Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Точилина, Анна Георгиевна

• Точилина, Анна Георгиевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Точилина, Анна Георгиевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Микроорганизмы молочнокислого брожения - биологические и молекуляр-но-генетические свойства.

1.1. Таксономическое положение и филогенетические связи лактобацилл.

1.2. Фенотипические свойства бактерий рода Lactobacillus.

1.2.1. Биохимические свойства как основа видовой энзимоидентификации бактерий рода Lactobacillus.

1.2.2 Некоторые биологические свойства бактерий рода

Lactobacillus: адгезия, антагонизм по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам и межбактериальные взаимодействия.

1.3. Проблемы раздельного и совместного культивирования лактобакте-рий.

1.4. Особенности молекулярно-генетической структуры микроорганизмов рода Lactobacillus.

1.5. Методы выделения геномной ДНК бактерий рода Lactobacillus.

1.6. Методы индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием молекулярно-генетических технологий.

2. Лактобациллы как основа пробиотических препаратов.

2.1.Классификация пробиотиков.

2.2.Механизмы действия пробиотических препаратов.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Исследуемые объекты.

2. Культивирование лактобактерий и биохимическая идентификация.

3. Полимеразная цепная реакция.

4. Секвенирование ДНК.

5. Определение биосовместимости лактобацилл.

6. Исследование динамики роста популяции бактерий Lactobacillus plantarum

8 RA-3 и Lactobacillus fermentum 39 в условиях раздельного и совместного культивирования.

7. Статистическая обработка.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение биохимических свойств вновь выделенных штаммов рода Lactobacillus

2. Разработка метода индикации бактерий рода Lactobacillus на основе специфической амплификации нуклеиновых кислот.

2.1 Разработка методики индикации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦРгена 16S рРНК.

2.2 Оценка эффективности методов выделения геномной ДНК из бактерий рода Lactobacillus.

3. Разработка унифицированной схемы видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР гена 16S рРНК и ее апробация.

3.1 Разработка методики видовой идентификации лактобацилл с использованием гнездового варианта ПЦР.

3.2 Оценка видовой специфичности ПЦР лактобацилл в сравнении с классическим биохимическим методом их идентификации.

4. Применение ПЦР в характеристике популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus.

4.1. Изучение межштаммовых взаимодействий производственно значимых видов лактобацилл.

4.2. Оценка метода ПЦР при изучении динамики роста культур L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus»

Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе, а некоторые виды являются важнейшими представителями микробиоты организма человека [Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В., 2003]. Лактоба-циллы длительное время привлекают внимание ученых — биохимиков, микробиологов, медиков, экологов, ввиду их потенциального значения для поддержания гомеостаза системы «человек-окружающая среда», сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих заболеваний различной этиологии.

Актуальным вопросом является получение новых знаний о биологических свойствах и молекулярно-генетической структуре лактобацилл; создание новых пробиотических препаратов на их основе с помощью разных методических подходов к культивированию. Главным конечным продуктом метаболизма лактобацилл является D- и L-молочная кислота. У гомоферментативных лактобацилл лактат составляет 90% всех продуктов брожения. У представителей ге-тероферментативных видов в качестве конечных продуктов также образуется молочная кислота и углекислый газ [Шлегель Г., 1987]. Благодаря продукции органических кислот, перекисей и бактериоцинов многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении патогенных и оппортунистических микроорганизмов [Quadri L.E., 2002; Kleerebezem, 2004]. Бактерии рода Lactobacillus усиливают гидролиз белков, сбраживают углеводы, омыляют жиры, препятствуют микробному декарбоксилированию пищевого гистидина и повышению количества гистамина [Воробьёв А.А., Лыкова Е.А., 1999]. Биохимические и морфологические свойства лактобацилл являются в настоящее время основным и единственным критерием межродовой и видовой идентификации этих микроорганизмов. Альтернативой классической биохимической идентификации может стать метод генотипирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработка новых и оптимизация известных молекулярно-генетических методик " индикации и точной видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus является актуальной, практически значимой и своевременной задачей, которой уделяется большое внимание как отечественными, так и зарубежными исследователями. Однако^.несмотря- на углубленное изучение этого вопроса на настоящий момент еще отсутствует оптимальная ,лабораторная методика на основе ПЦР, позволяющая проводить индикацию и идентификацию видов рода Lactobacillus.

Цель исследования

На, основе изучения биохимических свойств и структуры генома разработать унифицированный метод на основе ПЦР для индикации и видовой идентификации бактерий рода. Lactobacillus и исследовать их межштаммовые взаимоотношения. ,

Задачи исследования:

1. Изучить биохимические свойства новых штаммов лактобацилл:: (сахароли-тические свойства).

2. На основе анализа? нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения, представленных в GenBank, подобрать композицию универсальных праймеров для; индикации бактерий рода Lactobacillus.

3. Провести оценку сравнительной эффективности различных методов выделения ДНК из клеток бактерий рода Lactobacillus - ферментативного лизиса, кипячения и нуклеосорбции, для последующего проведения ПЦР.

4. Установить нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК следующих штаммов пробиотических лактобацилл: L.plantarum 8 RA-3, L.fermentum 39 и L.casei 583.

5. Разработать схему видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием «гнездовой» ПЦР специфического фрагмента индикации.

6. Провести сравнение метода видовой идентификации бактерий рода. Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода.

7. На основе изучения биологических (межштаммовых взаимодействий) и по-пуляционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus определить композицию'биосовместимых штаммов для осуществления процесса совместного культивирования при создании нового многокомпонентного пробиотика и отработать методологию контроля динамики роста с использованием ПЦР.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработана новая методика ПЦР для индикации бактерий рода Lactobacillus, основанная на оригинальных (авторских) родоспецифичных праймерах FLg, RLgl и RLgll, составивших предмет патентования.

Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermentum 39, которые депонированы в GenBank под номерами FJ210723, FJ210724, FJ210725, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генома лактобацилл.

Создана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР, включающая авторский праймер для идентификации L. delbrueckii.

При изучении межштаммовых взаимоотношений 10 штаммов лактобацилл впервые показана биосовместимость бактерий L. plantarum 8- RA-3 и L.fermentum 39. Эффективность совместного выращивания, установленная нами, обосновала создание симбиотика на основе этих лактобацилл с использованием принципа совместного культивирования (Патент №2280465, приоритет от 25.10.2004).

С помощью разработанной методики определены параметры контроля динамики роста новой композиции биосовместимых штаммов вида L. plantarum 8 RA-3 и L.fermentum 39 при совместном культивировании.

Полученные результаты позволили обосновать новые области применения ПЦР при подборе штаммов-продуцентов на этапе идентификации и для контроля штаммового состава на всех этапах производства пробиотических препаратов. Разработанная методология родовой и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus позволит усовершенствовать контроль технологического процесса на предприятиях по производству фармакопейных препаратов, БАД к пище и продуктов питания на основе молочнокислых микроорганизмов и поставить на новый методический уровень контроль, мультиштаммо-вых пробиотических продуктов на соответствие НТД в органах Роспотребнад-зора и Центрах сертификации.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанные методики на основе специфической« амплификации фрагмента гена 168 рРНК позволяют проводить индикацию и видовую идентификацию пробиотических штаммов лактобацилл, сопоставимую с их классической биохимической идентификацией.

2. Штаммы Ь. р1аг^агит 8 ЯА-З и Ь. ГегшепШш 39, относящиеся к двум разным подгруппам гетероферментативных лактобацилл обладают синер-гидными взаимоотношениями, что обосновало их использование в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков в условиях технологии совместного культивирования.

3. Разработанный метод полимеразной цепной реакции- с использованием «контрольных разведений» бактериальных культур является адекватным для оценки динамики роста Ь. р1ап1агат 8 КА-З и Е. ГегтепШш 39 в условиях совместного культивирования.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были доложены на конкурсе молодых ученых, проводимом в рамках IV съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 2007 г.), на заседаниях Ученого Совета и проблемных научно-практических семинарах Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (2005-2008 гг.).

Структура и объем диссертации

Материалы диссертации изложены на 148 страницах машинописного текста, иллюстрированы 17 рисунками и 15 таблицами. Работа состоит из-введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 185 источников, из которых 108 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Точилина, Анна Георгиевна

VI. ВЫВОДЫ

1. На основе изучения биохимических свойств 11-ти вновь выделенных штаммов лактобацилл определена их видовая принадлежность (2 штамма отнесены к виду Lactobacillus acidophilus, 1 штамм - к виду L. delbrueckii, 2 штамма идентифицированы как L. casei, 1 штамм как L. paracasei, 2 штамма как L.plantarum, 3 штамма как L. rhamnosus).

2. Подобрана новая композиция универсальных олигонуклеотидных прай-меров для специфической амплификации фрагмента гена 16S рРНК бактерий рода Lactobacillus различных биохимических групп.

3. Впервые установлена нуклеотидная последовательность участка гена 16S рРНК штаммов лактобацилл L. plantarum 8 RA-3, L. casei 583, L. fermen-tum 39.

4. Показана высокая эффективность выделения ДНК лактобацилл из различных субстратов методом нуклеосорбции.

5. Разработана унифицированная схема видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием гнездового варианта ПЦР.

6. Впервые установлена биосовместимость штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 и показана близкая удельная скорость роста популяции в условиях совместного и раздельного культивирования (р<0.05).

7. Показана возможность применения метода на основе ПЦР с использованием «конечных точек» для контроля динамики роста L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 в условиях совместного культивирования.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В составе пробиотических фармакопейных препаратов, БАД к пище и продуктов функционального питания наиболее часто применяют бактерии рода Lactobacillus. В современных условиях насыщения рынка отечественными и зарубежными продуктами, содержащими широкий спектр пробиотических штаммов разных родов и видов, назрела объективная необходимость дополнения существующих схем контроля этапом видовой идентификации штаммов-продуцентов пробиотических продуктов, для подтверждения-наличия всех заложенных в технологическую документацию штаммов в заявленном количестве.

Бактерии рода Lactobacillus обладают бродильным типом метаболизма, обладают способностью сбраживать лактозу при помощи р-галактозидазы. Способность, к расщеплению лактозы рассматривается как приспособление к среде, характерной для кишечника млекопитающих. Образующиеся- в ходе' расщепления лактозы глюкоза и галактоза вступают на путь катаболизма гексоз по фруктозо-1,6-бисфосфатному пути (гликолиз) или по пентозофосфатному пути. Особенности катаболизма гексоз определяют подразделение представителей рода на две биохимические группы: гомо- и гетероферментативные лак-тобациллы.

Индикация и идентификация молочнокислых бактерий классическими биохимическими методами затруднена, так как стандартизированные тест-системы малодоступны и дороги. Кроме этого необходимо отметить, что классический метод идентификации по биохимическим свойствам предусматривает выделение чистой культуры и, соответственно, занимает достаточно длительный отрезок времени (до 8 суток), вследствие чего не совсем удобен для практических лабораторий и, тем более, не удовлетворяет требованиям текущего оперативного контроля продуктов питания.

В связи с вышеизложенным очевидно, что-разработка унифицированной схемы индикации и идентификации бактерий молочнокислого брожения, в частности, широко применяемых в микробиологической промышленности микроорганизмов рода Lactobacillus, представляется актуальной задачей, имеющей большое научно-практическое значение.

Целью исследования явилась разработка унифицированного метода для индикации и видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР и исследование их межштаммовых взаимоотношений: Задачи исследования:

1. Изучить биохимические свойства новых штаммов лактобацилл: (сахаро-литические свойства).

2. На основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения, представленных в GenBank, подобрать композицию универсальных праймеров для индикации бактерий рода Lactobacillus.

3. Провести оценку сравнительной эффективности различных методов выделения ДНК из клеток бактерий рода Lactobacillus - ферментативного лизиса, кипячения и нуклеосорбции, для последующего проведения ПЦР.

4. Установить нуклеотидную последовательность фрагмента гена 16S рРНК следующих штаммов пробиотических лактобацилл: L.plantarum. 8 RA-3, L.fermentum 39 и L.casei 583.

5. Разработать схему видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием «гнездовой» ПЦР специфического фрагмента индикации.

6. < Провести сравнение метода видовой идентификации бактерий рода Lactobacillus с использованием ПЦР и классического биохимического метода.

7. На основе изучения биологических (межштаммовых взаимодействий) и популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus определить композицию биосовместимых штаммов для осуществления процесса совместного культивирования при создании нового многокомпонентного пробиотика и отработать методологию контроля динамики роста с использованием ПЦР.

На первом этапе работы нами был проведен сбор базы данных нуклео-тидных последовательностей геномной ДНК лактобацилл, их дальнейший анализ и выбор олигонуклеотидных праймеров для индикации. С использованием программы Mega 4.0 выполнено выравнивание 43 полных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК бактерий молочнокислого брожения, накопленных в GenBank на настоящий момент времени.

Анализ региона 20 — 900 п.н. гена 16S рРНК лактобацилл показал наличие участков, нуклеотидной последовательности, подходящих для создания праймеров, т.е. консервативных в пределах рода Lactobacillus, но имеющих значительные отличия от молочнокислых бактерий других родов. Для повышения специфичности нуклеотидные последовательности в регионах, соответствующих позициям праймеров, были детально проанализированы с целью выявления нуклеотидных замен. По результатам проведенного анализа подобраны универсальные праймеры для индикации лактобацилл - FLg, RLg Юи-RLg П.

Пара праймеров FLg - RLg I фланкирует фрагмент гена 16S рРНК, расположенный с 48>по 785 нуклеотид, размер получаемого фрагмента — 737 п.н. Позиции указаны по последовательности гена 16S рРНК L. casei BCRC10697. Пара праймеров FLg - RLg II фланкирует фрагмент гена 16S рРНК, расположенный с 48 по 785 нуклеотид, размер получаемого фрагмента — 612 п.н.

Для сконструированных пар праймеров были рассчитаны температура отжига и параметры амплификации с помощью программы Oligo 4.0, которые учитывались при подборе универсальной программы.

Теоретическая специфичность данных праймеров была подтверждена экспериментально на референтных штаммах бактерий молочнокислого брожения, включающих 9 штаммов рода Lactobacillus, 3 штамма рода Bifidobacterium и 1 штамм рода Streptococcus.

Установлено, что фрагмент нуклеотидной^ последовательности гена 16S рРНК размером 737 п.н., получаемый при использовании праймеров FLg - RLg I, может являться матрицей при разработке схемы видовой идентификации на основе гнездовой ПЦР. Олигонукледтидный праймер II также может быть использован для реализации схемы гнездовой ПЦР на этапе видовой идентификации бактерий этого рода.

В процессе решения поставленных задач нами было проведено секвени-рование фрагмента гена 16Б рРНК бактерий Ь. р1ап1агит 8 ЯА-З, Ь. ГегтепШт 39, Ь. саэе! 583, полученного при использовании пар праймеров - II. Штаммы Ь. р1ап1агиш 8 ЯА-3 и Ь. fermentum 39 давно используются в биотехнологии для получения пробиотических продуктов, причем как фармакопейных препаратов-пробиотиков, так и БАД к пище. Тем не менее, данных о нуклео-тидных последовательностях этих штаммов в международной базе данных (ОепВапк) нет. Секвенирование участков ДНК этих микроорганизмов расширит международную базу данных и позволит получить новую информацию об этих штаммах и облегчить процесс работы с ними.

Микроорганизм Ь. саэе! 583 выделен в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ. Его секвенирование является актуальной и своевременной задачей, так как этот штамм рассматривается нами как производственно-перспективный, что обуславливает необходимость всестороннего изучения его молекулярно-генетических и биологических свойств. Установленные нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16Б рРНК штаммов Ь. р1аЩагшп 8 ИА-3, Ь.саэе! 583 и Ь. fermentum 39 задепонированы в ОепеВапк под номерами ¥Л 10723, ¥1210724, ¥Л 10725.

Данные, полученные в результате этого опыта, не позволили провести сравнительную оценку регионов праймеров и II и, соответственно, проанализировать наличие нуклеотидных замен и оптимизировать родовые праймеры. Тем не менее, эти последовательности использовали на этапе подбора видовых праймеров для получения наиболее специфичных олигонуклеоти-дов, адаптированных для работы со штаммами Ь. р1ап1ашгп 8 ЯА-З, Ь. 1!егтеп-Шт 39 и Ь. саБе1 583.

Разработанная композиция праймеров может составлять основу для разработки тест-систем, позволяющих проводить индикацию бактерий рода Ьас1:оbacillus в однораундовой и двухраундовой полугнездовой ПЦР. Сконструированные праймеры представили предмет патентования (Заявка на патент «Способ индикации бактерий рода Lactobacillus», приоритетная справка № 2008113591 от 07.04.2008).

Вновь разработанная методика может иметь как научное значение для решения теоретических задач в микробиологии, например, при определении таксономического положения свежевыделенных культур из различных биотопов, включая природные, так и широкое прикладное значение в-пищевой и медицинской микробиологии и биотехнологии.

На следующем этапе работы нами была* решена задача по оценке эффективности различных методов выделения ДНК из клеток лактобацилл.

Выделение ДНК из грамположительных микроорганизмов представляет определенные трудности, так как их клеточная стенка более устойчива к воздействию физико-химических факторов из-за высокой концентрации в ней пегг-тидогликана. Применяют как простые методики, такие как метод кипячения, так и более сложные многоэтапные процедуры выделения ДНК, включающие этап депротеинизации и очистки.

Практическое значение имеет выбор наиболее эффективного метода выделения геномной ДНК бактерий рода Lactobacillus из коммерческих продуктов питания и фармакопейных препаратов-пробиотиков, которые могут быть представлены в виде жидких форм, кисломолочных продуктов, лиофильно высушенных культур.

Нами были изучены в сравнительном аспекте 3 метода выделения геномной ДНК, отражающие основные методические подходы: метод кипячения, многоэтапный метод с применением обработки лизоцимом и лизиса детергентами и метод нуклеосорбции. Методы, применяемые нами, не предусматривали использования токсических веществ, таких как фенол и хлороформ, что делает их удобными для практического использования в лаборатории.

Для сравнения эффективности методов нами был выполнен ряд десятикратных разведений культуры бактерий Lactobacillus plantarum 8 RA-3 от 10 Q до 10 в стерильном физиологическом растворе. Культура бактерий была предварительно стандартизирована с помощью стандарта мутности и содержала 109 степени бактериальных клеток в 1 мл. Выделение ДНК из указанных разведений проводилось всеми тремя методами параллельно. Затем проводилась ПЦР с использованием пары праймеров FLg и RLg I.

Установлено, что наиболее эффективным в отношении геномной ДНК лактобацилл является метод нуклеосорбции, порог аналитической чувствительности которого составляет 100-1000 ГЭ/мл пробы. Достоинством метода является быстрота (время обработки проб занимает около двух часов), воспроизводимость, отсутствие контакта с токсикантами. Метод позволяет работать с разными субстратами, включая, кисломолочные продукты и лиофильно высушенные пробиотические препараты. Результаты сравнения эффективности различных методов выделения ДНК из клеток грамположительных микроорганизмов был получены впервые. Многие исследователи предпочитают использовать различные многоэтапные методики с использованием детергентов, но, по нашим данным, метод нуклеосорбции можно считать предпочтительным при работе с лактобациллами, если в дальнейшем предполагается проведение ПЦР:

В следующем разделе работы нами была решена задача по созданию унифицированной методики идентификации промышленно-значимых видов бактерий рода Lactobacillus. При этом были выполнены следующие этапы работы: подбор олигонуклеотидных праймеров, конструирование схемы идентификации, изучение специфичности созданной методики и ее эффективности в сравнении с классическим микробиологическим методом идентификации.

Для создания такой схемы нам представлялось целесообразным использовать принцип гнездовой ПЦР на основе фрагмента 737 п.н., получаемого в результате амплификации ДНК с использованием праймеров FLg и RLg I.

Для идентификации бактерий L. plantarum, L. fermentum, L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus нами были использованы олигонуклеотиды, представленные в научной литературе. Из множества праймеров были отобраны те олигонуклеотиды, которые удовлетворяли задаче создания схемы гнездовой ПЦР на основе фрагмента. ДНК, амплифицированного с использованием праймеров FLg и RLg L Праймеры PLANT1, FERMI, CASE3 и Frham были оптимизированы нами с использованием нуклеотидных последовательностей фрагмента гена 16S рРНК штаммов L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39, L. casei 583, L. rhamnosus 2469; полученных нами впервые.

Праймер для- идентификации L. delbrueckii (FLd) был сконструирован нами в рамках данной работы, так как олигонуклеотиды для идентификации этого микроорганизма, предложенные в научной литературе, не подходили для использования в< схеме гнездовой ПЦР1 Вновь разработанный праймер FLd расположен в пределах фрагмента FLg - RLg I; обладает низкой степенью гомологии относительно соответствующих регионов ДНК других бактерий молочнокислого брожения, что обеспечивает достаточную специфичность ПНР,

Все праймеры были теоретически проверены на специфичность и наличие нуклеотидных замен путем анализа 47 выровненных нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК различных видов бактерий молочнокислого брожения. Анализ показал, что все олигонуклеотиды являются прямыми и составляют систему с праймером RLg II и RLg I.

Для всех отобранных праймеров были рассчитаны температура отжига и параметры амплификации с помощью программы Oligo 4.0.

Специфичность видовой ПЦР была подтверждена экспериментально с использованием референтных штаммов рода Lactobacillus. Кроме того, установлено, что позиции отобранных праймеров позволяют проводить мультиплексную ПЦР и одновременно осуществлять идентификацию следующих комбинаций микроорганизмов в одном образце: L. acidophilus (594 п.н.) - L. plantarum (567 п.н.) - L. fermentum (452 п.н.); L. acidophilus (594 п.н.) - L. casei (579 п.н.) - L. fermentum (452 п.н.); L. acidophilus-(594 п.н.) - L. rhamnosus (574 п.н.) -L. fermentum (452'п.н.); L. delbrueckii (584 п;н.) - L. fermentum (452 п.н.) и т.д. и могут варьироваться в зависимости от задач исследования.

Таким образом, в результате проведенной работы с использованием собственных праймеров и праймеров, указанных в научной литературе разработана унифицированная комплексная схема идентификации бактерий L. fermentum, L. plantarum, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР.

На следующем этапе работы проведена параллельная идентификация этих культур с использованием классической микробиологии и методики на основе ПЦР. Использованы 14 штаммов рода Lactobacillus: L. plantarum 8 RA-3, L.fermentum 39, L.acidophilus АЩГ3; L. fermentum 90 TC-4, депонированные в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Штаммы L. casei 577, L. plantarum 30, L. delbrueckii 76, L. rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583, L. plantarum 1862, L. paracasei'spp. paracasei 6, L. rhamnosus 7, L. rhamnosus 526 выделены из различных биотопов человека и идентифицированы по биохимическим признакам в лаборатории микробиоценозов и крнструирования пробиотиков^Нижегородско-го НИИЭМ.

Установлено, что результаты идентификации видов L. plantarum, L.fermentum, L.acidophilus, L. delbrueckii, L. casei, L. rhamnosus, полученные с использованием полимеразной цепной реакции, соответствуют результатам классического биохимического метода идентификации на основе сахаролити-ческой активности различных видов лактобацилл. В ряде случаев данные, полученные с использованием ПЦР, позволяют уточнить таксономическое положение исследуемых штаммов.

Учитывая большие временные и материальные затраты при использовании классического метода идентификации, варибельность и неоднозначность фенотипических признаков, можно сделать вывод, что вновь разработанная методика на основе гнездовой ПЦР является ценным дополнением схемы идентификации промышленно-значимых лактобацилл, может иметь большое прикладное значение и применяться в ходе производственного контроля на предприятиях-изготовителях пробиотиков и БАД к пище, а таюке для контроля качества этих препаратов в »органах Роспотребнадзора.

На заключительном этапе работы нами были проведены исследования по изучению возможности применения вновь разработанной методики идентификации лактобацилл для характеристики популяционно-ростовых свойств микроорганизмов рода Lactobacillus. Были выполнены следующие этапы работы: установлен характер межштаммовых взаимодействий производственно-значимых видов лактобацилл с целью выбора композиции биосовместимых штаммов, пригодных для совместного культивирования, и изучена динамика их роста в условиях in vitro с использованием классического микробиологического метода и методики на основе гнездовой ПЦР.

Для постановки опыта по изучению межштаммовых взаимоотношений были отобраны 10 штаммов рода Lactobacillus, 4 из них депонированы в ГИСК им. Л.А.Тарасевича и разрешены для промышленного использования - L. plantarum 8 RA-3, L.fermentum 39, L.acidophilus АЩГз, L. fermentum 90 TC-4. Штаммы L. casei 577, L. plantarum 30, L. delbrueckii 76, L. rhamnosus 1790, L.acidophilus 1660, L. casei 583 выделены и идентифицированы в лаборатории микробиоценозов и конструирования пробиотиков Нижегородского НИИЭМ.

По результатам изучения межштаммовых взаимоотношений исследуемые штаммы были разделены нами на 3 условные группы: штаммы с сильной антагонистической активностью, штаммы - слабые антагонисты и штаммы со средней антагонистической активностью. К первой группе нами были отнесены штаммы L. plantarum 30, L. delbrueckii 76 и L. rhamnosus 1790. Указанные микроорганизмы подавляют по 7 (L. plantarum 30) и 8 штаммов (L. delbrueckii 76 и L. rhamnosus 1790). Высокий уровень антагонизма этих бактерий по отношению к представителям этого же рода ограничивает их применение при реализации принципа совместного культивирования. К группе штаммов со средней антагонистической активностью нами были отнесены L. plantarum 8 RA-3, L. fermentum 39, L. fermentum 90 TC-4, L. acidophilus АЩГ3, L. casei sp. casei 583, L. acidophilus 1660. Наиболее слабые антагонистические свойства проявил штамм L. casei 577.

Таким образом, в данном разделе работы были получены новые данные об особенностях межштаммовых взаимоотношений лактобацилл разных биохимических групп.

Данные о межвидовых взаимоотношениях позволили выделить группу бактерий рода Lactobacillus наиболее перспективных в отношении совместного культивирования. Наибольший интерес из этой группы лактобактерий представляют штаммы L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39.

Данные о биосовместимости штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39, полученные in vitro, были подтверждены, нами в ходе опыта по совместному выращиванию этих микроорганизмов на среде МДС и модифицированной нами питательной среде МДС-м. Высевы на среды МДС и МДС-м проводили в 6-ти контрольных точках культивирования - 3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 24 ч и 27 ч. По результатам высева были построены кривые роста бактерий для всех опытных вариантов.

Результаты показали, что в первой'контрольной точке (через 3 часа инкубации)'количество микроорганизмов в 1 мл среды составляло 1x104 КОЕ/мл во всех трех вариантах (I- монокультура L. plantarum 8 RA-3; II — монокультура L. fermentum 39; III- смешанная« культура L. plantarum 8 RA-3 + L. fermentum 39). Через 6 часов роста количество КОЕ/мл во всех вариантах составило 1x10», через 9 часов - 1х108, через 12 часов - 1хЮ10. В точках, соответствующих 24* и 27 часам культивирования плотность микробной популяции-снижалась и составляла 1x109 КОЕ/мл. Длительность лаг-фазы во всех вариантах составляла 3 часа (с 3 по 6 час культивирования), длительность экспоненциальной фазы роста - 6 часов (с 6 по 12 час), затем наблюдался выход на плато - стационарная фаза роста.

Сравнение показателей удельной скорости роста (|i) при совместном и раздельном культивировании выявило недостоверность в их различии (р<0,05), что позволило сделать вывод о высокой «эффективности совместного культивирования в отношении штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39.

С помощью среды МДС-м установлено, что в течение первых 9 часов культивирования и далее соотношение клеток в смешанной популяции составляло 1:1с небольшим преобладанием L. fermentum 39 в дальнейшем, что обосновало целесообразность создания комплексного пробиотика на их основе (Патент на изобретение №2280465. Приоритет от 25.10.2004).

Параллельно, с целью контроля титра микробных клеток каждого штамма в смешанной популяции и при раздельном способе культивирования была применена вновь разработанная методика индикации и идентификации бактерий рода Lactobacillus на основе ПЦР. Методика, разработанная нами, позволяет идентифицировать L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 как в чистой культуре, так и при совместном выращивании, исключая этапы пересева на плотную питательную среду и выделения чистой культуры.

Реакцию проводили в 2 стадии. Индикацию лактобацилл проводили в тех же контрольных точках кривой роста, что и при определении числа жизнеспособных клеток (3 ч, 6 ч, 9 ч, 12 ч, 24 ч и 27 ч). В ходе опыта пробы из исходной культуры, взятой во всех контрольных точках, были выполнены серии разведений с последующим выделением ДНК. Следующим этапом была постановка ПЦР1 с использованием родо- и видоспецифичных праймеров для каждого разведения серии.

Использование «полуколичественной» ПЦР позволило определить «конечные разведения» (последнее разведение микробной культуры, в котором при постановке ПЦР присутствует ампликон) для каждого контрольного часа культивирования. Таким образом, была прослежена динамика роста штаммов L. plantarum 8 RA-3 и L. fermentum 39 при совместном культивировании. Установлено, что значения «конечных разведений» при раздельном и совместном культивировании не отличаются. Это свидетельствует об отсутствии перекрестного ингибирующего влияния изучаемых штаммов лактобацилл и подтверждает данные, полученные в условиях in vitro при изучении биосовместимости штаммов лактобацилл L. fermentum 39 и L. plantarum 8 RA-3.

С использованием полученных данных были определены рекомендуемые контрольные разведения культур лактобацилл для постановки ПЦР.

Проведенные опыты по использованию классического метода и методики на основе ПЦР для сравнительного изучения динамики роста лактобацилл в смешанной популяции показывают, что вновь разработанная методика для идентификации лактобацилл на основе гнездовой 1ТЦР может применяться- на этапе: контроля пробиотических препаратов^ содержащих лактобациллы. С использованием указанной методики можно? определять вид и титр пробйотических лактобацилл в. пробе, при условии, использования методологии конечных разведений.

Суммируя все вышесказанное можно заключить, что в рамках представленной; работы была создана методика индикации бактерий рода Lactobacillus, на основе ШДР гена 16S рРНК,,подобран наиболее эффективный метод выделе^ ния; ДНК. лактобацилл. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК пробиотических штаммов лактобацилл L. fermentum39, L. plantarum 8RA-3, L. rhamnosus 2469; L. casei 583. Предложена унифицированная комплексная схема видовой' идентификации. 6-ти промышленно-значимых, видов рода Lactobacillus: L. feirnentum^ L. plantarum, L.^acidophilus, E. . rhamnosus, L. casei, L. delbrueckii с использованием гнездовой ПЦР; вновь созданная методика эффективно апробирована с: использованием? референтных: штаммов лактобацилл, показана достоверная сопоставимость методики иден^ тификации на основе ПЦР и классического биохимического-метода.

В результате выполненных исследований получены новые данные о межвидовых взаимоотношениях промышленно-значимых лактобацилл, выделена группа биосовместимых видов, перспективных в отношении совместного культивирования.

Методика идентификации лактобацилл на основе ПЦР параллельно с классическим микробиологическим методом была применена для изучения особенностей динамики роста смешанной популяции лактобацилл, биосовместимых в условиях in vitro; Обоснована возможность применения методики в полуколичественном варианте для контроля видового состава и титра штаммов-продуцентов.пробиотических препаратов. .

Данные, полученные в результате проведенной работы,, имеют большую научную и практическую ценность й могут быть применены для получения новых знаний о биологических свойствах бактерий рода Lactobacillus, для изучения природных биотопов обитания и характера распространения этих бактерий и представлять практический интерес для использования в системе контроля качества продуктов питания, обогащенных лактобациллами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Точилина, Анна Георгиевна, 2009 год

1. Агол, В.И. Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот. / В.И. Агол, А.А. Богданов, В.А. Гвоздев и др.- М.: Высш. шк., 1990.-352 с.

2. Баженов, Л.Г. Изучение антагонистического действия лактобацилл на Helicobacter pylori / Л.Г. Баженов, В.М. Бондаренко, Е.А. Лыкова, и др.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1997. — №3. — С.89-91.

3. Бережной, В.В. Микроэкологические нарушения у детей и современные возможности повышения эффективности их- коррекции/ В.В. Бережной, С.А. Крамарев, В.Ю.Мартынюк и др. // Здоровье женщины. 2002. — Т.12, №4. - С.79-92.

4. Блинкова, Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, методы выяв-ления/Л.П.Блинкова// Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. — 2003. -№ 3. С. 109- 1*3.

5. Блохина, И.Н. Дисбактериозы / И.Н.Блохина, В.Г. Дорофейчук М.: Медицина, 1979. - 175 с.

6. Бондаренко, В.М. Дисбактериозы желудочно-кишечного тракта / В.М; Бондаренко, Б.В. Боев; Е.А. Лыкова и др. // Росс. журн. гастроэнтерол., ге-патол. и колопроктол. 1998. -№ 1. -С.66-70.

7. Бондаренко, В.М. Классификация бактерий рода Lactobacillus / В.М. Бондаренко // Матер.УШ съезда Всеросс. Общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. М., 2002. -T.I. - С. 140.

8. Бондаренко, В.М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией / В.М. Бондаренко, А.А. Воробьев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2004. - №1. - С. 84-92.

9. Бондаренко, В.М. Пробиотики и механизмы их лечебного действия / В.М. Бондаренко, Р.П. Чупринина, Ж.И. Аладышева и др. // Эксперим. и клин, гастроэнтерол. 2004. - №3. - С. 83-87.

10. Бондаренко, В.М. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы / В.М. Бондаренко, Т.В. Мацу-левич М;: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 304 с.

11. Буркин, A.B. Пробиотики в лечении и профилактике ротавирусной инфекции / A.B. Буркин // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2005. -№4.-С. 48-51.

12. Бухарин, О.В. Межбактериальные взаимодействия / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцова, J1.M. Хуснутдинова // Журн. Микробиол., эпидемиолог, и имму-нобиол. 2003. - №4. - С. 3- 8.

13. Воробьев, A.A. Дисбактериозы актуальные проблемы медицины / A.A. Воробьев, H.A. Абрамов, В.М. Бондаренко и др. // Вестн. Росс. АМН. -1997.-№3.-С. 4-7.

14. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. Практика, 1999. -459 с.

15. Глухов, А.И. Применение гнездовой ПЦР в детекции возбудителя чумы / А.И. Глухов // Клин. лаб. диагностика. 2003. - №7. - С. 48-50.

16. Глушанова, H.A. Экспериментальное обоснование новых подходов к коррекции микробиоценоза кишечника: Автореф. дис. . докт. мед. наук. / H.A. Глушанова Москва, 2005. - 56 с.

17. Головач, Т.Н. Опыт совместного культивирования лактобацилл / Т.Н. Головач // Микробиологический журнал. 2004. - №6. - С.23-25.

18. Горелов, A.B. Оценка эффективности пробиотического продукта, содержащего L. casei DN-114001, в терапии острых кишечных инфекций у детей / A.B. Горелов, Д.В. Усенко, Л.И. Елезова и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2005. - № 4. - С. 52 -56.

19. Горелов, A.B. Пробиотики: механизмы действия и эффективность при инфекциях желудочно-кишечного тракта / A.B. Горелов, Д.В. Усенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. - №4. - С.53 - 56.

20. Горская, Е.М. Адгезия микробов к эпителиальным клеткам кишечника / Е.М. Горская // Антибиотики и микроэкология человека и животных. — М., 1998.-С. 79-82.

21. Грузина, В.Д. Коммуникативные сигналы бактерий / В.Д. Грузина // Антибиотики и химиотерапия. — 2003. —Т.48. №10. - С. 32-39.

22. Диагностика и биокоррекция нарушений антиинфекционного гомеостаза в системе «мать-дитя»: Книга для практического врача / Под. ред. Ефимова Е.И, Соколовой К.Я. Нижний Новгород.: изд-во НГМА, 2004. — 376 с.

23. Дисбиоз кишечника. Руководство по диагностике и лечению / Под ред. проф. Е.И. Ткаченко, проф. А.Н. Суворова. СПб.: СпецЛит, 2007. — 236 с.

24. Егоров, Н.С. Бактериоцины. Образование, свойства, применение / Н.С. Егоров, И.П. Баранова // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - №6. - С. 33-40.

25. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в ин-фектологии/ под ред. Онищенко Г.Г., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. и др. М.: ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. - 608 с.

26. Коваленко, Н.К. Использование ПЦР для идентификации представителей родов Lactobacillus и Streptococcus' / Н.К. Коваленко, JI.H. Бурьяновский; B.C. Подгорский // Микробиологический журнал. 2000. № 62 (6). - С. 714.

27. Коршунов,4 В.М. Проблема регуляции микрофлоры кишечника / В.М. Коршунов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. — № 3. -С. 48-55

28. Красноголовец, В.Н. Дисбактериоз кишечника / В.Н. Красного ловец — М.: Медицина, 1989. 208 с.

29. Куваева, И.Б. Микроэкологические и иммунные нарушения у детей: диетическая коррекции / И.Б. Куваева М.: Медицина, 1991. - 221 с.

30. Лашевский, В.В. Дизайн праймеров для ДНК лактобактерий / В.В. Ла-шевский, Н.К. Коваленко// Микробиологический журнал. 2003. — № 65 (З).-С. 46-53.

31. Ленцнер,. A.A. Актуальные проблемы микробиологии человека / A.A. Ленцнер, Х.П. Ленцнер // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький: ГМИ\им-. С.М. Кирова; —1988.- С. 10-14.

32. Лихачева, АЛО. Биологические свойства лактобацилл и тест-системы:для их идентификации: Автореф: дисс. . канд. мед. наук / А.Ю. Лихачева Н. Новгород, 1992.-199 с.

33. Лихачева, А.Ю. Совершенствование видовой идентификации лактобацилл с использованием микрокультуральных тест-систем и данных о строении геном / А.Ю. Лихачева, К.Я. Соколова, Г.Ф. Леванова // Журн. микробиол. 1995. - № 5. - С. 45-48.

34. Лопатина, Т.К. Иммуномодулирующее действие препаратов — эубиотиков. / Т.К. Лопатина, М.С. Бляхер, В.Н. Николаенко и др. // Вестн. РАМН. -1997. -№3.-С. 30-34.

35. Лопухов, J1:B. Полимёразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике /. Л.В. Лопухов, М.В. Эйделыптейн // КМАХ. 2000. -Том 2, №3.- С.96 -106.

36. Лыкова,.Е.А. Коррекция пробйотиками-микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей / Е.А. Лыкова, В.М. Бондаренко, Ю.А. Изачик и др. // Журн. микробиол., эпидемиол. иимму-нобиол. 1996. - №2. - С. 88-90.

37. Мазан ко ва, JI.H. Метаболическая активность кишечной микрофлоры при острых кишечных инфекциях у детей / Л.IL Мазанкова, И.О. Ильина, O.A. Кондракова и др. // Рос. Вестник перинатологии и педиатрии; — 2006. — №2. -С. 49 -54.

38. Марко, O.II. Кишечная микрофлора при неспецифическом язвенном колите / О.П. Марко // Сб.научн. тр.1. «Применение колибактерина для профилактики, и лечения; кишечных заболеваний^ и ¡технология^егопроизводстг ва»-М., 1967. С.53-62:

39. Медицинская микробиология;/Ел и ред. ВШ; Покровский, O.K. Поздеев — М.: ГЭО'ГАР МЕДИЦИНА, 1999. 1200 с.

40. Мурашова, А.О. Разработка нового кисломолочного продукта функционального питания на основе усовершенствования производственных процессов культивирования бифидобактерий. Автореф. дисс. . канд. мед.наук/ А.О. Мурашова Москва, 2000. - 38 с.

41. Онищенко, Г.Г. Иммунобиологические препараты и; перспективы их применения в-инфектологии./ F.F. Онищенко, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев и др. М;: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

42. Пинегин, Б. В; Дисбактериоз кишечника./ Б.В. Пинегин, В.Н;. Мальцев, В;Mi,Коршунов? — М.: 1984. -144 с.54'., Подопригора, Г.И. Медицинская гнотобиология. / Г.И. Подопригора — Медицинское информационная агенство, 2003.— 272 е.

43. Рыбальченко, О.В. Изучение межклеточных взаимодействий между микроорганизмами-антагонистами с помощью электронной микроскопии / О.В. Рыбальченко // Микробиология. 2007. - № 75 (4) . -С. 550-555.

44. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах: Т. 1. Пер с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля М.: Мир, 2005. - 496 с.

45. Современная микробиология: прокариоты: в 2-х томах: Т. 2. Пер с англ. / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля М.: Мир, 2005. — 496 с.

46. Соколова, К.Я. Дисбактериозы: Теория и практика./ К.Я. Соколова, И.В. Соловьева -Н. Новгород, 1999. — 199 с.

47. Тюрин, М.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл / М.В. Тюрин, Б.А. Шендеров, Н.Г. Рахимова и др. // Журн. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1989. №2. — С. 3- 8.

48. Филиппов, В.А. Бактериоциногенотипирование лактобацилл. / В'.А. Филиппов // Антибиотики. -1982. №9. - С. 41 -44

49. Червинец, Ю. В. Высокоантагонистические штаммы лактобацилл, перспективные для' конструирования новых пробиотических препаратов. Ав-тореф. дисс. канд. мед. наук. / Ю. В. Червинец. Москва - 2006.

50. Червинец, Ю.В. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл. / Ю.В. Червинец, В.М. Бондаренко, H.A. Шабанова и др. // Журн. Микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2006. - №7. — С. 78 -82.

51. Шагинян, И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций / И.А. Шагинян // КМАХ. 2000. - т.2, №3 - С. 82-95.

52. Шевелева, С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса / С.А. Шевелева // Вопросы питания. — 1999. Т.68, №2. - С.32-40.

53. Шендеров, Б.А. Фаги и плазмиды лактобацилл / Б.А. Шендеров, М.В. Тюрин //Антибиотики и химиотерапия. —1988. №6. - С. 463-468.

54. Шендеров, Б.А. Пробнотнки и функциональное питание / Б.А. Шендеров, М.А. Манвелова, Ю.Б. Степанчук и др. // Антибиотики и химиотерапия. — 1997.Т. 42, №7. С. 30-34.

55. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том I: Микрофлора человека и животных и ее функции. / Б.А. Шендеров М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.

56. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том II: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. / Б.А. Шендеров М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998. - 416 с.

57. Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III: Пробиотики и функциональное питание. / Б.А. Шендеров -М.: Издательство ГРАНТЪ, 1998.-288 с.

58. Шендеров, Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. / Б.А. Шендеров // Рос. Журн. Гастроэнтерол., гепатол., коло-проктол. — 2001. Т. 7, № 1.-С. 61-65.

59. Шендеров, Б.А. Базовые механизмы регуляции гомеостаза и их модуляция нутриентами / Б.А. Шендеров // Клиническое питание. 2004. - №3. -С. 14-19.

60. Шлегель, Г. Общая микробиология. / Г. Шлегель М.: Мир, 1987. - 567 с.

61. Abee, Т. Bacteriocins: modes of action and potentials in food preservation'and control of food poisoning / T. Abee // Int J Food Microbiol. -1995. Vol. 28(2). - P.169-185.

62. AH, D. Characterization of diacetin B, a bacteriocin from Lactococcus lactis subsp. lactis bv diacetilactis UL 720 / D. Ali, C. Lacroix, D. Thuault et al. // Can J Microbiol. 1995. - Vol. 41 (9). - P. 832-841.

63. Alpert, G.A. Characterization of a theta-type plasmid from Lactobacillus sakei: a potential basis for low-copy-number vectors in lactobacilli / C.A. Alpert, A.M.

64. Crutz-Le Coq, C. Malleret et al // Appl Environ Microbiol. 2003. - Vol.69, №9. - P.5574-5584.

65. Altermann, E. Complete genome sequence of the probiotic lactic acid bacterium Lactobacillus acidophilus NCFM / E. Altermann, W.M. Rüssel, M.A. Az-carate-Peril et al // PNAS. 2005. - Vol. 102, №11-P. 1306-1312.

66. Alvarez-Martin P., Mayo B. Sequence and analysis of plasmid pBGl from Bi-fidobacterium catenulatum Unpublished.

67. Boekhorst, J. Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acidf bacteria / J. Boekhorst, Q. Helmer, M. Kleere-bezem et al //Microbiol. 2006. - Vol.152. - P. 273-280.

68. Bolotin, A. Complete genome sequence and* comparative genome analysis of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus / A*. Bolotin, B. Quainquis, P. Renault et al // Nature Biotechnology. 2004: - Vol.22, №12 - P. 1554-1558.

69. Boom; R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom; C.J: Sol, M.M. Salimans et al // J Clin Microbiol. 1990. - Vol.28, №3. -P.495-500

70. Bourniquel, A.A. DNA sequence and functional analysis of Lactobacillus del-brueckii sp. lactis plasmids pN42 and pJBL2 / A.A. Bourniquel, M.G. Casey, B. Mollet et al // Plasmid. 2002. - Vol. 47, Is.2. - P.153-157.

71. Braat, H. / H. Braat, E.C. de Jong, J.M. van den Brande et al // J Mol Med. -2004. Vol. 82, №3. - P. 197 - 205.

72. Castellanos, M. I. PCR methods for identification and specific detection of probiotic lactic acid bacteria / M. I. Castellanos, A. Chauvet, A. Deschamps et al // Curr microbiol. -1996. Vol. 33. - P. 100-103

73. Chagnaud, P. Rapid PCR-based procedure to identify lactic acid bacteria application to six common Lactobacillus species / P. Chagnaud // J of Microbiol Meth. 2001. - Vol.44. - P. 139-148.

74. Chaillou, S. The genome sequence of the meat-borne lactic acid bacterium Lactobacillus sakei 23K / S. Chaillou, M. Champomier-Verges, M. Cornet et al // Nat Biotechnol. 2005. - Vol.23, № 12. - P. 1494-1495.

75. Chaitov, L. Probiotics / L. Chaitov, N. Trenev. Thorsons Publishing Group, Northamptonshire, England, 1990.

76. Claesson, MJ. Multireplicon genome architecture of Lactobacillus salivarius / M.J. Claesson, Y. Li, S. Leahy // PNAS. 2006. - Vol.103, №17. - P. 67186723.

77. Corneau, N. Molecular characterization of three plasmids from Bifidobacte-rium longum / N. Corneau, E. Emond, G. LaPonte // Plasmid. 2004. - Vol. 51, Is.2. - P.87-100.

78. Cummings, J.H. Lactobacillus / J.H. Cummings, J.M; Antoine, F. Azpiroz et al //Eur J Nutr. 2004. - Vol.43, Suppl. 2. - P. II 118 - II 173.

79. Dach, S.K. Acidophilus: The Friendly Bacteria / S.K. Dach // In: Total«Health. 1995.-Apr.: 27

80. Darning, R. Complete DNA sequence and'analysis of two cryptic plasmids isolated from Lactobacillus plantarum / R. Darning, W. Yinyu, W. Zilai et al // Plasmid. 2003. - Vol. 50, Is. 1. - P.70-73.

81. Danielsen, M. Characterization of the tetracycline resistanse plasmid pMD5057 from Lactobacillus plantarum 5057 revealse a composite structure / M. E>anielsen // Plasmid. 2002. - Vol.48, Is.2 - P. 98 -103.

82. De las Rivas, B. Complete nucleotide1 sequence and structural organization of pPBl, a small Lactobacillus plantarum cryptic plasmid that originated by modular exchange / B. De las Rivas, A. Marcobal, R. Munoz // Plasmid. 2004. -Vol.52, №3.-P. 203-211.

83. De Man, J. C. A medium for the cultivation of lactobacilli / J. C. De-Man, M. Rogosa, M. E. Sharpe // J Appl Bacteriol. 1960, Vol. 23. - P. 130-135

84. De Vries, M.C. Lactobacillus plantarum — survival, functional and potential probiotic properties- in the human intestinal tract / M.C. De Vries, E.E. Vaughan, M. Kleerebezem et al // Int Dairy J. 2006. -Vol.16, Is. 9. - P. 10181028

85. Dubernet, S. PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level / S. Dubernet, N. Desmasures, M. Gueguen // FEMS Microbiol Lett. — 2002: Vol.10, 214(2). - P. 271-5

86. Eijsink, V.G. Production of class II bacteriocins by lactic acid bacteria; an example of biological warfare and communication./ V.G. Eijsink, L. Axelsson, D.B. Diep et al. // Antonie Van Leeuwenhoek.- 2002. Vol.81, №1. - P. 63954.

87. Eloy, C. / C. Eloy, R. Lacrosse Bull. Rech. Agron Gembloux, 1976, 11(1-2):83.

88. Gfelle, K.Y. Sequence and genetic organization of the 19.3-kb erythromycin-and dalfopristin-resisnanse plasmid pLME300 from Lactobacillus fermentum ROT1 / K.Y. Gfelle, M. Roth, L. Meile et al // Plasmid. 2003. - Vol.50, Is.3 -P. 190 -201.

89. Gibson; E.M. Transfer of plasmid-mediated antibiotic resistance from streptococci to lactobacilli / E.M. Gibson, N.M. Chace, S.B. London et al // LBacteriol. 1979.-Vol.137.-P. 614-619.

90. Gibson, G.R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics / G.R. Gibson, M.B. Roberfroid // J Nutr. 1995. -Vol.125 (6)-P. 1401-1412.

91. Gissen, A.S. Off Probiotics, Prebiotics & Synbiotics Iss VRPs Inc. Vit Res

92. Prod Newsletters, Sept, 1995, USA.

93. Hammes, W.P. The genus of Lactobacillus and Carnobacterium / W.P. Hammes, C. Hertel // The Procaryotes A. Balows, H.G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, K.-H. Schleifer, Vol.4, Edition 2, 1992, Springer-Verlag, New-York.

94. Hart, A.L. Modulation of human dendritic cell phenotype and function by pro-biotic bacteria / A.L. Hart, K. Lammers, P. BrigidLet al // Gut. 2004. - Vol: 53, №11.-P. 1602-1609.

95. Holzapfel, W.H. Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food and nutrition / W.H. Holzapfel, P. Haberer, R. Geisen et al // Am J Clin Nutr. 2001. - Vol. 73. - P. 365S-373S.

96. Kanatani, K. Identification of the replication region of Lactobacillus acidophilus plasmid pLA102T / K. Kanatani, T. Tahara, M. Oshimura et al // FEMS Microbiol Lett. 1995. -Vol. 133, Is. 2. -P. 127-130.

97. Kaneko, Y. Development of a host-vector system for Lactobacillus plantarum LI37 isolated from a traditional fermented food produced in the Philippines / Y. Kaneko, H. Kobayashi, P. Kiatpapan et al // J Biosci Bioeng. 2000. - Vol.89, №1. - P.62-67.

98. Klaenhammer, T.R. Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria / T.R. Klaenhammer // FEMS Microbiol Rev. -1993. Vol.12 (1-3). - P. 39-85.

99. Kleerebezem, M. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1 / M. Kleerebezem, J. Boerchorst, R. Kranenburg et al // PNAS. -2003. -Vol. 100, №4-P. 1990-1995.

100. Kleerebezem, M. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilin autoregulate their own biosynthesis / M. Kleerebezem // Peptides.2004. -Vol. 25(9). P. 1405-1414. ■

101. Klein, G. Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria / G. Klein, A. Rack, Ch. Bonaparte et al // Int J Food Microbiol. 1998. - Vol.41. -P.103-125.

102. Kranenburg, R. Functional analysis of three plasmids from Lactobacillus plantarum / R. Kranenburg, N. Golic, R. Bonders et al // Appl Environ Microbiol.2005. Vol.71, №3.-P. 1223-1230.

103. Kumar, S. Mega 3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment / S. Kumar // BRIEFINGS IN BIOINFOR-MATICS. 2004. - Vol.5, №2. - P. 150-163.

104. Lee, D.J. / D.J. Lee, R.A. Drongowski, A.G. Coran et al./ Pediatr Surg Int. -2000. Vol. 16. - P. 237-242.

105. Maldsonado, A. Production of plantaricin NC8 by Lactobacillus rlantarum NC8 is induced in the presence of different types of Gram -positive bacteria // A. Maldsonado, J.L. Ruiz-Barba, R. Jimenez-Diaz / Arch Microbiol. 2003. -Vol.1.-P. 29-35.

106. Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms / J. Marmur //J Mol Biol. 1961. - Vol.3. - P.208-218.

107. McKay, L.L. Applications for bioth'echnology: present and future improvements in lactic acid bacteria / L.L. McKay, K.A. Baldwin // FEMS Microbiol. Rev. 1990. - Vol.87. - P. 3-14.

108. Mickle, N. Technical Bulletin 110 / N. Mickle, L. Breed NY// State Agricultural Exp. Station. 1925. - P. 56-58.

109. Miller, K.W. Direct Submission Submitted (06-JUN-2003) /K.W. Miller, , P. Ray, T. Steinmetz et al // Molecular Biology, Univ. of Wyoming, Laramie, WY 82071-3944, USA.

110. Muller, M.R.A. Multiplex PCR for the detection of Lactobacillus ponis and two related species in a sourdough fermentation / M.R.A. Muller, M.A. Ehrmann, R.F. Vogel // Appl Environ Microbiol. 2000. -Vol.66, №5. - P: 21132116.

111. Otte, J.M. Rapid identification of probiotic Lactobacillus species / J.M. Otte, D.K. Podolsky // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004. - Vol. 286. -P. 613-626.

112. Park, M.S. Sequence analysis of plasmid pKJ50 from Bifidobacterium longum / M.S. Park, D.W. Shin, K.H. Lee et al // Microbiol. 1999. - Vol.145, (3). - P. 585-592.

113. Parrot, M. Preliminary characterization of four bacteriocins from Streptococcus mutans / M. Parrot, P.W. Caufield, M.C. Lavoie // Can J Microbiol. 1990. -Vol. 36 (2).-P. 123-130.

114. Pavlova, S.I. Characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus fermen-tum KC5b and its use for constructing a stable Lactobacillus cloning vector / S.I. Pavlova, A.O. Kilic, L. Topisirovic et al // Plasmid. 2002. - Vol. 47, №3. -P. 182-192.

115. Price, R.J. Inhibition.of Pseudomonas species by hydrogen peroxide producing lactobacilli / R.J. Price, J.S. Lee // J. Milk Food Technol: 1970. - Vol.3, №1. -PI 13-18.

116. Pridmore, R.D. The genome sequence of the probiotic intestinal bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533 / R.D. Pridmore, B. Berger, F. Desiere et al // PNAS. 2004: - Vol. 101, №8 - P. 2512-2517.

117. Quadri, L.E. Regulation of antimicrobial peptide production by autoinducer-mediated quorum sensing in lactic acid bacteria / L.E. Quadri // Antonie Van Leeuwenhoek. 2002. - Vol: 82(1-4). - P. 133-145.

118. Rawis, R.Y. Identification and characterization of bacteriocins produced by lactic acid bacteria / R.Y. Rawis // ChemEng New. 1997. - Vol. 75 (22). - P. 35-39:

119. Requena, T. Identification, detection and enumeration.of, human Bifldobacte-riun species by PCR targeting the transaldolase gen1 / T. Requena, J. Burton, T. Matsuki et al // Appl Environ Microbiol. -2002. -Vol.68, №5. P. 2420-2427.

120. Rogosa, M. A selective medium for the isolation and enumeration of oral lactobacilli / M. Rogosa, J.A. Mitchell; R.F. Wiseman // J Dent Res. 1951. -Vol.30, №5.-P. 682-689.

121. Roy, D. Molecular differentation of Bifidobacterium species with amplified ri-bosomal DNA restriction analysis and alignment of short regions of the ldh gene / D. Roy, S. Sirois // FEMS Microbiol Lett. 2000: - Vol. 191- P. 17 -24.

122. Sanders, M.E. Performance of commercial cultures in fluid milk application / M.E. Sanders, D.S. Walker, K.M: Walker et al // J Dairy Sci. -1996. №79. - P. 943-955.

123. Sanders, M.E. Summary of Probiotic Activities of Bifidobacterium lactis HN019 / M.E. Sanders // J Clin Gastroenterol. 2006. - Vol.40, (9). -P. 77683.

124. Savage, D.C. Mechanisms by which indigenous microorganisvs colonize gastrointestinal epithelial surfaces / D.C. Savage // Progr Food and Nutr Sci. — 1983. -7, №3-4.-P. 65-74.

125. Scell, M. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract / M. Scell, M. Karmirantzou, B. Snel et al // PNAS. 2002. - Vol. 99, №22 -P. 14422-14427.

126. Shan, N.P. Probiotic bacteria: selective enumeration and survival in dairy foods / N.P. Shan // J Dairy Sci. 2000. - № 83. - P. 894-907.

127. Shimizu-Kadota, M. Properties of lactose plasmid pLYlOl in Lactobacillus casei / M. Shimizu-Kadota // Appl Environ Microbiol. 1987. - Vol.53, №12. -P. 2987-1991.

128. Smeianov, V.V. Characterization of plasmid p4M from Bifidobacterium pseu-docatenulatum / V.V. Smeianov, B.A. Efimov, V.M. Korschunov // Unpublished.

129. Solow, B.T. Comparison of low-molecular-weight heat stress proteins encoded on plasmids in different strains of Streptococcus thermophilus / B.T. Solow, G.A. Somkuti // Curr Microbiol. 2000. - Vol. 41, №3. - P. 177-181.

130. Somkuti, G.A. Molecular organization of Streptococcus thermophilus plasmid pER13 / G.A. Somkuti, D.H. Steinberg // Unpublished.

131. Song, Y. Rapid identification of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species- specific praimers deraived from the 16S-23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA / Y.

132. Song, N. Kato, C. Liu et al // FEMS Microbiol-Lett. 2000. - Vol. 187. - P. 167-173.

133. Spiegel, J.E. Safety and Benefits of Fructooligosaccharides as Food Ingredients / J.E. Spiegel, R. Rose, P. Karabell et al // Food Technology. 1994. - Vol. 18.- P. 67-72.

134. Stackerbrandt, E. Molecular taxonomy and phylogenetic position of lactic acid bacteria / E. Stackerbrandt, M. Tauber // Biochimie. 1988. - Vol.70. - P. 317-324.

135. Stevens, K.A. Antimicrobial action of nisin against Salmonella typhimurium lipopolysaccharide mutants / K.A. Stevens, N.A. Klapes, B.W. Sheldon et al // Appl Environ. Microbiol: 1992. - Vol.58, №5. - P.1786-1788

136. Stiles, M.E. Lactic acid bacteria of foods and> their current taxonomy / M.E. Stiles, W.H. Holzapfel // Int J Food Microbiol. 1997. - Vol.36. - P.l-29.

137. Takigushi, R. Complete nucleotide sequence and characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus helveticus sp jugurti / R. Takigushi, H. Yashiba, K. Aoyama et al // Appl Environ Microbiol. 1989. -55, №6. - P. 1653-1655.

138. Tamura, K. Mega 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Software Version 4.0 / K. Tamura, J. Dudley, M. Nei et al //Mol Biol Evol. -2007. Vol.24, №8. - p. 1596 -1599.

139. Tanaka, K. Structural and functional analysis of pTB6 from Bifidobacterium longum / K. Tanaka, K. Samura, Y. Kano // Biosci Biotechnol Biochem. — 2005.- Vol.69, № 2. P. 422-425.

140. Tettelin, H. Complete genome sequence and comparative genome analysis of an emerging human pathogen, serotype V Streptococcus agalactae / H. Tettelin, V. Masignani, M!J. Gieclewicz et al // PNAS. 2002. - Vol. 99, №19 - P. 12391-12396.

141. Turgeon, N. Isolation and characterization of a Streptococcus thermophilus plasmid closely related to the pMVl58 family / Ni Turgeon; Si Moineau?// Plas-mid. 2001. - Vol.45, №3. - P. 171-183.

142. Turgeon^ N. Characterization, of^a theta-replicating plasmid from Streptococcus thermophilus / N. Turgeon, M. Frenette, S. Moineau et al // Plasmid. 2004.-Vol. 51, №1. - P.24-36.

143. Vescovo, M. Drug resistance plasmids in Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus reuteri / M. Vescovo, L. Morelli, V. Bottazzi // Appl Environ Microbiol.- 1982. Vol.43, №1. - P. 50-56.

144. Vescovo, M. Conjugal transfer of broad-host-range plasmid pAMip into enteric species of lactic acid bacteria / M. Vescovo; L. Morelli, V. Bottazzi et al // Appl Environ Microbiol. 1983. -Vol.46, №1. - p. 753-755*.

145. Vujcic, M. Molecular analysis of the rolling-circle replicating plasmid pAl of Lactobacillus plantarum A112 / M. Vujcic, L. Topisirovic // Appl Environ Microbiol. 1993. - Vol. 59 №1. - P. 274-280.,

146. Ward, L.J. Differentiation-of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus,rhamnosus by polymerase chain reaction^/ L.J. Ward,-M.J. Tim-mins // Lett Appl Microbiol. 1999: - Vol.29. - P.* 90-92. * "

147. Watanabe, K. Population Dynamics of Phenol-Degrading Bacteria in Activated Sludge Determined by g>ri?-Targeted Quantitative / K. Watanabe // Appl Environ Microbiol. 1998. -Vol.64, №4. - P. 1203 -1209.

148. West, C.A. Plasmid profiles and transfer of plasmid-encoded antibiotic-resistance in Lactobacillus plantarum / C.A. West, P.J. Warner // Appl Environ Microbiol. 1985. - Vol.50, №5. -P. 1319-1321

149. Yost, C.K. The use of multiplex PCR reactions to characterize populatipns of lactic acid bacteria associated with meat spoilage / C.K. Yost, F.M. Nattress // Lett Appl Microbiol 2000. - Vol.31.-P. 129-133.

150. Yun, J.W. Fructooligosaccharides Occurence, Preparation and Applications / J. W. Yun//Enzyme a Microbiol Technol. - 1996.-Vol.19.-P. 107-117

151. Zhong, W. Differentiation of lactobacillus species by molecular typing / W. Zhong, R. Millsap, H. Bialkowska-Hobrzanska et al // Appl Environ Microbiol.- 1998.- Vol.64, №7. -P. 2418-2423.