.Schumann and F.Wittinghofer Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherchia coli.// Nucleic Acids Res. 1985 - Vol. 13-(19)-P. 7139-7151.

38. I.S. Girons, A-M. Gilled, D. Margarita, S. Michelsonl, M. Monnot, S. Fermandjian, A. Danchin, and O. Barzu Structural and Catalytic Characteristics of Escherichia coli Adenylate Kinase.// J. Biol. Chem. 1987 - Vol. 262 - (2) - P. 622-629.

39. Watanabe K., Fukumoto H., Isoi K. Intracellular localization of ATP: AMP phosphotranspherase in Escherchia coli.// Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1986 Vol. 134 - (2) - P. 527-531.

40. Marco-Marin C., Rubio V. The site for the allosteric activator GTP of Escherichia coli UMP kinase. // FEBS Lett. 2009 - Vol. 583 - (1) - P. 185-189.

41. Yamanaka K., Ogura T., Niki H., and Hiraga S. Identification and Characterization of the smbA Gene, a Suppressor of the mukB Null Mutant of Escherichia coli.// J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - P. 7517-7526.

42. Huang S. H., Tang A., Drisco B., Zhang S. Q., Seeger R., Li C., Jong A. Human dTMP kinase: gene expression and enzymatic activity coinciding with cell cycle progression and cell growth.// DNA Cell Biol. 1994 - Vol. 13 - P. 461471.

43. Lee, L. S., Cheng, Y. Human thymidylate kinase. Purification, characterization, and kinetic behavior of the thymidylate kinase derived from chronic myelocytic leukemia. //J. Biol. Chem. 1977 - Vol. 252-P. 5686-5691.

44. Su, J. Y., Sclafani, R. A. Molecular cloning and expression of the human deoxythymidylate kinase gene in yeast.// Nucleic Acids Res. 1991 - Vol. 19 - P. 823-827.

45. Arima T., Akiyoshi H. and Fujii S. Characterization of pyrimidine nucleoside monophosphokinase in normal and malignant tissues. Cancer Res. — 1977 Vol. 37-P. 1593-1597.

46. Klelly R.K. Purification and Properties of Thymidine Monophosphate Kinase from Mouse Hepatoma. // J. Biol. Chem. 1970 - Vol. 245 - P. 4204-4212.

47. Maness P., Orengo A. A pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from rat liver. //Biochemistry 1975 - Vol. 14-P. 1484-1489.

48. Van Rompay A.R., Johansson M., Karlsson A. Phosphorylation of deoxycytidine analog monophosphates by UMP-CMP kinase, molecular characterisation of the human enzyme. // Mol. Pharmacol. 1999 - Vol. 56 — P. 562-569.

49. Hande K.R. and Chabner B.A. Pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from human leukemic blast cells. // Cancer Res. 1978 - Vol. 38 - P. 579-585.

50. Scott E.M. and Wright R.C. Kinetics and equilibria of pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from human erythrocytes. // Biochim. Biophys. Acta -1979-Vol. 571-P. 45-54.

51. Shimono H., Sugino Y. Metabolism of desoxyribonucleotides. Purification and properties of deoxyguanosine monophosphokinase of calf thymus, // Eur. J. Biochem.-1971-Vol. 19-P. 256-263.

52. Agarwal K. C., Miech R. P., Parks R. E. Jr. Guanylate kinases from human erythrocytes, hog brain and rat liver. // Methods Enzymol. 1978 Vol. 51 - P. 483 -490.

53. Zschocke, P. D., Schiltz, E., and Schulz, G. E. Purification and sequence determination of guanylate kinase from pig brain. // Eur. J. Biochem. 1993 - Vol. 213-P. 263-269.

54. Hall S., Kiihn H. Purification and properties of guanylate kinase from bovine retinas and rodouter segments. // Eur. J. Biochem. 1986 - Vol. 161 - P. 551-556.

55. Galdarov I.O., Suslov O.N., Ovchinnikova T.V., Abdulaev N.G. Guanylate kinase from bovine retina: isolation, primary structure, and expression in E. coli. // BioorgKhim.- 1994-Vol. 20-(4)-P. 367-381.

56. Richard E. Boehme Phosphorylation of the antiviral precursor9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine monophosphate by guanylate kinase isoenzyme. // J. Biol. Chem. 1984 - Vol. 259 - P. 12346-12349.

57. Noda L. and Kuby S.A. Adenosine triphosphate adenosine monophosphate transphosphorilase (myokinase). // J. Biol. Chem. - 1957 - Vol. 226 - P. 541-549.

58. Heil A., Muller G., Noda L., Pinder T., Schirmer I., Schirmer R. H., and Von Zabern, I. The amino-acid sequence of porcine adenylate kinase from skeletal muscle. // Eur. J. Biochem. 1974 - Vol. 43 - (1) - P. 131-144.

59. Thuma E., Schirmer R.H. & Schirmer I. Preparation and characterization of crystalline human ATP:AMP phosphotransferase. // Biochim. Biophys. Acta -1972-Vol. 268-(1)-P. 83 -91.

60. Tamura T., Shiraki H. and Nakagawa H. Purification and characterization of adenylate kinase isozymes from rat muscle and liver. // Biochim. Biophys. Acta -1980 Vol. 612 - (1) - P. 56-66.

61. Noda L., Schulz G.E. & von Zabern I. Crystalline adenylate kinase from carp muscle. // Eur. J. Biochem. 1975 - Vol. 51 - (1) - P. 229-235.

62. Markland F.S. & Wadkins, C.L. Adenosine triphospate adenosine 5'-monophosphate phosphotransferase of bovine liver mitichondria. // J. Biol. Chem. - 1966 - Vol. 241 - (18) - P. 4136-4145.

63. Sapico V., Litwack G. & Criss W.E. Purification of rat liver adenylate kinase isizyme II and comprison with isozyme III. // Biochim. Biophys. Acta 1972 -Vol. 258-(2)-P. 436-445.

64. Hamada M., Sumida M., Okuda H., Watanabe Т., Nojima M., and Kuby, S.A. Adenosine Triphosphate-Adenosine-5'-monophosphate Phosphotransferase from Normal Human Liver Mitochondria. // J. Biol. Chem. 1982 - Vol. 257 - P. 13120-13128.

65. Chiga M. & Plaut G.W. E. Purification and properties of an adenosine triphosphate adenosine monophosphate transphosphorylase from swine liver. // J. Biol. Chem. - 1960 - Vol. 235 - (11) - P. 3260-3265.

66. Itakura Т., Watanabe K., Shiokawa H. & Kubo S. Purification and characterization of acidic adenylate kinase in porcine heart. // Eur. J. Biochem. — 1978 Vol. 82 - (2) - P. 431 - 437.

67. A. G. Tomasselli, R.H. Schirmr, and L.H. Noda Mitochondrial ATP :AMP Phosphotransferase from Beef Heart : Purification and Properties. // Eur. J. Biochem. 1980 - Vol. 103 - P. 481-491.

68. Tsuboi, К. K. & Chervenka, С. H. Adenylate kinase of human erythrocyte. // J. Biol. Chem. 1975 - Vol. 250 - (1) - P. 132- 340.

69. Tomasselli A.G. & Noda L.H. Mitochondrial GTP-AMP Phosphotransferase. 1. Purification and Properties. // Eur. J. Biochem. 1979 - Vol. 93 - P. 263 - 270.

70. Hamada M., and Kuby S. A. Studies on adenosine triphosphate transphosphorilase. // Arch. Biochem. Biophys. 1978 - Vol. 190 - (2) - P. 772792.

71. Rhoads, D. G., and Lowenstein, J. M. Initial velocity and equilibrium of myokinase. // J. Biol. Chem. 1968 - Vol. 243 - (14) - P. 3963-3972.

72. И.К. Духницкая Получение набора ферментов для синтеза у-32(33)Р. АТР.// Дисс.канд.биол.наук. ЛТИ им. Ленсовета, Ленинград — 1991.

73. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Абдукаюмов М., Петренко Т.Д., Козлов А.В. Способ получения аденозин-5'- трифосфата, меченного радиоактивными изотопами фосфора в гамма- положение // Авторское свидетельство 1986 - № 245965

74. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Петренко Т.Д., Волкова И.И., Абдукаюмов М. Способ одновременного получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32(33) в альфа и гамма положение// Авторское свидетельство — 1988 № 281100

75. Микулинская Г.В., Мирошников А.И., Скоблов Ю.С., Скоблова Н.А., Третьякова С.Ю., Феофанов С.А. Способ синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении. // Патент РФ 2009 № 2355768

76. Hayashi F, Hatano O, Shinozawa T Preparation of highly concentrated superhot gamma-32P.ATP using small-scale ion-exchange chromatography. // Radioisotopes. 1987 - Vol. 36 - (7) - P. 347-350.

77. Lucien Bettendorff, Hoang-Oanh Nghiem, Pierre Wins, Bernard Lakaye A general method for the chemical synthesis of y-32P-labeled or unlabeled nucleoside 5'-triphosphates and thiamine triphosphate. // Anal. Biochem. 2003 -Vol. 322-(1)-P. 190-197.

78. Ажаев A.B., Абдукаюмов M., Гнучев Н.В., Краевский А.А., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П. Способ очистки нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32(33) // Авторское свидетельство 1987 - № 247519

79. Кузнецов С.А., Ли В.А., Осинский В.Ф., Петренко Т.Д., Рабинов И.В., Скоблов Ю.С., Рихтер В.А. Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33// Авторское свидетельство — 1991 № 1715218

80. Richardson, С. С. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. // Proc.Nat. Acad. Sci. — 1965 Vol. 54 -(1)-P. 158-165.

81. Lillehaug, J. R. and Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. // Biochem. 1975 - Vol. 14 - (6) - P. 1225-1225

82. Feinberg A.P., Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity.// Anal Biochem. 1983 - Vol. 132 - (1) — P. 6-13.

83. Абдукаюмов М., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П.К. Способ выделения нуклеозидмонофосфаткиназ // Авторское свидетельство 1986 - № 1274295

84. M.J.Bessman, S.T.Herriot, M.J.V. Bibber Orr THE ENZYMOLOGY OF VIRUS-INFECTED BACTERIA. VI. PURIFICATION AND PROPERTIES OF THE DEOXYNUCLEOTIDE KINASE INDUCED BY BACTERIOPHAGE T5. // J.Biol.Chem. 1965 - Vol. 240 - (1) - P.439-445

85. Mikoulinskaia G.V., Gubanov S.I., Zimin A.A.,Kolesnikov I.V.,Feofanov S.A., Miroshnikov A.I.Purification and characterization of the deoxynucleoside monophosphate kinase of bacteriophage T5. // Protein Expr. Purif 2003 - Vol. 27 -P. 195-201

86. R.E. O'Brien, N.R. Tzodikov. // Patent US 1983 - № 4390517.

87. N.R. Tzodikov Patent US 1983 - №4411881.

88. Скоблов Ю.С., Лосев А.П., Сметанин Э.Я., Фределинг Жан Пьер, Королев А.Э., Гжива Надина Способ получения водных растворов препаратов, меченных р- радионуклидами. // Патент РФ 1998 - № 2104035.

89. Y. Furuichi and A. J. Shatkin A simple method for the preparation of P-32P.purine nucleoside triphosphates. // Nucleic Acids Res. 1977 - Vol. 4 - (10) -P. 3341-3355

90. Скоблов М.Ю., Ясько М.В., Скоблов Ю.С. Получение 32Р-меченных 2-метилтио-аденозин ди- и трифосфатов.// Биоорган, химия — 1999 — т.25 — N 9- С.702-707

91. А.Н. Warner. A simple and inexpensive method for the preparation of |3,y-32P. guanosine 5'-triphosphate. // Biochim. Biophys. Acta 1975 - Vol. 383 - P. 229-235.

92. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976 - Vol. - 7 - (1) - P. 248-254.

93. Laemmly U.K., Favre M. Maturation of the head of backteriopage T4. DNA packaging events. // J. Mol. Biol. 1973 - Vol. 80 - (2) - P. 575-599.

94. Holbrook I.B., Leaver A.G., A procedure to increase the sensitivity of staining by coomassie brilliant blue G-250 perchloric acid solution. // AnaLBiochem. - 1976 - Vol. 75 - (2) - P. 634-636.

95. Л.А.Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, изд. Московский центр непрерывного математического образования. Москва -2002-С. 112.

96. Schenbom, Е.Т. and Mierendorf, R.C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: Dependence on template structure. // Nucl. Acids Res.- 1985 Vol. 13 - P. 6223-6236.