Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Петриков, Кирилл Владимирович

• Петриков, Кирилл Владимирович
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Петриков, Кирилл Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Виды, особенности синтеза и способы получения биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.1 Классификация микробных биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.2 Особенности строения и синтеза рамнолипидов и трегалолипидов.

1.1.2.1 Рамнолипиды микроорганизмов рода Pseudomonas.

1.1.2.2 Трегалолипиды микроорганизмов рода Rhodococcus.

1.1.3 Влияние условий культивирования микроорганизмов на продукцию биологических поверхностно-активных веществ.

1.1.3.1 Влияние источника углерода.

1.1.3.2 Влияние источника азота.

1.1.3.3 Влияние прочих условий культивирования.

1.1.3.4 Использование экономически выгодных субстратов.

1.1.4 Способы очистки биологических поверхностно-активных веществ.

1 2 Методы культивирования и хранения микроорганизмов.

1.2.1 Культивирование микроорганизмов.

1.2.1.1 Виды культивирования.

1.2.1.2 Стадии культивирования.

1.2.1.3 Питательные среды для культивирования.

1.2.2 Хранение микроорганизмов.

1.2.2.1 Повышение выживаемости микроорганизмов при длительном хранении с помощью защитных сред.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Штаммы микроорганизмов-продуцентов биологических поверхностно-активных веществ.

2.2 Питательные среды и условия культивирования микроорганизмов.

2.4 Измерение индекса эмульгирования.

2.5 Измерение эмульгирующей активности.

2.6 Измерение поверхностного натяжения.

2.7 Измерение содержания гликолипидных биоПАВ.

2.8 Экстракция биоПАВ.^^

2.9 Тонкослойная хроматография гликолипидов.

2.10 Очистка биоПАВ методом колоночной хроматографии.

2.12 Анализ биоПАВ методом масс-спектрометрии.

2.13 Анализ биоПАВ методом ИК-спектроскогош.

2.14 Условия проведения периодического культивирования в ферментёре.

2.16 Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов.

2.15 Расчёт удельной скорости роста микроорганизмов.

2.16 Хранение микроорганизмов.

2.16.1 Лиофилизация.^

2.16.2 Контактная сушка.^

2.17 Определение сохранения деградативной способности микроорганизмов и фенотипической стабильности плазмид.

2.17 Количественная оценка деградативной способности микроорганизмов.

2.18 Статистическая обработка результатов.5 ^

3 РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Характеристика способности микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ.

3.2 Выделение биоПАВ, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами.

3.3 Особенности структуры биоПАВ.^

3.4 Культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.

3.4.1 Раздельное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.7?

3.4.2 Совместное культивирование микроорганизмов

Р.Аиогеясет 142№ и Ккодососсиз эр. Б67.

3.5 Хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов.

3.5.1 Кратковременное хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов в жидкой форме.

3.5.2 Длительное хранение микрорганизмов-нефтедеструкторов.

3.5.3 Новый способ получения сухой формы биопрепарата методом контактной сушки.^ I

4 ОБСУЖДЕНИЕ.Я

4.1 Способность микроорганизмов-нефтедеструкторов к продуцированию биоПАВ при различных условиях роста.

4.2 Выделение биоПАВ, продуцируемых микроорганизмами-нефтедеструкторами.

4.3 Определение особенностей структуры биоПАВ.

4.4 Раздельное и совместное культивирование микроорганизмов-нефтедеструкторов.

4.5 Хранение микроорганизмов-нефтедеструкторов.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами-нефтедеструкторами родов Pseudomonas и Rhodococcus»

Решение проблемы антропогенного загрязнения окружающей среды- нефтью относится к первоочередным экологическим- задачам. Поскольку объёмы добычи, транспортировки и переработки этого сырья очень велики, то и связанные с этим-утечки« разливы при авариях имеют глобальный; масштаб; В период с; 1990: по 1999тг. приблизительный объём нефтяных загрязнёний;одних:толБКо;морских акваторий'составил более 3 000 000 тонн [1]. Несмотря на то, что нефть и её компоненты подвергаются естественному разложению,; процесс самовосстановления, загрязненной? среды; является^ очень длительным. Без проведения широкомасштабных и эффективных мероприятий; по ликвидации1 последствий попадания нефти и нефтепродуктов ; в' окружающую среду, количество загрязнённых территорий будет неуклонно расти. Такие распространённые методы, как: механический сбор, отжим и выжигание нефти,, вывоз и захоронение загрязнённой почвы, не только являются неэффективными; но и могут нанести дополнительный; вред окружающей; среде: Важными задачами являются разработка и усовершенствование высокоэффективных и: безопасных способов очистки загрязнённых: территорищ в основе которых лежат процессы^ происходящие при ауторемедиации.

Активность микроорганизмов является одним из главных' факторов, способствующих , естественной очистке почв и водоёмов [2]. Способность микроорганизмов, к деградации различных загрязнителей, в том числе и углеводородов -основных*компонентов нефти, известна давно и интенсивно: изучается. Большое внимание •уделяется процессам; биологической' ремедиации природных экосистем. Биоремедиация* обеспечивает экономически- выгодную, высокоспецифичную; и экологически безопасную очистку, приводящую к уменьшению .концентрации» полтотантов. Одним; из: основных методов биоремедиации in situ (на' месте загрязнения) является: интродукция: микроорганизмов в места загрязнения [3]. Суть этого метода заключается'во внесении в почву биопрепарата, включающего в себя биомассу жизнеспособных клеток одного или нескольких активных штаммов углеводородокисляющих бактерий. При этом в почве формируется конкурентоспособная ассоциация микроорганизмов-нефтедеструкторов.

Известны, различные отечественные биопрепараты, используемые для Выполнение экспериментальной части работы в лаборатории биологии плазмид УРАН ИБФМ им-; Г.К. Скрябина РАН осуществлялось под руководством к.б.н., с.н.с. Филонова А.Е. биоремедиации: «Биоойл-СН» и «Биоойл-Югра» (ЗАО «Биоойл», г. Новосибрск); «Биоприн (Олеоворин)» (ВНИИ-Синтезбелок, предприятие «Новые технологии»), «Деворойл» (ООО «Микробные технологии» совместно с ООО «Сити Строй», г. Москва) [4]. Однако, несмотря на широкий спектр предлагаемых продуктов, ведется постоянный поиск новых микроорганизмов-нефтедеструкторов и их ассоциаций и изучение их свойств с целью повышения эффективности очистки нефтезагрязнённых территорий.

Этого можно достичь, создавая новые биопрепараты, при разработке которых учитывались бы особенности деградации углеводородов нефти различными микроорганизмами. Одним из важнейших механизмов утилизации компонентов нефти, которые слабо- или нерастворимы в воде, является образование микроорганизмами поверхностно-активных соединений (биоПАВ или биосурфактантов) [5]. Они способствуют солюбилизации углеводородов, образованию мелкодисперсной эмульсии, в результате чего облегчается контакт микробных клеток с гидрофобным субстратом и поступление его внутрь клетки. В настоящее время биоПАВ являются объектами пристального изучения. Их преимущество перед синтетическими ПАВ состоит в том, что они высокоэффективны, биодеградабельны и обладают низкой токсичностью. Изучение свойств, строения, условий биосинтеза этих соединений позволит создать биопрепараты на основе отобранных микроорганизмов-продуцентов [6]. Помимо этого, потенциал использования биосурфактантов не ограничивается технологиями биоремедиации. Эти вещества находят применение в таких отраслях промышленности, как нефтедобывающая, пищевая, фармацевтическая и косметическая [7]. Таким образом, поиск новых штаммов микроорганизмов, продуцирующих биоПАВ, и изучение свойств этих соединений, является актуальной задачей.

Другим аспектом современной экологической биотехнологии является получение промышленных форм биопрепаратов, отвечающих требованиям экономичности и эффективности. Исходя из этого, для получения биомассы микроорганизмов должны быть подобраны такие условия, при которых достигался бы максимальный выход продукта с высокими численностью живых клеток и углеводородокисляющей активностью. Важен и выбор способа хранения готового биопрепарата, позволяющего сохранить максимальную численность жизнеспособных микроорганизмов, так как суспензия бактерий теряет свои качества, необходимые для использования в биопрепарате, в течение нескольких дней.

Целью данной работы являлось выявление особенностей образования и строения биологических поверхностно-активных веществ, продуцируемых бактериями родов

Pseudomonas и Rhodococcus, и выбор условий культивирования и хранения этих микроорганизмов-нефтедеструкторов как компонентов биопрепарата для ремедиации нефтезагрязнённых экосистем:

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Оценить способность микроорганизмов — эффективных нефтедеструкторов к образованию поверхностно-активных веществ в зависимости от условий культивирования.

2. Провести^ очистку биоПАВ, образуемых выбранными эффективными микроорганизмами-продуцентами.

3. Исследовать особенности строения поверхностно-активных соединений.

4. Подобрать условия получения биомассы бактерий-нефтедеструкторов, продуцирующих биосурфактанты, при раздельном и совместном культивировании.

5. Определить условия хранения полученной биомассы, выбрав наиболее эффективные консерванты и криопротекторы.

Научная новизна

В рамках комплексного подхода к разработке биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий изучена способность микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящих в состав биопрепаратов «МикроБак» и «ВиО», к образованию поверхностно-активных веществ.

Установлено, что все изученные бактерии являются продуцентами биоПАВ. Наибольшее количество биосурфактантов экзо-типа образуется при росте псевдомонад и родококков на гексадекане. Впервые показано, что клетки микроорганизмов рода

Rhodococcus, полученные при культивировании на гидрофильных субстратах (глюкоза, бакто-триптон), способны стабилизировать эмульсию гексадекан-вода за счёт образования клеточносвязанных биоПАВ.

Исследованы особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями-нефтедеструкторами. Установлено, что биоПАВ экзо-типа имеют гликолипидную природу. У микроорганизмов видов Pseudomonas putida (штамм BS3701(pBSl 141)(pBSl 142)) и Pseudomonas fluorescens (штамм 142NF(pNF142)) впервые показана способность к биосинтезу гомологичных рамнолипидов.

Впервые продемонстрирована возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы.

Выявлено, что консервирующее действие бензоата и глутамата натрия на микроорганизмы родов Pseudomonas и Rhodococcus позволяет сохранить жизнеспособность бактериальных клеток в концентрированной суспензии при хранении.

Научно-практическая значимость

Выбранные условия культивирования бактерий-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus на полноценной среде, содержащей кислотный гидролизат казеина, дрожжевой автолизат и глюкозу, позволяют за короткое время с высокой эффективностью получить основу биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязнённых территорий: биомассу углеводородокисляющих микроорганизмов. При осуществлении ферментации бактерий в смешанной культуре значительно снижаются энергетические и материальные затраты. Разработанные режимы культивирования нефтеокисляющих микроорганизмов применяются для наработки биомассы запатентованного биопрепарата «МикроБак», используемого для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

Определены условия хранения получаемой биомассы микроорганизмов, обеспечивающие высокую численность и деградативную активность. Для сохранения наибольшей выживаемости бактерий в концентрированной суспензии в течение двух-четырёх недель оптимальным является использование консервирующих агентов: 0,2% раствора бензоата или глутамата натрия при поддержании низкой положительной температуры (2-4°С). Для получения товарной формы биопрепарата, пригодной для длительного храпения, транспортировки и применения, наиболее подходящим способом обработки биомассы является контактная сушка с перлитовым сорбентом и выбранной защитной средой: 10% сахарозы, 4% тиомочевины, 4% полиглюкина, 2% аскорбиновой кислоты. Этот метод позволяет повысить выживаемость микроорганизмов в 1,5-2 раза по сравнению с лиофилизированными образцами. Хранение сухого препарата при отрицательной температуре (-20°С) обеспечивает наилучшее сохранение численности и деградирующей активности микроорганизмов.

Авторские права на способ культивирования и хранения защищены патентом РФ 2378090 «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения». Получено решение о выдаче патента РФ «Способ получения сухой формы биопрепарата для очистки территорий от загрязнений нефтью и нефтепродуктами».

Апробация работы

Материалы работы были представлены на IV Международной конференции из серии «Наука и Бизнес» «Нанобио- и другие перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.); VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008 г.); XII International congress of bacteriology and applied microbiology (Istanbul, 2008 г.); Ill Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008 г.); Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010» (Тула, 2010 г.); III Общероссийской студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форум 2011»; IV международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011 г.); Международной конференции «Окружающая среда и человек: друзья или враги?» (Пущино, 2011 г.).

Публикации

Опубликовано 12 работ, в том числе 4 статьи, 8 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций. Выдан патент РФ 2378090. Получено положительное решение о выдаче патента РФ по заявке №2010121688.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 136 страницах, содержит 35 рисунков и 15 таблиц. Список литературы включает 256 источников.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Петриков, Кирилл Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Микроорганизмы-нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus, входящие в состав биопрепаратов для биоремедиации «МикроБак» и «ВиО», являются эффективными продуцентами поверхностно-активных веществ при росте как на гидрофильных (глюкоза), так и на гидрофобных (гексадекан) субстратах. Впервые показано, что при росте на глюкозе родококки образуют эндо-биоПАВ, связанные с клеточной стенкой бактерий.

2. Подобраны условия для продуцирования, выделения и очистки биоПАВ, синтезируемых изучаемыми микроорганизмами-нефтедеструкторами, что позволяет получать природные биосурфактанты для дальнейшего практического использования.

3. Выявлены особенности строения выделенных биосурфактантов, продуцируемых изучаемыми бактериями родов Pseudomonas и Rhodococcus. Показано образование гомологичных дирамнолипидов микроорганизмами вида Р. putida (штамм BS3701) и вида Р. fluorescens (штамм 142NF). Исследованные штаммы родококков: Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5 и Rhodococcus sp. S26, образуют соединения гликолипидной природы, два из которых отнесены к сукциноилтрегалолипидам.

4. Впервые показана возможность глубинного периодического культивирования микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в смешанной культуре с высоким выходом биомассы. Индукция метаболизма псевдомонад салицилатом способствует увеличению урожая микроорганизмов. Выбранные условия культивирования были использованы при получении запатентованного биопрепарата «МикроБак» для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

5. Определён наилучший способ подготовки биомассы штаммов-нефтедеструкторов к длительному хранению: контактная сушка с защитной средой, содержащей сахарозу, тиомочевину, полиглюкин и аскорбиновую кислоту, и с сорбентом перлитовым песком. Разработанный способ сушки может быть использован для получения сухой формы биопрепарата с высокой выживаемостью и деградативной активностью входящих в его состав микроорганизмов.

гидроксидекановой кислоты с образованием двух гликозидных связей: сначала между димером ЖК и углеводом, а затем между получившимся монорамнолипидом и второй молекулой ТДФ-рамнозы [80]. При этом продукт первой реакции — монорамнолипид - не обязательно участвует во второй. Реакции катализируются специфическими рамнозилтрансферазами: RhlB (мембраносвязаной) и RhlC, соответственно. Активность ферментов была обнаружена как в мембранной фракции, так и в цитозоле. В дальнейших исследованиях эти выводы были подтверждены для другого штамма, P. aeruginosa PG201, а ферменты частично охарактеризованы [82]. На основании результатов секвенирования гена rhIB и анализа полученной таким образом аминокислотной последовательности белка RhlB, предположили, что этот фермент имеет два области связывания с внутренней мембраной. Фермент был выделен из мембранной фракции, его масса составила около 47 кДа. Так же был секвенирован и ген г/г/А. Однако, в своей работе Окснер и др. [82] сделали заключение, что белок RhlA, массой 35,5 кДа, локализован в периплазме и либо является прекурсором для другой рамнозилтрансферазы, либо необходим для стабилизации или закрепления в цитоплазматической мембране фермента RhlB. Дальнейшие исследования показали неточность этих выводов: было установлено, что RlilA отвечает за образование димера гидроксикислот [77]. Ген rhlC, кодирующий фермент RhlC, который отвечает за реакцию присоединения второго углевода к монорамнолипиду, был изучен в работе Рахима и др. [83]. Поскольку белок содержал трансмембранный гидрофобный участок, он, предположительно, также является мембраносвязанным. Таким образом, за присоединение рамнозы к жирнокислотному димеру отвечает фермент RhlB, а за добавление второй молекулы углевода к монорамнолипиду - RhlC. Обе этих реакции происходят в цитоплазме на внутренней мембране и лишь затем биосурфактанты транспортируются во внешнюю среду [79].

Остаётся открытым ряд вопросов, в частности о происхождении рамнолипидов типа 3 и 4 с одним остатком гидроксикислоты вместо димера. Они могут быть как продуктами прямого синтеза из углевода и одной жирной кислоты, так и результатом отщепления соответствующего участка от рамнолипидов типа 1 и 2 [79].

Цикл биосинтеза жирных кислот

- Р-гидроксидеканоат - АПБ

АПБ

RhtA.

О о И II

О—р — о-р—о

Тимидин о о n II

НО—СН -СН--С — О— СН —сн—с—он I 2 i г iCH2)a tf»2h

СН. сн„

НО НО о- О-Тим иди н-ди фосфорами оза р-гадроксидеканоил-р-гадроксидеканоат

Тим идин-дифо сфат

Рамнозилтрансфераза 1 RhlB о о

II л

О-СН -СН "С-О-СН —СН.,—С—он

СН2)6 СН t а сн2)6

СН,

Ра м нол и пи д 1 ко но

Тим иди н-ди фосфат

3 -"3

Тим иди н-ди фосфорами оза

Рамнозилтрансфераза 2 RhlC

О О

II II о -сн -СН.-С - О -СН -СН,- с-он О | [ Z f л

СНг)3

СН2)б

Рам нол и пи д 2 сн.

СН, но но

Рисунок 3 - Биосинтез рамнолипидов у P. aeruginosa [60, 79].

Что касается генетической регуляции синтеза рамнолипидов, то известно, что она тесно взаимосвязана с механизмами «quorum sensing» [84]. Основная часть ответственных за этот процесс часть генов организована в оперон г/г/ABRI (рис. 4). Последовательно расположенные участки г hi А и гЫВ кодируют, соответственно фермент RhlA, отвечающий за образование димера ЖК, и рамнозилтрансферазу 1 (RhlB) [85]. Далее в составе оперона расположен ген, который кодирует регуляторный белок RhlR. Он имеет массу 28 кДа и является позитивным регулятором, относящимся к группе активаторов транскрипции типа LuxR [86]. Последний участок оперона кодирует фермент Rhll, который синтезирует автоиндуктор N-бутаноилгомосеринлактон, участвующий в сигнальной системе «quorum sensing» [84]. rhll-дефектный мутант был не способен к синтезу рамнолипида, но при добавлении в среду синтетического индуктора начиналось образование биосурфактанта [60].

N-ОД-ГСЛ

N-Б-ГСЛ

Рисунок 4 - Модель генетической регуляции синтеза рамнолипидов у Р. aeruginosa в опероне rhlABRI [60, 79]. N-Б-ГСЛ - N-бутаноил-гомосеринлактон; N-ОД-ГСЛ - N-3-оксо-додеканоилгомосеринлактон.

Перед генами rhlA и rhä расположены участки связывания, к которым присоединяется комплекс регуляторного белка RhlR с автоиндуктором, запуская транскрипцию. Интересно, что данный белок, предположительно, может выступать как репрессор, в том случае, если он не связан с автоиндуктором [87]. Ген rhlC, кодирующий рамнозилтрансферазу 2 RhlC, не входит в описанный оперон, однако, находится под контролем той же сигнальной системы [83].

Кроме этого, синтез рамнолипидов регулируется двумя другими системами «quorum sensing». Первая представляет собой механизм позитивной регуляции ещё одним белком группы LuxR: LasR, специфическим лигандом для которого является N-3оксододеканоил-гомосеринлактон. Участки связывания для данного регулятора расположены перед генами rhlR. и rhll [84]. Другой механизм включает в себя сложную систему регуляции с участием гидроксиацилхинолинов [77, 88]. t

1.1.2.2 Трегалолипиды микроорганизмов рода Rliodococcus

Для представителей рода Rhodococcus характерно образование поверхностноактивных веществ в ответ на присутствие в среде культивирования» алканов. Эти ПАВ представляют собой гликолипиды, содержащие невосстанавливающий дисахарид трегалозу С12Н22О11 (a-D-глюкопиранозил-1,1 -a-D-глюкопираноза), с которым сложноэфирными связями соединены жирные кислоты [27]. Наиболее распространены а-разветвлённые ß-гидроксилированные (миколовые) кислоты с суммарной длинной углеродной цепи от 20 до 90 атомов [89]. Трегалолипиды встречаются* среди представителей родов Corynebacterium, Mycobacterium и Nocardia [90]. Клеточносвязанные (эндо-тип) трегало-6,6'-димиколаты, известные как «корд-фактор», являются фактором патогенности туберкулёзных бактерий Mycobacterium tuberculosis [91].

Биосурфактанты эндо-типа были - обнаружены при изучении штамма R. erythropolis DSM43215 [92] (рис. 5). Липидные фрагменты были представлены миколовыми (З-гидрокси-2-алкилированными) кислотами с общей формулой от С32Н64О3 до СзаН760з, где С34Н68О3 и С35Н70О3 оказались доминирующими [93]. Флокулирующими свойствами обладали клеточносвязанные гликолипиды штамма R. erythropolis S-1 [94]. После щелочного гидролиза этих соединений были обнаружены глюкоза и трегалоза, а также миколовые кислоты с длиной цепи от С32 до С40 с преобладающими компонентами С34, СЗб и С38. При росте штамма Rhodococcus sp. Н13-А на гексадекане образовывались биосурфактанты экзо- и эндо-типов, представлявшие неионогенные липиды трегалозы с одним основным и десятью минорными компонентами [95]. Углевод был связан с линейными насыщенными и ненасыщенными кислотами С10-С22, миколовыми кислотами С35-С40, гексан- и додекандикарбоновыми кислотами, 10-метилированными гексановой и октадекановой кислотами. Основной компонент был идентифицирован как 2,3,4,6,2',3|,4',6,-октаалканоилтрегалоза, а минорные - как ди-, тетра- и октаацилированные производные углевода.

Образование родококками гликолипидов экзо-типа, то есть не связанных с клеточной стенкой, а выделяемых в культуральную среду, было впервые показано в 1983 в работе Ристау и Вагнера [96]. Их структура была подтверждена методами инфракрасной спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса 'Н и 13С, масс-спектрометрии и элементного анализа. В отличие от ранее изученных миколатов трегалозы, эти биоПАВ содержали остаток янтарной кислоты, так что одна карбоксильная группа не участвовала в образовании сложноэфирных связей, то есть, фактически, данные соединения относились к анионогенным ПАВ. Кроме этого, в гликолипиды входили остатки линейных ЖК, длина которых была значительно меньше миколовых и варьировалась от С8 до С14. Анионнные трегалолипидные ПАВ, также содержащие остаток янтарной кислоты, ранее были обнаружены у микроорганизма Mycobacterium paraffinium, образующего 2-О-октаноил-3,2'-ди-0-деканоил-6-0-сукциноил трегалозу. С учётом этих структурных особенностей подобные соединения в научной литературе принято называть анионные сукциноилтрегалолипиды [27, 89, 96]. Сукциноилпроизводные, обычно, выделяются в отдельную группу биосурфактантов, с целью отделить их от более изученных трегаломиколатов. Предполагается, что для образования таких нестандартных (по сравнению миколатами) соединений, микроорганизмы должны находиться в условиях лимитированного роста, например, при дефиците азота [96].

Образование двух 2,3,4,2-тетраэфиров трегалозы, содержащих один остаток янтарной и еще три остатка декановой и октановой кислот, отмечено при культивировании микроорганизмов штамма Rhodococcus sp. MS11 с гексадеканом [97]. Методом масс-спектрометрии электронного спрея было установлено, что молекулярной массе 848 Да соответствует диоктаноил-деканоил, а массе 876 Да — октаноил-дидеканоил производные, хотя точное распределение ацильных радикалов не было установлено. Аналогичный состав биоПАВ обнаружили Тулева с соавт. [98] у R. wratislaviensis BN38, также при использовании гексадекана в качестве источника углерода и энергии.

Эспуни с соавт обнаружили сукциноилпроизводные трегалозы иного состава. Бактерии штамма Rhodococcus sp. 51Т7 при росте на отходах смазочного масла выделяли 2,3,4,2'-тетраэфиры трегалозы, в составе которых присутствовал сукциноил, а длина цепей остальных кислот варьировалась от 7 до 11 [99]. Позднее этой же группой учёных было отмечено, что состав жирнокислотных остатков зависит от источника углерода. При использовании н-декана биоПАВ представлял собой тетрадеканоилтрегалозу, а рост на н-тридекане давал в результате сукциноил-октаноил-нонаноил-деканоил производное [100]. t.I у™*

Фп

Димиколат : R-| =R2 = v JL

Y j*^ CHa

H*C ° OH Ч'Л

Моном и кол ат: R-j = - 1. £Л Ш

О ОН н

14 m-f/1 = 27-31)

Рисунок 5 - Структура трегаломиколатов эндо-типа, образуемых R. erythropolis DCM43215 [93].

Два анионных трегалолипида, содержащих два жирнокислотных остатка (С\2, С или Cie) и два (STL-1), либо один (STL-2) остаток янтарной кислоты, образуют микроорганизма штамма Rhodococcus sp. SD-74 при росте на гексадекане [101] или глицерине [102] (рис. 6). Сочетанием различных методов спектроскопии ЯМР (COSY, HMQS, НМВС), было установлено, что биосурфактант STL-1 представляет собой 3,4-0-диалканоил-2,2'-0-дисукциноил трегалозу, где длина углеродных цепей ацильных остатков составляет 12, 14 или 16 атомов [102]. Соединение STL-2 отличается отсутствием заместителя в положении С-2' и, соответственно, представляет собой триэфир.

ОН

Рисунок б - Структура анионного трегалолипида экзо-типа ЯТЬ-], образуемого

КЪойососст 8П-74 [102].

Известны некоторые закономерности и особенности путей биосинтеза соединений подобного типа, в которых углевод связан с кислотой сложноэфирной связью. Учитывая зависимость этих процессов от ростового источника углерода, особенный интерес представляют следующие аспекты.

1. Образование миколовых кислот рассматривают как реакцию по типу конденсации Кляйзена:

Е^-СО-Х + Яз-СНг-СО-У ^-СО-СНг^-СО-У К1-СН(ОН)-СН2(К2)-СООН ; где X и У - активизирующие группы возможно, -ЭН [74]. Для образования различных миколатов жирная кислота, составляющая главную цепь молекулы, синтезируется перед конденсацией со второй кислотой.

2. Синтез конечного углеводного остатка, трегалозо-6-фосфата, катализируется трегалозо-6-фосфатсинтетазой, которая соединяет два а-Б-глюкопиранозильных фрагмента 1-Г-связью. Вероятно, глюкозо-б-фосфат и глюкозо-уридин-5'-дифосфат (глюкозо-УДФ) являются непосредственными реагентами в данной реакции [93]: глюкозо-УДФ + глюкозо-б-фосфат = трегалозо-6-фосфат +УДФ

Рисунок 7 - Путь биосинтеза моно- и дикориномиколатов трегалозы у

R. erythropolis DSM43215 [93]. 3. Дальнейшее направление синтеза трегаломиколатов из трегалозо-6-фосфата было основано на изучении его индукции н-алканами у R. erythropolis. Кретчмер и Вагнер предложили путь биосинтеза моно- и дикориномиколатов при росте на тетрадекане [93] (рис. 7). Они наблюдали присутствие свободных интермедиатов синтеза кориномиколовой кислоты. Следовательно, кислота образуется независимо от этерифицируемого углевода. Трегалозо-б-фосфат, накапливающийся в клетках, конденсируется с кислотой в соответствующий кориномиколат трегалозы.

4. Механизмы синтеза сукциноилпроизводных остаются невыясненными. Исследования, направленные на выделение соответствующих ферментов, оказались неудачными [27].

Закономерности генетических механизмов синтеза гликолипидных биосурфактантов у родококков практически не изучены. Отмечено, что присутствие в клетке больших плазмид связывают со способносгью к образованию стабильных эмульсий [27].

1.1.3 Влияние условий культивирования микроорганизмов на продукцию биологических поверхностно-активных веществ

Способность микроорганизмов синтезировать биосурфактанты в зависимости от условий их культивирования интенсивно изучается. Основными направлениями является изучение влияния таких факторов, как источник углерода и азотное лимитирование культуры. С другой стороны, много исследований посвящено получению биосурфактантов при росте на дешёвых возобновляемых субстратах типа маслосодержащих отходов пищевой промышленности.

1.1.3.1 Влияние источника углерода

В ряде работ растворимые в воде источники углерода, такие как глицерин, глюкоза, маннит, и этанол использовались для синтеза рамнолипидов микроорганизмами Pseudomonas spp., однако, количество образующегося биосурфактанта был ниже, чем при культивировании с водонерастворимыми субстратами (н-алкаиы и оливковое масло) [44, 62]. Было показано [24], что хотя различные источники углерода в среде культивирования влияли на состав биосурфактанта, продуцируемого микроорганизмами рода Pseudomonas, наличие субстратов с различной длиной углеродной цепи не проявило влияния на длину цепочки фрагментов ЖК в гликолипидах. С другой стороны, для микроорганизмов штаммов Acinetobacter sp. Н13 и H01-N были отмечены качественные изменения в образовании биосурфактанта, отражающие число атомов углерода в алканах [103, 104].

При росте Arthrobacterparaffineus АТСС 19558 на глюкозе, добавление гексадекана в среду в ходе стационарной фазы роста привело к значительному увеличению выхода биосурфактанта [105]. В работе Дувняка и Козарика [105] показано образование Corynebacterium lepus большого количества биосурфактанта, связанного с клеточной стенкой, при выращивании этого микроорганизма на глюкозе, а добавление гексадекана способствовало освобождению ПАВ из клеток. Была также отмечена продукция незначительного количества биосурфактанта при росте клеток на легкодоступных источниках углерода; только тогда, когда все растворимые субстраты были исчерпаны-и при наличии водонерастворимых углеводородных субстратов запускался синтез биосурфактанта [107]. Производство гликолипида дрожжами при росте на среде, содержащей 10% глюкозы, стимулируется добавлением растительных масел, давая выход из 80 г/л [108]. Был продемонстрирован-[109] высокий выход софорозолипидов'путем преодоления ингибирования продуктов культивирования дрожжей Candida bombicola CBS 6009 после добавления этилового эфира жирной, кислоты рапсового' масла в среду с глюкозой. При культивировании» дрожжей Torulopsis apícola IMET 43747 на среде, содержащей глюкозу и подсолнечное масло, был получен выход гликолипида порядка 90 г/л [110]. В работе МакЭлви с соавт. [111] сообщается, что в периодической культуре Torulopsis bombicola, 37% усваиваемого углерода было использовано/, для получения» софорозолипида с выходом 80 г на литр. Однако в периодической культуре с подпиткой около'60% углерода было включено в биосурфактант с повышением выхода до 120 г/л.

Все эти» данные свидетельствуют, что источник углерода, имеет большое влияние на тип и количество производимого биосурфактанта. 3

1.1.3.2 Влияние источника азота

Помимо источника углерода на образование биосурфактантов влияют и другие компоненты питательной среды. Особенно важен выбор источника азота. Среди исследованных азотсодержащих соединений' соли аммония, и. мочевина были лучшими источниками азота для Arthrobacter paraffineus [112]. Количество биоПАВ, синтезируемого микроорганизмами Arthrobacter paraffineus, увеличивалось при добавлении в среду L-аминокислот, таких как аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аспарагин и< глицин [112]. В тоже время, для Р. aeruginosa [111, 113, 44] и Rhodococcus spp. [114] максимальное образование биосурфактанта происходит при наличии нитратов. Структура сурфактина зависит от концентраций аминокислот в среде: может образовываться либо 7-валин, либо 7-лейцин сурфактин [115]. Аналогичным образом, синтез лихенизина-А (lichenysin-A) микроорганизмами Bacillus licheniformis BAS50 может возрастать в два или четыре раза при добавлении в среду L-глутаминовой кислоты и L-аспарагина, соответственно [116].

Известно, что рост микроорганизмов в условиях азотного* лимитирования сопровождается значительным увеличением количества синтезируемого биосурфактанта. В ряде исследований различных псевдомонад показано наличие эффекта сверхпродуцирования биоПАВ после перехода культуры в стационарную фазу роста в связи с исчерпанием источника азота в среде культивирования [117118-119]. Кроме этого азотное лимитирование вызывало увеличение количества образуемого эмульгатора у Candida tropicalis IIP-4 [120], гликолипида у Nocardia sp.SFC-D [121] и водоростворимого биосурфактант у Torulopsis apicola\ [122]. Азотное лимитирование может вызывать не только сверхпродукцию биосурфактантов, но и изменения в их составе [5]. Было показано [113]; что максимальное: количество«; рамнолипида. образовывалось; при соотношении; углерод:азот. (C:N) от 16:1 до 18: Г, а; при<; соотношении/, ниже Г1-:1,, когда азотного лимитирования культуры- не было, синтез биосурфактанта не наблюдался. В соответствии с данными работы [122];. для оптимального выхода?; биомассы важно абсолютное количество азота, а не его относительная концентрация, в то время; как концентрация . гидрофобного источник углерода является определяющей, для трансформации;доступного : углеродав биосурфактант. . :

1.1.3.3 Влияние прочих условий культивирования

Условия роста такие, как pH, температура, перемешивание и аэрация также влияют ' * . . . .' " ■ на образование;, биосурфактантов посредством воздействия накроет клеток-: или их активность. Так; pH среды играет важную роль в синтезе софорозолипида дрожжами Torulopsis bombicola [30]. Образование рамнолипида у Р. aeruginosa достигало своего максимума в диапазоне pH; от 6 до 6,5 и резко сокращалось выше рН.7 [113]. В отличие от псевдомонад, .у Nocardia corynbacteroides синтез; пента- и дисахаридных лииидов в не; изменяется Bi диапазоне pH от 6,5 до 8 [123]. Кроме.того, известно,, что поверхностное натяжение у некоторых биосурфактантов^ остается, стабильным в широком; диапазоне: значений pH, в то время; как . эмульгирующая? активность, проявляется^ в» более узком-диапазон pH [124].

Для микроорганизмов Arthrobactcr par'affiheus [125]; w Pseudomonas sp; DSM 2874 [24] изменение температуры вызывает изменения в составе биосурфактантов. Термофильные бактериш Bacillus sp. росли и синтезировали; биосурфактант при температуре выше 40°G [126]. Термическая обработка некоторых биосурфактантов не вызывала, заметных изменений в свойствах, таких, как снижение поверхностного и межфазного натяжения и эффективности эмульгирования. Все они оставались стабильными после автоклавирования при 120°G в.течение 15 мин. [5].

При изучении механизма образования биосурфактанта микроорганизмами Arthrobacter calcoaceticus RAG-1 было показано [127], что соотношение (клеточносвязанный полимер)-(сухая масса клеток) уменьшалось вследствие увеличения негативного воздействия, вызванного перемешиванием среды. В тоже время, по результатам исследования [128] авторами был сделан вывод, что транспорт кислорода является одним из ключевых параметров для оптимизации процесса и масштабов производства сурфактина микроорганизмами Bacillus subtilis.

Концентрация! соли также оказывает влияние на синтез- биосурфактантов микроорганизмами," воздействуя активность клеток. Однако образование некоторых биоПАВ не изменялось при концентрации соли до 10%, хотя наблюдалось снижение критической концентрации мицеллообразования [124].

Кроме этого, перспективным, может быть получение биосурфактантов, образуемых покоящимися или иммобилизованными1 клетками. В таких условиях микроорганизмы не размножаются, однако способны к синтезу различных соединений, в том числе и биоПАВ. Данному вопросу посвящено несколько работ, касающихся образования рамнолипидов Pi aeruginosa [129, 24], софоролипидов Torulopsis bombicola [130] и Candida apicola [131], целлобиолипидов Ustilago maydis [132], тетраэфиров трегалозы R erythropolis [93, 133], маннозилэритролипидов Candida antarctica [134, 135]. Использование таких способов поможет снизить стоимость получения продукта, поскольку фаза, в которой содержится продукт, и фаза, в которой находятся клетки микроорганизмов, изначально разделены.

Внесение в среду культивирования прекурсоров биосурфактантов может вызвать как количественные, так и качественные изменения в составе продукта. Добавление определённых липофильных соединений в ростовую среду Torulopsis magnoliae [0136], Torulopsis bombicola [137, 138] и Torulopsis apicola IMET43747 [110] вызывало увеличение производства сурфактанта примерно до 120-150 г/л. Был также отмечен рост количества синтезируемых моно-, ди- и трисахаридов при культивировании Arthrobacter paraffineus DSM2567 [0139], Corynebacterium spp. [140], Nocardia spp. [141] и Brevibacterium spp. [142] после внесения в среду культивирования' соответствующего углевода.

1.1.3.4 Использование экономически выгодных субстратов

В настоящее время, биосурфактанты не могут конкурировать с синтетическими

ПАВ, по причине высокой стоимости их производства. Часто компоненты ростовой среды вносят значительный вклад в расходы на культивирование микроорганизмов, а значит и на стоимость получаемого биосурфактанта [143]. Стоимость субстратов'составляет от 10 до 30% стоимости всего биотехнологического процесса [144]. Таким образом, для повышения экономической эффективности производства биосурфактантов желательно снижать затраты на расходные материалы. Одним из интенсивно исследуемых путей для достижения этой цели является использование дешёвых и легкодоступных материалов в качестве основных субстратов для культивирования. Такими субстратами могут быть растительные масла и отходы пищевой промышленности (табл. 2).

Исследования по культивированию микроорганизмов' с использованием растительных масел показывают, что эти субстраты могут быть достаточно эффективными и, в тоже время, дешёвыми для производства биосурфактантов. Рапсовое [145], кукурузное [146], оливковое [13], пальмовое [147, 148] и соевое масла [149] использовались для получения рамнолипидов при культивировании псевдомонад. Помимо этого, высоких выходов биоПАВ удавалось достигнуть для получения софоролипидов Candida bombicola [150, 151], маннозилэритролипидов Candida sp. SY16 [152], липопептидов Serratia marcescens [149]. Была показана возможность использования и животных жиров как субстратов для роста Candida bombicola, при этом выход софоролипида составил 12 г/л [153].

Перспективными субстратами для получения биосурфактантов являются отходы, образующиеся при получении и очистке масел [11]. Более того, отходы пищевой промышленности, которые принято относить к загрязнителям окружающей среды, оказались пригодны для получения биосурфактантов. При этом достигается не только снижение стоимости продукта, но и происходит утилизация отходов. Например, в пищевой промышленности производство оливкового масла сопровождается образованием значительного количества отходов, что негативно воздействует на окружающую среду. В работе [154] показано, что псевдомонады образуют биосурфактанты при культивировании на среде, содержащей такие отходы, при этом, выход рамнолипида составил 14 г на 1 кг отходов. Использование очистков г апельсинов как субстрата для выращивания Р. aeruginosa МТСС 2297 в оптимизированных условиях позволило добиться выхода биосурфактанта 9,2 г/л [155]. После дополнительного подбора условий культивирования микроорганизмов штамма Р. aeruginosa 47Т2 NCIB 40044 на отработанном масле (после его использования для жарки) выход рамнолипида составил 2,7 г/л [156]. При твердофазном культивировании Р. aeruginosa UFPEDA 614 на тростниковом жмыхе, пропитанном глицерином, удалось достигнуть образования 40 г продукта на 1 кг субстрата [157]. Смесь отходов переработки маниоки с отходами пищевого масла также была использована для получения рамнолипидов [158]. Показана возможность выращивания псевдомонад на отходах соевого масла для продукции биосурфактантов [159,160].

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Петриков, Кирилл Владимирович, 2011 год

1. Etkin D.S. Analysis of oil spill trends in the United States and worldwide // 2001 International Oil Spill Conference, American Petroleum Institute, Washington D.C. 2001. P. 1291-1300.

2. Van Hamme J.D., Singh A., Ward O.P. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003 - V. 67. - No 4. - P. 503-549.

3. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. — 1995 -№ 3-С. 20-27.

4. Кобзев Е.Н. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов микробными ассоциациями в модельных системах. Дис. . канд. биол. наук. 2003. Оболенск. 179 с.

5. Desai J., Banat I. Microbial production of surfactants and their commercial potential // Microbiol, and Molecular Biology Reviews 1997 - V. 61. - No 1. - P. 47-64.

6. Pacwa-Plociniczak M. Environmental Applications of Biosurfactants: Recent Advances // Int. J. Mol. Sci. 2011 - V. 12 - P. 633-654.

7. Banat I., Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Martinotti M., Fracchia L., Smyth T., Marchant R. Microbial biosurfactants production, applications and future potential // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2010 - V. 87. - P. 427-444.

8. Ланге K.P. Поверхностно-активные вещества: синтез, свойства, анализ, применение. Пер. с англ. / Под науч. ред. Л.П. Зайченко. СПб: Профессия, 2004. 240 с.

9. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. Л.: «Химия», 1975. 248 с.

10. Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогеных элементов: учеб. для вузов / Ю.А. Ершов, В.А. Попков, А.С. Берлянд и др. Под ред. Ю.А. Ершова. М. Высш. шк., 2000. 560с.

11. Muthusamy К., Gopalakrishnan S., Thiengungal K.R., Sivachidambaram P. Biosurfactants: Properties, commercial production and application 11 Current Science -2008 V. 94. - No 6. - P. 736-747.

12. Lima T.M., Procopio L.C., Brandao F.D., Carvalho A.M., Totola M.R., Borges А.С. Biodegradability of bacterial surfactants // Biodégradation 2011 -V. 22. -No 3. - P. 585-592.

13. Abouseoud M., Yataghene A., Amrane A., Maachi R. Biosurfactant production by free and alginate entrapped cells of Pseudomonas fluorescens // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2008 - V. 35 -No 11. - P. 1303-1308.

14. Gautam K.K., Tyagi V.K. Microbial Surfactants: A Review // J. Oleo. Sci. 2006 - V. 55.17.