Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата: катализ и изменение его природы сайт-направленным мутагенезом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Топоркова, Яна Юрьевна

• Топоркова, Яна Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Топоркова, Яна Юрьевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Метаболизм оксилипинов.

1.2. Общая характеристика цитохромов Р450.

1.3. Общая характеристика ферментов семейства CYP цитохромов Р450.

1.3.1. Субстратная специфичность ферментов семейства СУР74.

1.3.2. Распространение и внутриклеточная локализация CYP74.

1.4. Алленоксидсинтаза.

1.5. Общая характеристика LeAOS3.

1.5.1. Предполагаемое функциональное значение LeAOS3.

1.6. Физиологическое значение продуктов реакций, катализируемых ферментами CYP74.

1.7. Независимые исследования взаимосвязи структуры и функций ферментов CYP74.

1.8. Ферменты семейства CYP74 вне царства растений.

1.9. Постановка цели исследования.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы и векторы.

2.1.1. Характеристика штаммов.

2.1.2. Характеристика вектора рЕТ23.

2.1.3. Хранение штаммов Е. coli и рекомбинантных плазмид.

2.2. Питательные среды.

2.3. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.4. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.5. Индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.6. Выделение и очистка рекомбинантного белка.

2.7. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле.

2.8. Выделение и очистка препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.9. Электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле.

2.10. Амплификация фрагментов целевых генов с помощью полимеразной цепной реакции (ПНР).

2.11. Сайт-направленный мутагенез.

2.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.13. Реактивы и материалы для исследований катализа рекомбинантных ферментов.

2.14. Получение гидроперекисей жирных кислот.

2.15. Инкубация рекомбинантного фермента LeAOS с 9-гидроперекисью линолевой кислоты.

2.16. Получение алленоксидсинтаз из семян кукурузы и льна.

2.17. Микропрепаративные инкубации.

2.18. Анализ энантиомерного состава продуктов реакций, катализируемых LeAOS3.

2.19. Инкубации ферментов LeAOS3 и MtHPL дикого типа и их мутантных форм с гидроперекисями жирных кислот.

2.20. Анализ продуктов реакций, катализируемых CYP74, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

2.20.1. Хроматография на обращенной фазе.

2.20.2. Хроматография на нормальной фазе.

2.20.3. Анализ энантиомеров с помощью хроматографии на хиральной фазе.

2.21. Спектральные исследования.

2.22. Методы биоинформатики анализа структуры CYP74.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Клонирование и экспрессия рекомбинантного гена leAOS3.

3.2. Получение очищенного рекомбинантного фермента LeAOS3.

3.3. Продукты превращения 9-гидроперекиси линолевой кислоты под действием LeAOS3.

3.4. Анализ энантиомерного состава цис-10-оксо-11 -фитоеновой кислоты.

3.5. Анализ энантиомерного состава а-кетола и метоксикетона.

3.6. Превращение 13-гидроперекиси линолевой кислоты под действием LeAOS3.

3.7. Метанол из окисей аллена, синтезированных в результате инкубации 13-гидроперекисей с LeAOS3 (CYP74C) и

ZmAOS кукурузы CYP74A).

3.8. Образование окиси аллена под действием

АОС кукурузы (CYP74A) и ее дальнейшее превращение после добавления LeAOS3 in situ.

3.9. Предположительная схема механизма реакции, катализируемой LeAOS3.

3.10. Исследование взаимосвязи между структурой и функцией ферментов методом сайт-направленного мутагенеза.

3.11. Определение положения IHCD в первичной последовательности CYP74.

3.12. Выбор сайтов для мутирования в LeAOS3.

3.13. Анализ продуктов LeAOS3 дикого типа и ее мутантных форм.

3.14. Выбор сайтов для мутагенеза в первичной последовательности MtHPL и сравнительный анализ результатов сайт-направленного мутагенеза LeAOS3 и MtHPL.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Алленоксидсинтаза CYP74C3 томата: катализ и изменение его природы сайт-направленным мутагенезом»

Постановка проблемы и ее актуальность. В онтогенезе растений и формировании у них ответа на стрессовые факторы важная роль принадлежит ферментам липоксигеназной сигнальной системы: цитохромам Р450 семейства CYP74 и липоксигеназам. Результатом работы этой системы является образование окисленных производных жирных кислот - оксилипинов. Ок-силипины относятся к одной из основных групп биоактивных соединений, образующихся в различных организмах в результате окислительного метаболизма полиненасыщенных жирных кислот [Itoh et al., 2002; Stumpe, Feussner, 2006]. В настоящее время имеется достаточно информации, чтобы считать липоксигеназный путь превращения мембранных липидов самостоятельной сигнальной системой [Тарчевский, 2001].

Основное внимание исследователями уделяется изучению продуктов превращения 13-гидроперекисей жирных кислот, к которым относятся жас-моновая кислота и ее производные. Меньше известно о биосинтезе и функциях других членов семейства оксилипинов у растений.

Первую реакцию в пути биосинтеза жасмоновой кислоты, а именно синтез окиси аллена, катализируют алленоксидсинтазы (АОС). Все алленок-сидсинтазы катализируют образование окисей аллена из гидроперекисей жирных кислот: 13-изомеры являются субстратами для алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, 9-изомеры — для алленоксидсинтаз CYP74C. Время полужизни окисей аллена составляет 30 секунд при 0°С, поэтому в качестве продуктов алленоксидсинтазной реакции регистрируются продукты их дальнейших превращений, включающие а- и у-кетолы, образующиеся в результате спонтанного гидролиза, а также циклопентеноны — продукты циклизации окисей аллена, протекающей либо под действием фермента алленоксидцик-лазы, либо спонтанно. Спонтанный гидролиз идет гораздо интенсивнее, чем спонтанная циклизация, в результате чего циклопентеноны в качестве окончательного продукта реакции, катализируемой алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A, регистрируются в следовых количествах. В отличие от этого, среди продуктов реакций, катализируемых алленоксидсинтазами подсемейства CYP74C, в частности LeAOS3, наблюдается значительное количество циклопентенонов. Этот факт до сих пор не имеет объяснения. Физиологическая роль многих продуктов LeAOS3 также до настоящего времени остается неизвестной. Кроме того, не изучены каталитические свойства данного фермента. Особый интерес представляет филогенез LeAOS3, поскольку ее первичная структура обнаруживает большую гомологию с некоторыми гид-ропероксидлиазами (ГПЛ) и дивинилэфирсинтазами (ДЭС), чем с 13-АОС других растений. Имеются основания полагать, что изучение данного белка может дать ключ к пониманию эволюции семейства CYP74 в целом.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований было выявление особенностей каталитического действия фермента подсемейства CYP74C цитохромов Р450 алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) томата (Lycopersicon esculentum) дикого типа и его мутантных форм и сравнение их с особенностями каталитического действия других (классических) представителей подсемейства CYP74C — гидропероксидлиаз. Были поставлены следующие задачи:

1. Получение рекомбинантной алленоксидсинтазы LeAOS3 (CYP74C3) и выяснение особенностей механизма катализа в сравнении с алленоксидсинтазами подсемейства CYP74A.

2. Выявление консервативных особенностей строения каталитически важных доменов различных ферментов семейства CYP74.

3. Выбор участков для модификаций полипептидной цепи и получение мутантных форм LeAOS3 с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагенеза. Сравнение особенностей каталитического действия фермента дикого типа и его мутантных форм.

4. Получение мутантных форм классического представителя подсемейства CYP74C гидропероксидлиазы MtHPL люцерны (Medicago truncatula) с единичными заменами аминокислот с помощью сайт-направленного мутагснеза. Сравнение особенностей каталитического действия мутантных форм LeAOS3 и MtHPL.

Научная новизна работы. Впервые показано, что фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C цитохромов Р450, является мульти-функциональным и катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена, в отличии от большинства алленоксидсинтаз (CYP74A), катализирующих синтез окисей аллена, но не участвующих в их дальнейших превращениях. Показано, что продуктами LeAOS3 являются: образующийся стереоспецифически (9£)-а-кетол и рацемическая смесь цис-Ю-оксо-11-фитоеновой кислоты (^ис-Ю-ОФЕК).

Проведен сравнительный анализ первичных последовательностей ферментов — представителей семейства CYP74; выявлены гипотетические первичные детерминанты катализа - сайты, находящиеся в каталитически важных доменах, имеющих закрепленные последовательности у ферментов с разным типом катализа (алленоксидсинтазы, гидропероксидлиазы и дивини-лэфирсинтазы).

На основании сравнения первичных и третичных структур моноокси-геназ Р450 и ферментов семейства CYP74 выбраны сайты для предполагаемых направленных модификаций представителей подсемейства CYP74C: алленоксидсинтазы LeAOS3 томата и гидропероксидлиазы MtHPL люцерны, проведен сайт-направленный мутагенез по выявленным гипотетическим сайтам — детерминантам катализа CYP74 - соответствующих генов, изучены каталитические свойства мутантных форм.

Впервые показано изменение механизма каталитического действия ферментов семейства CYP74 в результате замены отдельных аминокислот, входящих в состав доменов, находящихся в активном центре вблизи гема. Мутантные формы LeAOS3 обладают гидропероксидлиазной (изомеразной) активностью, тогда как алленоксидсинтазная (дегидразная) активность снижена, либо полностью отсутствует. Среди продуктов реакций, катализируемых мутантными формами MtHPL, обнаруживаются новые продукты в результате нарушений в ферментативном катализе.

Впервые проведено направленное превращение ферментов CYP74 в результате замены отдельных аминокислот, которое может служить подтверждением дивергенции генов CYP74 в ходе их эволюции от единого гипотетического предка с гидропероксидлиазной активностью, существовавшего у примитивных аэробов.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание функционирования одной из ключевых сигнальных систем растения, способствующей его адаптации к неблагоприятным для роста условиям. Изучены механизмы образования продуктов функционирования липоксигеназной сигнальной системы - оксилипинов, участвующих в процессах онтогенеза растений, таких как созревание плодов, прорастание семян, образование пыльцы, развитие цветков, корней и других органов, а также в формировании ответа на стрессовые факторы.

Разработаны системы получения и очистки препаративных количеств ферментов семейства CYP74. Использование технологии рекомбинантных ДНК и различных систем экспрессии дает возможность получения рекомбинантных белков CYP74 для последующего возможного использования в промышленности, которое ограничено низкой доступностью ферментов данного класса из природных источников.

Возможность направленных превращений ферментов открывает новые способы модификации их каталитических свойств. Качественное изменение ферментативного катализа при сайт-направленном мутагенезе представляет потенциальный интерес для практического использования в области биоинженерии с целью получения ферментов с заданными свойствами.

Экспериментальные данные и методические приемы, изложенные в работе, могут быть использованы в учреждениях медицинского, сельскохозяйственного, биологического и биотехнологического профилей, занимающихся получением рекомбинантных ферментов, исследованием взаимосвязи структуры и функций белков, а также в учебном процессе при чтении курсов лекций по биохимии, физиологии растений и молекулярной биологии в ВУЗах.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа проводилась с 2006 по 2009 гг. в соответствии с планом научных исследований Учреждения РАН КИББ КазНЦ РАН по теме «Липоксигеназы и цитохромы семейства CYP74: структура и роль в катализе биосинтеза оксилипинов — эндогенных биорегуляторов растений» (гос. регистрационный номер: 01200901959). Исследования автора, как исполнителя по данной тематике, частично поддержаны грантами РФФИ № 06-04-48430-а «Липоксигеназы растений. От первичного строения — к пониманию молекулярных механизмов действия», № 09-04-00915-а «Ферменты CYP74: контроль биосинтеза регуляторных оксилипинов у растений», № 09-04-12222-офим «Семейство генов CYP74 Zea mays: структура, экспрессия, роль в липоксигеназном сигнальном каскаде», а также грантом ведущей научной школы академика И.А. Тарчевского НШ № 5492.2008.4 «Сигнальные системы клеток — медиаторы, протеом». Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Положения, выносимые на защиту:

1. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент подсемейства CYP74C LeAOS3, является мультифункциональным. LeAOS3 катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена.

2. Первичный продукт LeAOS3 — окись аллена - после высвобождения из активного центра вновь захватывается ферментом, катализирующим ее вторичные превращения, а именно гидролиз и циклизацию с образованием 9(R)-а-кетола и рацемической ^wc-10-оксофитоеновой кислоты, соответственно.

3. Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют о принципиальной роли центрального домена I-спирали и ERR-триады в формировании определенного типа катализа ферментов семейства CYP74. Все ферменты CYP74 относятся к близкородственной филогенетической группе, несмотря на широкий спектр каталитических функций.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы доложены на 10-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); на 2-ом Международном симпозиуме «Сигнальные системы растительных клеток: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006); на Российской школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), на Конференции «Современные достижения в биохимии и клеточной биологии растительных липидов» (США, Солт-Лейк-Сити, 2007); на 12-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2008); на I Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань,

2008); на Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); па Международном симпозиуме «Растительные липиды и оксилипины» (Казань, 2008); на Межвузовской конференции по современной биологии (Казань, 2008); на

2-ом Международном семинаре по липидным медиаторам (Испания, Валья-долид, 2008); на Международном симпозиуме «Регуляторные оксилипины» (Швейцария, Лозанна, 2009); на 34-ом конгрессе FEBS «Life's Molecular Interactions» (Чехия, Прага, 2009); на Международной конференции «Симби

03-2009: Биология - расширение границ» (Казань, 2009); на II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); на Всероссийской конференции «Устойчивость к неблагоприятным факторам окружающей среды» (Иркутск,

2009); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), а также на итоговой конференции Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН (2009). Работа является призером Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2008). По результатам работы опубликовано две статьи в зарубежных рецензируемых изданиях.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Топоркова, Яна Юрьевна

ВЫВОДЫ

1. В отличие от алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, фермент LeAOS3, принадлежащий подсемейству CYP74C, является мульти-функциональным и катализирует не только синтез, но также гидролиз и циклизацию окиси аллена.

2. Гидролиз окиси аллена под действием LeAOS3 протекает стереоспеци-фически, приводя к образованию (9^?)-ос-кетола, тогда как циклизация приводит к образованию рацемической смеси г/ио10-0ФЕК.

3. Методами биоинформатики выявлены гипотетические сайты, определяющие механизм каталитического действия ферментов CYP74. С помощью сайт-направленного мутагенеза проведены единичные замены аминокислот в LeAOS3: мутации F295I, K302S, и S297A в центре I-спирали и T366Y и D359R в ERR-триаде. В центре I-спирали MtHPL с помощью сайт-направленного мутагенеза проведены замены F284I и N285T.

4. Мутации кардинально изменили механизм каталитического действия LeAOS3. Полученные мутантные формы проявляют активность гидропероксидлиазы (изомеразы), тогда как алленоксидсинтазная (дегидраз-ная) активность либо сильно снижена (K302S, T366Y и S297A), либо полностью отсутствует (F295I).

5. Результаты экспериментов по сайт-направленному мутагенезу свидетельствуют, что эпоксиаллильный радикал - центральный промежуточный интермедиат катализа ферментов CYP74 — либо теряет один атом водорода, приводя к образованию окиси аллена (фермент дикого типа), либо подвергается перегруппировке в изомерный радикал, который рекомбинирует с гидроксильным радикалом с образованием полу-ацеталя - первичного продукта ГПЛ (мутантные формы F295I, K302S, T366Y и S297A).

6. Помимо основного продукта (9Z)-12-оксододеценовой кислоты в реакциях, катализируемых мутантными формами MtHPL, появляются

9ZJ 1£)-13-оксотридекадиеновая и (9Z)-11-оксоундеценовая кислоты — продукты гомолитической фрагментации углеродного остова. 7. Консервативный аспарагин в центре I-спирали не является абсолютно необходимым для каталитической активности ферментов CYP74. Му-тантная форма MtHPL N285T сохраняет остаточную активность гидро-пероксидлиазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство растительных алленоксидсинтаз, принадлежащих подсемейству CYP74A цитохромов Р450 [Tijet, Brash, 2002], катализируют синтез окисей аллена, но не участвуют в их циклизации. Окиси аллена, образуемые в результате каталитического действия алленоксидсинтаз подсемейства CYP74A, претерпевают спонтанный гидролиз и, в гораздо меньшей степени, спонтанную циклизацию. Недавно обнаруженные АОС картофеля и томата подсемейства CYP74C представляют собой исключения. Среди продуктов реакции, катализируемой этими ферментами, наблюдается значительное количество циклопентенонов наряду с а-кетолом [Hamberg, 2000; Itoh et al., 2002].

В полном согласии с данными литературы [Hamberg, 2000; Itoh et al, 2002], первичным продуктом, продуцируемым и высвобождаемым из каталитического центра LeAOS3, являлась короткоживущая окись аллена. Таким образом, синтез окиси аллена является общей функцией АОС как подсемейства CYP74A, так и CYP74C.

В то же время, характер дальнейших превращений окиси аллена в присутствии LeAOS3 сильно различается по нескольким аспектам. Во-первых, время полужизни окиси аллена строго зависит от концентрации LeAOS3. Чем выше концентрация LeAOS3, тем меньше время полужизни 9ДО-ЭОД. Во-вторых, 9ДО-ЭОД сразу превращается в Ю-ОФЕК и а-кетол. Когда концентрация LeAOS3 достигает значения насыщения, происходит полное превращение 9-ГПОД через 9ДО-ЭОД в Ю-ОФЕК и а-кетол за 20 секунд при 0°С, рН 7.0. В-третьих, а-кетол образуется стереоспецифически (9К). Окончательными продуктами LeAOS3 являются (9Я)-а-кетол и рацемическая цис-Ю-оксо-11-фитоеновая кислота (Схема 5, путь А). о—он он

9/?)-а-кетол LeAOS3 I wt он с" оон

9Z,11£)-13-okcotph декад неновая кислота t

В)

LeAOS3 wt

Окись аллена (9,Ю-ЭОД)

I LeAOS3 | wt

Рацемическая цис-Ю-ОФЕК

MtHPL F284I, F287V N285A, N285T G288I

Г) Окисление

Эпоксиалл ильный радикал

LeAOS3 F295I, S297A K302S, T366Y

MtHPL wt

Б) онс'

-соон

92)-11-оксоундеценовая кислота он Полуацеталь

Спонтанно) онс.

Альдегид

Альдокислота

Схема 5. Механизмы реакций, катализируемых ферментами CYP74 дикого типа и их мутантными формами. В результате единичных замен аминокислот произошли изменения типа катализа как LeAOS3, так и MtHPL. А -механизм реакции, катализируемой LeAOS3 дикого типа (тип катализа — дегидратация); Б — механизм реакции, катализируемой мутантными формами LeAOS3 и MtHPL дикого типа (тип катализа — изомеризация); В и Г - механизмы реакций, катализируемых мутантными формами MtHPL (нарушение ферментативного катализа). R=(CH2)7C02Me; R'=(CH2)4Me для LeAOS3. и R=CH2CH=CHCH2Me; R'=(CH2)7C02Me для MtHPL.

Мутантные формы сохранили способность утилизировать 9-ГПОД. Однако, наряду с продуктами, характерными для реакции LeAOS3, появились продукты, характерные для ГПЛ, а именно 9-оксононановая кислота (Схема 5, путь Б). Если в случае замен K302S, T366Y и S297A синтезировались продукты как алленоксидсинтазной, так и гидропероксидлиазной реакций, то в случае замены фенилаланина на изолейцин (F295I) продуктов алленоксидсинтазной реакции практически не наблюдалось. Это свидетельствует о роли данных консервативных аминокислот в специфической функции фермента. С другой стороны, замена аспарагиновой кислоты на аргинин (D359R) в ERR-триаде не привела к изменениям в механизме катализа.

Результаты данной работы по сайт-направленному мутагенезу LeAOS3 и MtHPL частично подтверждают гипотезу о том, что предковый фермент CYP74 мог функционировать в качестве ГПЛ.

К настоящему времени определены два сайта, необходимые для формирования типа катализа. Первый был выявлен в работе Рамана с сотр. [Lee et al., 2008], второй - в результате настоящей работы. Алленоксидсинтазы содержат фенилаланин в обоих сайтах. Гидропероксидлиазы содержат фени-лаланин в домене IHCD и лейцин или изолейцин в сайте, определенном Ра-маном с сотр. [Lee et al., 2008]. Дивинилэфирсинтазы содержат лейцин или изолейцин в обоих сайтах.

Поскольку ни одна из единичных мутаций в каталитически важных сайтах MtHPL, определенных ранее в экспериментах с LeAOS3, не привела к появлению нового каталитического механизма, характерного для семейства CYP74, тогда как четыре из пяти мутаций в LeAOS3 превратили данный фермент из дегидразы в изомеразу (частично или полностью), можно предположить, что гидропероксидлиазная реакция по механизму является базовой, а алленоксидсинтазная и дивинилэфирсинтазная реакции формируются в процессе видоизменения этой базовой реакции из-за дополнительного влияния боковых групп определенных аминокислот.

Этот путь метаболизма жирных кислот характерен не только для томата. В нашей лаборатории были проведены эксперименты по скринингу ли-поксигеназного каскада у растений и выявлено, что аналогичные пути превращения гидроперекисей жирных кислот в циклопентеноны и кетолы под действием алленоксидсинтаз характерны для ряда растений, в том числе имбиря, ландыша и подсолнечника.

Биологическое значение описанного пути превращения жирных кислот еще предстоит выяснить. Возможно, эти соединения образуются в результате действия каскадов, альтернативных образованию жасмоновой кислоты.

Практически все ферменты суперсемейства Р450 являются моноокси-геназами, и для них характерно использование двух субстратов: непосредственно окисляемого соединения и молекулярного кислорода. Уникальным свойством ферментов семейства CYP74 является отсутствие необходимости во втором субстрате, а именно молекулярном кислороде. В реакции участвует кислород гидропероксигруппы окисленной жирной кислоты. Соответственно, центральный домен I-спирали ферментов CYP74 является вырожденным. Аминокислотные остатки, участвующие в связывании и активации кислорода и переносе электронов у монооксигеназ, отсутствуют в последовательностях CYP74. Мы предположили, что функция центрального домена I-спирали у CYP74 заключается во взаимодействии с гидроперекисной группировкой субстрата и непосредственном участии в реакциях, катализируемых ферментами CYP74. Кроме того, исходя из сопоставления первичных последовательностей и расположения другого консервативного домена ферментов CYP74 - ERR-триады — относительно гема, мы предположили, что некоторые аминокислотные остатки, входящие в его состав, также могут принимать участие в катализе специфических реакций.

Полученные нами данные демонстрируют превращение ферментов CYP74 в результате сайт-направленного мутагенеза (Схема 5). Четыре единичные мутации LeAOS3 (CYP74C3) F295I, K302S, T366Y и S297A превратили АОС (дегидразу) (Схема 5, путь А) в ГПЛ (изомеразу) (Схема 5, путь Б).

147

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Топоркова, Яна Юрьевна, 2009 год

1. Георгиев, Г.П. Метод быстрого выделения высокополимерной дезокси-рибонуклеиновой кислоты / Г.П. Георгиев // Биохимия. — 1959. — Т. 24. — Н. З.-С. 472-480.

2. Гловер, Д. Клонирование ДНК. Методы / Д. Гловер.— М.: Мир, 1988. -538 с.

3. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук. -М.: Мир, 1984. 480 с.

4. Остерман, JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие) / Л.А. Остерман. -М.: Наука, 1981.-288 с.

5. Тарчевский, И.А. Метаболизм растений при стрессе (избранные труды) / И.А. Тарчевский. К.: Фэн, 2001. - 448 с.

6. Baldwin, SJ. Ketoconazole and sulphaphenazole as the respective selective inhibitors of P4503A and 2C9 / S.J. Baldwin, J.C. Bloomer, G.J. Smith, A.D. Ayrton, S.E. Clarke, R.J. Chenery // Xenobiotica. 1995. - V. 25. - P. 261270.

7. Bell, C.D. The age of the angiosperms: a molecular timescale without a clock / C.D. Bell, D.E. Soltis, P.S. Soltis // Evolution. 2005. - V. 59. - P. 12451258.

8. Black, S.D. P-450 cytochromes: structure and function / S.D. Black, M.J. Coon // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 1987. - V. 60 - P. 35-87.

9. Blee, E. Envelope membranes from spinach chloroplasts are a site of metabolism of fatty acid hydroperoxides / E. Blee, J. Joyard // Plant Physiol. — 1996. -V. 102.-P. 821-828.

10. Blee, E. Phytooxylipins and plant defense reactions / Prog. Lipid Res. — 1998. -V. 37.-P. 33-72.

11. Blee, E. Impact of phyto-oxylipins in plant defense / Trends Plant Sci. 2002. -V. 7.-P. 315-322.

12. Bouarab, K. The innate immunity of a marine red alga involves oxylipins from both the eicosanoid and octadecanoid pathways. / K. Bouarab, F. Adas, E. Gaquerel, B. Kloareg, J.-P. Salau, P. Potin // Plant Physiol. 2004. - V. 135.-N. 3.-P. 1838-1848.

13. Brash, A.R. Isolation and characterization of natural allene oxides: Unstable intermediates in the metabolism of lipid hydroperoxides / A.R. Brash, S.W. Baertschi, C.D. Ingram, T.M. Harris // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. -V. 85.-P. 3382-3386.

14. Caldelari, D. A rapid assay for the coupled cell free generation of oxylipins / D. Caldelari, E.E. Farmer // Phytochemistry. 1998. - V. 47. - P. 599-604.

15. Chehab, E.W. Rice hydroperoxide lyases with unique expression patterns generate distinct aldehyde signatures in Arabidopsis / E.W. Chehab, G. Raman, J.W. Walley, J.V. Perea, G. Bame et al. // Plant Physiol. 2006. - V. 141.-P. 121-134.

16. Conconi, A. Intracellular levels of free linolenic and linoleic acids increase in tomato leaves in response to wounding / A. Conconi, M. Miquel, J.A. Browse, C.A. Ryan // Plant Physiol. 1996. - V. 111. - P. 797-803.

17. Creelman, R.A. Biosynthesis and action of jasmonates in plants / R.A. Creel-man, J.E. Mullet // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1997. - V. 48.-P. 355-381.

18. Dathe, W. Endogenous plant hormones of the broad bean, Vicia faba L. (-)-Jasmonic acid, a plant growth inhibitor in pericarp / W. Dathe, H. Ronsch, A. Preiss, W. Schade, G. Sembdner, K. Schreiber // Planta. 1981. - V. 153 - P. 530-535.

19. Demole, E. Isolement et de. Termination de la structure du jasmonate de methyle, constituant odorant characteristique de Г essence de jasmin / E. Demole, E. Lederer, D. Mercier // Helv. Chim. Acta. 1962. - V. 45. - P. 675-685.

20. Denisov, I.G. Structure and chemistry of cytochrome P450 / I.G. Denisov, T.M. Makris, S.G. Sligar, I. Schlichting // Chem. Rev. 2005. - V. 105. - P. 2253-2277.

21. Edwards, RJ. Identification and location of alpha-helices in mammalian cytochromes P450 / R.J. Edwards, B.P. Murray, A.R. Boobis, D.S. Davies // Biochemistry. 1989. - V. 28. - P. 3762-3770.

22. Farmer, E.E. Interplant communication: Airborne methyl jasmonate induces synthesis of proteinase inhibitors in plant leaves / E.E. Farmer, C.A. Ryan // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87.-P. 7713-7716.

23. Farmer, E.E. Regulation of expression of proteinase inhibitor genes by methyl jasmonate and jasmonic acid / E.E. Farmer, R.R. Johnson, C.A. Ryan // Plant Physiol. 1991.-V. 98.-P. 995-1002.

24. Farmer, E.E. Octadecanoid-derived signals in plants / E.E. Fanner, C.A. Ryan // Trends Cell Biol. 1992. - V. 2. - P. 236-241.

25. Fauconnier, M.-L. Purification and characterization of tomato leaf (Lycoper-sicon esculentum Mill.) hydroperoxide lyase / M.-L. Fauconnier, A.G. Perez, C. Sanz, M. Marlier // J. Agric. Food Chem. 1997. - V. 45. - P. 4232-4236.

26. Feng, P. Specificity of flax hydroperoxide isomerase / P. Feng, D.C. Zimmerman//Lipids. 1979.-V. 14.-P. 710-713.

27. Feussner, I. The lipoxygenase pathway / I. Feussner, C. Wasternack // Annu Rev Plant Biol. 2002. - V. 53. - P. 275-297.

28. Gardner, H.W. Sequential enzymes of linoleic acid oxidation in com germ: Lipoxygenase and linoleate hydroperoxide isomerase / J. Lipid Res. — 1970. -V. 11. — P.311-321.

29. Gardner, H.W. Decomposition of linoleic acid hydroperoxides. Enzymic reactions compared with nonenzymic / J. Agric. Food Chem. — 1975. — V. 23. — P. 129-136.

30. Gardner, H.W. Recent investigations into the lipoxygenase pathway of plants / Biochem. Biophys. Acta. 1991. - V. 1084. - P. 221-239.

31. Gobel, C. Oxylipin profiling reveals the preferential stimulation of the 9-lipoxygenase pathway in elicitor-treated potato cells / C. Gobel, I. Feussner,

32. A. Schmidt, D. Scheel, J. Sanchez-Serrano et al. // J. Biol. Chem. 2001. - V. 276.-P. 6267-6273.

33. Gobel, C. Lipid peroxidation during the hypersensitive response in potato in the absence of 9-lipoxygenases / C. Gobel, I. Feussner, S. Rosahl // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - P. 52834-52840.

34. Gotoh, O. Structural characteristics of cytochrome P-450. Possible location of the heme-binding cysteine in determined amino-acid sequences / O. Gotoh, Y. Tagashira, T. Iizuka, Y. Fujii-Kuriyama // J. Biochem. (Tokyo). — 1983. V. 93.-P. 807-817.

35. Gotoh, O. Possible steroid binding site common to adrenal cytochrome P-450scc and prostatic steroid binding protein / O. Gotoh, Y. Tagashira, K. Mo-rohashi, Y. Fujii-Kuriyama // FEBS Lett. 1985. - V. 188. - P. 8-10.

36. Gotoh, O. Evolution, structure and gene regulation of cytochrome P-450 / O. Gotoh, Y. Fujii-Kuriyama // Frontiers in Biotransformation / K. Ruckpaul, H. Rein. Berlin: Akademie-Verlag, 1989.-V. l.-P. 195-243.

37. Gotoh, O. Substrate recognition sites in cytochrome P450 Family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences / The Journal of biological chemistry. 1992. - V. 267. - P. 83-90.

38. Goulitquer, S. Release of volatile aldehydes by the brown algal kelp Lami-naria digitata in response to both biotic and abiotic stress / S. Goulitquer, A. Ritter, F. Thomas, C. Ferec, J.P. Salaun, P. Potin // Chembiochem. 2009. -V. 10(6).-P. 977-82.

39. Grechkin, A.N. Cyclization of natural allene oxide fatty acids. The anchimeric assistance of P,y-double bond beside the oxirane and the reaction mechanism / Biochim Biophys Acta. 1994. - V. 1213. - P. 199-206.

40. Grechkin, A.N. The lipoxygenase pathway in garlic (Allium sativum L.) bulbs: detection of the novel divinyl ether oxylipins / A.N. Grechkin, F.N. Fazliev, L.S. Mukhtarova // FEBS Letters. 1995. - V. 371. - P. 159-162.

41. Grechkin, A.N. On the mechanism of biosynthesis of divinyl ether oxylipins by enzyme from garlic bulbs / A.N. Grechkin, A.V. Ilyasov, M. Hamberg // Eur J Biochem. 1997. - V. 245. - P. 137-142.

42. Grechkin, A.N. Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway / Prog. Lipid Res. 1998. - V. 37. - P. 317-352.

43. Grechkin, A. N. Formation of cyclopentenones from all-(E) hydroperoxides of linoleic acid via allene oxides. New insight into the mechanism of cycliza-tion / A. N. Grechkin, M. Hamberg // FEBS Lett. 2000. - V. 466 - P. 6366.

44. Grechkin, A.N. The lipoxygenase pathway in tulip (Tulipa gesneriana): detection of the ketol route / A.N. Grechkin, L.S. Mukhtarova, M.Hamberg // Biochem. J. 2000. - V. 352. - P. 501-509.

45. Grechkin, A.N. Hydroperoxide lyase and divinyl ether synthase / Prostaglandins Other Lipid Mediat. 2002. - V. 68-69 - P. 457-470.

46. Grechkin, A.N. Biocatalysis by the plant lipoxygenase pathway hydroperox-ide-metabolizing enzymes / A.N. Grechkin, H.W. Gardner // Lipid Biotechnology / T.M. Kuo, H.W. Gardner. NY: Marcel Dekker, 2002. - P. 183-201.

47. Grechkin, A.N. The "heterolytic hydroperoxide lyase" is an isomerase producing a short-lived fatty acid hemiacetal / A.N. Grechkin, M. Hamberg // Bi-ochim Biophys Acta. 2004. - V. 1636. - P. 47-58.

48. Grechkin, A.N. Detection of a pathway from linoleate to a novel cyclopente-none: cw-12-oxo-10-phytoenoic acid in sunflower roots / A.N. Grechkin,

49. A.V. Ogorodnikova, O.I. Gnezdilov, L.S. Mukhtarova // ChemBioChem. — 2007. V. 8. - P. 2275-2280.

50. Green, M.T. Oxoiron(IV) in chloroperoxidase compound II is basic: implications for P450 chemistry / M.T. Green, J.H. Dawson, H.B. Gray // Science. — 2004. V. 304. - P. 1653-1656.

51. Gundlach, H. Jasmonic acid as a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures / H. Gundlach, M J. Muller, T.M. Kutchan, M.H. Zenk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 2389-2393.

52. Hamberg, M. Mechanism of corn hydroperoxide isomerase: detection of 12,13(5)-oxido-9(Z),l 1-octadecadienoic acid / Biochim. Biophys. Acta. — 1987.-V. 920.-P. 76-84.

53. Hamberg, M. Biosynthesis of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid: identification of an allene oxide cyclase / Biochem Biophys Res Comm. 1988. - V. 156.-P. 543-550.

54. Hamberg, M. Fatty acid allene oxides. III. Albumin-induced cyclization of 12,13(5)-epoxy-9(Z),l 1 -octadecadienoic acid / M. Hamberg, M.A. Hughes // Lipids. 1988. - V. 23. - P. 469-475.

55. Hamberg, M. Absolute configuration of 12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid / M. Hamberg, O. Miersch, G. Sembdner // Lipids. 1988. - V. 23. - P. 521524.

56. Hamberg, M. Biosynthesis and conversions of fatty acid allene oxides / M. Hamberg, M.A. Hughes // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res. 1989. — V. 19.-P. 64-69.

57. Hamberg, M. Allene oxide cyclase: a new enzyme in plant lipid metabolism / M. Hamberg, P. Fahlstadius // Arch. Biochem. Biophys. 1990. - V. 276. -P. 518-526.

58. Hamberg, M. Oxylipin pathway to jasmonates: biochemistry and biological significance / M. Hamberg, H.W. Gardner // Biochim. Biophys. Acta. — 1992. -V. 1165.-P. 1-18.

59. Hamberg, M. A pathway for biosynthesis of divinyl ether fatty acids in green leaves/Lipids. 1998.-V. 33.-P. 1061-1071.

60. Hamberg, M. New cyclopentenone fatty acids formed from linoleic and lino-lenic acids in potato / Lipids. 2000. - V. 35. - P. 353-363.

61. Hasemann, C.A. Structure and function of cytochromes P450: a comparative analysis of thee crystal structures / C.A. Hasemann, R.G. Kurumbail, S.S. Boddupalli, J.A. Peterson, J. Deisenhofer // Structure. 1995. - V. 3. - P. 4162.

62. Hatanaka, A. The biogeneration of green odour by green leaves / Phytochem-istry. 1993. — Y. 34.-P. 1201-1218.

63. Hess, B.A. Mechanism of the rearrangement of vinyl allene oxide to 2-cyclopenten-l-one / B.A. Hess, L. Smentek, A.R. Brash, J.K. Cha // J. Am. Chem. Soc. 1999. - V. 121.-P. 5603-5604.

64. Hofmann, E. The crystal structure of Arabidopsis thaliana allene oxide cyclase: insights into the oxylipin cyclization reaction / E. Hofmann, Ph. Zerbe, F. Schaller//The Plant Cell. -2006. V. 18.-P. 3201-3217.

65. Howe, G.A. Cytochrome P450-dependent metabolism of oxylipins in tomato. Cloning and expression of allene oxide synthase and fatty acid hydroperoxide lyase / G.A. Howe, G.I. Lee, A. Itoh, L. Li, A.E. DeRocher // Plant Physiol. -2000.-Y. 123.-P. 711-724.

66. Howe, G.A. Oxylipin metabolism in response to stress / G.A. Howe, A.L. Schilmiller // Curr Opin Plant Biol. 2002. - V. 5. - P. 230-236.

67. Humphrey, W.F. VMD Visual Molecular Dynamics / W.F. Humphrey, A. Dalke, K. Schulten // J. Mol. Graphics. - 1996. - V. 14. - P. 33-38.

68. Imai, Y. Characterization of rabbit liver cytochrome P-450 (laurate omega-1 hydroxylase) synthesized in transformed yeast cells / J. Biochem. (Tokyo). -1988.-V. 103.-P. 143-148.

69. Itoh, A. Molecular cloning of a divinyl ether synthase: identification as a CYP74 cytochrome P450 / A. Itoh, G.A. Howe // J Biol Chem. 2001. - V. 276.-P. 3620-3627.

70. Itoh, A. Identification of a jasmonate-regulated allene oxide synthase that metabolizes 9-hydroperoxides of linoleic and linolenic acids / A. Itoh, A.L. Schilmiller, B.C. McCaig, G.A. Howe // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - P. 46051-46058.

71. Jones, D.T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices / J. Mol. Biol. 1999. - V. 292.-P. 195-202.

72. Joo, H. Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hy-droxylation / H. Joo, Z. Lin, F.H. Arnold // Nature. 1999. - V. 399 - P. 670673.

73. Kahn, R. Function and evolution of plant cytochrome P450 / R. Kahn, F. Durst // Recent Adv. Phytochem. 2000. - V. 34. - P. 151-189.

74. Kalb, V.F. Proteins from eight eukaryotic cytochrome P-450 families share a segmented region of sequence similarity / V.F. Kalb, J.C. Loper // Proc Natl Acad Sci USA 1988. - V. 85 - P. 7221-7225.

75. Kandzia, R. On the specificity of lipid hydroperoxide fragmentation by fatty acid hydroperoxide lyase from Arabidopsis thaliana / R. Kandzia, M. Stumpe, E. Berndt, M. Szalata, K. Matsui, I. Feussner // J Plant Physiol. 2003. - V. 160.-P. 803-809.

76. Kim, S.J. An efficient cyclopentenone formation via an allene oxide / S.J. Kim, J.K. Cha//Tetrahedron Lett. 1988. - V. 29.-P. 5613-5616.

77. Koda, Y. Possible involvement of jasmonic acid in various morphogenic events / Physiol. Plant. 1997. - V. 100. - P. 639-646.

78. Kolomiets, M.Y. A leaf lipoxygenase of potato induced specifically by pathogen infection / M.V. Kolomiets, H. Chen, R.J. Gladon, E.J. Braun, D.J. Han-napel//Plant Physiol.-2000.-V. 124. P. 1121-1130.

79. Kolomiets, M.V. Lipoxygenase is involved in the control of potato tuber development / M.V. Kolomiets, D.J. Hannapel, H. Chen, M. Tymeson, R.J. Gladon//Plant Cell-2001.-V. 13-P. 613-626.

80. Kramell, R. Amino acid conjugates of jasmonic acid induce jasmonate-responsive gene expression in barley (Hordeum vulgare L.) leaves / R. Kramell, O. Miersch, B. Hause, B. Ortel, B. Parthier, B. Wasternack // FEBS Lett. 1997.-V. 414.-P. 197-202.

81. Kronbach, T. Hybrid cytochromes P-450 identify a substrate binding domain in P-450IIC5 and P-450IIC4 / T. Kronbach, T.M. Larabee, E.F. Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 8262-8265.

82. Kubigsteltig, I. Structure and regulation of the Arabidopsis thaliana allene oxide synthase gene /1. Kubigsteltig, D. Laudert, E.W. Weiler // Planta 1999. -V. 208.-P. 463-471.

83. Lambert, C. ESyPred3D: prediction of proteins 3D structures / C. Lambert, N. Leonard, X. De Bolle, E. Depiereux // Bioinformatics. 2002. - V. 18. - P. 1250-1256.

84. Lau, S.M. Low carbon monoxide affinity allene oxide synthase is the predominant cytochrome P450 in many plant tissues / S.M. Lau, P.A. Harder, D.P. O'Keefe //Biochemistry. 1993. -V. 32(8). - P. 1945-1950.

85. Laudert, D. Allene oxide synthase: a major control point in Arabidopsis thaliana octadecanoid signalling / D. Laudert, E.W. Weiler // Plant J. 1998. -V. 15.-P. 675-684.

86. Laudert, D. Transgenic Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana plants overexpressing allene oxide synthase / D. Laudert, F. Schaller, E.W. Weiler // Planta 2000. - V. 211. — P. 163-165.

87. Laughton, C.A. A molecular model for the enzyme cytochrome P450(17 alpha), a major target for the chemotherapy of prostatic cancer / C.A. Laughton, S. Neidle, M.J. Zvelebil, M.J. Sternberg // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. — V. 171.-P. 1160-1167.

88. Lee, D.-S. Structural insights into the evolutionary paths of oxylipin biosynthesis enzymes / D.-S. Lee, P. Nioche, M. Hamberg, C.S. Raman // Nature. -2008. V. 455. - P. 363-370.

89. Lindberg, R.L. Alteration of mouse cytochrome P450coh substrate specificity by mutation of a single amino-acid residue / R.L. Lindberg, M. Negishi // Nature 1989. - V. 339. - P. 632-634.

90. Mansuy, D. The great diversity of reactions catalyzed by cytochrome P450 / Сотр. Biochem. Physiol. Part. C. 1998. - V. 121. - P. 5-14.

91. Martinis, S.A. A conserved residue of cytochrome P-450 is involved in heme-oxygen stability and activation / S.A. Martinis, W.M. Atkins, P.S. Stayton, S.G. Sligar // J. Am. Chem. Soc. 1989. - V. 111. - P. 9252-9253.

92. Mast, N. Expression of human cytochrome P450 46A1 in Escherichia coli: effects of N- and C-terminal modifications / N. Mast, U. Andersson, K. Na-kayama, I. Bjorkhem, I.A. Pikulevaa // Arch. Biochem. Biophys. — 2004. — V. 428.-P. 99-108.

93. Matoba, T. Contribution of hydroperoxide lyase activity to n-hexanal formation in soybean / T. Matoba, H. Hidaka, K. Kitamura, N. Kaizuma, M. Kito // J. Agric. Food Chem. 1985. - V. 33. - P. 856-858.

94. Matsui, K. Fatty acid hydroperoxide cleaving enzyme, hydroperoxide lyase, from tea leaves / K. Matsui, H. Toyota, T. Kajiwara, T. Kakuno, A. Hatanaka //Phytochemistry. 1991.-V. 30.-P. 2109-2113.

95. Matsui, K. Bell pepper fruit fatty acid hydroperoxide lyase is a cytochrome P450 (CYP74B) / K. Matsui, M. Shibutani, T. Hase, T. Kajiwara // FEBS Lett. 1996. - V. 394. - P. 21-24.

96. Matsui, K. Fatty acid 9- and 13-hydroperoxide lyases from cucumber / K. Matsui, C. Ujita, S. Fujimoto, J. Wilkinson, B. Hiatt et al. II FEBS Lett. -2000b.-V. 481.-P. 183-188.

97. Maucher, H. Allene oxide synthases of barley (Hordeum vulgare cv. Salome): tissue specific regulation in seedling development / H. Maucher, B. Hause, I. Feussner, J. Ziegler, C. Wastemack // Plant J. 2000. - V. 21. - P. 199-213.

98. McConn, M. The critical requirement for linolenic acid is pollen development, not photosynthesis, in an Arabidopsis mutant / M. McConn, J. Browse //Plant Cell. 1996.-V. 8.-P. 403-416.

99. McGuffin, L.J. The PSIPRED protein structure prediction server / L.J. McGuffin, K. Bryson, D.T. Jones // Bioinformatics. 2000. - V. 16. - P. 404405.

100. McLean, K.J. Biodiversity of cytochrome P450 redox systems / K.J. McLean, M. Sabri, K.R. Marshall, R.J. Lawson, D.G. Lewis et al. II Biochemical Society Transactions. 2005. - V. 33.-P. 796-801.

101. Meyer, A. Occurrence of the plant growth regulator jasmonic acid in plants / A. Meyer, O. Miersch, C. Biittner, W. Dathe, G. Sembdner // J. Plant Growth Regul. 1984. - V. 3. - P. 1-8.

102. Mita, G. Molecular cloning and characterization of an almond 9-hydroperoxide lyase, a new CYP74 targeted to lipid bodies / G. Mita, A. Quarta, P. Fasano, A. de Paolis, G.P. Di Sansebastiano et al. // J Exp. Bot. -2005. V. 56. - P. 2321-2333.

103. Mueller, M.J. Signaling in the elicitation process is mediated through the oc-tadecanoid pathway leading to jasmonic acid / M.J. Mueller, W. Brodschelm, E. Spannagl, M.H. Zenk // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 7490-7494.

104. Nagano, S. Crystallographic study on the dioxygen complex of wild-type and mutant cytochrome P450cam / S. Nagano, T.L. Poulos // J. Biol. Chem. — 2005. V. 280. - P. 31659-31663.

105. Narvaez-Vasquez, J. Positional specificity of a phospholipase A2 activity induced by wounding, systemin, and oligosaccharide elicitors in tomato leaves / J. Narvaez-Vasquez, J. Florin-Christensen, C.A. Ryan // Plant Cell. 1999. -V. 11.-P. 2249-2260.

106. Nelson, D.R. Evolution of cytochrome P-450 proteins / D.R. Nelson, H.W. Strobel // Mol. Biol. Euol. 1987. - V. 4. - P. 572-593.

107. Nelson, D.R. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P-450 proteins / D.R. Nelson, H.W. Strobel // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 6038-6050.

108. Nelson, D.R. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature / D.R. Nelson, L. Koymans, T. Kamataki, J.J. Stegeman, R. Feyereisen et al. II Pharmacogenetics. — 1996. V. 6. - P. 1-42.

109. Nelson, D.R. Cytochrome P450 and the individuality of species / Arch. Bio-chem. Biophys. 1999. - V. 369. - P. 1-10.

110. Noordermeer, M.A. Oxygenation of (3Z)-alkenal to 4-hydroxy-(2E)-alkenals in plant extracts: a non-enzymatic process / M.A. Noordermeer, 1. Feussner, A. Kolbe, G.A. Veldink, J.F. Vliegenthart // Biochem Biophys Res Commun.- 2000. V. 277. - P. 112-116.

111. Noordermeer, M.A. Fatty acid hydroperoxide lyase: a plant cytochrome P450 enzyme involved in wound healing and pest resistance / M.A. Noordermeer, G.A. Veldink, J.F. Vliegenthart // ChemBioChem. 2001. - V. 2. - P. 494504.

112. Ogliaro, F. The 'push' effect of the thiolate ligand in cytochrome P450: a theoretical gauging / F. Ogliaro, S.P. de Visser, S. Shaik // J. Inorg. Biochem.- 2002. — V. 91. -P. 554-567.

113. Oh, K. Design and synthesis of novel imidazole derivatives as potent inhibitors of allene oxide synthase (CYP74) / K. Oh, N. Murofushi // Bioorganic and Medicinal chemistry. 2002. - V. 10. - P. 3707-3711.

114. Oldham, M.L. The structure of coral allene oxide synthase reveals a catalase adapted for metabolism of a fatty acid hydroperoxide / M.L. Oldham, A.R. Brash, M.E. Newcomer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102(2) -P. 297-302.

115. Omura, Т. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. evidence for its hemoprotein nature / T. Omura, R. Sato // J. Biol. Chem. 1964. -V. 239.-P. 2370-2378.

116. Ortiz de Montellano, P.R. Inhibition of cytochrome P450 enzymes / P.R. Ortiz de Montellano, M.A. Correia // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (2nd ed.) / P.R. Ortiz de montellano. NY: Plenum Press, 1995. - P. 305-364.

117. Partridge, M. Roles of a membrane-bound caleosin and putative peroxygenase in biotic and abiotic stress responses in Arabidopsis / M. Partridge, D.J. Murphy // Plant Physiology and Biochemistry. 2009. - V. 47. - I. 9. - P. 796806.

118. Pena-Cortes, H. Aspirin prevents wound-induced gene-expression in tomato leaves by blocking jasmonic acid biosynthesis / H. Pena-Cortes, T. Albrecht, S. Prat, E.W. Weiler, L. Willmitzer//Planta. 1993. - V. 191. - P. 123-128.

119. Picado-Leonard, J. Homologous sequences in steroidogenic enzymes, steroid receptors and a steroid binding protein suggest a consensus steroid-bindingsequence / J. Picado-Leonard, W.L. Miller // Mol. Endocrinol. 1988. - V. 2. -P. 1145-1150.

120. Podust, L.M. Crystal structure of cytochrome P450 14a-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors / L.M. Podust, T.L. Poulos, M.R. Waterman // Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. -V. 98.-P. 3068-3073.

121. Pompon, D. Protein engineering by cDNA recombination in yeasts: shuffling of mammalian cytochrome P-450 functions / D. Pompon, A. Nicolas // Gene (Amst.). 1989. - V. 83. - P. 15-24.

122. Poulos, T.L. The 2.6-A crystal structure of Pseudomonas putida cytochrome P-450 / T.L. Poulos, B.C. Finzel, I.C. Gunsalus, G.C. Wagner, J. Kraut // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 16122-16130.

123. Poulos, T.L. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam / T.L. Poulos, B.C. Finzel, A.J. Howard // J. Mol. Biol. 1987. - V. 195. - P. 687700.

124. Poulos, T.L. Structures of cytochrome P450 enzymes / T.L. Poulos, E.F. Johnson // Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry (3d ed.) / P.R. Ortiz de montellano NY: Plenum Press, 2005 - P. 87-114.

125. Prost, I. Evaluation of the antimicrobial activities of plant oxylipins supports their involvement in defense against pathogens /1. Prost, S. Dhondt, G. Rothe, J. Vicente, MJ. Rodriguez et al. II Plant Physiol. 2005. - V. 139. - P. 19021913.

126. Quackenbush, J. Microarray data normalization and transformation / Nature Genetics Supp. 2002. - V. 32. - P. 496-501.

127. Reymond, P. Jasmonate and salicylate as global signals for defense gene expression / P. Reymond, E.E. Farmer // Curr. Opin. Plant Biol. — 1998. — V. 1. p. 404-411.

128. Rensing, S.A. The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants / S.A. Rensing, D. Lang, A.D. Zimmer, A. Terry, A. Salamov et al. II Science. 2008. - V. 319. - P. 64-69.

129. Rosahl, S. Oxylipins / S. Rosahl, I. Feussner // Plant lipids: biology, utilization and manipulation / J. Murphy. Boca Raton: CRC Press LLC, 2000. - P. 329-354.

130. Rowland, P. Crystal structure of human cytochrome P450 2D6 / P. Rowland, F.E. Blaney, M.G. Smyth, J.J. Jones, Y.R. Leydon et al. II The Journal of Biological Chemistry. 2006. - V. 281.-P. 7614-7622.

131. Sakaki, T. Expression in Saccharomyces cerevisiae of chimeric cytochrome P450 cDNAs constructed from cDNAs for rat cytochrome P450c and P450d / T. Sakaki, M. Shibata, Y. Yabusaki, H. Ohkawa // DNA and Cell Biology. -1987.-V. 6.-P. 31-39.

132. Saniewski, M. Relationship between stimulatory effect of methyl jasmonate on ethylene production and content in tomatoes / M. Saniewski, J. Czapski, J. Nowacki // Biol Plant. 1987a. - Y. 29. - P. 17-21.

133. Saniewski, M. The effect of methyl jasmonate on ethylene and 1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid production in apple fruits / M. Saniewski, J. Czapski, J. Nowacki, E. Lange // Biol Plant. 1987b. - V. 29. - P. 199-203.

134. Schalk, M. A single amino acid substitution (F363I) converts the regiochem-istry of the spearmint (2)-limonene hydroxylase from a C6- to a C3hydroxylase / M. Schalk, R. Croteau // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. -V. 97.-P. 11948-11953.

135. Schaller, F. Enzymes of octadecanoid biosynthesis in plants. 12-oxo-phytodienoate 10,11-reductase / F. Schaller, E.W. Weiler // Eur. J. Biochem. 1997a. - V. 245. - P. 294-299.

136. Schlichting, I. The catalytic pathway of cytochrome P450cam at atomic resolution / I. Schlichting, J. Berendzen, K. Chu, A.M. Stock, S.A. Maves et al. И Science. 2000. - V. 287. - P. 1615-1622.

137. Schoch, G.A. Structure of human microsomal cytochrome P450 2C8. Evidence for a peripheral fatty acid binding site / G.A. Schoch, J.K. Yano, M.R. Wester, K.J. Griffin, C.D. Stout, E.F. Johnson // J. Biol. Chem. 2003. - V. 279.-P. 9497-9503.

138. Schreier, P. Separation, partial purification, and characterization of a fatty acid hydroperoxide cleaving enzyme from apple and tomato fruits / P. Schreier, G. Lorenz, // Z. Naturforsch. 1982. - V. 37 C. - P. 165-173.

139. Shibata, Y. Purification and properties of fatty acid hydroperoxide lyase from green bell pepper fruits / Y. Shibata, K. Matsui, T. Kajiwara, A. Hatanaka // Plant Cell Physiol. 1995. - V. 36. - P. 147-156.

140. Sivasankar, S. Expression of allene oxide synthase determines defense gene activation in tomato / S. Sivasankar, B. Sheldrick, S.J. Rothstein // Plant Physiol. 2000.-V. 122.-P. 1335-1342.

141. Song, W.C. Purification of an allene oxide synthase and identification of the enzyme as a cytochrome P-450 / W.C. Song, A.R. Brash // Science — 1991. -V. 253.-P. 781-784.

142. Song, W.C. Formation of epoxyalcohols by a purified allene oxide synthase. Implications for the mechanism of allene oxide synthesis / W.C. Song, S.W. Baertschi, W.E. Boeglin, T.M. Harris, A.R. Brash // J Biol Chem. 1993a. -V. 268.-P. 6293-6298.

143. Song, W.C. Molecular cloning of an allene oxide synthase — a cytochrome-P450 specialized for the metabolism of fatty acid hydroperoxides / W.C. Song, C.D. Funk, A.R. Brash // Proc. Natl Acad Sci USA. 1993b. - V. 90. -P.8519-8523.

144. Stenzel, I. Jasmonate biosynthesis and the allene oxide cyclase family of Arabidopsis thaliana / I. Stenzel, B. Hause, O. Miersch, T. Kurz, H. Maucher et al. II Plant Mol. Biol. 2003. - V. 51. - P. 895-911.

145. Stintzi, A. Plant defense in the absence of jasmonic acid: The role of cyclo-pentenones / A. Stintzi, H. Weber, P. Reymond, J. Browse, E.E. Farmer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. V. 98.-P. 12837-12842.

146. Stumpe, M. A pathogen-inducible divinyl ether synthase (CYP74D) from eli-citor-treated potato suspension cells / M. Stumpe, R. Kandzia, C. Gobel, S. Rosahl, I. Feussner // FEBS Lett. 2001. - V. 507. - P. 371 -376.

147. Stumpe, M. Formation of oxylipins by CYP74 enzymes / M. Stumpe, I. Feussner // Phytochemistry Review. 2006. - V. 5. - P. 347-357.

148. Stumpe, M. Biosynthesis of C9-aldehydes in the moss Physcomitrella patens / M. Stumpe, J. Bode, C. Gobel, T. Wichard, A. Schaaf et al. II Biochim Biophys Acta. 2006a. - V. 1761.-P. 301-312.

149. Ueda, J. Isolation and identification of a senescence-promoting substance from wormwood {Artemisia absinthium L.) / J. Ueda, J. Kato // Plant Physiol. 1980. - V. 66. - P. 246-249.

150. Uno, T. Identification of regions functioning in substrate interaction of rabbit liver cytochrome P-450 (laurate (omega-l)-hydroxylase) / T. Uno, Y. Imai // J. Biochem. (Tokyo) 1989. - V. 106. - P. 569-574.

151. Tijet, N. Allene oxide synthases and allene oxides / N. Tijet, A.R. Brash // Prostaglandins Lipid Mediators. 2002. - V. 68-69. - P. 423-431.

152. Tuck, S.F. The cytochrome P450 1A2 active site: topology and perturbations caused by glutamic acid-318 and threonine-319 mutations / S.F. Tuck, K. Hi-roya, T. Shimizu, M. Hatano, P.R. Ortiz de Montellano // Biochemistry. -1993. V. 32. - P. 2548-2553.

153. Turner, J.G. The jasmonate signal pathway / J.G. Turner, C. Ellis, A. Devoto // Plant Cell. 2002. - V. 14.-P. 153-164.

154. Veldink, G.A. Plant lipoxygenases / G.A. Veldink, J.F.G. Vliegenthart, J. Boldingh//Prog. Chem. Fats Other Lipids. 1977. - V. 15.-P. 131-166.

155. Vick, B.A. Lipoxygenase and hydroperoxide lyase in germinating watermelon seedlings / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1976. - V. 57. - P. 780-788.

156. Vick, B.A. Thermal alteration of a cyclic fatty acid produced by a flaxseed extract / B.A. Vick, D.C. Zimmerman, D. Weisleder // Lipids. 1979. - V. 14.-P. 734-740.

157. Vick, B.A. Formation of 12-18-0.oxo-c/s-10, cis-\5-phytodienoic acid from 13[18-0]hydroperoxylinolenic acid by hydroperoxide cyclase / B.A. Vick, P. Feng, D.C. Zimmerman // Lipids. 1980. - V. 15. - P. 468-471.

158. Vick, B.A. Lipoxygenase, hydroperoxide isomerase and hydroperoxide cyclase in young cotton seedlings / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1981.-V. 67.-P. 92-97.

159. Vick, B.A. Biosynthesis of jasmonic acid by several plant species / B.A. Vick, D.C. Zimmerman//Plant Physiol. 1984. - V. 75.-P. 458-461.

160. Vick, B.A. Pathways of fatty acid hydroperoxide metabolism in spinach leaf chloroplasts / B.A. Vick, D.C. Zimmerman // Plant Physiol. 1987. - V. 85. -P. 1073-1078.

161. Vidi, P.A. Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles / P.A. Vidi, M. Kan-wischer, S. Baginsky, J.R. Austin, G. Csucs et al. II J. Biol. Chem. — 2006. — V. 281.-P. 11225-11234.

162. Weber, H. Divinyl ether fatty acid synthesis in late blightdiseased potato leaves / H. Weber, A. Chetelat, D. Caldelari, E.E. Farmer // Plant Cell. -1999.-V. 11. — P.485-493.

163. Weichert, H. Metabolic profiling of oxylipins upon salicylate treatment in barley leaves—preferential induction of the reductase pathway by salicylate(l)

164. H. Weichert, I. Stenzel, E. Berndt, C. Wasternack, I. Feussner // FEBS Lett. 1999.-V. 464.-P. 133-137.

165. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450: a success story / D. Werck-Reichhart, R. Feyereisen // Genome Biol. 2000. - V. 1. - P. 1 -7.

166. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance / D. Werck-Reichhart, A. Hehn, L. Didierjean // Trends Plant Sci. 2000. - V. 5.-P. 116-123.

167. Werck-Reichhart, D. Cytochromes P450 / D. Werck-Reichhart, S. Bak, S. Pa-quette // The Arabidopsis Book / C.R. Somerville, E.M. Meyerowitz. Rock-ville, MD: American Society of Plant Biologists, 2002. - P. 1-28.

168. Williams, P.A. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity / P.A. Williams, J. Cosme, V. Sridhar, E.F. Johnson, D.E. McRee // Mol. Cell. -2000a.-V. 5.-P. 121-131.

169. Williams, M. Lipoxygenase pathway in olive callus cultures (Olea europaea) / M. Williams, J.J. Salas, J. Sanchez, J.L. Harwood // Phytochemistry. — 2000b.-V. 53.-P. 13-19.

170. Xu, Y. Upregulation of a tonoplast-localized cytochrome P450 during petal senescence in Petunia inflata / Y. Xu, H. Ishida, D. Reisen, M.R. Hanson // BMC Plant Biol. 2006. - V. 6. - P. 8.

171. Yokoyama, M. Stress-induced factor involved in flower formation of Lemna is an a-ketol derivative of linolenic acid / M. Yokoyama, S. Yamaguchi, S. Inomata, K. Komatsu, S. Yoshida et al. II Plant Cell Physiol. 2000. - V. 41. -P. 110-113.

172. Ziegler, J. Purification and characterization of allene oxide cyclase from dry com seeds / J. Ziegler, M. Hamberg, O. Miersh, B. Parthier // Plant Physiol. -1997.-V. 114.-P. 565-573.

173. Ziegler, J. On the specificity of allene oxide cyclase / J. Ziegler, C. Waster-nack, M. Hamberg//Lipids. 1999.-V. 34.-P. 1005-1015.

174. Ziegler, J. Molecular cloning of allene oxide cyclase. The enzyme establishing the stereochemistry of octadecanoids and jasmonates / J. Ziegler, I. Sten-zel, B. Hause, H. Maucher, M. Hamberg et al. II J. Biol. Chem. 2000. - V. 275.-P. 19132-19138.efi