Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Лаасри Мажид

• Лаасри Мажид
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лаасри Мажид

Оглавление

стр

Глава 1. Введение

Глава 2, Обзор литературы: Вирусы папилломы человека как модель

изучения молекулярных механизмов канцерогенеза.

2Л, Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе 9 V человека

2,2 Регуляция транскрипции вирусных генов

2.3.Трансформирующие гены вирусов папиллом 19 2.3,1, Ген Еб 19 23.2. Ген Е7

2.4. Функциональная кооперация онкобелжов Е-6 и Е7

Глава 3. Материалы и методы

3.1, Список использованных растворов и сред 3!

3 ^-Молекулярное клонирование

3.2 Л -Ферменты 3

3,2.2-Бактериальные штаммы и плазмиды

32.3-Трансформация бактерий Е.еоН. плазмидной ДНК

а). Получение компетентных клеток

б). Введение в клетки шгазмидной ДНК

3.2.4, Выделение плазмидной ДНК

3.2.5, Рестрикция и яигирование 37 3 2,6. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов

3.2.7. Секвенирование

3.2.8. Эяектрофоретическое разделение продуктов ееквенирования 38 в денатурирующем полиакрнламндном геле (ПААГ)

3.2.9. Амплификация ДНК 3

3.2.10. Клонирование генов Е6 и Е7 НРУ18

3.2.11. Сайт-направленный мутагенез

3.3. Получение и анализ культур клеток млекопитающих

3.3.1. Плазмиды и векторы

3.3.2. Клеточные линии 46 3.3,3 Трансфекция клеток млекопитающих

3.3.4. Выделение РНК и ДНК с помощью гуанидин изотиоцианата

3.3.5. Препаративное выделение специфических фрагментов 48 ДНК и:? агарозных гелей

3.3.6. Препаративный электрофорез ДНК в агарозных гелях

3.3.7. Г ибридизация 49 3.3.7.1. Перенос ДНК из геля на нейлоновый фильтр (НуЬош! М+)

3.3.7.2. Получение молекулярных ДНК-зондов

3.3.7.3. Гибридизация ДНК, иммобилизованной на фильтрах

3.3.7.4. Авторадиография j I

3.3.7.5. Пробы для гибридизации 5 i 3.3.8. RT-PCR 51 3.33, Биологические свойства

3.3 3 ■. 1, Рост клонов

3.3.9.2. Измерение времени удвоения и насыщения плотности

клеточной популяции

3.3.9.3. Культивирование клеток в полужидкой среде

3.3.9.4. Введение клеток в сингенны крыс (линия Фишер)

Глава 4. Результаты исследования

4.1, Введение

4 2, Молекулярное клонирование

4.2.1, Анализ последовательностей вставки в шхазмиде рС7

4.2.2, Субкяонировшгае генов Бб и Б?

а). Ген Еб

о). Ген Е7

4.2.3, Получение и клонирование новых мутантных вариантов гена Е7 68 HPV тип 18.

4.3. Исследование биологической активности клонированных генов

4,3 Л, Трансфекция чувствительных клеток

4.3.2, Идентификация последовательностей трансфицированных генов

4.3.2.1. Саузерн б лот гибридизация

4.3.2.2. Полимер азная цепная реакция (PCR) 78 43. Экспрессия генов Еб и Е7 в трансфицированных клетках

4.3.4. Характеристики роста полученных клонов

4.3.5. Анализ морфологии клеток

4.3.6. Субстратная зависимость размножения клеток

4.3.7. Анализ туморогенности полученных клонов 90 Глава 5. Обсуждение результатов 93 Глава 6. Выводы 98 Глава 1, Список литературы J

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

HPV вирус папиллом человека

EMBI, - Европейский Банк данных молекулярной биологии

€Ш - интразпителиальная днеплазия

URR -регуляторный район HPV

pRB -белковый продукт гена ретинобластом ы

МЦ -метил-целлюлоза

н.п. - нуклеотидная пара

тл.я. -тысяча иуклеотидных пар

ФНГ1 -фланкирующая последовательность

CR -консервативный район

ND •• анализ не проводился.

pRB bdg - сайт связывания ретинобластомы бедка

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологический потенциал мутантных вариантов генов Е6 и Е7 вируса папиллом человека тип 18»

/ ловя 1* Введение

Вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим фактором ори раке шейки матки , Многочисленные данные свидетельствуют о том. что генетический материал этих вирусов присутствует практически во всех опухолях этой локализации, причем превалирующим среди них являются HPV !6 и 18 типов* За последне годы достигнуты существеные успехи в пониманий механизмов действия этих вирусов. Оказалось что ключевую роль в этом процессе иг рают 2 вирусных гена Е6 и Е7, которые нарушают функции основных генов, контролирующих размножение клеток, т.е. генов» супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла. Гены Еб и Е7 клонированы и секвенированы. получено достаточное количество как делециошшх, так н точечных мутантов этих генов. Благодарим этому имеется достаточно подробная информация о роли отдельных участков указанных генов в проявлении трансформирующих потенций, однако эта информация в основном касается генов Еб и Е7- HPV 16 типа и имеется сравнительно мало данных о генах HPV 18 тина.

В силу этого целью настоящего исследования было изучение биологического потенциала генов Еб и Е7 HPV 18 типа, т.к. существует предположение о том, что HPV именно этого типа обнаруживается в более агрессивных опухолях шейки матки. Тема настоящей работы является

актуальной как в теоретическом, так и в практическом плане, т.е. получение любого генетического маркера, обладающего биологическим эффектом на грансфицированные им клетки, является необходимым для дальнейшего прогресса биологии, медицины и онкологии в частности. Для выполнения этой задачи были использование экспериментальные модели, полученные в лаборатории молекулярной биологии вирусов ранее: иммортализованые клетки крыс IE5 и плазмида рС7, содержащая гены Её и Е7, обладающая трансформирующим эффектом на эти клетки. Гены Еб и Б? HPV (В были субклонированны и установлено, что эти гены в дополнение к нескольким бессмысленным мутациям, содержат по одной точечной мутации в С концевой области. С помощью сайт - направленного мутагенеза было получено еще 2 варианта гена Е7 по доменам CR1 и CR2 и показано, что точечная мутация по кодону 24 (CR2 домен) элиминирует трансформирующий потенциал вируса. Таким образом, полученные нами клоны генов Е6 и Е7 дополняют коллекцию существующих вариантов этих генов и получение результаты нереданы в Европейский Банк Молекулярной Биологии (EMB L).

1 шва 2. Обзор шжершпуры Вирусы попито мы человека как модель изучения молекулярных механизмов канцер о генз а,

2.1. Генетическая структура вирусов папиллом и их роль в канцерогенезе у человека.

За последние десятилетие особый интерес к изучению вирусов папиллом вполне объясним. После того как в середине 70-х годов было высказано предположение [1], что вирусы папиллом человека (HPV) являются этиологическим агентом рака шейки, эта область вирусологии и онкологии подучила стремительное развитие. С одной стороны, это привело к твердым доказательствам этнологической роли HPV при данной формы рака, что окончательно подтверждено в Бюллетене Всемирной Организации Здравоохранение [2], а с другой -способствовало стремительному прогрессу в анализе не только вирусов этой группы, но и механизмов превращения нормальной клетки в опухолевую под действием этих вирусов,

В настоящем обзоре мы не ставили своей задачей представление всех данных по доказательству роли HPV в возникновении раки шейки матки, таких как частота встречаемости вирусной ДНК в опухолях, экспрессия этой ДНК. форма ее персистентнии. эпидемиологические данные (об этом

подробно см. раздел 2.3), а хотели бы акцентировать особое внимание на тех вирусных генах, которые играют ключевую роль в процессах злокачественной трансформации клеток.

Известно более 100 типов вирусов папиллом человека [3]. Одной из наиболее характерных особенностей вирусов этой группы является отсутствие адекватной чувствительной клеточной модели для их размножения, поэтому подавляющее большинство вирусов этой группы идентифицированы на основании выявления в зараженных клетках вирусной ДНК, последующего ее клонирования и секвенирования.

Фактически все HPV можно условно разделить на две большие группы, которые ассоциируются либо с поражениями кожей, либо поражениями слизистых ободочек. Наиболее типичными проявлениями инфекции кожи являются доброкачественные бородавки, а слизистых - предраковые и раковые поражения шейки матки [4].

Все HPV имеют весьма сходную структуру. Они содержат ДНК в 8.000 пар оснований, содержащую 9 открытых рамок считывания, причем две из них (LI и L2) кодируют структурные белки вириона, остальные 7 (El - Е?) относятся к так называемым "ранним" вирусным генам, контролирующим функции, необходимые для репродукции и проявления патогенного потенциала [5].

Среди всех известных HPV лишь сравнительно небольшое количество связано с различными злокачественными поражениями. К числу "кожных" вариантов HPV, относятся те, которые были обнаружены при бородавчатой эшщермодисшгазии, заболевании, при котором пноскокпеточные

карциномы возникают ш папиллом в результате воздействия солнечной радиации [6]. Наиболее часто при этом заболевании выявляется HPV 5 типа, а существенно реже HPV других типов (типы 8,14,17,20) [7], и поскольку отсутствуют какие-либо клеточные модели этого заболевания о механизмах (Ьункниониоования вирусов (этих типов) практически ничего неизвестно,

2. а* • А. JL а* .'А

Наиболее серьезные данные о связи HPV с канцерогенезом у человека были получены для вирусов, выявляемых в слизистых оболочках прежде всего при раке шейки матки. Пионерские исследования группы zur Hansen Н, [8-!1| в середине 80-х годов убедительно показали, что как миниум 2 типа HPV: 16 и 18 типов выявляются при раках шейки матки, в то время как при доброкачественных поражениях были обнаружены в основном HPV 6 и 1! типов. В дальнейших исследованиях еще несколько типов HPV было обнаружено как при раках шейки матки, так и при других злокачественных поражениях аногенитальной области у женщин, и у мужчин (типы 31, 33, 35, 39,45, 51, 52,56, 58, 59, 66, 70), в то же время количество новых типов HPV, которые были выделены из папиллом (доброкачественных поражений) этой области, и папиллом ротовой полости было существенно меньше (типы 3,

! ? 'i > Ч ? ч Г i - Vi

32ä >г, !.?} j h:j.

К настоящему времени сложилась ситуация, что при использовании соответствующих чувствительных методов исследований, ДНК HPV различных типов выявляются более, чем в 90% опухолей шейки матки. Это

является важным аргументом в пользу того, что присутствие вирусного генетического материала необходимый фактор для превращения

нормальных клеток в опухолевые.

На основании вышеизложенных данных все HPV, выделенные при доброкачественных и злокачественных неоплазиях, были разделены на так называемые HPV "низкого" и "высокого" риска. Анализ этих 2 классов HPV не выявил принципиальных структурных отличий в генетической структуре - и те и другие содержат по 2 структурных гена (L1 и L2) и 7 функциональных генов (El - Е7) (рис.1). Кроме того, в составе всех HPV была идентифицирована регуляторная область (URR - upstream regulatory region), локализующаяся непосредственно перед генами Е6 и Е7. В URR было выявлено значительное количество сайтов, способных взаимодействовать как с позитивными, так и негативными факторами транскрипции. Необходимость такого взаимодействия очевидна, исходя из того, что инфекция HPY для плоскоклеточного и слизистого эпителия является персистентной и вызывает ускоренную пролиферацию зараженных клеток. Для достижения такой инфекции вирус должен инфицировать банальные клетки, поскольку только эти клетки эпителия способны к размножению. Эти клетки активируют все остальные клетки вышележащих слоев, которые в процессе дефференцировкн теряют способность к размножению и отслаиваются от поверхности. Репликация вирусной ДНК, экспрессия поздних генов и сборка вирионов тесно связаны со стадией дифференцировки и происходят только в верхн ел ежащих клеточных слоях.

На разных стадиях инфекции после проникновения вирусной ДНК в клеточное ядро транскрипция генов НРУ зависит в основном от клеточных транскрипционных факторов. На более поздних стадиях в регуляции

экспрессии как ранних, так и поздних вирусных функций принимают участие и вирусные факторы.

Вирусный геном в зараженных кллетках может персистировать как в эписомальной, так я в интегрированной формах [13] и первые данные свидетельствовали и том, что на ранних стадиях опухолевого процесса ( интраэпителиальной днсплазии - CIN) эписомальная форма является превалирующей, в то время как в карциномах основная масса вирусной ДНК интегрирована в клеточный геном [14]. Однако, в настоящее время столь однозначная трактовка этих результатов вряд ли справедлива. По-видимому, в опухолевых линиях, подученных из карцином шейки матки, в подавляющем большинстве случаев вирусная ДНК интегрирована в клеточную ДНК, в то время как в опухоли (где выявляется высокая гетерогенность клеточной популяции) возможно выявление обеих типов персистенции вирусной ДНК [15], Б какой степени, интеграция является определяющим фактором для поддержания опухолевого статуса клетки, остается неясным, поскольку отсутствует полная информация о том, какие типы РНК считываются с интегрированного и эписомального вирусного генома.

Р»йон,& котором при

неэкспрессирующийся при интеграции

Рис.1 Структура генома папиллом человека 16 тала

1Л* Регуляция транскрипции вирусных генов.

Из представленных выше данных с очевидностью следует, что поддержание трансформированного фенотипа контролируется вирусными генами. В настоящее время можно считать установленным, что основными трансформирующими генами вирусов папиллом человека являются гены Е6 и Е7, экспрессия которых модулируется областью URB.. Размер этой области составляет от 800 до 1000 пар оснований для HPV различных типов и условно может оыть разделена на 3 участка - 5' область, центральный сегмент, и V- область, которая расположена непосредственно перед двумя вышеуказанными генами. За генами Е6 и Е7 локализуются гены Е! и Е2, причем последний перекрывает ген Е4, и ген Е5, который также возможно является трансформирующим геном. Сигнальная терминирующая последовательность для поли А локализуется на 3'-конце ранней области, Транскрипция РНК начинается с промотора в У - области URR, непосредственно перед началом гена Е6. Этот промотор получил обозначение Р97 для HPV 16 и PÍ05 для HPV 18. Промотор содержит 1АТА бокс и сайт инициации транскрипции, которые регулируются различными знхансерными элементами, локализованными в центральном и V = сегментах ORR. Именно они и узнаются клеточными факторами. 3f - область URR содержит также 2 сайта для вирусного траскрипционного фактора Е2, сайты связывания для клеточных транскрипционных факторов Spl и YYÍ и ориджины репликации с сайтом связывания для вирусного белка Ei,

Центральный сегмент URR содержит конститутивный энхансер, наиболее активный в эпителиальных клетках и зависящий только от клеточных факторов [16-19]. В этом участке идентифицированы сайты связывают для различных клеточных факторов, включая API, NF1, Octl, TEF1, TEF2, YY1, рецепторы стероидных гормонов. Все эти факторы являются убнквнтарными и могут функционировать в клетках различных типов. 5' -участок URR содержит сигналы для терминации и полиаденилирования поздних вирусных транскриптов [18].

Среди многочисленных факторов, способных взаимодействовать с участком URR. имеется лишь один фактор вирусной природы (продукт гена Е2), активность которого может иметь существенное значение для функционирования трансформирующих генов HPV. URR HPV содержит 4 В2 - связующих сайта. Данные по действию Е2 на транскрипцию генов Е-6 и Е7 носят противоречивый характер. С одной стороны, белки-продукты гена Е2 могут функционировать в качестве репрессоров для промотора HPV 18 типа [20], а мутации по гену Е2 увеличивает уровень иммортализации под действием генов Е6 и Е? [21]. С другой стороны - имеются данные о том, что белки Е2 HPV 16 и 18 типов активируют промотор в URR [22]. По-видимому эти различия обусловлены синтезом различно сплайсированных aiРНК данного гена, приводящих к образованием белков Е2 меньшего размера. Именно белок Е2, утерявшей N-концевой, трансакхнвирующий домен, может интерферировать с активирующими потенциями полноразмерного белка Е2 [22]. Таким образом, регуляция активности генов Е6 и Е7 под действием продукта вирусного гена Е2 является достаточно

сложной, т.к. этот белок обладает двойной функцией - активатора и репрессора.

Среди многочисленных клеточных факторов, способных взаимодействовать с участком URR, отметим лишь некоторые из них, значимость которых для проявления функций генов Е6 и Е7 представляется очевидной, Это прежде всего фактор АР!, представляющий собой димерный белковый комплекс, содержащий по одному из представителей двух семейств генов Jim н fos. URR HPV 16 и 18 типов содержат соответственно 3 и 2 АР1 - связывающих сайтов. По-видимому, основная функция АР!-сайта - участие в определении специфичности транскрипта и уровня дифференцировки на транскрипционную активность ÜRR [23]. Другим важным регулятором Ö RR является фактор YY1, причем в данной системе он может функционировать как активатор и как репрессор транскрипции в зависимости от типа вируса, типа клеток и активности других транскрипционных факторов и прежде всего фактора АР! [24,25]. Еще одна группа сайтов способна связывать С/ЕВР - (ССААТ/ знхансер связывающий белок) [26], причем факторы этого типа также могут взаимодействовать не только непосредственно с соответствующей областью ДНК в участке URR, во и образовывать комплексы с другими клеточными факторами. Основная функция этой группы генов - регуляция клеточной дифференцировки и активация генов различных цитокинов. Фактор SP1 способен связываться с элементом GC боксов и его сайт находится непосредственно рядом с ТАГА боксом. Этот фактор необходим для транскрипции вирусного генома [27]. Среди транскрипционных факторов, принадлежащих к группе ядерных

рецепторов, две группы (рецепторы стероидных гормонов и тироид'ретиноидные) имеют рецепторы в URR области. Среди рецепторов стероидных гормонов - гликокортикоидные н прогестероновые, [28-30]. Сайт, отвечающий на гликортикоид (GRE) локализуется в 3' области между API и Spl связывающим сайтом. Оба типа рецепторов являются активаторами транскрипции. Фактор, специфический для керагиноцитов KR.F1, взаимодействуют с API для активации транскрипции ¡31]. URR содержит также несколько связующих сайтов для белков с так называемым POU доменом, которые способны связываться с канонической октамериой последовательностью ATGCAAAT (тогда эти белки обозначаются как Oct). Один из белков этой группы (OctГ) репрессирует URR HPV 18 [32], а другом представитель этого семейства (Ерое 1), обладает обратным эффектом [33]. Для факторов семейства NF1 имеется несколько сайтов связывания в области конститутивного реп рессора [34]. Эти сайты обладают сравнительно низким аффинитетом и до-видимому являются необходимыми для проявления специфичности транскрипции в эпителиальных клетках, Транскрипционные факторы TEF1 и TEF2 имеют 4 сайта в энхасере HPV16 и они по-видимому являются активаторами для промотора Р97 [35],

Таким образом, представленная выше краткая сводка по факторам, регулирующим транскрипцию трансформирующих генов HPV, свидетельствует о том, что этот контроль носит весьма сложный характер, поскольку осуществляется многочисленными факторами, которые способны взаимодействовать как непосредственно с областью URR вирусного

генома, так и друг с другом н обладающими позитивным и негативным влиянием на транскрипцию

2.3. Трансформирующие гены вирусов папиллом.

1 1 1 Т-1___С<

&.J.X. J ш С/0

Из представленных выше данных следует, что в злокачественных опухолях вирусная ДНК персиетирует как правило в интегрированной форме, причем разрыв в вирусном геноме, необходимый для встраивания в клеточный, происходит в основном в рамках El ••••Е2, Из этого следует вывод о том, что а трансформированных клетках интактными могут оставаться гены Е6 и Е7, экспрессия которых контролируется областью ÜRR, Три группы доказательств свидетельствует в пользу того, что именно эти гены контролируют трансформированный фенотип клеток: Í) гены Е6 и Е7 обладают трансформирующим потенциалом in vitro, 2) трансфецированные этими генами клетки способны индуцировать опухоли у бестнмусных мышей и 3) ингибирование экспрессии генов Е6/Е7 вызывает в клетках реверсию трасформированного фенотипа.

Ниже будут представлены данные о трансформирующим потенциале этих генов.

Гены Ш и Е7 транскрибируются с промотора Р9? (для HPV16) или Р! 05 (для HPV18) как полицистроииые тРНК [36]. Идентифицированы 5 различных тРНК, содержащих рамку- Е6, но только одна из них является полноразмерной = Четыре остальных вида являются укороченными и возникают в результате дифференциального сплайсинга либо внутри рамки

Еб, либо между рамкой Е6 и рамками Ei или Е2» последовательности которых выявляются в этих еплайсированных РНК. Наиболее часто встречаемой является РНК, содержащая урезанный вариант Еб (обозначаемый Еб*) и полноразмерный - Е? [37,38]. Функции такой РНК остаются неясными.

Продукты генов Еб - белок, содержащий 150 аминокислот, с отсутствием каких-либо ферментативных активностей. Локализуются белки Еб в ядре , цитоплазме и мембранной фракции [39]. Белки достаточно консервативны и Еб HPV "низкого риска" гомологичны между собой на 80-90%, примерно сходные уровни гомологичности наблюдается и у HPV группы "высокого риска." Между собой Еб этих двух групп сходны на 50-60%. Характерной особенностью белков Еб всех HPV является наличие 4 мотивов "цинковых пальцев" ¡40], т.е. последовательностей, xapaKTq>Hbix для белков, способных взаимодействовать с ДНК, однако все попытки выявить такое взаимодействие закончились неудачно,

Исследование биологической активности генов Еб HPV высокого риска показало, что он как в одиночестве, так и в сочетании с геном Е7 способен к иммортализации клеток плоскоклеточного эпителия человека [41J и в отсутствие Е7 - к интерференции с дифференцировкой кератиноцитов, индуцируемой сывороткой и ионами Са2+ [42]. Кроме того, белки Еб способны к иммортализацин эпителия молочных желез человека [43]. Еб в кооперации с активированным онкогеном ras иммортализует фибробласты грызунов [44], а в сочетании с Е7 - индуцирует образование опухолей у трансгенных мышей [45].

В отличие от Е6 HPV "высокого риска" Еб HPV "низкого риска55 не способны ни к иммортализации, ни к трансформации [46].

Одной из главных мишеней действия гена Е6 является продукт генар53. Как известно, ген pS3 [47] является модулятором транскрипции и специфически взаимодействует с ДНК. Он способен трансактивировать такие важные гены как р2! WAFi, который является ингибитором циклин-зависимых киназ [48] и Ьах, участвующих в аноптозе клеток [49]. Этот ген активируется при обработке клеток ДНК - повреждающими агентами и в условиях гипоксии [50,51]. Мутантный вариант гена р53, регулярно выявляемый во в многих опухолях, не способен к осуществлению функций, описанных выше, и. кроме того, в некоторых опухолях его локализация ограничена цитоплазмой [52].

Ранее было показано, что белок гена р53 способен копрецшгатироваться с большим Т-антигеном вируса SV40 и продуктом раннего гена El а аденовируса из клеток, зараженных этими вирусами [53,54]. На основании этого было высказано предположение о роли р53 в проявлении онкогенного потенциала этих вирусов. Оказалось, что белок Еб HPV "высокого риска" (но sie "низкого риска") также способен взаимодействовать ср53 в системах in vitro [55]. Однако, по-видимому, биологический смысл взаимодействия вирусных генов с р53 в этих трех системах различен, поскольку для' первых двух систем образование комплекса способствует стабилизации белка р53, а в системе с Е7 HPV период полужизни р53 наоборот уменьшается. Это связано с тем, что происходит деградация белка р53 за счет системы убвквитина. [56], которая является основным элементом селективной

деградации цитозольных и ядерных белков в клетках эукарнот [57], Для деградации р53 под действием Е6 необходимо предварительное образование комплеса между Е6 и одним из компонентов этого комплекса -убнквитин - протеин лигазы, обозначаемой как Е6-АР [58] и имеющей молекулярную массу в 100 кД.

Кроме способности вызывать деградацию p53s Еб ингибирует такие функции р53 дикого типа как транскрипционная активация и транскрипционная репрессия, т.е. конкурирует за те функции, которые являются определяющими в выполнении р53 супрессорных функций в опухолевом росте. Показано также, что Е6 увеличивает уровень мутагенеза и генетической нестабильности [59]. Поскольку в подавляющем большинстве карцином шейки матки (в отличие от многих других опухолей человека) отсутствуют мутации в гене р53 [60], можно предполагать, что экспрессия белка Еб HPV "высокого риска" в итоге оказывает на р53 такое же воздействие, как и соматические мутации, т.е. потеря р53 регулируемой транскрипции и ингибировании нормального клеточного ответа на повреждения ДНК.

Кроме основного свойства белка Еб взаимодействовать с р53. этот белок обладает ещё рядом свойств, которые могут вносить вклад в процесс трансформации и которые независимы от р53. К их числу относятся активация гетеролох ичных промоторов [61], уменьшение апоптоза [62], активация теломеразы, ферментативного РНК-белкового комплекса, полдерживающего размер теломерной области хромосом [63], связывание с Са2+ - связывающим белком Е6БР, идентичным белку ERC 55 [64],

взаимодействие с малоизученной протеинкнназой и ее субстратом [65], трансактивации промоторов а- протимозина и с-тус [66].

Функциональная значимость этих взаимодействий остается пока неясной. 2.3.2. Ген Е7.

Продуктом гена Е7 является сравнительно небольшой фосфобелок, содержащий 98 аминокислот. N-концевой домен этого белка (аминокислоты !-38) содержит в основном гидрофильные аминокислоты, в то время как С-концевой домен (аминокислоты 39-98) - более гидрофобен. Несмотря на расчетный молекулярный вес И кД белок Е-? HPV i 6 мигрирует при электрофорезе в п оли акр и ламид н ом геле как молекула с массой в 18-20 кД [67]. Е7 структурно и функционально родственен белкам других ДНК-содержащих вирусов, таких как большой Т-антиген вируса SV40 и ранний бедок El А аденовируса. Белок Е7 может быть разделен на 3 основных домена - консервативный участок i (CRI), консервативный участок 2 (CR2) и консервативный участок 3 (CR3). Все три домена необходимы для проявления биологической активности Е7 {68].

Участок CRÎ кодирует короткую последовательность аминокислот (6-20), которая является высококонсервативной и сходной с таковой в CRI EiA аденовируса. Несмотря на это существует функциональное различие- между CRI v белков этих bhovcob - CRI El А способен взаимодействовать с такими

J Я. *> '

"pocket" бешеами как рЗОО и с меньшей эффективностью с pRb. а то время как CR1 Е7 не способен взаимодействовать с этим белком [69]. Делеции или

точечные мутации в CRI F.7 HPV 16 приводят к резкому снижению трансформирующего потенциала этого гена [70].

CR2 HPV 16 Е7 содержит домен LXCXE (аминокислоты 21-40), который ответственен за взаимодействие с "pocket" белками (белок pi05 гена еупрессора pRb и родственные белки р!07 и р130). Любые мутации в этой области элиминируют способность взаимодействовать с pRb и подавляют трансформирующую активность Е7 [71]. HPV "низкого риска", имеют одно характерное отличие - в CR2 домене вместо аспарагиновой кислоты в позиции 21 в Е7 HPV16, и в CR i HPV типов 6 и 11 находятся глицин. По-видимому, именно эта замена обеспечивает Е7 HPV "высокого риска" более высокое сродство с pRb и способность кооперировать с активированным онкогеном ras при трансформации первичных клеток грызунов [72]. Кроме главного сайта связывания с pRb в CR2, возможно, существует еще один сайт в домене CR3, участвующий в ассоциации epRb [73].

С-концевая область домена CR2 содержит сайт для казеин-киназы II (CK II) (серины в позициях 3! и 32). Именно эти два аминокислотных остатка фосфорилируются in vitro CK II. Билогический смысл фосфорилирования остается неясным, но не исключено, что этот сайт каким-ro образом вовлечен в трансформацию. Замена Двух указанных сериновых остатков незаряженными остатками аланина снижает способность Е7 к трансформации первичных клеток при совместной траисфекции с Ras, в то время как: замена на отрицательно заряженый остаток аспарагиной кислоты приводит к формированию фенотипа дикого тина [74]. Кроме того, фосфорнлование этих двух сериновых остатков резко усиливает

взаимодействие белка Е7 HPV! 6 с TATA - боксом связующего белка ТВР

Домен CKJ HPV 16 Е7 имеет очень слабую гомологию с CR3 доменом белка El А аденовируса, но оба домена содержат две СХХС п о следов ат ел ь н о от и, участвующие в связывании с Zn2+ [76]. Последовательности CR3 Е7 (аминокислоты 41-98) существенно отличаются от таковых у белков, содержащих "цинковые пальцы". Связывание Е7 с Zn2+ приводит к димеризации белка Е7 и невидимому димеризация является важным моментом в проявлении трансформирующей активности Е7 [77].

Что касается локализация Е7, хо первоначально были получены противоречивые результаты, повидимому обусловленные тем, что этот белок замаскирован в клетках и далеко не все его эпитопы доступны используемым антителам. Совокупность имеющихся данных позволяет считать, что Е7 локализуется в нескольких клеточных фракциях - главным образом в ядре и ядрышке [78,79].

Иммортал изующие и трансформирующие потенции Е7 HPV "высокого риска" зависят от типа используемых дня этой цели клеток, Е; HPV 16 и 18 типов способен индуцировать образование фокусов трансформации и рост в полужидком агаре в различных стабильных клеточных линиях фибробластов грызунов., таких к примеру как NIH ЗТЗ и Y31 [80,81]. Для Е7 HPV "низкого риска" наблюдается меньшая эффективность трансформации: клетки не способны к росту в полужидком агаре, но являются туморогенными для бестимусных мышей [82].

Е7 белки HPV! 6 или HPV 18 сами по себе способны к иммортализации первичных клеток грызунов [83], а в сочетании с активированным ras - к их трансформации [84]. В системе кератиноцитов человека ген Е7 вызывает ймморталйзацию, эффективность которой существенно возрастает при котрансфекции с геном Е6 HPV "высокого риска/' В некоторых случаях такая котрансфекция может приводить и к трансформации [85]. Кроме того, ген Е7 может вызывать иммортализацию еще нескольких типов клеток, таких как эпителиальные клетки молочных желез, клетки поверхностного эпителия яичника [86,87]. Е7 и Е6 гены HPV "низкого риска" не способны к имморталиэации первичных кератиноцитов [88].

Основная функция гена Е7 HPV "высокого риска" сводится к дерегулирующему эффекту на прохождение клеточного цикла, в основном йидуцируя переход покоящихся клеток из Сто - в S - фазу. Это осуществляется за счет активации некоторых клеточных генов иод влиянием Е7 и в результате прямого взаимодействия Е7 с белками, регулирующими прохождение клеточного цикла.

В клеточном цикле можно выделить 2 основных этапа - репликация генома и последущее деление клетки. Эти 2 события разделены 2 фазами - Gi до репликации ДНК и Gi до митоза. Правильность прохождения цикла контролируется циклин-зависимыми протеннкиназами (CDK). В нормальных клетках переход из Go фазы запускается факторами роста, и рецепторами этих факторов, специфичными для данного типа клеток. На этом этане ростовые факторы активируют экспрессию циклинов Д-типа и ассоциированных с ними киназ. (CDK 4 или CDK 6), индуцируя в свою

очередь переход клеток в (...< j фзну, активируют ЦИКЛИHЫ Е И Â, И фактор транскрипции E2F-1. Белки семейства гена ретинобластомы ("pocket") -pRb, pi 07, pi 30 блокируют прогрессию клеточного цикла путем взаимодействия с клеточными транскрипционными факторами семейства T2F и DP. "Pocket" белки инактивируются в результате фосфоршгароваиия по многим сайтам под действием СВК, что приводит к образованию транскрипционно активных гетеродамеров E2F/DP. Такие ингибиторы CDK как р!5 ink 4В, р!б ink Y, p21 waf-l и p27 kip 1 задерживают клетки в G! фазе, путем ограничения фосфорнлирования pRb и родственных белков [89].

Ген Е7 HPV16 обеспечивает переход клеток из G1 в S фазу клеточного цикла и увеличивает пролиферативную активность первичных кератиноцитов и эпителиальных клеток молочных желез человека. Ген Е7 способен преодолевать контроль за прохождением клеточного цикла на границе G1/S, что позволяет предполагать, что Е7 способен либо нейтрализовать, либо преодолевать блокирующий эффект физиологических ингибиторов CDK таких как p21 waf и p27kip J, которые индуцируются р53 и удалением сыворотки [90].

Ген Е7 HFV16 способен к взаимодействию с белком гена=супресеора pRMOS, что приводит к возрастанию деградации pRb [91[, Это сопровождается индукцией активности семейства клеточных транскрипционных факторов, состоящих из множественных E2F/DP гетероднмеров. Е7 и E2F-1 связываются с различными сайтами на pRb [92]. С участком CR2 на Е7 связывается также pRb - родственный белок р 107 [93].

На разных фазах клеточного цикла существует 2 различных комплекса. E2F-р 107, но Е7 селективно разрушает комплекс, специфичный для Gl фазы [94].

Среди генов, которые активируются в результате освобождения E2F. идентифицирован ген Е2 аденовируса 5 типа, а также гены, кодирующие В-myb, циклины А и Е [95-97].

Кроме pR b и его родственников, связанных с регуляцией клеточного цикла, существуют и другие белки-регуляторы транскрипции, являющиеся мишенями для Е7. Сюда относятся семейство транскрипционных факторов АР-1. В результате взамодействия с АР-1. происходит трансактивация АР-1 направляемых генов [98]. Кроме того, Е7 HPV!6 способен связываться с ТАТА-бокс взаимодействующим белком и ТВР - ассоциированным факторм TAF 110 [99].

Доказана возможность физического взаимодействия Е7 HPV 16 с циклином А и CDK2 через CR2 домен [100], а также с циклином Е в комплексе CDK2 и р 10? [101]. Не исключено, что взаимодействие Е7 с циклинами опосредовано рЮ7, который, как было указано выше, способен ассоциироваться с циклинами А и Е [102]. Ингибитор CDK p27kip 1 связывается с Е7 через С-концевой домен, что приводит к функциональной инактивации р27 kip 1 [103].

Одной из удивительных способностей Е7 HPV 16 является его способность и к пролиферации и к апонтозу. Последний феномен четко проявляется в нормальных фибробластах человека в отсутствии активности гена Е6 [104]. Ответственным за проявление этой активности является pRb - связывающий домен Е7 . Характерно, что апоптоз под действием Е7 проявляется в клетках

ГиЫШёЙ С УД ЗЛЁН H hï m T'cHûM рэЗ . IffiŒâi ОбрШЮМ, ЭПОПХ'ОЗ под действием Е/ может проявляться по р53 зависимому и р53~ не- зависимому пути [S3].

ï»4„ Ф^Ж1ди0?.1«1-льн«я кэ».жЁрз5д||н оккоб^лков Еб и F/7, Как видно из представленных выше данных, оикобепки Еб и Е7 обладают оикогенным потенциалом per se, но этот потенциал существенно возрастает при совместной экспрессии [4! ,85]. Это свидетельствует о том, что вирусные факторы могут функционально кооперировать в процессе клеточной трансформации. По-видимому наиболее интересный аспект этой проблемы состоит в том. что Еб может потенциировать нарушение контроля за регуляцией размножения путем активирования апоптоза, направляемого Е7. Это нашло экспериментальное подверждение на модели трансгенных мышей [105], а также в уроэпитеяиальных клетках человека [106]. Таким образом, функциональная кооперация между белками Еб и Е7 HFV '"высокого риска"'' в процессе трансформации хотя бы частично может быть связана с Еб - индуцированным ингнбированием апоптоза. Это сопровождается элиминацией клеток с нарушенной системой ростовых сигналов, включая и те. которые направляются Е7.

функции Еб и Е7 также тесно связаны и на уровне дерегуляции клеточного цикла и размножение клеток. По этой схеме pRb является общей мишенью для обоих вирусных белков в результате физического взаимодействия с Е7 и изменения уровня фосфорилирования под действием Еб. По этому сценарию Еб подавляет активацию p21 waf (ингибитор цимшн - зависимых киназ), опосредованную р53 [48]. Индукция p2i waf под действием р53

контролирует нефоефоршгарованый рКЬ, который является необходимым для функционирования р!.Ь, как контролирующего фактора в О ¡-фазе клеточного цикла [107]. Йнгибирование индукции р21 \\-af (опосредованное р53) под действием р53 может приводить к нарушениям в контролирующих функциях рКЬ и таким образом кооперировать в инактивации рКЬ при связывании с Е7.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лаасри Мажид, 1998 год

Глша 7. Список литературы

1. zur Hausen H.. Condylomata, acuminata and human genital cancer, Cancer Res. 1976. ¥.36. P. 530.

2. Бюл. WHO, Press Release, WHO /47, July 3, 1996, Cervical Cancer: Этиологической роли HPV при раке шейки матки.

3. de. VÜiiers Е.М., Human pathogenic papillomavirus types: an update, Current Topics in Microbiol, Immunol., Ed. zur Hausen., Berlin-Heidelberg SpringerVerlag, 1994, V-. 186, P.I-12.

4. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 3ÄRC Publications, 1995, V. 64, P. 35-283

5. zur Hausen H., Papillomavirus infections - a major cause of human cancers, Biochim. Biophys. Acta., 1996, V. 1288, P. 55-78.

6. Jablonska S., Dabrowski J., Jakubowiez K., Epidermodysplasia verruciformis as a model in studies on the role of papoviruses in oncogenesis, Cancer Res., 1972, V. 32, P, 583-589.

7. Orth G., Jablonska S., Jarsabek-Chorzeiska M. et al, Characteristics of the lesions and risk of malignant conversion as related to the type of the human

papillomavirus involved in epidermodysplasia verrucifomis. Cancer Res, 1979, V, 39, P. 1074» 1082,

8. Gissmann. L., zur Hansen., Partial characterization of viral DNA from human genital warts (condylomata acumilata), Int. J. Cancer, 1980, V. 25, P. 605-609.

9. Gissmann L., Diehi V,, Schultz-Coulon H.. Zur Hansen H,, Molecular cloning and characterization of human papilloma virus DNA derived from a laryngeal papilloma, J. Virol., 1982, V. 44, P. 393-400.

10. Durst M., Gissmann L., Ikenberg H., Zur Hausen H., A papillomavirus DNA from a cervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from different geographic regions., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, ¥. 80, P. 381238 i 5.

11. Boshart M„ Gissmann L., l'kenberg PL, Kleinheinz A., Scheurlen W., zur Hausen H., A new type of papillomavirus DNA, its presence in genital cancer biopsies and in cell lines derived from cervical cancer, EMBO J., 1984, V. 3, P.

1151.-1157.

12. zur Hausen H., Rosl F., Pathogenesis of cancer of the cervix. Cold Spring Harborg Symp. Quantit. Biol., 1994, V. 59, P. 623-628.

13. Durst M„ Kleinheinz A., Hots M., Gissmann L., The physical state of human papillomavirus type 16 DNA in benign and malignant genital tumours., J. Gen. Virol., 1985, V. 66, P. 1515-1522.

14. Chook Pan C., Han S., Integration of human papillomavirus type 16 into cellular DNA of cervical carcinoma: preferential deletion of the E2 gene and invariable retention of the long control region and the E6/E7 open reading frames,

Virology, 1987, V. 161, P. 259-261.

15. Samoylova E., Shaihaev G., Petrov S. Kisseljova N., Kisselov F., HPV infection in cervical-cancer eases in Russia, Int. J. Cancer, 1995, V. 61, P. 337341.

11 Gloss B., Bernhard H., Seedorf K.. Kiock G., The upstream regulatory region of the human papilloma virus-16 contains E2 protein - independent enhancer wihich is specific for cervical carcinoma cells and regulated by glucocorticoid hormones, EMBO J., 1987, V. 6, P. 3735-3743.

17. Cripe T., Alderbom A., Anderson R., Pakkinen S., Bergman 1'., Haugen H., Petterson V'.. Turek L.. Transcriptional activation of the human papillomavirus -16 P97 promoter by an 88 nucleotide enhancer containing distinct cell-dependent and AP-1 responsive modules. The New Biol., 1990, V. 2, P. 450-463.

18. Garsia-Garanca A., Thierry F., Yaniv M., Interplay of viral and cellular proteins along the long control region of human papillomavirus 18, J. Virol., 1988, V. 62, P. 4321-4330.

19. Gius D., Grossman S., Bedell M., Inducible and constitutive enhancer domain« in the noncoding region of human papillomavirus typl8, J . Virol., 1988, V. 62, P.665-672.

20. Bernard B., Bailly C., Lenoir M., Darmon M., Thierty F., Yaniv M., The human papillomavirus type 18 (HPV18) E2 gene product is a repressor of the HPV 18 regulatory region in human keratiiiocyt.es. J, Virol., 1989, V. 63, P. 43174324.

21. Romanczuk H., Howley P., Disruption of either the El or E2 regulatory gene of human papillomavirus type 16 increases viral immortalization capacity, Proc. Nat Acad. Sci. USA, 1992, V. 89, P. 3159-3163.

22. Bouvard V., Storey A., Pim D., and Banks L., Characterisation of the human papillomavirus E2 protein : evidence of trans-activation and trans-repression in cervical keratmocytes, EMBO J., 1994, V. 13, P. 5451- 5459.

23. Offord E., Beard P., A member of the activator protein 1 family found hi keratmocytes but not in fibroblasts required for transcription from a hum an papillomavirus type 18 promoter, J. Virol., 1990, V. 64. P. 4792-4798.

14- Bauknecht T., Angel P., Royer H.D., zur Hansen H., Identification of a nagative regulatory domain in the human papillomavirus type 18 promoter: interaction with the transcriptional! repressior YY1, EMBO J., 1992, V. 11, P. 4607-4617.

IS. May M.5 Dong X-P., Beyer-Finkler E., Stubenrauch F.s Fuchs G.P.. Pfister H., The E6/E7 promoter of extrachromosomal HPV 16 DMA in cervical cancers ascapes from cellular repression by mutation of target sequences for YYl, EMBO J., 1994, V. 13, P. 1460-1466.

26. Hoppe-Seyler F,, Bute K., Activation of human papillomavirus type 18 £6-fi? oncogene expression by transcription factor Spl, Nucleic Acid. Res., 1992, V. 20, P. 6701-6706.

27. Bute K., Hoppe-Seyler F., Transcriptional control of human papillomavirus (HPV) omcogene axpression: composition of the HPV type 18 upstream regulatory region, J. Virol., 1993, V. 67, P. 6467-6486.

18, Chan WK., KlockG., Bernard HU., Progesterone and glucocorticoid control elements occur in the long control regions of several human papillomaviruses involved in anogenitai neoplasia. J. Virol., 1989, V. 63, P. 3261-3269.

19. Mittal R., Pater A., Pater M., Multiple human papillomavirus type 16 glucocorticoide reponse elements functional for transformation, transien expression, and DNA - protein interaction, J. Virol., 1993, V. 67, P. 5665-56S9.

30. Medina-Martinez G., Morales-Peza N.. Yaniv M. et a!.. Single element mediates glucocorticoid hormone reponse of HPV 18 with no functional interactions with API or hbbrm, Virology, 1996, V. 217, P. 392-396.

31. Mack D.., Laimins L., A keratinocyte-specific transcription factor, KRE-1, interacts with AP-l to activate expression of human papillomavirus type 18 in squamous epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 9102- 9106.

32. Hoppe-Seyler F., Butz K., zur Hansen H.. Repression of the human papillomavirus type 18 enhancer by the cellular transcription factor Oct-1, J. Virol., 1991, V. 65, P.5613-5618.

33. Yakawa K.< Butz K., Yasui T. et aL, Regulation of human papillomavirus transcription by the differentiation- dependent epithelial factor Epocl/skm-la,

a" \r:___i I i*ii. <■ ir J/1 fi l/i I £

J.Viroi., S'"?«, V. M>, JT. 1U-10.

34. Chong T., Apt D., Gloss B., Isa M,, Bernard H.U., The enhancer of human papillomavirus type 16; Binding sites for the ubiquitous trascriptional factors Oct-1, NFA, Tef-2, NF1, and Apl participate in epithelial cell-specific transcription, J. Virol., 1991, V, 65, P. 5933-5943.

35. Ishiji T., Lace M., Parkkinen S., Anderson RD,, Haugea TH.( Cripe TP., Xiao

J-H., Davidson I., Chambón P., Turek LP., Transcriptional enhancer factor (TEF)-l and its cell-specific co-activator activate human papillomavirus- 16 E6 and E7 oncogene transcription in keratinocytes and cervical carcinoma cells., EMBO J., 1992. V. 11. P. 2271 -228 i.

36. Smotkin D., Wettstein F., Transcription of human papillomavirus type 16 early genes in a cervical cancer and a cancer-derived cell line and identification of the E7 protein, Proc. Nat. Acad. Sci USA, 1986, V. 83, P. 4680-4684.

37. Schwartz E., Freese IT.. Gissmann L., Mayer W., Roggenbuck B., Stremlau A., zur Hausen H., Structure and transcription of human papillomavirus sequences in cervical carcinoma ceils, Nature, 1985, V. 314, P. 111-114.

38. Smotkin D„ Prokoph H.t Wettstein F., Oncogenic and nononcogenic human genital papillomaviruses generate the E7 mRNA by different mechnisms, J. Virol., 1989, V, 63, P. 1441-1447.

39. Grossman S., Mora R., Laimins L,, Intracellular localization and DNA-binding properties of human papillomavirus type 18 E6 protein expressed with a baculovirus vector, J. Virol,. 1989, V. 63, P. 366-374.

40. Grossman S., Laimins L., E6 protein of human papillomavirus type 18 binds zinc, Oncogene, 1989, V. 4. P.i089-1093.

41. Hawley-Nelson P., Vousdea K., Hubbert N., Lowy DR., Schiller JT., HPV16

E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes, EMBO J., 1989, V. 8, P. 3905-3910.

42. Stoppler M., Ching K.. Stopler U., //J. Virol. 1996. V. 70. P. 6987-6993.

43= Band V., De Caprio J., Delmolino L,, Kulesa V., Sager R., Loss of p53 protein in human papillomavirus type 16 Ed-immortalized human mammary epithelial cells, J. Virol., 1991, V. 65, P.6671-6676.

44. Storey A., Banks L., Human papillomavirus type 16 E6 gene cooperates with EJ-ras to immortalize primary mouse cells, Oncogene, 1993, V. 8, P. 819-824.

45, Lambert P., Pan H„ Pilot C., Li em AM Jackson M., and Griep A. B., Epidermalcancer asssociated with expression of human papillomavirus type 16 E6 and E7 oncogenes in the skin of tatisgenie mice., Proc. Nat. Acad, USA, 1993, V . 90, P. 5583 »5587,

46« Halbert C., Demers G.» Galloway .D,, The- Ed and E7 genes papillomavirus types have weak, immortalizing activity in human epithelial cells, J, Virol., ¡992, V. 66, P. 2125-2134,

47, Haffher R., Ore» M,. Biochimical properties and biological effects of p53, Curr, Optn. Gevet. Dev., 1995, V. 5, P, 84-90,

48. ELDelry W., Tokino T,, Velculesen V., Levy D., Parsons R., Trent J., Lin IX, Mercer W., KJnzler K., Vogeistein B., WAF1, a potential mediator of p53 tumour suppression. Cell, 1993, V. 75, P. 817-825.

Si/sicn^liji T p at»/! I r>il ! Gt* i V «n P lu i- 'ia«

I/» L^xiCUOltiL X Ku&ti -Jsj V-Vli» 1 J J > V « 5JV 5 1 1 J ' ^ .

50. Kastaa M., Zhan Q., Ei-Deiry W., Carrier F., Jacks T., Walsh W., Plunkett B., Vogeistein B., Fornanee A,, A mammalian cell cycle checkpoint pathway utilizing p53 and GADD4S is defective in ataxia-telangiectasia, Cell, 1992, V. 71,

P. 587-59?,

51. Fritsche M.. Haessler C., Brandner G., Induction of nuclear accumulat ion of the tumor - suppressor protein p53 by DNA - damaging agents. Oncogene, 1993, V. 8, P. 307-318.

52. Moll U.s Riou G., Levine A.< Two distinct mechanisms alter p53 in breast cancer: Mutation and nuclear exclusion, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1992, V. 89,

P. 7262-7266.

53. Lane D., Crawford L., T antigen is bound to a host protein in SV40-lransformed cells, Nature, 1979, V. 278, P. 261-263.

54. Sarnow P., Ho Y., Williams J., and Levine A,, Adenovirus Elb - 58 kd tumor antigen and SV40 large tumor antigen are physically associated with the same 54 kd cellular protein transformed cells, Cell., 1982, V. 28, P. 387-394.

55. Hubbert N., Sedman S., Schiller J., Human papillomavirus type 16 E6 increases the degradation rate ofp53 in human keratinoeytes, J. Virol., 1992, V. 66, P.6237-6241.

56. Scheffiier M., Wemess B., Huibregste J., Levine A J'., Howley P.M., The E6

oncoprotein encoded by human papillomavirus types 16 and 18 promoters the degradation of p53, Cell, 1990, V. 63, P. i 129-1.136.

57. Ciechanover A., The ubiquitin - proteasome proteolytic path way, Cell, 1994. V.79.P. 13-21.

58. Scheffiier M., Huibregste J., Vierstra RM Howley P.M., The HPV 16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-proteiu ligase in the ubiquitination of p53, Cell, 1993, V. 75, P. 455-505.

White A., Livaaos E., llsty i.5 Oiflerential d<sri>pflOii of genomic integrite and cell cycle regulation in normal human fibroblasts by the HPV oncoproteins,

Genes Dev., 1994, V. 8, P. 666-67?.

Heliand A., Holm R., Kristensen G., Kaern J., Karlsen F., Trope €,, et al., Genetic alterations of the TP53 gene, p53 proteinexpression and HPV infection in primary cervical carcinpmas, J.Pathol. 1993. V. 171. P. 105-114.

61. Desaintes C., Hallez S., VanAiphen P., Buray A., Transcriptional activation of several heterologous promoters by the B6 protein of human papillomavirus type 16, J. Virol., 1992, V. 66, P. 325-333.

62. Pan EL Griep A., Temporally distinct patterns of p53-dependent and p53

independent apoptosis during mouse lens development, Genes. Dev., i')95, V, 9, P. 2157-2169.

63. Klingelhutz A., Foster S., McBougall J., Telomerase activation by the E6 gene product of human papillomavirus type 16, Nature, 1996, V. 380, P. 529-531.

64. Chen J., Reid €., Band V., Androphy J., Interaction of papillomavirus E6 oncoproteins with a putative calcium binding protein, Science, 1995,

V. 269 ( P. 529-531.

65. Keen N., Elston R.-, Crawford L., Interaction of the E6 protein of human papillomavirus with cellular proteins, Oncogene, 1994, V. 9, P. 1493-1499.

66. Kinoshita T., Shirasawa H., Shino Y., Moriya H., Desbarats L., Eiler M., Simiz B., Transactivation of prothymosin a and ornyc promoters by human papillomavirus type 16 E6 protein, Virology, 1997, V. 232, P. 53-61.

€1. Armstrong D., Roman A,, The anomalous eiectrophoretic behavior of the

human papillomavirus type 16 E7 protein is due to the high content of acidic

amino acid residues, Biochim. Biophys. Res. Commua,, 1993, V. 192, P. 13801 1 <>1

1361 .

68. Vousden K,, Yat P., Function similarity between HPV 16 E7, SV40 large T and adenovirus El a proteins, Oncogene, 1989, V. 4, P. 153-158.

69. Phelps W., Manger K., Yee €., Barnes JA., Howley PM., Sructure-function analysis of the human papillomavirus E7 oncoprotein, J. Virol., 1992, V. 66, P. 2418-2427.

70« Watanabe S., Kanda T., Sato H., Furuno A., Yoshiike K., Mutational

analysis of human papillomavirus type 16 E7 functions, J. Virol., 1990, V, 64, P. 207-214.

71. Dyson N.. Howley P., Munger K., Harlow E.. The human papillomavirus-16 E? oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product, Science, 1989, V. 243., P. 934-937.

72. Heck DM Yee C„ Howley P., Munger K., Efficiency of binding to the retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E7 oncoproteins of the human papillomaviruses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, V . 89, P. 4442-4446.

73. Patrick D., Oliflf A., Heimbrook D., Identification of a novel retinoblastoma

gene product binding site on human papillomavirus type 16 E7 protein, J. Biol. Chem., 1994, V. 269, P. 6842-6850.

74. Firzlaff J., Luscher B., Eisenmann R.N., Negative charge at the casein kinase II, Proe. Nat, Acad. Sci. USA, 1991, V. 88, P. 5187-5191.

75. Massimi P., Pirn D.. Storey A., and Banks L.. HPV-16 E7 and adenovirus Ela complex formation with TATA box binding protein is enhanced by casein kinase II phosphorylation, Oncogene, 1996, V. 12, P. 2325-2330.

H. Barbosa M„ Low D., Schiller Y,, Papillomavirus polypeptides E6 and E? are zinc-binding proteins, J. Virol., 1989, V. 63, P. 1404-1407.

77= Mc Intyre M., Frattini M., Grossman S., Laimins L., Human papillomavirus

type 18 E7 protein requeres intact Cys-x-x-Cys motifs for zink binding, dimeriztion, and transformation but not for Rb binding, J. Virol., 1993, V. 67; P. 3432-3450.

78. Kanda T., Zanma S.f Watanabe S., Furuno A., and Yoshiike K.,Two Immunodominant regions of the human papillomavirus type 16 E7 protein are aiasked in the nuclei of monkey COS-1 cells. Virology, 1991, V. 182, P. 723-731,

19. Zatsepina O., Braspenning Y., Robberson D., Hajibagheri N., Blight K,, Ely S., Hibma M., Spitkovsky D., et at., The human papillomavirus type 16 E7 protein is associated with the nucleolus in mammalian and yeast, cells, Oncogene, 1997, V. 14, P. 1137-1145.

80. Bedell M., Jones K., Grossman S., and Laimins L., Identification of human papillomavirus type 18 transforming genes in immortalized and primary cells, J.

i OOfs fT O T> t'JAI i » iiui,, s ;'■:>.:•'•, s . Uj, i . L-Z4 - I

81. Kanda. T., Watanabe S,, Yoshiiki K,, Immortalization of primary rat cells by human papillomavirus type 16 subgenomic DNA fragments eontroied by SV40 promoter, Virology, 1988, V. 165, P. 321-325.

82. Barbosa M., Vass W., Lowy D., Schiller J,, In vivo biological activities of £6 and E7 genes vary among human papillomaviruses of different oncogenic potential, J. Virol., 1991, V. 65, P. 292-298.

83. Yutsudo M., Okamoto J., Hakura A., Functinal dissociation of transforming genes of human papillomavirus type 16, Virology, 1988, V, 166. P. 594-597.

84. Matlashewski G., Schneider J., Banks L., Jones M,, Murray A., Crawford L., Human papiilomavirus type 16 DNA cooperates with activated ras un transf'oming primary cells, EMBO J., 1987, V. 6, P. 1741-1746.

85. Munger K., Phelps W., Bubb V., Howley P., Schlegel R., TheE6 and fi? genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human keratinocyt.es, J. Virol., 1989, V. 63, P. 44174421.

86. Wazer D., Liu X,, Chu Q., Gao Q., and Band V., Immortalization of distinct human mammary epithelial cell types by human papilloma virus 16E6 or E7, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1995, V. 92, P. 3687-3691.

87. Tsao S., Mok S., Fey E. et a!., Characterization oa human ovarian surface epithelial cells immortalized by human papilloma viral oncogenes (HPV - E6 E? ORFs), Exp. Cell. Res., 1995, V. 218, P. 499-507.

88= Halbert Demsrs '-~>.? C alio way D=, flie Eg ami B/ scenes ot human papillomavirus type 6 have weak immortalizing activity in human epithelial cells, J. Virol., 1992, V. 66, P. 2125-2134.

89. Sherr C., Cancer cell cycles, Science, 1996, V. 274, P. 1672=1677.

90. Zerfass-Thome K., Zwuschke W., Mannhardt B., Tindle R., Botz J., and Jansen-Durr P., Inactivation of the edk inhibitor p27KIPl by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein, Oncogene, 1996, V. 13, P. 2323-2330.

91. Boyer S., Wazer D., Band V., E7 protein papillomavirus-16 induces degradation of retinoblastoma protein through the ubiquitm-proteasome pathway, Cancer. Res., 1996, V. 56, P. 46204624.

92. Wu E., Clemens K., Heck D., Munger K., The human papillomavirus E7 oncoprotein and the cellular trascription factor E2F bind to separates!tes on the retinoblastoma tumor suppressor protein, J. Virol., 1993, V. 67. P. 2402-2407.

93. Dyson N., Gnida Pi« Munger K.., and Harlow E„ Homologous sequences in adenovirus El A and human papillomavirus E7 proteins mediate interactions with the same set of cellular proteins, J. Virol., 1992, V. 66, P. 6893-6902.

94. Zerfass K,. Levy L., Cremonesi C., Ciccolini F.. Jansen-Durr P., Crawford L., Ralston R.„ and Tommasino M., Cell cycle dependent distruption of 'E2F/pl07 complexes by human papillomavirus type 16 E7 J. Gen. Virol., 1995, V, 76, P.

1815-1820.

95. Phelps W., Bagchi S., Barnes J., Raychaudhuri P., Kraus V., Munger K., Howley P.M., and Nevins J.R., Analysis of trans activation by human

papillomavirus type 16 E7 and adenovirus 12S El A suggests a common mechanism, J. Virol., 1991, V. 65, P. 6922-6930.

H. Lain E., Morris J., Davies R., Crook T., Watson R., Vousden K., HPV-16 E7 oncoprotein deregulates B-myb expression: correlation with targeting of p!07/E2F complexes, EMBO J., 1994, V. 13, P. 871 »878.

97. Schulze A., Zerfass K., Spitkovsky D., Berges J., Middendorp S., Jansen-

Durr P., and Henglein B., Cell cycle regulation of cyclin A gene transcription is mediated by a variant E2F binding site, Proc, Nat. Acad. Sei. USA., 1995, V. 92, P. 11264-11268.

98. Antinore M., Birrer M., Patel D., Nader L., and McCance D., The human

papillomavirus type 16 E7 gene product interacts with and trans-activates the API family of transcription factors, EMBO J., 1996, V. 15, P. 1950 1960.

99. Mazzarelli J., Atkins G., Geisberg J., Ricciardi R.. The viral oncoproteins Ad 5 El A, HPV 16 and SV 40 Tag bind a common region of the TBP - associated factor - 110, Oncogene, 1995, V. 11, P. 1859-1864.

100. Tommasino MM Adamczewsld J., Carlotti F., Barth C.F., Manetti R.„ Con.tonii M., Cavalieri F., Hunt T.s Crawford LM Protein associates with the protein kinase p33CDK2and cyclin A., Oncogene, 1993, V. 8, P. 195-202,

101. Mclntyre M., Ruesch M., Laimins L., Human papillomavirus E7 oncoproteins bind a single form of cyclin E in a complex with cdk2 and pi07, Virology, 1996, V. 215, P. 73-83.

102. Shirodkar S., Even M., DeCaprio J., et al., The transcription factor E2F interacts with the retinoblastoma product and a pi 07 - cyclin A complex in a cell cycle - regulated manner, Cell, 1992, V. 62, P. 157-166.

ivi^. : liv'jiiu- iti, f^s-jwiofc-njiLr ïï IvimiiliiaiUL ., luiul^- J-V.i ï.i: J., cum

Jansen-Durr P., Inactivation of the cdk inhibitor p27KIPl by the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein. Oncogene, 1996, V. 13, P, 2323-2330.

1(14. White A., Livanos E., Tlsty T.. Differential distruption of genomic integrity and cell cycle regulation in normal human fibroblasts by the HPV oncoproteins , Genes and Dev., 1994, V. 8, P. 667-677.

105. Pan H,, Griep A., Temporally distinct patterns of p53-dependeat and p53-independent apoptosis during mouse lens development, Genes, and Dev., 1995, ¥.9, P. 2157-2169.

Putenveett.il J., Frederickson S., Reznikoff C., Apoptosis in human

ri.l I I A f rt .1 ï f î f 1 ï C i ti Uni -nAÎ- t-i'A * t^'i »Tk î i <r f-t * Ï ■( ii-i'i ¿riiiijir, j 1 ^

papijiuauiVii uii i u I'tiL JIVL i-s<kj iinuiui. iaiiiui^u iuhhoii LU vvrijuiiwiai ^i/hiij

Oncogene, 1996, V. 13, P. 1123-1131.

107. Weinberg R., The retinoblastoma protein and ceil cycle control,Cell. 1995. V. 81. P. 323-330.

108. Sam brook J., Fritsch E. F., Mania tis T., Molecular Cloning.» A Laboratory Manual- Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989,

109. McBride L, J., Carutilers M.H., An investigation of several deoxynucleoside phosphoamidites useful for synthesizing deoxyoligoimcleotides, Tetrahedron Jetteres, 1983, V. 24, P. 245-248.

1.16

110. Jones RA,, Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Ed. By M.J. Gait. Oxford. Washington DC, IRL Press, 1984, P. 23-24.

111. Maxam A., Gilbert W., Sequencing end-labeled DNA with base specific chemical cleavage, Meth. Eazymol., 1980, V. 65, P. 499-560 ,

112. Sanger F., Coulson A.R., A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol., 1975, V. 94, P. 441 446.

113. Suggs S.V., Hi rose T., Miyake J., Kawashima E.< Jonson M., Itakura K., et ai, Use of synthetic oligonucleotides for the isolation of specific cloned DNA sequences using Purified Genes. In: Developmental Biology. / ed . Brown D.D.N .Y.: Acad. Press, 1981, P. 683-693 .

114. Higuchi R. Krümmel B., Saiki R., A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments : study of protein and DNA

interactions, Nucl. Acids Res., 1988, V. 16, P. 7351-7367.

115. Komissarova E.V., Soyfer M.V., Pavlova L.S., Kisselojov F.L., The state of immortalized, transforming and suppressor genes in rat. ceils, transfected by Polyomavirus large T and HPV 18 E6 + E7 genes, Oncol. Rep., 1995, V. 2, P. 1169-1174.

116. Wigler M.,H!.!icer A., Silverctein S., Alex R,, Biochimical Transfer of single-copy eucatyotic genes using total cellular DNA as donor, Cell, 1978, V. 14, P. 725-731.

117. Chirgwin J.M., Przybvla A.E., McDonald R.J., Rutter WJ., Isolation of Biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease,

Biochemistry, 1979, V. 18, P. 5294-5299.

118. Спитковскии Д.Д., Зборовская И.Б,, Киселев 1 ранскрипция клеточных онкогенов а опухолях человека, Молекулярная Биология,. 1986, V. 20, Р. 1409-1422.

119. Пол Д. Культура клеток и ткани. - М.: Медгиз, 1963. - 346 е.

120. Stoker М., O'Neill См Венугпап S., Waxmami ¥., Anchorage and growth regulation in normal and virus transformed cells. Int. J. Cancer, 1968, V. 3, P. 683-693.

121. Oltersdorf Т., Roewekamp W., Schneider-Gaedicke A., Seedorf K,, Duerst M., Schwartz E.., "Expression products of human papilloma virus type 18, antibodies specific for these proteins, and diagnostic reagents containing these antibodies or the corresponding DNA. Patent number EP0256321-АЛ, 1988.

TT.-i- Тч л тт____,» ... "D - - .« % ».... . ... '(.->' T3«[,t,„____ .. f c;.. .»:.. . j-J. .

ш. neck jJ., i ее с.., nowiey г., ниа munger К.., riiucienoy ol bmumg ine retinoblastoma protein correlates with the transforming capacity of the E? oncoprpteins of the human papillomaviruses, Proc. Nat. Acad. Sci, USA., of America, V. 89, P. 4442-4446.

123. Sang В., and Barbosa M., Single amino acid substitutions in "Low-risk" human papillomavirus (HPV) type 6 E7 protein enhance features characteristic of the "high-risk" HPV E7 oncoproteins, Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1992, V. 89,

P.8063-8067.

124. Banks L,, Edmonds C., and Vousden K., Ability of the HPV 16 E7 protein to bind RB and induce DNA synthesis is not sufficient for efficient transforming

«nfiwh,"KirwiTt »»л!ic Ац.члллпл | вол v ^ P лев

125. Brofcaw J., Yee €,, and Manger K., A mutational analysis of the amino terminal domain of the human papillomavirus type 16 B7 oncoprotein. Virology, 1994, V. 205, P. 603-607.

\