Жизнеспособность природных микробных сообществ в условиях моделирования параметров инопланетных грунтов и открытого космоса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Чепцов Владимир Сергеевич

• Чепцов Владимир Сергеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Чепцов Владимир Сергеевич

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Космические условия и гипотеза транспермии

2.2. Основные факторы среды на Марсе

2.3. Воздействие радиации на живые организмы

2.3.1. Общие закономерности воздействия излучения

2.3.2. Факторы, модифицирующие действие радиации

2.3.3. Воздействие радиации на микроорганизмы и микробные сообщества

2.4. Температурные пределы сохранения микроорганизмами жизнеспособности и метаболической активности

2.5. Влияние низкого давления на микроорганизмы

2.6. Влияние УФ-излучения на микроорганизмы

2.7. Краткий обзор результатов исследований комплексного воздействия астробиологических факторов на жизнеспособность микроорганизмов. Эксперименты в космосе и лабораторное моделирование

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Описание исследованных образцов

3.2. Облучение образцов

3.2.1. Облучение гамма-излучением в условиях низкого давления и низкой температуры

3.2.2. Облучение гамма-излучением в условиях, близких к нормальным

3.2.3. Облучение ускоренными электронами

3.3. Моделирование температурного цикла поверхности Марса и процесса сублимации подповерхностного льда

3.4. Экспонирование при низком давлении

2

3.5. Облучение УФ-излучением при низком давлении

3.6. Исследование состояния культур и сообществ

3.6.1. Учет численности культивируемых клеток

3.6.2. Эпифлуоресцентный анализ тотальной численности микроорганизмов (ЭФМ)

3.6.3. FISH-анализ структуры сообществ прокариот

3.6.4. Анализ функциональной активности микробных сообществ и чистых культур бактерий. Метод мультисубстратного тестирования (МСТ)

3.6.5. Исследование структуры бактериальных сообществ методом газо-хромато масс-спектрометрии (ГХ-МС) липидных маркеров

3.6.6. Идентификация чистых культур бактерий

3.6.6.1. МАЛДИ-ТОФ масс-спектрометрия

3.6.6.2. Анализ генов 16S рРНК

3.6.7. Молекулярно-филогенетические методы анализа структуры и биоразнообразия микробных сообществ

3.6.7.1. Молекулярное клонирование и рестрикционный анализ ПЦР-фрагментов

3.6.7.2. Высокопроизводительное секвенирование

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Влияние гамма-излучения и низкого давления на микробное сообщество почвы и на иммобилизованные культуры микроорганизмов в условиях варьирования температуры

4.2. Воздействие градиента дозы гамма-излучения (1-1000 кГр) в условиях низкого давления и низкой температуры на микробные сообщества аридных почв и мерзлых осадочных пород

4.2.1. Численность микроорганизмов

4.2.2. Функциональное состояние микробных сообществ

4.2.3. Исследование структуры микробных сообществ in situ методом ГХ-МС анализа липидных маркеров

4.2.4. Исследование структуры микробных сообществ in situ с применением методов молекулярного клонирования и рестрикционного анализа ПЦР-фрагментов

4.2.5. Исследование структуры микробных сообществ in situ с помощью высокопроизводительного секвенирования

4.2.6. Оценка воспроизводимости результатов лабораторного моделирования

4.3. Воздействие гамма-излучения в градиенте доз 143-1250 кГр на микробные сообщества почв в условиях близких к нормальным

4.3.1. Влияние облучения на численность микроорганизмов

4.3.2. Разнообразие культивируемых бактерий после облучения почвы

4.3.3. Функциональное состояние микробных сообществ

4.3.4. Исследование структуры микробных сообществ in situ методом ГХ-МС анализа липидных маркеров

4.3.5. Анализ возможных постэффектов воздействия на микробное сообщество излучения дозой 150 кГр

4.4. Воздействие ускоренных электронов (10 кГр, 100 кГр) в условиях низкого давления и низкой температуры на микробные сообщества аридных почв и мерзлых осадочных пород

4.4.1. Влияние облучения электронами на численность микроорганизмов в сероземе и древней арктической мерзлой породе

4.4.2. Метаболическая активность микробных сообществ

4.4.3. Биоразнообразие культивируемых бактериальных сообществ

4.5. Влияние градиента дозы гамма-излучения и ускоренных электронов, интенсивности гамма-излучения, низких температур и низкого давления на жизнеспособность культур микроорганизмов

4.6. Влияние градиента дозы гамма-излучения на жизнеспособность чистых культур микроорганизмов в условиях близких к нормальным

4.7. Моделирование сублимации подповерхностного льда через реголит

Марса

4.8. Влияние длительного экспонирования при низком давлении на состояние микробных сообществ и чистых культур микроорганизмов

4.9. Облучение УФ-излучением в условиях низкого давления

4.10. Расчет возможной длительности криоконсервации жизнеспособных микроорганизмов на различных телах Солнечной системы

4.11. Ограничения и допущения в модельных экспериментах

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

ПРИЛОЖЕНИЕ Б

ПРИЛОЖЕНИЕ В

ПРИЛОЖЕНИЕ Г

1. ВВЕДЕНИЕ

Жизнь на Земле, в соответствии с современными представлениями, существует в ограниченных пределах сбалансированного воздействия физико-химических факторов. Значительные изменения амплитуды воздействия того или иного фактора могут привести к коллапсированию биосистем вплоть до исчезновения жизни. Несмотря на давний научный интерес к проблеме устойчивости живой клетки к неблагоприятным воздействиям и многочисленные биологические исследования экстремальных местообитаний, вопрос о пределах жизнеспособности клетки в различных условиях остается открытым и в последние десятилетия приобрел масштаб астробиологической проблемы. Определение пределов устойчивости земных микроорганизмов к воздействию факторов внеземного пространства является одним из приоритетных направлений современных астробиологических исследований (Cockell et al., 2017; Horneck et al., 2016; Rummel, Conley, 2018). Большое внимание уделяется ионизирующей радиации (Moeller et al., 2017; Musilova et al., 2015) как одному из основных факторов, способных препятствовать сохранению и распространению жизни за пределами Земли. Среди физико-химических факторов природной среды обитания ионизирующее излучение, несомненно, имеет приоритетное значение, оказывая прямое воздействие на генетический материал живой клетки.

Воздействие ионизирующего излучения на организмы изучается давно, и радиобиология обобщает и продолжает накапливать опыт исследований по влиянию на клетки ионизирующей радиации в сравнительно невысоких дозах (Benhamda et al., 2015). Для планирования и проведения астробиологических планетных исследований необходимы оценки воздействия высоких доз различных видов радиации на микроорганизмы, адаптированные в естественной среде обитания. При этом задачи

астробиологии требуют дифференцированного рассмотрения

6

астробиологических моделей (Марс, ледовые спутники, Титан, Венера, кометы, экзопланеты) с учетом гипотетических моделей биосфер, потоков радиации и других данных планетологии, характеризующих природную среду. Доказано, что условия, при которых происходит воздействие облучения (температура, давление, и др.), существенно корректируют радиационные эффекты (Baumstark-Khan, Facius, 2002; Dartnell et al., 2010). Микроорганизмы, развивающиеся в природных гетерофазных минеральных средах (почвы, породы) хорошо защищены от стрессового воздействия физико-химических факторов. Опубликовано уже немало данных о повышенной устойчивости микроорганизмов к стрессу в составе биопленок или микробных сообществ in situ в среде обитания в сравнении с чистыми культурами (Vorobyova et al. 1996, 1997; Decho, 2000; El-Registan et al., 2006; Froesler et al., 2017). Следовательно, для корректной оценки радиорезистентности микроорганизмов земного типа в составе инопланетного грунта или другой среды обитания необходимо наиболее полное воспроизведение комплекса соответствующих физико-химических факторов при сохранении естественной среды, к которой адаптированы микробные сообщества. При этом для проведения модельных экспериментов могут быть использованы объекты, рассматриваемые как аналоги гипотетических внеземных экосистем ввиду сходства ряда физико-химических факторов среды. Такими природными объектами являются древние вечномерзые осадочные породы Арктики и Антарктики, почвы и породы пустынь, эвапориты, термальные местообитания и др. (Smith, McKay, 2005; Wierzchos et al., 2012; DiRuggiero et al., 2013; Parro et al., 2011; Preston, Dartnell, 2014).

В радиобиологических и астробиологических иследованях для моделирования космического излучения, как правило, используется гамма-излучение в связи с его высокой проникающей способностью, доступностью источников излучения и т.д. (Dartnell et al., 2010). Однако в составе

космического излучения гамма-излучение составляет небольшую часть. Различные виды ионизирующей радиации различаются по биологическому воздействию (Baumstark-Khan, Facius, 2002). Для астробиологического моделирования необходимы исследования in situ устойчивости природных сообществ микроорганизмов к различным видам космического излучения в условиях максимально приближенных к инопланетным моделям. Выяснение предельных доз, выявление наиболее устойчивых in situ микроорганизмов или их комплексов не только скорректирует задачи поиска, но, несмотря на условность экстраполяции расчетов на реальные условия, позволит оценить саму целесообразность поиска жизни на том или ином космическом объекте, что обусловливает актуальность исследования. Исследования в этом направлении необходимы не только для решения астробиологических задач, но, несомненно, внесут свой вклад в решение ряда экологических и биотехнологических проблем.

Цель исследования

Изучение воздействия ионизирующих излучений, ультрафиолетового излучения, температуры и низкого давления, как ключевых параметров инопланетных грунтов и открытого космоса, на естественные микробные сообщества и чистые культуры микроорганизмов.

Задачи исследования

1. Исследование жизнеспособности и физиологического отклика микроорганизмов и микробных сообществ почв и древней мерзлоты Земли при воздействии: высоких доз ионизирующего и УФ излучений, низкого давления, низких температур, а также комплексного воздействии ультрафиолетового излучения и вакуума;

2. Определение предела устойчивости микробных сообществ к воздействию гамма-излучения, оценка зависимости повреждений от

интенсивности и вида излучения, типа минеральной матрицы, исследование последействия радиации;

3. Оценка возможности функционирования микробных сообществ в условиях температурного режима, атмосферного давления и влажности поверхностного слоя марсианского реголита, а также времени сохранения потенциально жизнеспособных микроорганизмов на различных объектах Солнечной системы и в открытом космосе;

4. Создание коллекции устойчивых микроорганизмов.

Научная новизна

В ходе исследования впервые выявлены пределы устойчивости земных микроорганизмов при воздействии ряда наиболее существенных космических факторов. Исследование позволяет прогнозировать возможность формирования инопланетных биосфер земного типа и потенциальную продолжительность сохранения жизнеспособности микроорганизмов в инопланетных условиях и в открытом космосе, что вносит вклад в фундаментальные научные представления о возможностях появления жизни на планетах и ее распространении в космосе. Создана коллекция микроорганизмов, обладающих высокой устойчивостью к совокупному воздействию космических факторов.

Практическая значимость

Прогнозирование биологической эволюции планетных тел необходимо для планирования астробиологических миссий, выбора мест для посадочных модулей, создания и выбора необходимого оборудования. Коллекция микроорганизмов устойчивых к условиям космоса и инопланетной среде имеет ценность как для разработки протоколов космического карантина, так и для развития биотехнологий, в том числе космических. Результаты

исследования могут быть применены также при прогнозировании отклика естественных микробных биосистем в случае техногенного радиационного загрязнения окружающей среды.

Положения, выносимые на защиту

1) Впервые показано, что естественные микробные сообщества экстремальных местообитаний Земли способны выдерживать воздействие ионизирующей радиации в сверхвысоких дозах: при нормальных условиях -не менее 430 кГр, а в условиях низкого давления и низкой температуры - не менее 1 МГр. При воздействии экстремальных факторов сохраняется высокая численность жизнеспособных клеток, метаболическая активность и высокое биоразнообразие при частичной перестройке таксономической структуры сообществ;

2) Показано, что бактерии имеют значительно более высокую радиорезистентность in situ в естественной среде обитания по сравнению с их устойчивостью в чистой культуре. Благодаря протекторным свойствам природной среды и внутри- и межпопуляционным взаимодействиям даже радиочувствительные микроорганизмы, находясь в составе природных микробных сообществ, способны выдерживать воздействие высоких доз ионизирующей радиации;

3) Впервые показано, что природные микробные сообщества без существенных потерь выдерживают воздействие ионизирующего излучения в сочетании с низкими температурами и низким давлением в дозах, обеспечивающих потенциальную возможность выживания экосистем земного типа в поверхностном слое марсианского реголита в течение не менее 13 млн. лет и в течение не менее 200 млн. лет на глубине 5 м, в открытом космосе в составе метеоритов в течение не менее 4 млн. лет, во льду спутника Юпитера Европы на глубине 10 см в течение не менее ~ 2 тыс. лет;

4) Естественные микробные сообщества экстремальных местообитаний Земли способны выдерживать длительное воздействие низкого давления, в том числе, в сочетании с воздействием ультрафиолетового излучения, сохраняя высокую численность живых клеток и биоразнообразие. Показано, что низкое давление воздействует на природные биосистемы, вызывая в них активный метаболический отклик и адаптивную реакцию;

5) Сублимация подповерхностного льда может являться источником жидкой воды в верхнем слое марсианского реголита и обеспечивать возможность нормального функционирования сообществ земного типа.

Личный вклад автора

Работа является результатом оригинальных исследований. Автор принимал участие в определении направлений исследований, разработке схем экспериментов, обработке данных, обсуждении полученных результатов и подготовке публикаций. Основные экспериментальные результаты получены лично автором.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Жизнеспособность природных микробных сообществ в условиях моделирования параметров инопланетных грунтов и открытого космоса»

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих всероссийских и международных конференциях: 1-ая Всероссийская конференциия "Астробиология: от Происхождения Жизни к Жизни во Вселенной" (Пущино, Московская обл., 2012), The Fourth Moscow Solar System Symposium (Москва, 2013), 13th European Workshop on Astrobiology - EANA'13 (Шецин, Польша, 2013), Международная Конференция «Криология Земли: XXI век» (Пущино, Московская обл., 2013), Биология - наука XXI века: 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, Московская обл., 2013), XX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых

ученых "Ломоносов-2013" (Москва, 2013), XVII Докучаевские молодежные чтения «Новые вехи в развитии почвоведения: современные технологии как средства познания» (Санкт-Петербург, 2014), Круглый стол "Актуальные проблемы общей и космической радиобиологии и астробиологии" (Дубна, Московская обл., 2014), The Fifth Moscow Solar System Symposium (Москва,

2014), EXTREMOPHILES 2014: 10th International Congress on Extremophiles (Санкт-Петербург, 2014), 40th COSPAR Scientific Assembly (Москва, 2014), Современные направления в радиобиологии и астробиологии. Молекулярные, генетические, клеточные и тканевые эффекты (Дубна, Московская обл., 2015), The Sixth Moscow Solar System Symposium (Москва,

2015), Permafrost in XXI century: basic and applied researches (Пущино,

Московская обл., 2015), Современные аспекты сельскохозяйственной

микробиологии (Москва, 2016), Земля на ранних этапах развития Солнечной

системы (Москва, 2016), Микробные сообщества в эволюции биосферы с

древнейших времен до наших дней (Москва, 2016), Актуальные проблемы

радиобиологии и астробиологии. Генетические и эпигенетические эффекты

ионизирующих излучений (Дубна, Московская обл., 2016), XI

Международная школа-конференция с международным участием

"Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2016), The

Seventh Moscow Solar System Symposium (Москва, 2016), 2-я Всероссийская

конференция по астробиологии: «Жизнь во Вселенной: физические,

химические и биологические аспекты» (Пущино, Московская обл., 2016), The

Eighth Moscow Solar System Symposium (Москва, 2017), EANA 2017 European

Astrobiology Network Association (Орхус, Дания, 2017), Earth's Cryosphere:

Past, Present and Future (Пущино, Московская обл., 2017), Вторая открытая

конференция молодых ученых Почвенного института имени В.В. Докучаева

«Почвоведение: горизонты будущего. 2018» (Москва, 2018), XXXVII Annual

Meeting of the European Culture Collections' Organisation Conference (Москва,

2018), EANA 2018 European Astrobiology Network Association (Берлин,

Германия, 2018), The Ninth Moscow Solar System Symposium (Москва, 2018),

12

Эволюция биосферы с древнейших времен до наших дней (Москва, 2018), Проект МГУ «Ноев ковчег»: вчера, сегодня, завтра (Москва, 2018), III Молодежная конференция «Почвоведение: Горизонты будущего» (Москва, 2019).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 51 работа: 12 статей в рецензируемых научных изданиях, индексируемых международными базами данных (Web of Science, Scopus) и/или рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных работ, 1 глава в коллективной монографии, 1 статья в сборнике, 37 публикаций в сборниках материалов и тезисах докладов на российских и международных научных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из 7 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит 69 рисунков, 20 таблиц и 4 приложения. Список литературы включает 332 источника, из них 50 на русском и 282 на иностранных языках.

Благодарности

Автор глубоко признателен своему первому научному руководителю Воробьевой Е.А. за выбор тематики исследований, определивший научный путь автора, а также за помощь и поддержку на всех этапах работы. Автор благодарен своим научным руководителям Манучаровой Н.А и Звягинцеву Д.Г. за ценные советы и содействие в работе. Автор выражает благодарность Булату С.А. за неоценимую помощь в проведении молекулярно -биологических анализов, за обучение ряду молекулярно-биологических

методов, за ценные советы о дизайне экспериментов и публикации научных результатов. Автор признателен Павлову А.К. за создание уникального оборудования, без которого выполение основных экспериментов было бы невозможно; Белову А.А. - за постоянную поддержку и помощь в работе; Осипову Г.А. - за помощь в проведении ГХ-МС анализа липидов; Горленко М.В. - за помощь в проведении мультисубстратного тестирования; Полянской Л.М. - за обучение эпифлуоресцентной микроскопии; Коцюрбенко О.Р, Конраду Р., Климиной К.М., Дениэлу Р. и Наке Х. - за помощь в проведении высокопроизводительного секвенирования и анализе данных; Ломасову В.Н. - за содействие в проведении ряда экспериментов по облучению; Розановой М.С. - за проведение химического анализа исследованных образцов. Автор глубоко признателен коллегам, друзьям и близким за неоценимую помощь и поддержку на всем протяжении работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Космические условия и гипотеза транспермии

В условиях открытого космоса давление составляет в среднем 10-14 Па. Вблизи Земли из-за дегазации (истечения газов из атмосферы в окружающий космос) давление значительно выше - от 10-4 до 10-6 Па. Основными компонентами разреженного газа являются молекулы кислорода и азота, а также высоко реакционноспособные атомарные кислород и азот (Nicholson et al., 2000). Радиационный климат в пределах Солнечной системы складывается из галактической и собственно солнечной составляющей. Галактическое излучение, попадающее в солнечную систему, состоит в основном из протонов (85%), электронов, альфа-частиц (14%) и так называемых тяжелых заряженных частиц - ускоренных ионов элементов с зарядом более 2 (1%). Спектр заряженных частиц, излучаемых с солнечным ветром и во время вспышек на солнце, состоит из протонов (90-95 %), от 5 до 10 процентов составляют альфа-частицы и также присутствует незначительное количество более тяжелых ионов (Nicholson et al., 2000; Horneck et al., 2002; 2010). Спектр электромагнитного излучения солнца достаточно широк: от коротковолнового рентгеновского излучения до радиочастотного диапазона. Количество энергии, переносимой солнечным светом, относительно постоянно и на околоземной орбите составляет 1360 Вт/м2. Из этого 45% приходится на долю инфракрасного излучения, 48% на видимый диапазон и только 7% составляет ультрафиолетовое излучение (Nicholson et al., 2000).

Температура тела в космическом пространстве определяется поглощением и излучением энергии, которое зависит от положения тела относительно солнца и других объектов, а также от его поверхности, массы, размера и альбедо (отражающей способности). На орбите Земли поступление энергии определяется солнечным излучением (1360 Вт/м2), излучением,

отраженным от поверхности Земли (480 Вт/м2) и излучением самой Земли (230 Вт/м2). Объект, находящийся на орбите, периодически оказывается в планетарной тени. Таким образом, в зависимости от положения и скорости вращения, колебания температуры объекта могут достигать весьма значительных величин (Horneck et al., 2002; Nicholson et al., 2000).

Гипотетический перенос микроорганизмов в космическом пространстве, транспермия или панспермия, и его роль в происхождении земной жизни зависит от способности микроорганизмов пережить такое путешествие. Маловероятно, чтобы индивидуальные клетки могли избежать силы тяжести планеты или пережить радиацию, вакуум или прохождение через планетарную атмосферу. Однако, по современным оценкам, приблизительно одна тонна марсианской породы, выброшенной в результате бомбардировки планеты кометами и метеоритами, прибывает на Землю каждый год в форме метеоритов (Gladman, 1997). Действительно, приблизительно тридцать метеоритов идентифицированы как имеющие марсианское происхождение (Meyer, 2002; Nyquist et al., 2001), и они, очевидно, представляют только малую часть переданной с Марса на Землю породы. Кроме того, известно, что около 40 000 тонн межпланетных частиц пыли поступает в атмосферу Земли каждый год (Love, Brownlee, 1993). Предполагается, что эти частицы были одним из источником предбиотического органического вещества на первобытной Земле (Flynn et al., 2000).

Хотя большая часть межпланетного материала, который прибывает на

Землю, провела несколько миллионов лет в космосе, полагают, что один из

107 прибывающих на Землю марсианских метеоритов совершил

межпланетное путешествие меньше, чем за год (Gladman, 1997;

Mileikowsky et al., 2000), и что каждый миллион лет приблизительно десять

метеоритов, более крупных, чем 100 г, доставлены с Марса на Землю за два

- три года (Gladman, 1997). Кроме того, рассчитано, что глобальная

16

бомбардировка планет в состоянии переместить куски породы с поверхности планеты, такой как Марс, на поверхность планеты, такой, как Земля, не нагревая их внутри до температур достаточно высоких, чтобы убить прокариотические или эукариотические микроорганизмы во время выброса с Марса или прохода через атмосферу Земли (Weiss et al., 2000; Mileikowsky et al., 2000; Belbruno et al., 2012). Альтернативно, пылевые частицы испытывают мягкое торможение при входе в верхние слои земной атмосферы, достигая поверхности планеты без чрезмерного нагревания (Anders, 1989).

Таким образом, предполагается, что микроорганизмы, населяющие породу, почву, или пыль, выброшенные в космическую среду в результате случайного воздействия, способны неопределенно долго сохранять жизнеспособность в космическом пространстве, вследствие чего появляется возможность передачи жизни с обитаемых планет на безжизненные планеты или их спутники (Clarke et al., 2013).

2.2 Основные факторы среды на Марсе

В настоящее время физические условия на Марсе довольно неблагоприятны для жизни (в сравнении с Землей). Средние годовые температуры на поверхности планеты около 180 К, максимальные летние температуры могут подниматься до 280-290 K, давление около 5.4 мбар, преимущественно углекислая атмосфера (Комаров, Исаев, 2010 ; Rummel et al., 2014).

Марс практически лишен магнитосферы (присутствуют только локальные магнитные поля), атмосфера тонкая и разреженная, поэтому поверхность Марса подвержена воздействию потоков УФ и ионизирующих излучений, в 10-20 раз более мощных, чем максимальные излучения на поверхности Земли (ESA, 1999; Dartnell et al., 2007; Pavlov et al., 2010; Hassler

et al., 2014). При этом наиболее губительным для потенциальных микроорганизмов является ультрафиолетовое излучение, однако оно поглощается первыми миллиметрами грунта (Pavlov et al., 2002). Рентгеновское же излучение в значительной мере поглощается атмосферой и также не является препятствием для существования жизни (Jain et al., 2012). Наибольшую опасность для потенциальной биосферы представляют галактические и солнечные космические лучи: интенсивность излучения на поверхности планеты по разным оценкам составляет от 0,76 Гр/год (Hassler et al., 2014) до 0,2 Гр/год (Pavlov et al., 2002), однако быстро снижается с глубиной. Фоновое излучение невелико и сравнимо с земным, порядка 0,5 мГр/год (Dartnell et al., 2007; Pavlov et al., 2002; UNSCEAR, 2008).

Следующим неблагоприятным для живых организмов фактором является присутствие в грунте Марса сильных окислителей - пероксидов и перхлоратов (Klein, 1977; NASA, 2008; Nicholson et al., 2012; Иванов, 2002). Однако подобные концентрации окислителей встречаются и в природных земных местообитаниях, населенных микроорганизмами ( Parro et al., 2011; Catling et al., 2010).

Одним из важнейших ресурсов для зарождения и поддержания жизни

является жидкая вода, однако вопрос о ее присутствии и распространенности

на Марсе является дискуссионным. В условиях низкого атмосферного

давления при колебаниях температуры вода переходит из твердого состояния

в газообразное и обратно, минуя жидкую фазу. На планете обнаружены

значительные залежи водяного льда: по различным оценкам, в Южной

полярной шапке содержится 3000-5000 км3 льда, содержание льда в грунте

южнополярной области - от 15 до 50% по массе, т.е. свыше 50% по объему

(Комаров, Исаев, 2010; Byrne et al., 2009). В основном, глубина залегания

грунтового льда варьирует от нескольких сантиметров до 1 метра (Boynton et

al., 2002; Feldman et al., 2002; Mitrofanov et al., 2002). Предполагается, что при

колебаниях температуры в процессе сублимации такого подповерхностного

18

льда возможно образование пленок жидкой воды на частицах реголита, что подтверждается результатами лабораторного моделирования (Pavlov et al., 2010). О возможности существования подобных пленок свидетельствует и распределение солей в грунте Марса (Cull et al., 2010). Кроме того, вероятно присутствие воды в виде рассолов (Renno et al., 2009; Davila et al., 2010) и в стеклообразном состоянии (Toner et al., 2014b). Кроме того, на поверхности Марса наблюдаются современные структуры, подобные потокам, которые вероятно формируются при участии жидкой воды (Chevrier et Rivera-Valentin, 2012; Kereszturi et Rivera-Valentin, 2012). Предполагается также, что сорбирование воды гигроскопичными солями, в частности, перхлоратами, может быть источником воды, доступной для микроорганизмов (Nuding et al., 2017). Однако даже в случае реализации описанных процессов ресурсы жидкой воды на планете довольно ограничены.

Таким образом, на современном Марсе сформировался экстремальный для организмов земного типа комплекс условий: низкие температуры и давление, высокая интенсивность ионизирующего излучения, низкая доступность воды. Однако в ходе долговременной эволюции на планете были периоды с более благоприятной для жизни обстановкой (Fairen et al., 2010; Westall et al., 2013). Существует несколько точек зрения на изменения климата Марса (Wordsworth et al., 2011, 2013; Forget et al., 2013), однако ученые сходятся во мнении, что ранее на планете были постоянные водные потоки (Carr, 1995; Irwin et al., 2005; Hynek et al., 2010), озера (Fassett et al., 2008), возможно даже океан (Ivanov et al., 2014), а также существовали гидротермальные системы, в которых могло произойти зарождение жизни (NASA, 2010; Maarry et al., 2012; Osinski et al., 2013), и пригодные для обитания аналоги земных мерзлых пород (Fairen et al., 2010; Ulrich et al., 2012). Если в этот период (ранее чем 3.7-3.8 млрд. лет назад) на Марсе сформировалась биосфера, то есть вероятность, что она сохраняется до сих пор в анабиотическом состоянии, подобно земным сообществам,

населяющим мерзлоту Арктики и Антарктики (Beaty et al., 2005). При этом ключевым фактором, обусловливающим гибель клеток и деградацию биомолекул, будет являться ионизирующее излучение в связи с накоплением микробными клетками в анабиотическом состоянии радиационных повреждений в течение геологического времени (Pavlov et al., 2002; Stamenkovic et al., 2019).

2.3. Воздействие радиации на живые организмы

2.3.1. Общие закономерности воздействия излучения

Механизмы радиобиологических эффектов в облучённом организме наиболее полно раскрывает структурно-метаболическая теория (Кузин, 1981, 1988). Согласно структурно-метаболической теории (СМТ), при облучении первичные процессы возникают на молекулярном, субклеточном, клеточном, органном, тканевом и организменном уровнях. Реализация радиобиологических эффектов протекает в ходе взаимодействия нормальных процессов организма и процессов, вызванных облучением. Т.е. радиобиологические эффекты имеют многофакторный характер. Согласно СМТ, при воздействии ионизирующих излучений можно условно выделить три этапа:

а) первичное действие ионизирующего излучения на облучённую структуру;

б) действие радиации на клетки;

в) влияние радиации на целостный организм.

Развитие радиобиологических эффектов условно разделяют на четыре стадии:

1. Физическую - физическое взаимодействие, поглощение энергии излучения;

2. Стадию радиационно-химических процессов, включающую в себя образование свободных радикалов;

3. Стадию радиационного нарушения биохимических процессов;

4. Стадию ультраструктурных и видимых повреждений.

Первичное действие радиации бывает прямым и непрямым. Прямое действие ионизирующей радиации связано с поглощением энергии излучения молекулами организма, что приводит к ионизации атомов и молекул, а также может приводить к разрыву молекул. Непрямое действие радиации обусловлено образованием свободных радикалов. Наиболее важным источником радикалов является вода (Кузин, 1981, 1988; Баишв1агк-КИаи, ЕаешБ, 2002; НаШ^^П, Gutteгidge, 2015). При радиолизе воды образуются пероксид водорода (Н2О2*), атомарный водород (Н*), гидроксильный (ОН*) и гидропероксидный (НО2*) радикалы.

Свободные радикалы, взаимодействуя с биомолекулами, изменяют их структуру, что ведет к нарушению синтеза нуклеиновых кислот, снижению ферментативной активности, изменению проницаемости мембран и транспортных процессов в клетке. Повреждение структуры ДНК ведет к возникновению мутаций и нарушению синтеза белков (синтез белков с измененной структурой), следствием чего является образование вторичных радиотоксинов. При этом непрямое воздействие радиации вызывает до 90% от всех повреждений клетки (Корыстов, 1986; Baumstark-Khan, ЕасшБ, 2002; НаШ^^П, Gutteгidge, 2015).

2.3.2. Факторы, модифицирующие действие радиации

Условия, при которых проводится облучение, существенно влияют на возникновение повреждений в клетке. Ниже кратко рассмотрены основные факторы, модифицирующие эффект облучения, без обсуждения механизмов их действия, т.к. изучение этих механизмов не входит в задачи исследования.

Как указано выше, вклад непрямого действия ионизирующей радиации составляет до 90% от всех повреждений клетки при облучении (Корыстов, 1986; Baumstark-Khan, Facius, 2002; Halliwell, Gutteridge, 2015). Одним из наиболее важных источников свободных радикалов является вода. Следовательно, высушивание объекта снижает биологические повреждения (Bauermeister et al., 2011; Verseux et al., 2017). Однако вопрос о влиянии воды на степень лучевого поражения не исчерпывается проблемами прямого и косвенного действия радиации, где вода служит источником новых поражающих агентов, возникающих в результате радиолиза за счет энергии, поглощенной средой. Вода также может проявлять защитное действие при ее малом содержании в объекте (Эйдус, 1977).

Существенным фактором является концентрация кислорода в атмосфере, являющегося важным источником свободных радикалов, т.к. при облучении может проявляться «кислородный эффект». Кислородным эффектом, как правило, называют усиление радиационного повреждения при повышении концентрации кислорода в среде (Кудряшов, Беренфельд, 1982; Horneck et al., 2002). Возможно также и защитное действие кислорода -обратный кислородный эффект (Эйдус, 1972).

На распространение свободных радикалов в клетке (и, следовательно, на их способность вызывать биоповреждения) значительное влияние оказывает температура. Например, такие радикалы как ОН* и О2Н* при

температуре -196 °С не распространяются, их распространение становится существенным при температуре выше -153 °С (Dartnell et al., 2010).

Важным фактором является органоминеральный состав среды, в которой проводится облучение. Так, есть сведения о проявлении гумусовыми веществами протекторных свойств при облучении (Горовая, Скворцов, 1989). Другие же исследователи полагают, что, напротив, радиационные повреждения ниже при малом содержании органики (Stotzky, Mortensen, 1959).

Таким образом, воздействие радиации на биологические молекулы и организмы зависит не только от характеристик излучения и объекта, но и от ряда других факторов, которые следует принимать во внимание при постановке эксперимента и интерпретации результатов.

2.3.3. Воздействие радиации на микроорганизмы и микробные сообщества

К настоящему времени накоплен огромный фактический материал и установлен ряд общих закономерностей действия излучения на живые объекты (Бак, Александер, 1963; Коггл, 1986; Кузин, 1988; Кудряшов, 2004). Влияние ионизирующей радиации на микробные клетки детально рассмотрено в обзорах Ли (Lea,1955), Сокуровой (Сокурова, 1987), Бэка и Александера (Bacq, Alexander, 1961). На данный момент показано, что наиболее радиорезистентные виды бактерий в чистой культуре способны выдерживать воздействие доз излучения порядка 20-30 кГр (Battista et al., 1999; Ferreira et al., 1999; Rainey et al., 2005; Cox, Battista, 2005; Musilova et al., 2015), а при понижении температуры во время облучения вплоть до 80 кГр (Dartnell et al., 2010). Более того, микроорганизмы способны увеличивать радиорезистентность при воздействии сублетальных доз излучения (Harris et al., 2009; Tesfai et al., 2011). При этом бактерии обладают несколькими

различными механизмами, обусловливающими их устойчивость к облучению (Cox, Battista, 2005). Показано, что радиорезистентность микроорганизмов связана с устойчивостью к воздействию других стрессовых факторов и главным образом определяется устойчивостью к окислительному стрессу и способностью к репарации ДНК (Auerbach, 1976; Рокитко, 2003; Wassmann et al., 2010).

Устойчивость естественных микробных сообществ к воздействию ионизирующего излучения менее изучена. Гамма-излучение используется в ряде случаев для стерилизации почв, однако немногочисленные данные о стерилизующих дозах противоречивы, а условия, способствующие высокой устойчивости микроорганизмов, остаются невыясненными (McNamara et al., 2003).

Показано, что грибы более чувствительны к воздействию радиации и в

некоторых почвах полностью элиминируются дозами 1 - 10 кГр, однако

достоверно предел их устойчивости не определен (Shields et al., 1961; Johnson

and Osborne, 1964; Thompson, 1990; Brown, 1981; Sheremata et al., 1997). Так,

недавно было продемонстрировано, что микромицет Cryomyces antarcticus в

чистой культуре способен выдерживать облучение гамма-излучением в дозах

до 117 кГр (Pacelli et al., 2017). Данные об устойчивости бактериальных

сообществ также значительно различаются. По данным Денисовой с соавт.

(Денисова и др., 2005), репродуцирующее сообщество чернозема

обыкновенного подавлялось дозой 20 кГр, такая же доза полностью

стерилизовала дерново-подзолистую почву. Аналогичные данные получили

S.C. Lopez, N.O. Barbara (1988) при гамма-облучении некоторых

субтропических почв дозой 25 кГр. Для других почв элиминация

репродуцирующих бактерий наблюдалась под влиянием доз 15-25 кГр

(McNamara et al„ 2003), 40 кГр (Skyring, Thompson, 1966), 50 кГр (Sheremata

et al., 1997). Бактерии в торфяных почвах выдерживают воздействие доз до

75 кГр (Yardin et al., 2000). При этом большинство авторов отмечает

24

снижение биоразнообразия после облучения, смену доминант в микробном сообществе, как in situ (McNamara et al., 2007; El-Sayed, Ghanem, 2009), так и при культивировании (Денисова, 2011). Однако некоторые сообщества способны сохранять свою структуру (El-Sayed, Ghanem, 2009). В ряде работ показана возможность восстановления микробного разнообразия и численности после воздействия высоких доз ионизирующего излучения, отмечено стимулирующее воздействие облучения низкими дозами (Denisova et al., 2007; McNamara et al., 2007). Интересны работы Питонцо с соавторами (Pitonzo et al., 1999). Показано, что при воздействии дозой 2.33 кГр практически все микроорганизмы переходили в некультивируемое состояние. В работе изучали возможность выхода микробов из некультивируемого состояния после облучения гамма-лучами дозой от 2.33 до 9.34 kGy включительно. После выдерживания облученных образцов при пониженной температуре 4°С в течение 2 месяцев на питательную среду удавалось выделить 9 из 26 штаммов бактерий, выделяемых из контрольного (необлученного) образца, т.е. вновь перевести эти популяции в репродуктивное состояние.

Следует отметить, что в подавляющем большинстве работ по изучению воздействия высоких доз радиации на микробные сообщества обнаружение жизнеспособных клеток проводилось только методом посева. Однако в условиях стресса микроорганизмы могут прекращать процессы, связанные с ростом и размножением и образовывать некультивируемые и покоящиеся формы (El-Registan et al., 2006; Pitonzo et al., 1999). В таком случае они могут не выявляться методом посева, и переход сообщества в некультивируемое состояние может быть ошибочно воспринят как его гибель, а величина стерилизующей дозы радиации может быть занижена.

Проведен ряд работ по изучению воздействия хронического

ионизирующего излучения на почвенные организмы. Романовская с

соавторами (Романовская и др., 1996, 1999) изучали изменение состава

25

микробного сообщества почв вследствие радиационного поражения территории в непосредственной близости от ЧАЭС. В одной из работ (Романовская и др., 1999) авторы приводят данные по воздействию УФ -излучения на микробные сообщества почв, экстраполируя полученные результаты на ионизирующее излучение как идентично действующий на клетки фактор. Последнее мотивируется тем, что механизмы репарации повреждений в клетках при воздействии этих двух видов излучения аналогичны или подобны (Ауэрбах, 1989). Показано, что как после УФ облучения почвенных образцов, так и при хроническом воздействии радиации на почву, в них снижается общая численность бактерий и уменьшается количество доминантных видов, т.е. облучение приводит к снижению бактериального разнообразия. Вместе с тем, в облученных образцах выявляются новые малочисленные виды. Уменьшение численности доминантных видов на два и более порядка приводит к тому, что создаются условия для роста тех видов, которые численно уступают доминантам. В результате начинают проявляться устойчивые микроорганизмы, которые в исходных образцах и фоновых почвах представляют минорные виды (Романовская и др., 1999; Рокитко, 2003). В работе делается предположение о большей радиорезистентности пигментированных штаммов по аналогии с их резистентностью к УФ облучению. Аналогичные результаты получены и в ряде работ других авторов по изучению воздействия хронического ионизирующего излучения на микробные сообщества (Панахова и др., 2011; Ishii et al., 2011).

При воздействии ионизирующего излучения в почве могут происходить некоторые физические и химические изменения (McLaren, 1969; McNamara et al., 2003). В облученных почвах возрастает количество растворимого азота, причем большая часть его, по-видимому, имеет биологическое происхождение (Cawse,1971). Изменяется содержание подвижного марганца, серы и др. На содержание гумуса в почве излучение,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чепцов Владимир Сергеевич, 2019 год

^ „ -

о 7.5 а в ■а

§ 7.0

5 6.5

6.0

Число КОЕ на среде ГПД

Число КОЕ на среде И2Л

Общая численность прокариот (ЭФМ)

S1, Контроль S1, 1.4 Па, 75 сут.

а

-

Z

^вд -J

н о

5

6

« »

о &

с

■а н

SJ

о =

=

и

П

SJ

S

V

9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0

т

.. 1'

с ■■ 1

Число КОЕ на среде ГПД

Число КОЕ на среде И2Л

Общая численность прокариот (ЭФМ)

A-6/99-6, A-6/99-6, 1.4 Контроль Па, 75 сут.

б

Рисунок 56. Влияние экспонирования при низком давлении (1.4 Па, 75 сут.) на численность прокариот в образцах: а) аридной почвы, б) древней мерзлой породы. Планки погрешности обозначают доверительный интервал при р<0.05.

Таблица 19. Изменение параметров функционального разнообразия микробных сообществ антарктической мерзлой осадочной породы (образец А-6/99-6) и горной серо-коричневой почвы (образец Б1) после экспонирования при давлении 1.4 Па в течение 75 суток.

£

Образец Коэффициент рангового распределени спектров потребления субстратов, d Количество потребляемых субстратов, Удельная метаболическая работа, W Выравненность, Е Индекс Шеннона, Н Интегральный показатель общего благополучия системы, G

S1, Контроль 0.797 15 2007 0.970 3.79 40.0

81, 1.4 Па, 75 сут. 0.838 19 2130 0.981 4.17 48.2

А-6/99-6, Контроль 0.685 13 2040 0.972 3.60 40.4

А-6/99-6, 1.4 Па, 75 сут. 0.835 14 2224 0.985 3.75 35.7

Рисунок 57. Влияние экспонирования при давлении 1.4 Па в течение 75 сут. на потребление различных номинальных групп субстратов микробным сообществом аридной почвы. П - пентозы, Г - гексозы, О -олигосахара, С - спирты, АК - аминокислоты; СОК - соли органических кислот; ПМ - полимеры; ААН - амины, амиды, нуклеозиды.

ч

ш

X н

о 10

0

н

л

Q. н

и

Ю >

и си

X

01 е; ю 01

.

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

A-6/99-6, Контроль

A-6/99-6, 1.4 Па, 75 сут.

О

АК СОК ПМ ААН

0

П

Г

С

Рисунок 58. Влияние экспонирования при давлении 1.4 Па в течение 75 сут. на потребление различных номинальных групп субстратов микробным сообществом древней мерзлой породы. П - пентозы, Г - гексозы, О - олигосахара, С - спирты, АК - аминокислоты; СОК - соли органических кислот; ПМ - полимеры; ААН - амины, амиды, нуклеозиды.

Результаты ГХ-МС анализа структуры микробного сообщества в образце аридной почвы S1 после воздействия вакуума свидетельствуют о значительных изменениях структуры сообщества при сохранении исходного видового разнообразия. Существенно (в 4-100 раз) сократилась концентрация липидных маркеров доминирующих групп бактерий: Bifidobacterium, Dein.radiophilus/Methylococcus, E. moniliforme, E.nodatum, E.sabureum, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium OPA (рис. 59, 60). Концентрация липидных маркеров большинства субдоминантных и минорных групп микроорганизмов сохранилась на уровне контроля или немного снизилась (не более чем в 2 раза). Концентрации маркеров нескольких минорных групп микроорганизмов (Desulfovibrio, Actinomyces sp., Caulobacter, Deinococcus maricopensis/Pseudonocardia, Micrococcus/Arthrobacter, Enterobacteriaceae и Malassesia), напротив, увеличились в 1.5-3 раза, а степень доминирования этих микроорганизмов в сообществе возросла в 4-6 раз. Таким образом,

разнообразие липидных маркеров, обнаруженных в почвенном образце после экспонирования при низком давлении, было идентично таковому в контроле, однако общая концентрация обнаруженных маркеров снизилась в 2.5 раз, и наибольшее снижение наблюдалось для доминантных групп микроорганизмов.

100%

90%

80%

70%

к

£ 60% to

0 о.

1

I 50%

0 ч

и

1

01

40%

30%

20%

10%

0%

Bifidobacterium

Dein.radiophilus/Methylococcus

Eubacterium moniliforme, E.nodatum, E.sabureum

Propionibacterium freudenreichii

Clostridium omelianskii, C. Pasterianum, C. acetobutyricum Butyrivibrio 1-4-11

Desulfovibrio

Streptomyces-Nocardiopsis Rhodococcus equi Hymenobacter/FRB Actinomyces sp Bacillus

Eubacterium lentum Caulobacter Rhodococcus terrae Deinococcus

maricopensis/Pseudonocardia Nitrobacter, Hyphomicrobium, Xanthobacter Others

S1, Контроль

S1, 1.4 Па, 75 сут

Рисунок 59. Воздействие низкого давления (1.4 Па, 75 сут.) на структуру микробного сообщества горной серо-коричневой почвы (образец Б1).

Desulfovibrio Butyrivibrio 1-4-11 Clostridium OPA* Propionibacterium freudenreichii E. moniliforme, E.nodatum,. Dein.radiophilus/Methylococcus Bifidobacterium

A

S1, 1.4 Па, 75 сут. S1, Контроль

10 20 30

Численность бактерий, кл/г х105

40

0

Agrobacterium radiobacter Nitrobacter, Hyphomicrobium,..

Eubacterium C.perfringens Sphingobacterium spiritovorum Malassesia Cytophaga Xanthomonas Planta

Sphingomonas capsulata Streptococcus mutans Pseudomonas fluorescens Anabaena, Aphanizomenon, Microcystis Enterobacteriaceae Micrococcus/Arthrobacter Butyrivibrio 7S-14-3 Eucariotes Nocardia/Acetobacterium Actinomadura roseola Aeromonas hydrophila WARB*

Acetobacter-Rhodobacter group Aspergillus Mycobacterium 6bicTpopacT. Anabaena (cyanobacteria) Bacillus subtilis Nocardia carnea P.putida Deinococcus... Rhodococcus terrae Caulobacter Eubacterium lentum Bacillus Actinomyces sp Hymenobacter/FRB Rhodococcus equi Streptomyces-Nocardiopsis

Б

S1, 1.4 Па, 75 сут. IS1, Контроль

12 3 4

Численность бактерий, кл/г х105

0

5

Рисунок 60. Воздействие низкого давления (1.4 Па, 75 сут.) на концентрацию липидных маркеров различных групп микроорганизмов в образце горной серо-коричневой почвы (образец Б1): А - доминирующие популяции, Б - минорные популяции.

100%

90%

80%

к 5 I (б IQ

0 Q. 5

1 5

S

0 Ч и

1 Ol с Ol i-и

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

Nitrobacter

Methylococcus/Clostridium sp Butyrivibrio 1-4-11 Clostridium propionicum Rhodococcus terrae Aeromonas hydrophila Pseudomonas fluorescens Acetobacter + Cyanobacteria Enterococcus Sphingomonas capsulata Bacillus subtilis Rhodococcus equi Bacillus/Cellulomonas Pseudonocardia Ruminococcus Arthrobacter globiformis Mycobacterium Others

А-6/99-6, Контроль А-6/99-6, 1.4 Па, 75 сут.

Рисунок 61. Воздействие низкого давления (1.4 Па, 75 сут.) на структуру микробного сообщества антарктической мерзлой осадочной породы (А-6/99-6).

После длительного воздействия низкого давления структура микробного сообщества мерзлой породы также претерпела ряд изменений (по данным ГХ-МС липидов). Большинство субдоминантных и минорных групп бактерий снизили численность клеток в 1.2-4 раза (рис. 61, 62).

Arthrobacter globiformis, Pseudomonas putida, Bacteroides ruminicola и B. hypermegas/Selenomonas, обнаруженные в контрольном образце, не были идентифицированы после воздействия низкого давления. В то же время были обнаружены группы бактерий, не наблюдавшиеся в контроле (Peptostreptococcus, Nocardia, Butyrivibrio 7S-14-3, Mycobacterium, C. perfringens), однако концентрации липидных маркеров, характерных для них, были невелики. Наиболее существенные изменения структуры микробного сообщества древней мерзлой породы были обусловлены увеличением концентрации маркеров трех доминирующих групп бактерий: Nitrobacter, Methylococcus/Clostridium sp. и Clostridium propionicum. Максимальные изменения отмечены для Methylococcus/Clostridium sp. и Clostridium propionicum - концентрации маркеров этих групп возросли в 6 и 4 раз соответственно, а суммарная степень доминирования этих групп в микробном сообществе возросла с 17.6% до 67%. Суммарная концентрация всех обнаруженных липидных маркеров бактерий в образце увеличилась более чем в 2 раза после воздействия низкого давления, и это увеличение было обусловлено в основном ростом концентрации липидов Methylococcus/Clostridium sp.

Снижение концентрации ряда липидных маркеров в исследованных образцах свидетельствует о гибели некоторых микробных популяций в ходе эксперимента. В то же время, обнаружено увеличение концентрации липидных маркеров, характерных для ряда групп микроорганизмов, представители которых в большинстве принадлежат к анаэробным и факультативно-анаэробным бактериям. Полученные данные не позволяют однозначно утверждать, что в ходе эксперимента произошло увеличение численности микробных клеток, так как соотношение различных липидов в составе клеточной стенки бактерий может изменяться в ответ на некоторые воздействия (Zhang, Rock, 2008; Mansilla et al., 2004). Однако результаты исследования указывают на сохранение метаболической активности

некоторыми микроорганизмами в ходе эксперимента. На сегодняшний день показано, что некоторые бактерии способны расти и размножаться при давлении 700 Па (Schuerger et al., 2013; Nicholson et al., 2013). Также продемонстрирована способность бактерий рода Vibrio расти и размножаться при давлении 1-10 Па (Pavlov et al., 2010). В последнем случае бактерии помещались в песок, моделирующий реголит Марса, моделировался процесс сублимации подповерхностного льда через реголит Марса, и развитие микроорганизмов происходило в пленках воды, образовывавшихся на минеральных частицах (т. е. обеспечивалось регулярное поступление жидкой воды, доступной для микроорганимов). Вероятно, в нашем эксперименте клетки сохраняли достаточное количество воды для поддержания метаболической активности, несмотря на высушивание образца, вызванное понижением давления. Подтверждение сохранения метаболической активности микроорганизмами при примененных нами (и, возможно, более низких) значениях атмосферного давления требует дополнительных исследований.

Таким образом, показано, что низкое давление активно воздействует на природные биосистемы, вызывая в них метаболический отклик и адаптивную реакцию. Предполагается, что при низком давлении минеральная матрица способствует удержанию микроорганизмами достаточного количества воды для осуществления внутренней метаболической работы, направленной не только на устойчивость и поддержание, но и на адаптивное изменение сообществ in situ.

А

Clostridium propionicum

Methylococcus/Clostridium sp

■ A-6/99-6, 1.4 Па, 75 сут.

Nitrobacter A-6/99-6, Контроль

i i i i i i 0 10 20 30 40 50 Численность бактерий, кл/г х105

C.perfringens Mycobacterium Butyrivibrio 7S-14-3

Nocardia Peptostreptococcus Agrobacterium radiobacter B.hypermegas/Selenomonas ^aHo6aKTepMM Planta

Bacteroides ruminicola Staphylococcus P.putida Eucariotes Arthrobacter globiformis Ruminococcus Pseudonocardia Bacillus/Cellulomonas Rhodococcus equi Bacillus subtilis Sphingomonas capsulata Enterococcus Acetobacter + цмано6актермм Pseudomonas fluorescens Aeromonas hydrophila Rhodococcus terrae Butyrivibrio 1-4-11

Б

A-6/99-6, 1.4 Па, 75 сут. A-6/99-6, Контроль

112 2 3

Численность бактерий, кл/г х105

0

Рисунок 62. Воздействие низкого давления (1.4 Па, 75 сут.) на концентрацию липидных маркеров различных групп микроорганизмов в образце антарктической мерзлой осадочной породы (А-6/99-6): А -доминирующие популяции, Б - минорные популяции.

Необходимо отметить, что давление в проведенном эксперименте было выше, чем в открытом космосе (Horneck et al., 2010; см. раздел 2.5). Такие показатели давления характерны для верхних слоев атмосферы Земли и Марса, а также для некоторых космических объектов с тонкой атмосферой. В связи с этим, полученные результаты, хотя и указывают на возможность сохранения и транспорта микробных экосистем в космическом пространстве, имеют ограниченное применение, и изучение выживаемости микробных сообществ в открытом космосе (например, в составе метеоритов) требует дальнейших исследований в условиях более низких давлений. Тем не менее, результаты настоящего исследования свидетельствуют в пользу предположения о том, что в верхних слоях атмосферы Земли микроорганизмы способны осуществлять метаболические процессы. Полученные данные вносят вклад в исследования возможности переноса живых клеток из атмосферы в космическое пространство и указывают на возможность выживания и развития микробных систем на планетах и спутниках, имеющих атмосферы с низким давлением (Horneck et al., 2010).

В проведенном нами эксперименте наблюдалась более высокая (в ряде случаев 100%) выживаемость бактерий, чем в ряде экспериментов других авторов (см. раздел 2.5). Доказано сохранение биоразнообразия микробных систем, тогда как по известным данным многие бактерии не выдерживают воздействие космического вакуума. Противоречивость результатов возможно объясняется более высоким давлением в нашем эксперименте. Однако, несомненна протекторная роль гетерофазной минеральной среды, обеспечивающей сорбцию газов и воды на минеральной матрице и иммобилизованных клетках, формирование микросред и полисахаридного матрикса (Frosler et al., 2017), способствующих поддержанию межклеточных и популяционных взаимодействий.

4.9. Облучение УФ-излучением в условиях низкого давления

При исследовании совместного воздействия низкого давления и ультрафиолетового излучения (см. описание эксперимента в разделе 3.5) численность культивируемых клеток Kocuria rosea SN_T61, иммобилизованных на аналогах марсианского и лунного реголита, практически не изменилась. Число КОЕ менялось не более чем в 2.3 раза, различия не превышали ошибки метода и были статистически недостоверны (рис. 62). Такой результат согласуется с данными раздела 4.8, а также со сведениями о поглощении УФ-излучения различными минералами (см. раздел 2.6).

Рисунок 62. Влияние низкого давления и УФ-излучения на численность клеток Kocuria rosea SN_T61, иммобилизованных в аналоге реголита Марса JSC Mars-1 и в аналоге лунного реголита (стеклянные микросферы).

В образцах почвы и мерзлой породы общая численность прокариот in situ и численность культивируемых клеток также сохранились на уровне контрольных значений как после экспонирования при низком давлении, так и после совокупного воздействия низкого давления и УФ-излучения (рис. 63).

а б

Рисунок 63. Влияние низкого давления и УФ-излучения на численность клеток прокариот в образцах: а) серозема (8Ы); б) древней мерзлой антарктической осадочной породы.

Воздействие низкого давления и УФ-излучения существенно повлияло на потенциальную метаболическую активность исследованных микробных сообществ (табл. 20). Значения коэффициентов рангового распределения спектра потребления субстратов, характеризующие микробные сообщества серозема и мерзлой породы, возросли, что свидетельствует о дестабилизации сообществ. В то же время, отмечено расширение разнообразия потребляемых субстратов и индекса Шеннона, как после воздействия низкого давления, так и после совокупного воздействия вакуума и ультрафиолета. Наиболее широкий спектр потребляемых субстратов был зафиксирован в образце серозема, подвергшегося комплексному воздействию вакуума и УФ -излучения - отмечено потребление 21 субстрата (при утилизации лишь 11 субстратов в контроле).

Выше упоминалось, что микробное сообщество серозема после

экспонирования при низком давлении стало активнее потреблять пентозы,

гексозы, спирты, аминокислоты и полимеры. После облучения

176

ультрафиолетом при низком давлении возросла ассимиляция всех групп субстратов, кроме аминов, амидов и нуклеозидов, как в сравнении с контролем, так и относительно образца, экспонированного при низком давлении (рис. 64). Наиболее активное потребление (и наибольшее увеличение потребления) отмечено для олигосахаров, спиртов и аминокислот. Подобный эффект наблюдали и для микробного сообщества другой аридной почвы (Б1) после длительного экспонирования при низком давлении (см. раздел 4.8).

Таблица 20. Изменение параметров функционального разнообразия микробных сообществ антарктической мерзлой осадочной породы (образец А-6/99-6) и серозема (образец БК2) после воздействия низкого давления и УФ-излучения.

Образец Коэффициент рангового распределения спектров потребления субстратов, d Количество потребляемых субстратов, N Удельная метаболическая работа, W Выравненность, Е Индекс Шеннона, Н Интегральный показатель общего благополучия системы, G

SN, контроль 0.234 11 2239.4 0.981 3.39 100.0

SN, низкое давление, УФ 0.457 21 2612.1 0.982 4.31 97.8

SN, низкое давление 0.512 16 2431.1 0.982 4.19 98.6

А-6/99-6, контроль 0.709 12 2028.4 0.974 3.49 36.0

А-6/99-6, низкое давление, УФ 1.203 14 1957.1 0.964 3.67 24.8

А-6/99-6, низкое давление 1.214 13 1986.0 0.970 3.52 25.3

Рисунок 64. Влияние низкого давления и УФ-излучения на потребление различных номинальных групп субстратов микробным сообществом аридной почвы (образец БЫ). П - пентозы, Г - гексозы, О -олигосахара, С - спирты, АК - аминокислоты; СОК - соли органических кислот; ПМ - полимеры; ААН - амины, амиды, нуклеозиды.

Потенциальная метаболическая активность микробного сообщества мерзлой породы изменялась несколько иным образом. После экспонирования при низком давлении сократилось потребление гексоз и олигосахаров, активизировалась ассимиляция спиртов, потребление же остальных групп субстратов было близко к контрольному уровню (рис. 65). После облучения УФ-излучением возросло потребление солей органических кислот, полимеров, спиртов и пентоз в сравнении с контролем, ассимиляция же гексоз и олигосахаров проходила менее активно. Примечательно, что после исследуемых экстремальных воздействий не наблюдалось активизации потребления аминокислот микробным сообществом, что было характерно для большинства исследованных микробных сообществ после воздействия низкого давления и/или гамма-излучения и низких температур (см. разделы 4.2.2, 4.8).

Рисунок 65. Влияние низкого давления и УФ-излучения на потребление различных номинальных групп субстратов микробным сообществом мерзлой породы (образец А-6/99-6). П - пентозы, Г - гексозы, О - олигосахара, С - спирты, АК - аминокислоты; СОК - соли органических кислот; ПМ - полимеры; ААН - амины, амиды, нуклеозиды.

Согласно результатам ГХ-МС анализа липидов в образце серозема после воздействия низкого давления произошло небольшое (как правило, до 20%) увеличение численности большинства идентифицированных групп микроорганизмов (рис. 66). Резкое увеличение концентрации маркерных липидов - в 15 раз - отмечено только для Pseudomonas freudenreichii, в связи с чем степень доминирования этого вида в сообществе возросла с 2.5 до 19% (рис. 67). В основном, именно этим изменением обусловлено сокращение степени доминирования большинства других микробных групп в образце

AFe-reducing bacteria Rhodococcus terrae Clostridium OPA Pseudomonas freudenreichii Deinococcus maricopensis/Pseudonocardia

Actinomyces sp Nitrobacter, Hyphomicrobium,... Butyrivibrio 7S-14-3 Deinococcus radiophlus/Methylococcus Hymenobacter/FRB

0

20

40

60

80

Численность бактерий, кл/г x106

Glomus etunicatum Eubacterium lentum Caulobacter Sphingomonas capsulata Pseudomonas vesicularis C.perfringens Sphingobacterium spiritovorum Sphingomonas adgesiva Agrobacterium radiobacter Pseudomonas fluorescens Xanthomonas sp. Enterobacteriaceae Riemirella

Gigaspora/Streptococcus mutans Anabaena (cyanobacteria) Aeromonas hydrophila Pseudomonas putida Actinomadura roseola Cytophaga sp. Butyrivibrio 1-4-11 Anabaena (cyanobacteria) Butyrivibrio 1-2-13 Bacillus subtilis Bacillus sp. WARB

Acetobacter-Rhodobacter group Streptomyces-Nocardiopsis Carboxydotermus Micrococcus/Arthrobacter sp.

Bifidobacterium sp.

Desulfovibrio sp. Rhodococcus equi

Б

SN2, низкое давление SN2, низкое давление, УФ SN2,контроль

2468 Численность бактерий,кл/гх106

10

0

Рисунок 66. Воздействие низкого давления и УФ-излучения на концентрацию липидных маркеров различных групп микроорганизмов в образце серозема А - доминирующие популяции, Б - минорные

популяции.

100%

90%

80%

70%

к 5

1 60%

0 о.

1

! 50%

0 ч

и

£ 40%

01

30%

20%

10%

0%

Hymenobacter/FRB Deinococcus

radiophlus/Methylococcus Butyrivibrio 7S-14-3

Nitrobacter, Hyphomicrobium, Xanthobacter+ Actinomyces sp

Deinococcus

maricopensis/Pseudonocardia Rhodococcus equi

Desulfovibrio sp.

Bifidobacterium sp.

Pseudomonas freudenreichii

Clostridium OPA

Rhodococcus terrae

Fe-reducing bacteria

Others

SN2, контроль SN2, низкое SN2, низкое давление, УФ давление

Рисунок 67. Воздействие низкого давления и УФ-излучения на структуру микробного сообщества серозема (образец SN).

После воздействия УФ-излучения маркеры, характерные для

Bifidobacterium sp., Micrococcus/Arthrobacter sp., Bacillus sp., Bacillus subtilis,

Anabaena (cyanobacteria), Actinomadura roseola, Pseudomonas putida,

Riemirella, Enterobacteriaceae, Xanthomonas sp., Pseudomonas fluorescens,

Agrobacterium radiobacter, Sphingomonas adgesiva, Sphingobacterium

spiritovorum, Pseudomonas vesicularis и Sphingomonas capsulate, не были

обнаружены в образце серозема, хотя они были идентифицированы в

контрольном образце и/или в образце, экспонированном при низком

давлении. Это свидетельствует о гибели части микробных популяций

вследствие воздействия УФ-излучения или о снижении численности клеток

181

ниже предела чувствительности метода. Концентрация маркеров большинства групп бактерий, обнаруженных после облучения, сократилась в 1.1 - 2 раза в сравнении с образцом, подвергшимся воздействию только низкого давления. В то же время концентрация маркеров некоторых групп микроорганизмов увеличилась после облучения, как в сравнении с контролем, так и относительно воздействия вакуума без облучения. В частности, маркеров групп Deinococcus radiophlus/Methylococcus, Desulfovibrio sp., Carboxydotermus и Aeromonas hydrophila в облученном образце было обнаружено в 1.2-11 раз больше, чем в других образцах, концентрации же маркеров групп Clostridium OPA, Rhodococcus terrae и Fe-reducing bacteria в облученном образце были выше в 13-30 раз, чем в контроле и после экспонирования образца в вакууме без ультрафиолета. После комплексного воздействия УФ-излучения и низкого давления в образце преимущественно доминировали анаэробные, факультативно -анаэробные и микроаэрофильные бактерии (рис. 67).

В образце мерзлой породы после воздействия низкого давления наиболее существенно увеличилась концентрация липидных маркеров следующих групп микроорганизмов: Sphaerotilus, Fe-Reducing bacteria, Methylococcus/Clostridium sp., Peptostreptococcus, Bacillus/Cellulomonas и Rhodococcus equi - в 1.5-7 раз, Acetobacterium - в 26 раз, Pseudonocardia, Desulfovibrio и Nocardia carnea - более чем в 250 раз (рис. 68). Снижение концентрации маркеров отмечено для Nitrobacter, Acetobacter + Cyanobacteria, Cyanobacteria, Clostridium perfringens (для каждой группы -снижение не более 15%) и Bacillus subtilis (снижение на 70%). Изменения структуры сообщества были во многом обусловлены увеличением доли Acetobacterium в сообществе с 3% до 24% (рис. 69). Суммарная концентрация липидных маркеров прокариот, обнаруженных после экспонирования в вакууме, была в 3.7 раз выше, чем в контрольном образце.

Nocardia carnea Pseudomonas putida Desulfovibrio Acetobacterium Rhodococcus equi Bacillus/Cellulomonas Peptostreptococcus Methylococcus/Clostridium sp Fe-Reducing bacteria Rhodococcus terrae Sphaerotilus Nitrobacter

А

А-6/99-6, низкое давление А-6/99-6, низкое давление, УФ I А-6/99-6, контроль

10 20 30

Численность бактерий, кл/г х105

40

0

Butyrivibrio 1-2-13 Aeromonas hydrophila Butyrivibrio 7S-14-3 Pseudonocardia Agrabacterium... Clostridium perfringens Cyanobacteria Corynebacterium sp. Micrococcus Streptomyces Staphylococcus Mycobacterium Bacillus subtilis Acetobacter +.

Б

А-6/99-6, низкое давление А-6/99-6, низкое давление, УФ А-6/99-6, контроль

0

12 3

Численность бактерий, кл/г х105

4

Рисунок 68. Воздействие низкого давления и УФ-излучения на концентрацию липидных маркеров различных групп микроорганизмов в образце антарктической мерзлой осадочной породы (А-6/99-6): А -доминирующие популяции, Б - минорные популяции.

100%

90%

80%

70%

к 5 I

S 60%

0

Q. 5

1

I 50% о

n

Í 40%

с

V

I-

u

30%

20%

10%

0%

Nitrobacter

I Sphaerotilus

Rhodococcus terrae

Fe-Reducing bacteria

I Acetobacter + Cyanobacteria

Methylococcus/Clostridium sp

Peptostreptococcus

Bacillus/Cellulomonas

Rhodococcus equi

I Acetobacterium

Others

A-6/99-6, A-6/99-6, A-6/99-6, контроль низкое низкое

давление, УФ давление

Рисунок 69. Воздействие низкого давления и УФ-излучения на структуру микробного сообщества антарктической мерзлой осадочной породы (образец А-6/99-6).

После воздействия ультрафиолета концентрация маркеров Sphaerotilus

и Acetobacterium была ниже, чем после экспонирования при низком

давлении, но выше, чем в контроле. Маркеров Bacillus subtilis, Streptomyces,

Cyanobacteria, Clostridium perfringens и Agrobacterium radiobacter после

облучения было обнаружено меньше чем в контроле, в то время как

концентрации маркеров остальных групп после облучения превышали

контрольные значения. Концентрации липидов Rhodococcus terrae, Fe-

Reducing bacteria, Peptostreptococcus, Bacillus/Cellulomonas, Rhodococcus equi,

Desulfovibrio и Nocardia carnea после воздействия ультрафиолета были выше,

чем в двух других образцах. При этом наибольшие изменения отмечены для

184

Rhodococcus terrae и Fe-Reducing bacteria (в 17 и 22 раза относительно контроля соответственно), и их суммарная доля в сообществе увеличилась до 56%, в то время как в контроле она составляла 17% (рис. 69). Общая концентрация обнаруженных липидных маркеров в облученном образце была в 6.2 раз выше, чем в контроле, и в 1.7 раз выше, чем после воздействия низкого давления.

Таким образом, после воздействия низкого давления в образцах почвы и мерзлой породы отмечено увеличение концентрации липидных маркеров некоторых микроорганизмов, что согласуется с данными раздела 4.8 и позволяет предполагать сохранение метаболической активности некоторыми микробными популяциями в ходе эксперимента. Воздействие УФ-излучения привело к гибели ряда микробных популяций, но также, к активизации метаболических процессов или процессов роста и размножения некоторых микроорганизмов. Подобный эффект (ускорение роста бактерий) ранее наблюдали при воздействии низких доз ионизирующей радиации (Denisova et al., 2007; McNamara et al., 2007) и при воздействии на микроорганизмы света с длинами волн 404-750 нм (Tiphlova, Karu, 1988). Кроме того, был описан эффект ускорения роста микроорганизмов и увеличения их биомассы при внесении микроорганизмов в природные образцы, предварительно облученные ультрафиолетом (Lindell et al., 1995). В последнем случае ускорение роста было связано с повышением доступности органических веществ после облучения вследствие их фотохимической трансформации.

Исследованные микробные сообщества и микроорганизмы

продемонстрировали высокую устойчивость к воздействию низкого давления

и УФ-излучения, сохранив высокую численность живых клеток,

потенциальную метаболическую активность и биоразнообразие после

экстремальных воздействий. Полученные результаты хорошо согласуются с

данными раздела 4.8 и свидетельствуют о возможности сохранения в

минеральной среде метаболической активности некоторыми

185

микроорганизмами при давлении 1.4 Па. Воздействие УФ-излучения приводило к гибели части микробных популяций, но стимулировало метаболические процессы в клетках некоторых микроорганизмов, о чем свидетельствуют результаты ГХ-МС анализа. Полученные данные убеждают в том, что воздействие УФ-излучения не должно являться фактором, лимитирующим жизнеспособность микробных сообществ в условиях открытого космоса, если микроорганизмы находятся в метеоритах (обломках породы) диаметром >2 мм. Результаты исследования также подтверждают, что слоя реголита толщиной менее 1 мм достаточно для защиты микроорганизмов от УФ-излучения на поверхности Марса. Важно, что в настоящем эксперименте продемонстрировано выживание не отдельных устойчивых видов микроорганизмов, а широкого спектра прокариот.

4.10. Расчет возможной длительности криоконсервации жизнеспособных микроорганизмов на различных телах Солнечной системы

Интенсивность ионизирующего излучения на поверхности

современного Марса - около 0.076 Гр/год (Hassler et al., 2014). Доза

излучения 1 МГр аккумулируется в поверхностном слое реголита в течение

13 млн. лет. Это позволяет предполагать, что микроорганизмы в

современных холодных условиях Марса (при отсутствии возможности

активно репарировать радиационные повреждения) способны сохранять

жизнеспособность в течение этого срока. На глубине 5 м при интенсивности

излучения около 5 мГр/год доза 1 МГр накапливается в течение 200 млн. лет

(Dartnell et al., 2007). Можно также предполагать сохранение

жизнеспособных микроорганизмов во льду Европы в течение не менее 2000

лет на глубине 10 см с учетом данных об интенсивности излучения на

спутнике Юпитера (Baumstark-Khan, Facius, 2002). Однако в этом случае

следует учитывать, что в нашем эксперименте образцы были высушены, в то

время как присутствие воды может существенно влиять на

186

радиорезистентность (Baumstark-Khan, Facius, 2002; Halliwell, Gutteridge, 2015). Воздействие ионизирующей радиации также является лимитирующим фактором для панспермии (Baumstark-Khan, Facius, 2002; Mileikowsky et al., 2002). При длительном путешествии метеоритов в космическом пространстве гипотетические микроорганизмы, находящиеся внутри метеоритов, должны аккумулировать высокие дозы излучения. Известно, что большинство марсианских метеоритов достигает Земли после тысяч и миллионов лет полета в открытом космосе (Mileikowsky et al., 2002). Основываясь на интенсивности излучения внутри метеоритов (Baumstark-Khan, Facius, 2002), результаты нашего исследования позволяют предполагать выживание микроорганизмов в течение не менее 4 млн. лет в открытом космосе. Эти данные могут быть применены для оценки вероятности межпланетного транспорта жизни.

Облучение электронами привело к большему повреждению микробных сообществ, чем облучение теми же дозами гамма-излучения в сходных условиях. Это выражалось в снижении общей численности прокариот в естественных образцах грунтов, а также в резком угнетении потенциальной метаболической активности. Данный результат подтвержден и на чистых культурах бактерий. Штаммы Arthrobacter polychromogenes SN_T61 и Kocuria rosea SN_T60 способны выдерживать облучение гамма-излучением в условиях низкого давления (1 торр) и низкой температуры (-50С) дозами не менее 10 кГр без существенного снижения численности клеток. Облучение электронами дозой 10 кГр вело к снижению численности на 3-4 порядка. Необходимо исследование эффектов всего спектра излучений, а также исследование воздействия более высоких доз излучений для более точного прогнозирования длительности сохранения микроорганизмов и биомаркеров на различных объектах Солнечной системы.

Возраст марсианских мерзлых отложений составляет более 3 млрд. лет

(Fairen et al., 2010). Это означает, что сохранения жизнеспособности

187

клетками после облучения дозами, накапливающимися в течение первых сотен миллионов лет недостаточно для криоконсервации гипотетической древней биосферы до настоящего времени в жизнеспособном состоянии. При современном уровне ионизирующего излучения криоконсервированные клетки должны аккумулировать дозы около 230 МГр и около 15 МГр в поверхностном слое реголита и на глубине 5 м, соответственно. Вероятно, что ранний Марс имел плотную атмосферу, которая могла защищать клетки от космической радиации (Dartnell et al., 2007). Хотя величину атмосферного давления на раннем Марсе и скорость потери атмосферы сложно оценить, марсианская атмосфера могла защищать гипотетическую биосферу в течение длительного времени. Кроме того, необходимо отметить, что исследованне нами дозы излучения не были стерилизующими, и стерилизующие дозы могут быть существенно выше. Несмотря на это, криоконсервация гипотетической древней биосферы в жизнеспособном состоянии в течение 3 млрд. лет при отсутствии размножения и метаболизма клеток (т.е. без восстановления радиационных повреждений) представляется маловероятной. Однако, есть ряд свидетельств существования более мягкого климата и наличия жидкой воды в недавнем прошлом Марса - сотни тысяч и несколько миллионов лет назад (Murray et al., 2005; Mustard et al., 2001; Madeleine et al., 2014; Johnsson et al., 2014). Микроорганизмы должны выживать в мерзлоте такого возраста даже на небольших глубинах.

Приведенные выше расчеты не учитывают возможности восстановления повреждений клетками при низких температурах. Известно, что микроорганизмы способны размножаться при температурах до -18 °C и сохраняют метаболическую активность при -33 °C (Rummel et al., 2014; Dieser et al., 2013). Принимая во внимание эти данные, можно предполагать еще более долгую криоконсервацию живых клеток. В некоторых регионах Марса возможно повышение температур выше 0 °C и образование жидкой воды (Rummel et al., 2014; Martín-Torres et al., 2015; Jones, 2018; Jones et al.,

2011; Pavlov et al., 2010). В этом случае возможна быстрая репарация повреждений и репродукция клеток с последующим сохранением в покоящемся состоянии до наступления следующего периода с благоприятными условиями (Westall et al., 2013). На сегодняшний день показано, что микроорганизмы способны расти в условиях низкого давления и низкой температуры в бескислородной атмосфере (Nicholson et al., 2013), хорошо выдерживают воздействие солей и сильных окислителей (Nicholson et al., 2012; Beblo-Vranesevic et al., 2017a; 2017b; Al Soudi et al., 2017), выживают в холодных рассолах (Nuding et al., 2017; Heinz et al., 2018). Если подходящие условия для микробного роста и размножения создаются чаще, чем каждые 200 млн. лет, длительность сохранения живых клеток может быть практически неограниченной.

4.11. Ограничения и допущения в модельных экспериментах

В экспериментах по моделированию воздействия ионизирующей

радиации в условиях Марса газовый состав марсианской атмосферы не

воспроизводился. Состав атмосферы и атмосферное давление могут влиять

на радиационные повреждения двумя путями: а) посредством высушивания

образца и клеток при снижении давления, и, следовательно, уменьшения

концентрации воды, являющейся одним из основных источников свободных

радикалов; б) посредством изменения концентрации кислорода в атмосфере,

который также является одним из основных источников свободных

радикалов при облучении (Halliwell, Gutteridge, 2015; Baumstark-Khan, Facius,

2002). Давление в ходе экспериментов по облучению гамма-излучением (см.

раздел 3.2.1) было близко к атмосферному давлению вблизи поверхности

Марса (Комаров, Исаев, 2010; Rummel et al., 2014). В связи с этим, вероятно,

что процессы высушивания были воспроизведены довольно точно. В то же

время, климатическая камера не позволяла воспроизвести газовый состав

марсианской атмосферы. Таким образом, в эксперименте концентрация

кислорода была несколько выше, чем в атмосфере Марса. Однако снижение

189

давления до 1 торр привело к удалению ~99.9%, и оставшиеся ~0.01% кислорода, вероятно, не могли существенно модифицировать радиационные эффекты. В экспериментах по облучению ускоренными электронами (см. раздел 3.2.3) давление составляло ~0.01 торр, что значительно ниже давления в приповерхностном слое атмосферы Марса. В этом случае концентрация кислорода должна была быть близкой к показателям марсианской атмосферы, тогда как содержание воды в образцах и клетках могло быть ниже, чем в условиях Марса.

Состав солей в исследованных образцах не воспроизводил состав солей, обнаруженных в марсианском реголите (Hecht et al., 2009; Boynton et al., 2009; Toner et al., 2014a). Минеральный состав образцов также различен. Очевидно, что химический и минералогический состав реголита должен варьироваться в пространстве, в том числе в микромасштабах, что должно создавать разнообразие экониш с различными физико-химическими характеристиками (Toner et al., 2014; Meslin et al., 2013; Mangold et al., 2015). Среди разнообразия экониш могут присутствовать локусы, близкие по химическим и минералогическим условиям к исследованным образцам. Различные соли в концентрациях, обнаруженных в реголите Марса, per se не являются фактором, лимитирующим выживание бактерий (Nicholson et al., 2012; Beblo-Vranesevic 2017a; 2017b; Al Soudi et al., 2017; Nuding et al., 2017; Heinz et al., 2018), и могут даже способствовать конденсации жидкой воды клетками (Nuding et al., 2017). Соли и минералы также могут быть источником свободных радикалов при радиолизе (Zakharov, Nevostruev, 1968). В то время как вода и кислород считаются наиболее важными источниками свободных радикалов (Halliwell, Gutteridge, 2015; BaumstarkKhan, Facius, 2002), значение минерального и солевого состава остается неясным. Исследования влияния присутствия солей в окружающей среде на выживаемость микроорганизмов при воздействии ионизирующей радиации к настоящему времения отсутствуют. Недавно были изучены эффекты

обработки бактерий солями до и после облучения, однако каких-либо закономерностей не было выявлено (Beblo-Vranesevic 2017a; 2017b). Как упоминалось ранее, есть сведения о влиянии органо-минерального состава на радиационные эффекты, однако эти данные фрагментарны и противоречивы (El-Sayed, Ghanem, 2009; Stotzky, Mortensen, 1959; McNamara et al., 2003). Влияние перечисленных факторов должно быть изучено в дальнейших исследованиях.

Ионизирующее излучение в реголите Марса включает в себя протоны, электроны, пионы, мюоны, ионы и др. (Dartnell et al., 2007a; 2007b). Эти компоненты излучения производят различный радиобиологический эффект, отличный от влияния гамма-излучения (Baumstark-Khan, Facius, 2002). Однако ускорители различных частиц труднодоступны, нередко имеют низкую интенсивность излучения и позволяют облучать крайне малые объемы образцов ввиду малых размеров пучков ускоренных частиц и их энергий, обеспечивающих небольшую глубину проникновения излучения в образец (Dartnell et al., 2010). В связи с этим в астробиологических исследованиях, как правило, используется рентгеновское и гамма-излучение (Bauermeister et al., 2011; Dartnell et al., 2010; Beblo-Vranesevic 2017b). Источники этих излучений позволяют проводить облучение при высокой интенсивности, они более доступны и удобны в использовании, указанные виды излучений имеют высокую проникающую способность, хотя при этом и принимается во внимание, что ионизация, и, следовательно, некоторые биологические эффекты, вызываемые этими излучениями, не полностью воспроизводят эффекты воздействия ускоренных частиц (Dartnell et al., 2010). Кроме того, с увеличением глубины в реголите возрастает доля слабоионизирующих вторичных частиц каскада мягких космических лучей, таких как мюоны, электроны и гамма-лучи, и они начинают доминировать с глубины около 2 м. Таким образом, моделирование космических лучей с помощью гамма-излучения становится более точным с увеличением глубины

(Dartnell et al., 2007a; 2007b; Dartnell et al., 2010). Несмотря на это, в настоящей работе проведено также исследование влияния ускоренных электронов на микроорганизмы и показано различие некоторых эффектов, что указывает на необходимость исследования воздействия как можно более полного спектра космических лучей, несмотря на техническую сложность этой задачи.

Интенсивность ионизирующего излучения в экспериментах была на порядки выше, чем на современном Марсе (Hassler et al., 2014). Это обычная практика в подобных экспериментах (Bauermeister et al., 2011; Dartnell et al., 2010; Beblo-Vranesevic 2017b), так как, очевидно, невозможно проводить облучение образцов в течение тысяч и миллионов лет. Интенсивность излучения в настоящей работе была близка к параметрам используемым другими авторами. Известно, что в целом эффективность дозы редкоионизирующей радиации (включая гамма-излучение и ускоренные электроны) снижается с уменьшением интенсивности излучения (BaumstarkKhan, Facius, 2002). Обычно это объясняется восстановлением радиационных повреждений клетками в ходе облучения. Ранее в исследовании выживаемости бактерий после гамма-облучения при температуре -79°С и различной интенсивности радиации, четких различий не наблюдалось (Dartnell et al., 2010). Вероятно, это связано с низкой скоростью или полной остановкой метаболизма в условиях низких температур (Rummel et al., 2014). Однако, рассматривая гипотетическую биосферу Марса, следует принимать во внимание большую длительность облучения. Если в клетке протекают даже очень медленные восстановительные процессы, это может иметь значительный эффект в течение геологического времени. Как обсуждалось выше (раздел 4.10), на Марсе существуют потенциальные возможности для репарации повреждений клетками, и даже для периодического роста и размножения микроорганизмов. Более того, можно предполагать увеличение радиорезистентности микроорганизмов в условиях Марса, принимая во

внимание исследования по направленной эволюции радиорезистентности бактерий при воздействии сублетальных доз ионизирующей радиации (Harris et al., 2009; Tesfai et al., 2011). Суммируя изложенные факты и предположения относительно интенсивности излучения, можно заключить, что в условиях Марса длительность сохранения жизнеспособности криоконсервированными клетками in situ должна быть выше, чем рассчитанная по результатам модельных экспериментов.

В целом, принимая во внимание указанные допущения и ограничения в экспериментах, мы полагаем, что в исследованиях был воспроизведен комплекс наиболее важных физических факторов, влияющих на радиорезистентность. В то же время, в дальнейшем предполагается создание более точных моделей, включающих в себя присутствие солей и окислителей, а также иные виды ионизирующей радиации.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Принято считать, что микроорганизмы, за исключением некоторых резистентных видов, неустойчивы к воздействию ряда таких экстремальных факторов, как ионизирующее излучение, УФ-излучение, низкое давление. Однако исследования последних лет пополняют список устойчивых видов. При этом до сих пор остаются невыясненными пределы устойчивости естественных микробных сообществ, но становится очевидно, что природная среда обладает протекторными свойствами по отношению к населяющим ее микроорганизмам.

В настоящей работе исследовано воздействие различных видов ионизирующей радиации, низких температур, низкого давления и ультрафиолетового излучения на естественные сообщества микроорганизмов, населяющих экстремальные, но различные по физико-химическим условиям местообитания. Установлено, что во всех исследованных экотопах реакция микробных сообществ на облучение ионизирующей радиацией сходна: часть популяций переходит в некультивируемое (возможно, покоящееся) состояние, другие, напротив, активизируются. Следствием этих процессов является перестройка таксономической структуры сообществ. При этом, как правило, происходит некоторое угнетение отдельных доминантных и субдоминантных популяций, что создает условия для роста минорных видов. Однако в целом структура сообществ и их биоразнообразие сохранялись. Наибольшую устойчивость и активность проявили бактерии родов Deinococcus, Methylococcus, Clostridium и Arthrobacter. В работе показано, что после экстремальных нагрузок микробные сообщества сохранили высокое функциональное разнообразие и метаболическую активность.

Показано, что устойчивость микробных сообществ к воздействию гамма-излучения существенно повышается в условиях низкого давления и

низкой температуры. В частности, облучение дозой 1 МГр в условиях низкого давления и низкой температуры не снижало общей численности прокариот в образцах, в то время как облучение дозой 148 кГр в нормальных условиях снижало численность клеток на порядок. Сравнение стерилизующих доз не представляется возможным, так как максимальная доза, примененная в условиях низкого давления и низкой температуры (1 МГр) оказалась недостаточной для стерилизации.

Воздействие ускоренных электронов имело больший ингибирующий эффект, чем гамма-облучение теми же дозами, что выражалось в резком угнетении потенциальной метаболической активности микробных сообществ и снижении численности прокариот in situ.

Результаты исследования свидетельствуют о том, что радиорезистентность природных микробных сообществ существенно недооценена. Показано, что устойчивость микроорганизмов в естественной гетерогенной органоминеральной среде значительно превосходит устойчивость в чистой культуре, что может быть связано как с взаимодействием клетки с окружающей ее органоминеральной средой, так и с внутри- и межпопуляционными взаимодействиями.

В исследовании показано, что природные микробные сообщества способны сохранять высокую численность живых клеток, потенциальную метаболическую активность и биоразнообразие при длительном воздействии низких давлений, в том числе, в сочетании с облучением ультрафиолетом. Предполагается возможность сохранения метаболической активности in situ некоторыми микробными популяциями при давлении 1.4 Па. Показано, что слоя реголита толщиной 1 мм достаточно для защиты гипотетических микробных сообществ от УФ-излучения на поверхности Марса. При транспорте микроорганизмов в открытом космосе в составе метеоритов (обломков пород) диаметром более 2 мм воздействие УФ-излучения не

должно лимитировать длительность сохранения жизнеспособности микроорганизмами.

Экстраполяция доз ионизирующего излучения, примененных в эксперименте, на интенсивность излучения в поверхностном слое марсианского реголита и в открытом космосе позволяет предполагать возможность сохранения потенциальных внеземных микробных сообществ в анабиотическом состоянии в течение не менее 13 млн. лет в поверхностном слое реголита Марса, в течение 200 млн. лет на глубине 5 м и в течение не менее 4 млн. лет в космических условиях в составе метеоритов. Такой результат дает экспериментально подтвержденные основания для расширенного анализа гипотезы транспермии (длительное путешествие метеоритов, несущих жизнь, в пределах Солнечной системы), а также более оптимистичного анализа потенциального существования биосфер на целом ряде объектов Солнечной системы. Настоящее исследование расширяет существующие представления о пределах устойчивости биосистем и подтверждает важность роли естественной среды для обеспечения выживания микроорганизмов при экстремальных нагрузках. Следует отметить, что большинство экстремальных воздействий, изученных в ходе исследования, не привели к стерилизации образцов, и выяснение пределов устойчивости микробных сообществ является следующим этапом работы.

Результаты исследования могут быть применены при планировании астробиологических миссий (выбор мест высадки посадочных модулей), при разработке приборов для автоматических космических аппаратов и для развития карантинных мер в планетных исследованиях с учетом диапазона устойчивости микробных сообществ земного типа к экстремальным воздействиям. Выделенные штаммы устойчивых бактерий перспективны для биотехнологических исследований.

6. ВЫВОДЫ

1) Впервые показано, что естественные микробные сообщества экстремальных местообитаний Земли способны выдерживать воздействие ионизирующей радиации в сверхвысоких дозах при нормальных условиях -не менее 430 кГр, а в условиях низкого давления и низкой температуры - не менее 1 МГр, что существенно превосходит современные представления о радиорезистентности микроорганизмов. При воздействии экстремальных факторов сохраняется высокая численность жизнеспособных клеток, метаболическая активность и высокое биоразнообразие при частичной перестройке таксономической структуры сообществ и переходе части микробных популяций в некультивирумое состояние. Наибольшую устойчивость и активность in situ проявили бактерии родов Deinococcus, Methylococcus, Clostridium и Arthrobacter;

2) Показано, что бактерии имеют значительно более высокую радиорезистентность in situ в естественной среде обитания по сравнению с их устойчивостью в чистой культуре. При облучении в естественной среде в условиях низкого давления и низкой температуры радиорезистентность повышается более чем в 20 раз в сравнении с облучением в чистой культуре при нормальных условиях. Благодаря протекторным свойствам природной среды и внутри- и межпопуляционным взаимодействиям даже радиочувствительные микроорганизмы, находясь в составе природных микробных сообществ, способны выдерживать воздействие очень высоких доз ионизирующей радиации;

3) Впервые показано, что природные микробные сообщества без существенных потерь выдерживают воздействие ионизирующего излучения в сочетании с низкими температурами и низким давлением в дозах, обеспечивающих потенциальную возможность выживания экосистем земного типа в поверхностном слое марсианского реголита (защищенном от УФ-излучения) в течение не менее 13 млн. лет и в течение не менее 200 млн.

лет на глубине 5 м, в открытом космосе в составе метеоритов в течение не менее 4 млн. лет, во льду Европы на глубине 10 см в течение не менее ~ 2 тыс. лет;

4) Природные микробные сообщества in situ способны сохранять высокую численность живых клеток, потенциальную метаболическую активность и биоразнообразие при длительном воздействии низких давлений, в том числе в сочетании с облучением ультрафиолетом. Предполагается сохранение метаболической активности in situ некоторыми микробными популяциями при давлении 1.4 Па;

5) Показано, что слоя реголита толщиной 1 мм достаточно для защиты гипотетических микробных сообществ от УФ-излучения на поверхности Марса. При транспорте микроорганизмов в открытом космосе в составе метеоритов (обломков пород) диаметром более 2 мм должна обеспечиваться достаточная защита микробных клеток от ультрафиолета, то есть воздействие УФ-излучения не должно лимитировать длительность сохранения жизнеспособности микроорганизмами;

6) Сублимация подповерхностного льда может являться источником жидкой воды и обеспечивать возможность функционирования сообществ земного типа в верхнем слое марсианского реголита.

7) Более 300 штаммов бактерий, выделенных из экстремальных местообитаний и/или после экстремальных воздействий, депонированы в Астробиологическую коллекцию микроорганизмов факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова и доступны для дальнейшего изучения.

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Архангелов А.А. Подземное оледенение севера Колымской низменности в позднем кайнозое // Проблемы криолитологии. 1977. № IV. С. 26-57.