Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Брещенко, Елена Евгеньевна
- Специальность ВАК РФ03.00.04
- Количество страниц 148
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Брещенко, Елена Евгеньевна
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕЙРОГУМОРАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ СЕКРЕТОРНОЙ ФУНКЦИИ ЖЕЛУДКА И ЭКЗО-4 КРИННОЙ СЕКРЕЦИИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ.
1.1. Регуляция желудочной секреции гормонами пептидной и непептидной природы.
1.2. Ферменты панкреатического сока и регуляция экзокринной секреции поджелудочной железы.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Технология получения препарата «Панинтестин» и выделения из него биологически активных пептидов.
2.2. Постановка эксперимента на животных.
2.2. 1. Определение содержания пептидов в пробе для расчета дозировки.
2. 3. Методы исследования.
2.3.1. Определение молокосвертывающей способности пепсина.
2. 3. 2. Определение протеолитической активности пепсина.
2. 3. 3. Определение активности панкреатических протеиназ суммарно.
2. 3. 4. Определение активности трипсина.
2. 3. 5. Определение активности химотрипсина.
2. 3. 6. Определение активности амилазы.
2. 4. Статистические методы исследования.
ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ПЕПТИДОВ ИЗ ПАНИНТЕСТИНА И ИЗУЧЕНИЕ
ИХ ОСНОВНЫХ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.
3.1. Хроматографическое разделение пептидов панинтестина методом гель-фильтрации.
3.2. Определение молекулярной массы пептидов, выделенных из панинтестина.
3.3. Высокоэффективная жидкостная хроматография и ее использование для фракционирования пептида В, выделенного из панинтестина.
3.4. Разделение и анализ пептида В панинтестина с использованием методов капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии и мембранной фильтрации.
ГЛАВА 4. ДЕЙСТВИЕ ПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПАНИНТЕСТИНА, НА АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ В СЛИЗИСТОЙ ЖЕЛУДКА, ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ И ТКАНИ
ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ У КРЫС.
4.1. Влияние пептидов, выделенных из панинтестина методом гель-фильтрации, на активность пищеварительных ферментов желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки.
4.2. Влияние низкомолекулярного пептида Сз, выделенного из пептида В методом мембранной фильтрации, на активность пищеварительных ферментов в органах гастропанкреато-дуоденального комплекса.
4.3. Сравнение изменения активности пищеварительных ферментов под действием пептида С3, выделенного из панинтестина, и патентованных средств, применяемых для стимуляции или подавления внешнесекреторной деятельности органов гастропанкреатодуоденального комплекса.
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК
Использование хирургических и биохимических технологий для выделения гастродуоденальных ульцерозных пептидов и изучения их биологических свойств2005 год, Быков, Михаил Ильич
Сравнительная биохимическая характеристика патентованных препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии2003 год, кандидат биологических наук Хвостова, Татьяна Станиславовна
Желудочная и панкреатическая секреция электролитов и ферментов на стрессовые раздражители в норме и при язвенной болезни2002 год, кандидат биологических наук Слинькова, Татьяна Александровна
Особенности пищеварения у норок и песцов клеточного разведения1984 год, кандидат биологических наук Олейник, Виктор Михайлович
Секреторная функция желудка и поджелудочной железы при действии эмоционального стресса2007 год, доктор биологических наук Смелышева, Лада Николаевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение пептидов из панинтестина и изучение их биологических свойств»
Актуальность исследования. В связи с ростом количества гастроэнтерологических заболеваний, широко распространенных среди взрослого и детского населения и сопровождающихся секреторной недостаточностью желудка, поджелудочной железы, печени, тонкого кишечника, растет и потребность в различных препаратах ферментозаместительной терапии, выпускаемых отечественными и зарубежными фирмами (Златкина А.Р. и соавт., 1998; Ивашкин В Т., Рапопорт С.И., 1999). Ферментные препараты отличаются друг от друга как сочетанием и дозой содержащихся в них пищеварительных ферментов, так и наличием различных добавок. Успех коррегирующей ферментотерапии зависит от правильного подбора лекарственного средства (Яковенко Э.П., 1998; Охлобыстин A.B., 2001; Di-Magno Е.Р., 1999).
Известно (Яковенко Э.П., 1998), что в некоторых из ферментных препаратов содержатся высокие дозировки ферментов заместительной терапии (пепсина, трипсина, химотрипсина, липазы, амилазы), однако и они не могут полностью компенсировать недостающую часть ферментов, так как покрывают только десятые или сотые доли суточной нормы (Сторожук П.Г., Быков И.М., 1994; Быков И.М., 2001). Несмотря на то, что ферменто-заместительная терапия не может оказывать существенного влияния на процессы пищеварения из-за недостаточного содержания в препаратах пищеварительных ферментов, многие исследователи отмечают положительный терапевтический эффект от применения препаратов ферментозаместительной терапии. Возможно, такие результаты связаны с наличием в препаратах биологически активных пептидов.
На кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии уже несколько десятилетий разрабатываются технологии получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучаются их биохимические и физиологические свойства. Профессором Н.П. Пятницким были созданы пепсинсодержащие препараты пепсидил и сальпепсин (A.c. № 200740, 1967; A.c. № 289812, 1970), затем проф. П.Г. Сторожуком и М.М. Мыкртычаном была разработана технология получения нового искусственного желудочного сока - копепсидила (A.c. № 908358, 1982). Позже коллектив сотрудников кафедры биохимии разработал технологию приготовления препарата панинтестин (A.c. № 1476653,1987), предназначенного для лечения заболеваний с секреторной недостаточностью поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Технология получения панинтести-на предусматривает введение в гомогенат поджелудочной железы слизистой оболочки тонкой кишки, где содержатся ферменты, активирующие трипсиноген, и заканчивающие гидролиз мелких пептидов трипептидазы, дипептидазы, в результате чего происходит активация всех панкреатических ферментов, гидролиз белков собственных тканей органа с образованием многообразных форм пептидов.
При исследовании препаратов ферментозаместительной терапии было установлено, что они обладают способностью повышать секреторную деятельность желудка, поджелудочной железы и тонкой кишки. Это свойство принадлежит сопутствующим пептидам, которые были выделены из пепсидила и копепсидила (Хангалдова Т.Н., 1977; Быков И.М., 1982). Также было установлено, что препарат панинтестин обладает подобным свойством (Быков И.М., 2001). В связи с этим изучение механизмов действия препаратов заместительной энзимотерапии является одной из актуальных проблем современной гастроэнтерологии. Особое значение она приобретает при хирургическом лечении заболеваний желудка, поджелудочной железы и двенадцатиперстной кишки. Эта проблема актуальна и в педиатрии, так как недостаточность секреторной деятельности пищеварительных желез у детей не позволяет ребенку нормально питаться, что сказывается на его росте и развитии.
Целью настоящей работы является выделение пептидов из панинте-стина и исследование их влияния на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке.
В связи с этим перед исследователем стояли следующие задачи:
1. При помощи гель-фильтрации и других современных физико-химических методов выделить из панинтестина пептиды с различной молекулярной массой, определить их молекулярную массу и идентифицировать наиболее активные фракции.
2. В экспериментах на животных провести исследование влияния высоко- и низкомолекулярных пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.
3. Провести сравнительный анализ воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных модуляторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка.
Новизна результатов исследования
Установлено, что препарат панинтестин, разработанный на кафедре биохимии Кубанской государственной медицинской академии и предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит как высокомолекулярные белки, так и биологически активные пептиды.
Впервые с использованием различных физико-химических методов, из панинтестина выделены пептиды, проведен анализ и определена их молекулярная масса.
Выявлено, что пептиды, входящие в состав панинтестина, обладают биологической активностью по отношению к органам пищеварения. Исследованиями на лабораторных животных установлено, что различные пептиды обладают разнонаправленным действием: одни из них увеличивают активность ферментов желудочно-кишечного тракта, другие -уменьшают. Эффект зависит от молекулярной массы и первичной структуры пептида.
Впервые в острых опытах на крысах показано, что высокая биологическая активность полученных пептидов по своей интенсивности часто не уступает известным стимуляторам секреции желудка и внешнесекретор-ной функции поджелудочной железы (пентагастрин, гистамин).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Из препарата ферментозаместительной терапии панинтестина, технология приготовления которого разработана на кафедре биохимии КГМА, при помощи гель-фильтрации и других современных физико-химических методов выделены биологически активные пептиды, определены их молекулярные массы и идентифицированы наиболее активные фракции.
2. Установлено, что высоко- и низкомолекулярные пептиды, выделенные из панинтестина, обладают способностью изменять активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки экспериментальных животных.
3. При сравнительном анализе воздействия на активность пищеварительных ферментов пептидов, выделенных из панинтестина, современных стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции, применяемых в клинике и научно-исследовательских целях, а также пептидов, выделенных из ткани язвы желудка, показано, что пептиды, полученные из панинтестина, по степени влияния не уступают признанным модуляторам секреции пищеварительных желез.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработана схема хроматографического разделения препаратов ферментозаместительной терапии (ПФЗТ) и получения из них биологически активных пептидов. Это позволит использовать отдельные фракции пептидов для практических целей в качестве стимуляторов и ингибиторов желудочной и панкреатической секреции.
Исследованиями установлено, что при получении ПФЗТ не следует добиваться тщательной очистки ферментов от сопутствующих пептидов, так как от этих примесей зависит биологическая активность препаратов.
Сведения о внедрении результатов исследования в практику
Результаты исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах биохимии и общей химии Кубанской государственной медицинской академии, на кафедре биохимии человека и животных Кубанского государственного университета, в Институте аллергии и астмы.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Органосохраняющие принципы в хирургии неотложных состояний» (Ейск, 2001), X юбилейной международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2002), 18-ой Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и патология пищеварения» (Геленджик, 2002).
Публикации. По материалам проведенных исследований опубликовано 10 печатных работ.
Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК
Выделение и физико-химические свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта сома европейского Silurus glanis L.2005 год, кандидат биологических наук Улитина, Нина Николаевна
Очистка и свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта озерной лягушки2001 год, кандидат биологических наук Фиц, Ирина Владимировна
Секреторная деятельность желудка и ее адаптивные трансформации в норме и при осложненной язвенной болезни двенадцатиперстной кишки2006 год, кандидат биологических наук Плешкова, Марина Анатольевна
Особенности восстановления секреторной активности пищеварительных желез после действия мышечной нагрузки2011 год, доктор биологических наук Грязных, Андрей Витальевич
Особенности секреторной функции поджелудочной железы цыплят-бройлеров и возможности коррекции пищеварения животных ферментными препаратами на цеолитовой основе2004 год, доктор биологических наук Вертипрахов, Владимир Георгиевич
Заключение диссертации по теме «Биохимия», Брещенко, Елена Евгеньевна
ВЫВОДЫ
1. Разработан метод экстракции и хроматографического выделения пептидов, содержащихся в гастроэнтерологических препаратах ферментоза-местительной терапии (ПФЗТ), которые обладают биологической активностью, выражающейся в изменении активности пищеварительных ферментов.
2. Методами гель-фильтрации, высокоэффективной хроматографии и капиллярного электрофореза из панинтестина, который, как и другие ПФЗТ, содержит в основном панкреатические ферменты, выделено около двух десятков биологически активных пептидных фракций молекулярной массой до 5500-6500 Да.
3. Выделенные из панинтестина пептиды при парентеральном введении экспериментальным животным (крысам) обладают способностью как увеличивать активность ферментов пищеварительных желез, так и тормозить ее. При этом не всегда наблюдается параллельность изменений активности ферментов в желудке, поджелудочной железе и слизистой тонкой кишки.
4. Выделенные из панинтестина методом колоночной гель-фильтрации пептиды А, В и С (ММ 5500-6500, 3000-3500 и 2000-2500 Да соответственно) при внутрибрюшинном введении животным оказывают резко выраженное действие. Пептид В стимулирует активность панкреатических и интестинальных ферментов, а пептиды А и С - угнетают. На активность пепсина они сколько-нибудь заметного действия не оказывают.
5. Установлено, что более выраженным свойством влиять на активность пищеварительных ферментов обладают низкомолекулярные пептиды (ММ < 3000 Да), что, по-видимому, зависит от первичной структуры пептидов.
6. Низкомолекулярный пептид Сз (ММ < 3000 Да), полученный из фракции В при помощи комбинированных физико-химических способов выделения (колоночной гель-хроматографии и мембранной фильтрации) по своей способности увеличивать активность ферментов органов гаст-родуоденальной зоны приближается к действию таких стимуляторов как гистамин и пентагастрин, а подчас и превышает его.
7. При помощи разработанной на кафедре биохимии КГМА технологии выделения пептидов из гастроэнтерологических препаратов ферменто-заместительной терапии получены пептиды из ульцерозной ткани желудка, которые обладают способностью влиять на активность ферментов в органах гастродуоденального комплекса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Технология получения препаратов ферментозаместительной терапии и изучение механизмов их действия традиционно входят в число научных приоритетов кафедры биохимии Кубанской медицинской академии.
Работы в этом направлении были начаты проф. Н.П. Пятницким и в течение нескольких десятилетий продолжаются его учениками. Наибольшее распространение среди препаратов ферментозаместительной терапии, разработанных ими, получили «Пепсидил» (Пятницкий Н.П. Авт.св. № 200740, 1967), «Сальпепсин» (Пятницкий Н.П., Пятницкая И.Н. Авт.св. № 263808, 1969) и «Копепсидил» (Сторожук П.Г., Мкртычан М.М. Авт.св. № 908358, 1982). Препараты, предложенные Н.П. Пятницким и другими авторами, прошли клиническую апробацию и показали высокую терапевтическую эффективность. Положительное действие этих препаратов приписывалось исключительно пепсину, ферменту, восполняющему его недостаточность в собственном желудочном соке больных (Маланьина Н.С., 1974).
В диссертациях Т.Н. Хангалдовой (1977), И.М. Быкова (1982), И.И. Павлюченко (1987), А.Н. Колесникова (1987) и других работах, выполненных под руководством проф. П.Г. Сторожука и посвященных технологии создания новых отечественных препаратов ферментозаместительной терапии и изучению их биологических свойств, были установлены новые, ранее неизвестные научные факты. Так, Т.Н. Хангалдовой (1977) показано, что препараты пепсина обладают свойством усиливать желудочную секрецию, вызванную пищевым раздражителем, и что эта стимуляция секреции обусловлена наличием в препаратах биологически активных пептидов с молекулярной массой 10000-12000 Да.
Затем в работе И.М. Быкова (1982) было проведено разделение белковых фракций пепсинсодержащих препаратов методом молекулярных сит и выделено три пептида, обладающих высокой биологической активностью. Совместно с Институтом биохимии им. акад. A.B. Палладина (г. Киев) был изучен аминокислотный состав и молекулярная масса этих пептидов. Было установлено, что молекулярная масса этих пептидов составляла от 2400 до 3200 Да.
На кафедре биохимии проводились исследования влияния пептидов, выделенных из пепсинсодержащих препаратов, на ферментообразование в органах пищеварения у лабораторных животных при различных видах введения (Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Маланьина Н.С.,1979; Сторо-жук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М., 1979а; Быков И.М., 1982; Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М., Ханферян P.A., 1983; Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И., Колесников А.Н., 1986а). Было установлено, что эти пептиды оказывают влияние не только на секреторную функцию желудка, но и на экскреторную функцию поджелудочной железы.
Наряду с препаратами, содержащими пепсин, изучались и физиологические и биохимические свойства полиферментных препаратов, применяемых при лечении заболеваний с недостаточностью ферментовыдели-тельной функции поджелудочной железы и тонкой кишки (Сторожук П.Г., 1985; Сторожук П.Г., Быков И.М., Маланьина Н.С., Павлюченко И.И., 1986; Сторожук П.Г., Быков И.М., 1994; Быков И.М. и соавт., 2000; Сторожук П.Г., Быков И.М., Хвостова Т.С. и др., 2000а; Сторожук П.Г., Быков И М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., 2001; Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е. и др., 2001а). В сравнении с другими, широко используемыми в клинике препаратами ферментозаместительной терапии, такими как фестал, панзинорм, дигестал и другие, прошел экспериментальную апробацию и препарат панинтестин, получаемый по технологии П.Г. Сторо-жука, И.М. Быкова, И.И. Павлюченко (1987). По полученным данным было сделано предположение, что полиферментные препараты обладают способностью изменять секрецию пищеварительных ферментов за счет содержащихся в них пептидов, образующихся в процессе производства ауто-лизным методом и проявляющих гормоноподобный эффект в отношении экзокринных желез органов пищеварительной системы.
В результате проведенных исследований было установлено, что препарат панинтестин имеет неоднородный состав и включает в себя помимо высокомолекулярных белковых фракций, обладающих ферментативной (протеолитической и амилолитической) активностью, ряд низкомолекулярных фракций, у которых ферментативная активность отсутствует. В процессе получения панинтестина под влиянием собственных протеиназ поджелудочной железы и слизистой оболочки тонкой кишки происходит протеолиз тканевых белков этих органов, в результате чего образуются пептиды с различной молекулярной массой.
В последующих работах была предпринята попытка выделить пептиды методом колоночной гель-хроматографии с использованием сефадек-сов О-100 и С-25 из полуфабриката панинтестина, который готовится путем аутолиза смеси гомогенатов поджелудочной железы и слизистой тонкой кишки. Удалось получить ряд пептидов различной молекулярной массы. Была установлена молекулярная масса некоторых из них, которая составила от 2000-2500 Да (пептид С) до 5500-6500 Да (пептид А), и изучена биологическая активность этих пептидов в опытах на животных. Полученные пептиды были неоднородны по составу, что подтверждено дальнейшими исследованиями с помощью современных физико-химических анализов, проведенных совместно с Институтом биоорганической химии им. акад. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (г. Москва, 2002). Для разделения и анализа пептидов, выделенных из панинтестина, применялись такие методы, как высокоэффективная жидкостная хроматография, основанная на избирательной растворимости различных веществ в полярных и неполярных растворителях, капиллярный электрофорез, в основу которого положена способность заряженных частиц перемещаться в растворе под влиянием электрического поля с различной скоростью, и массспектромет-рия, широко используемая для идентификации и установления структуры органических соединений. Для детального исследования был выбран пептид В, который в опытах на крысах показал выраженный стимулирующий эффект. Исследования проводились на микроколоночном жидкостном хроматографе «Миллихром А-02» (производства фирмы «Эконова», Новосибирск), приборе для капиллярного электрофореза фирмы ABI, масс-спектры снимались на приборе Vision-2000 (фирмы Thermo Bioanalysis Corp., Англия). Современными физико-химическими методами доказано, что пептид В, полученный гель-фильтрацией на молекулярных ситах (се-фадексы G-100 и G-25), состоит не менее чем из пяти пептидных фракций, некоторые из которых содержат 3-5 аминокислотных остатка.
В качестве экспериментальных животных для изучения биологической активности полученных пептидов были выбраны крысы, поскольку они являются животными, на которых можно проводить острый эксперимент и одновременно исследовать действие того или иного фактора на ткани и ферментные системы нескольких органов. Было необходимо установить действие выделенных из панинтестина пептидов на активность пищеварительных ферментов в желудке, поджелудочной железе и слизистой двенадцатиперстной кишки. Причем ферменты пищеварения в желудочно-кишечном тракте подвергаются взаимоперевариванию, в результате чего из них образуются многообразные осколки, обладающие различными биологическими свойствами. Поэтому изучение действия пептидов следует проводить при парентеральном введении, так как они, не всасываясь в кровь, могут проникать в межклеточные щели и оказывать свое действие через мембраны клеток пищеварительных желез. Необходимость экспериментов на крысах диктуется также ограниченным количеством испытуемого материала, в частности пептидов.
В острых опытах на крысах установлено, что при парентеральном введении пептидов I и II, полученных колоночной гель-фильтрацией на сефадексе в-100 из полуфабриката панинтестина, приготовленного из разных проб биоматериала, происходило изменение активности как желудочных протеиназ, так и протеолитических ферментов, синтезирующихся в поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке. Увеличение активности пепсина в желудке составляло 56-63% по сравнению с контрольной группой животных, прирост активности трипсина - от 20 до 86%, а общая активность протеиназ существенно не изменялась. Изменения активности трипсина и суммарных протеиназ в гомогенатах двенадцатиперстной кишки носили другой характер: пептиды I и II существенно повышают СПА (на 40 и 114% соответственно) в гомогенате двенадцатиперстной кишки, но не вызывают статистически достоверных изменений активности трипсина. Активность амилазы под действием этих пептидов уменьшается как в поджелудочной железе, так и в двенадцатиперстной кишке (на 32-56 и 10-31% соответственно). Следует отметить, что активность определяемых ферментов изменяется параллельно в ткани поджелудочной железы и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки.
Пептиды, полученные последовательным разделением полуфабриката панинтестина на сефадексах О-ЮО и 0-25, также проявляли биологическую активность. Этим методом было получено три пептидные фракции, обозначенные как А, В и С. В опытах, проведенных на крысах, было показано, что эти пептиды, введенные парентерально, оказывают разнонаправленное влияние на активность ферментов в желудке, поджелудочной железе и двенадцатиперстной кишке. Так в поджелудочной железе пептиды А и С оказывают угнетающее действие на активность трипсина и химот-рипсина, снижая ее в среднем на 25 и 34% соотвественно. В то же время пептид В увеличивает активность трипсина на 23%, а химотрипсина - на
16%. В гомогенате двенадцатиперстной кишки активность ферментов также изменялась, причем также как и в поджелудочной железе, пептиды А и С ослабляли активность трипсина на 20-29%, а пептид В увеличивал ее на 42%. Суммарная активность протеиназ увеличивалась под действием всех трех пептидов, но в различной степени: на 42% при введении пептида В и менее значительно - на 9-12% под влиянием пептидов А и С.
Поскольку пептид В показал наибольший стимулирующий эффект, он был выбран для дальнейших, более тонких, физико-химических исследований. Этот пептид был не только исследован с помощью широко известных физико-химических способов, но и подвергнут дополнительному фракционированию мембранной фильтрацией на фильтрах «Центрикон», позволяющей разделить смесь на фракции с различной молекулярной массой. Применялись фильтры с диапазоном отсечки фракций с молекулярными массами: 1-я > 30 кДа, 2-я - 3-10 кДа и 3-я < 3 кДа. При помощи этого метода был получен низкомолекулярный пептид, условно обозначенный как Сз, имевший молекулярную массу < 3 кДа. Было изучено влияние этого пептида на активность пищеварительных ферментов в поджелудочной железе, желудке и двенадцатиперстной кишке. Также было проведено исследование действия пептида Сз в сравнении с применяющимися в клинике и НИР модуляторами секреции пищеварительных желез - пентагастри-ном, гистамином и даларгином, а также пептидами, выделенными из уль-церозной ткани желудка.
Так, у крыс под действием пентагастрина активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы увеличивается на 39% (р<0,001), а суммарная протеолитическая активность - на 24%. Активность амилазы в поджелудочной железе под влиянием пентагастрина растет, достигая 122% (р<0,01). Активность протеиназ в слизистой двенадцатиперстной кишки у крыс в ответ на введение пентагастрина также изменяется: активность трипсина возрастает на 24% (р<0,05), суммарная активность протеиназ на 40%. Протеолитическая активность пепсина в гомогенате желудка увеличивается на 35% по сравнению с контрольной группой крыс.
Под действием гистамина активность ферментов в органах желудочно-кишечного тракта у крыс изменяется следующим образом: активность пепсина увеличивается на 26% (р<0,01) по сравнению с контролем, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы возрастает до 163% (р<0,001) , а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - до 128% (р<0,02). Изменение суммарной протеолитической активности у этой группы крыс не столь существенно: в гомогенате поджелудочной железы СП А возрастает на 20%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24%. Активность амилазы увеличивается на 65% в гомогенате поджелудочной железы и не изменяется в гомогенате двенадцатиперстной кишки.
Введение даларгина снижает активность всех пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта: активность пепсина уменьшается на 37,4%, активность трипсина в гомогенате поджелудочной железы падает на 28,5%, а в гомогенате двенадцатиперстной кишки - на 24,5%. Активность амилазы и СПА в ответ на введение даларгина изменяются не столь значительно: в гомогенате двенадцатиперстной кишки активность амилазы составляет 88,6% от контрольной, а суммарная активность протеиназ -87%. Однако эти изменения статистически недостоверны.
В острых опытах на крысах установлено также, что под влиянием пептида Сз, введенного животным парентерально, значительно возрастает активность трипсина и амилазы как в поджелудочной железе (на 51 и 84% соответственно), так и в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки (на 59 и 54% соответственно), в то время как активность протеиназ практически не изменяется. Однако этот пептид не оказывает существенного влияния и на активность пепсина в слизистой оболочке желудка.
При введении пептида ОиР-1 (гастроульцерозного пептида), выделенного из ткани язвы желудка, активность трипсина в гомогенатах поджелудочной железы увеличивается на 14%, а суммарная протеолитиче-ская активность - на 26%. При этом на 78% возрастает и активность амилазы. В слизистой желудка содержание пепсина увеличивается на 18%. При внутрибрюшинном введении ОиР-2 процент увеличения активности несколько ниже, чем при действии ОЦР-1, но также носит статистически достоверный характер. В гомогенате двенадцатиперстной кишки под действием ульцерозных пептидов активность ферментов уменьшается почти во всех случаях, кроме активности трипсина, которая возрастает под влиянием ОИР-1 на 27%.
Таким образом установлено, что препарат панинтестин, предназначенный для коррекции секреторной недостаточности поджелудочной железы, содержит пептиды, оказывающие гормоноподобное действие на активность ферментов органов гастропанкреатодуоденального комплекса. При этом направление и степень воздействия всецело зависят от состава и структуры самого пептида. Возможно, эти пептиды, образующиеся при изготовлении препарата, а также содержащиеся в используемом для его производства материале (ткани поджелудочной железы и слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки), похожи по строению на пептидные гастро-интестинальные гормоны - гастрин, холецистокинин, бомбезин и др. Можно предположить, что сходство строения позволяет полученным нами пептидам взаимодействовать с рецепторами пептидных гормонов желудочно-кишечного тракта и действовать по механизмам, сходным с механизмами действия гастроинтестинальных гормонов.
Стимулирующим влиянием обладают также и пептиды, полученные из ткани язвы желудка. Представляется вероятным, что слизистая желудка, вовлеченная в патологический процесс, сопровождающийся образованием язвы, продуцирует биологически активные пептиды. Их образование может быть связано с преждевременной активацией лизосомальных протеиназ (катепсинов), которые гидролизуют внутриклеточные протеины, или действием ферментов, локализованных в протеосомах, также подвергающих деградации видоизмененные воспалительным процессом внутриклеточные белки.
При этом следует отметить, что низкомолекулярные пептиды, прошедшие более тщательную очистку - пентагастрин и пептид Сз - обладают наибольшим действием, особенно хорошо выраженным в отношении панкреатических протеиназ и амилазы.
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Брещенко, Елена Евгеньевна, 2003 год
1. Адриан Т.Е., Блюм С.Р., Полак Дж.М. Регуляторные пептиды верхнего отдела пищеварительного тракта // Гастроэнтерология / Под ред. Дж.Х. Барона, Ф.Г. Муди. В 3 частях. Пер. с англ. - М.: Медицина, 1988. - 4.1. -304 с.
2. Амиров Н.Ш., Антонов Д.В. Спектр протеаз слизистой оболочки желудка в норме и при экспериментальном язвообразовании // Патол. физиология и эксперим. терапия. 1983. - № 5. - С.75-78.
3. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983. - 367 с.
4. Барашкова Г.М. Гастрин, холецистокинин-панкреозимин, секретин и взаимодействие моторной функции желудка, двенадцатиперстной кишки и желчевыводящего аппарата // Физиол. журн. СССР. 1975. - Т. 61, N 5. - С. 763-767.
5. Барашкова Г.М., Фокина A.A., Климов П.К. Действие энкефалинов и их аналогов на желудочную секрецию // Физиол. журнал СССР. 1982. -Т. 68,№5.-С. 632-638.
6. Березкин В.Г. Хроматография как научная дисциплина // Заводская лаборатория. 1999. - Т. 65, № 8. - с. 1-7.
7. Бидлингмейер Б., Фрайд Б., Хегнауер Г. Препаративная жидкостная хроматография. М.: Мир, 1990. - 358 с.
8. Брокерхов X., Дженсен Р. Липолитические ферменты. М: Мир, 1978. - 394 с.
9. Быков И.М. Действие отечественных препаратов пепсина на секреторную функцию желудка в норме и при патологии: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1982. - 18 с.
10. Ю.Быков И М. Биохимическая оценка гастроэнтерологических ферментных препаратов и выделенных из них биологически активных пептидов: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. -Ростов-нД, 2001. 45 с.
11. Вальдек Ф. Функции желудочно-кишечного тракта // Физиология человека. В 4-х томах. / Под ред. Р.Шмидта и Г.Тевса. Пер. с англ. М., 1986.-Т. 4,- С. 109-144.
12. Вафин А.З. К изучению секреторной деятельности желудка // Физиол. журн. СССР. 1967. - Т. 53, № 4. - С. 455-458.
13. Волощук A.M. Руководство по капиллярному электрофорезу: Науч. совет РАН по хроматографии. М., 1996. - 231 с.
14. Гарднер Дж.Д., Йенсен Р.Т. Характеристика рецепторов к пептидам желудочно-кишечного тракта // Полак Дж.М. и др. Физиология и патофизиология желудочно-кишечного тракта. М., 1989. - С. 16-32.
15. Геккелер К.Е., Экштайн X. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994. - 407 с.
16. Геллер А.Л. Пентагастрин в изучении желудочной секреции и моторики у больных хроническим гастритом, гастродуоденитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки: Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Хабаровск, 1984. 23 с.
17. Геллер Л.И. Желудочная секреция и механизмы ее регуляции у здорового человека. Л.: Наука, 1975. - 132 с.
18. Геллер Л.И. Клиническая физиология поджелудочной железы. Хабаровск, 1977. - 93 с.
19. Геллер Л.И. Пептидно-гормональные регуляции системы пищеварения //Клин, медицина. 1986. - N 10. - С. 25-31.
20. Герасимов В.К., Румянцев С.Н., Туголукова В.Н. Переваривание бело-ксодержащих пищевых продуктов желудочным соком в норме и при патологии желудочно-кишечного тракта // Терапевт, арх. 1989. - Т. 61, № 11.-С. 62-64.
21. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. -459 с.23 .Григорович O.A. Желудочная секреция у людей разных типов телосложения в условиях ее стимулирования и ингибирования // Физиология человека. 1998. - Т. 24, N 2. - С. 117-121.
22. Гринберг Р. Г. Нейрогуморальная регуляция функций поджелудочной железы у человека и ее нарушения // Полак Дж.М. и др. Физиология и патофизиология желудочно-кишечного тракта. М, 1989. - С. 123-134.
23. Гроссман М. Желудочно-кишечные гормоны и патология пищеварительной системы. М.: Медицина. - 1981. - 271 с.
24. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1982. - Т. 1. - С. 1-392.
25. Ивашкин В.Т. Метаболическая организация функций желудка. Л.: Наука, 1981.- 214 с.
26. Ивашкин В.Т., Рапопорт С.И. Справочник практического врача по гастроэнтерологии. М.: Сов. спорт, 1999. - С. 118-126.
27. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хромато-масс-спектрометрию / Пер. с англ. М.: Химия, 1993. - 467 с.
28. Климов П.К. Пептиды и пищеварительная система. Л.: Наука, 1983. -272 с.
29. Климов П.К. Физиологическое значение пептидов мозга для деятельности пищеварительной системы. Л.: Наука, 1986. - 256 с.
30. Климов П.К., Ткаченко Е.И. Некоторые дополнения к основным принципам регуляции функций органов пищеварения // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1995. -N3.-C.3-15.
31. Климов П.К., Фокина A.A. Физиология поджелудочной железы. Регуляция внешнесекреторной деятельности. Л.: Наука, 1987. - 152 с.
32. Колесников А.Н. Биохимическая и физиологическая характеристика препаратов искусственного желудочного сока: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1987. - 16 с.
33. Колодзейская М.В., Пилявская A.C. Пептидазы. Киев: Наук, думка, 1982.- 176 с.
34. Контурек С.Дж. Соматостатин, секреция и двигательная активность желудочно-кишечного тракта // Желудочно-кишечные гормоны / Под ред. М. Гроссмана. -М., 1981. С. 199-206.
35. Коробов Н.В. Даларгин опиоидный пептид периферического действия // Фармакология и токсикология. - 1988. - № 4. - С. 35-38.
36. Коротько Г.Ф. Желудочное пищеварение, его функциональная организация и роль в пищеварительном конвейере. Ташкент: Медицина, 1980. - 78 с.
37. Коротько Г.Ф. Саморегуляция панкреатической секреции // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1994. - Т.4, № 3.- С. 10-14.
38. Коротько Г.Ф. Регуляторные свойства ферментов пищеварительных желез // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1996. - Т. 82, № 3. - С. 74-81.
39. Коротько Г.Ф. Регуляция секреции поджелудочной железы // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 1999. - Т. 9., № 4.- С. 41-49.
40. Коротько Г.Ф., Восканян С.Э. Генерализованное и селективное обратное торможение секреции панкреатических ферментов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова 2001. - Т. 87, № 7. - С. 982-994.
41. Корочанская С.П., Сторожук П.Г. К методике определения амилазы // Лабораторное дело. 1974. - № 5. - С. 310-311.
42. Курзанов АН. Роль энкефалинов в пептидергической и холинергической регуляции гастродуоденопанкреатического комплекса. Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Краснодар, 2001. - 42 с.
43. Курзанов А.Н., Генрих С.Р., Алейник В.А. Влияние лей-энкефалина и его аналогов на секреторную и моторную деятельность желудка // Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем. Томск, 1989. - С. 61-62.
44. Курзанов А.Н., Теплюк С.Г., Алейник В.А. Влияние даларгина на желудочную и панкреатическую секрецию // Нейропептиды в экспериментальной и клинической практике. М., 1986. - С. 37-54.
45. Ленинджер А. Основы биохимии / Пер. с англ. -М.: Мир, 1985. Т. 3. -320 с.
46. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов // Химия протеолитических ферментов. 3-й симпоз.: Тез. докл. и стенд, сообщений. 1993. - С.
47. Маланьина Н.С. Секреторно-выделительная деятельность желудка у детей первой недели жизни и ее изменение под влиянием сальпепсина и пепсикона: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1974. - 19 с.
48. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэл В. Биохимия человека: В 2-х томах / Пер. с англ.: М.: Мир, 1993. - Т. 2. - 415 е., с шт.
49. Мерков A.M., Поляков Л.Е. Санитарная статистика. М.: Медицина, 1974.-С. 51-92.
50. Мирза-заде A.A., Мирза-заде В.А. Панкреатический полипептид: обзор // Пробл. эндокринологии. 1987. - Т. 33, № 4. - С. 81-84.
51. Мосолов ВВ. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. - 414 с.
52. Нейрогуморальная регуляция пищеварения / Под ред. В.Х. Василенко, E.H. Кочиной; АМН СССР. М.: Медицина, 1983. - 288 с.
53. Павлюченко И.И. Сравнительная биохимическая и физиологическая характеристика ферментных препаратов поджелудочной железы: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-нД, 1987. - 16 с.
54. Панасюк E.H., Скляров А.Я., Скляров Е.Я. Пепсиноген: физиологические и клинические аспекты // Врачеб. дело. 1990. - № 10. - С.80-83.
55. Пятницкий Н.П. Определение пепсина, химозина, уропепсиногена, ге-мопепсиногена, лактопепсиногена и химотрипсина // Достижения биологии в сельское хоз-во. - М., 1965. - С. 158-160.
56. Пятницкий Н.П. Способ получения искусственного желудочного сока: A.c. №200740, 1967.
57. Пятницкий Н.П. Способ определения пепсина: A.c. № 211030, 1968.
58. Пятницкий Н.П. Лекарственное средство: A.c. № 289812, 1970.
59. Пятницкий Н.П., Пятницкая И.Н. Лекарственное средство: A.c. № 263808,1969.
60. Радбиль О.С., Федорова М.В. О новом принципе торможения желудочной секреции. Обз. лит. // МРЖ. 1985. - Разд. 17, № 9. - С. 1-4.
61. Рафес Ю.И., Ягмур С.С. Об общих эффектах гастрина (пентагастрина) // Терапевт.арх. 1977. - Т. 49, № 2. - С. 37-38.
62. Руководство по изучению питания и здоровья населения./Под ред. A.A. Покровского. М.: Медицина, 1964. - 280 с.
63. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ганкина Э.С., Шатц В.А. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993.-464 с.
64. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 358 с.
65. Смагин В Г., Виноградов В.А., Шаталов В Н., Полонский В.М., Булгаков С.А., Анохина В.В., Беспалова Ж.Д. Ингибирующий эффект лей-энкефалина на желудочную секрецию у собак // Бюл. экспер. биологии и медицины. 1980. - № 6. - С. 652-654.
66. Соловьева Г.И., Народецкая P.B. Ответная реакция поджелудочной железы крыс на воздействие секретина и панкреозимина в условиях разного питания // Вопр. питания. 1987. - № 5. - С. 50-53.
67. Соловьева И.А., Климов П.К. Морфологическое обоснование единства нервного и гормонального контроля деятельности желудка // Физиол. журн. СССР. 1977. - Т. 63. - С. 1574-1579.
68. Столяров Б. В., Савинов И. М., Витенберг А. Г., Карцова А. А., Зенкевич И.Г., Калмановский В.И., Каламберт Ю.А. Практическая газовая и жидкостная хроматография. СПб.: Изд-во С.-Петербург, ун - та, 1998. -612 с.
69. Сторожук П.Г., Анашкина Т.И. Экспресс-метод количественного определения активности амилазы слюны, панкреатического сока и диастазы мочи И 2-й Всесоюз. биохим. съезд: Тез. секц. сообщ. Ташкент, 1969. -Секция 24.-С. 90-91.
70. Сторожук П.Г., Криштопа B.JI. Спектрофотометрическое определение суммарной активности протеиназ панкреатического сока // Сб. материалов к науч. конф. молодых ученых Кубани. Краснодар, 1969. -С. 115-116.
71. Сторожук П.Г. Гидролитическое расщепление белковых продуктов животного происхождения некоторыми ферментами желудочно-кишечного тракта // Вопр. питания. 1970. - № 4. - С. 3-8.
72. Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Маланьина Н.С. Влияние новых отечественных препаратов пепсина на желудочную секрецию у собак // Конф. молодых ученых Кубанского мед. института «Патология пищеварения». 1979.-С. 8.
73. Сторожук П.Г., Литвинова Т.Н., Быков И.М. Влияние пептидов, входящих в состав лечебных препаратов пепсина, на желудочную секрецию усобак // Конф. молодых ученых Кубанского мед. института «Патология пищеварения». 1979а. - С. 138-140.
74. Сторожук П.Г., Быков И.М., Литвинова Т.Н. Полипептиды, выделенные из слизистой оболочки желудка, и их действие на биосинтез пепсина железами желудка // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1981. - № 2. - С. 40-42.
75. Сторожук П.Г., Мыкртычан М.М. Способ получения желудочного сока: А. с. №908358, 1982.
76. Сторожук П.Г. Успехи и проблемы ферментотерапии при патологии органов гастродуоденальной зоны // Некоторые вопр. медицинской и прикл. энзимологии: Науч. тр. Краснодар, 1985. - С. 4-15.
77. Сторожук П.Г., Быков И.М., Маланьина Н.С., Павлюченко И.И. Фер-ментообразующая функция пищеварительных желез под влиянием полипептида С, копепсидила и панинтестина // Украин. биохим. журн. -1986,- Т. 58, №5.-С. 84-87.
78. Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И. Способ получения биологически активного вещества для ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии. А. с. СССР№ 1476653 от 08.04.1987.
79. Сторожук П.Г., Быков И.М. К механизму действия препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии и целенаправленности их применения // Кубан. науч. мед. вестн. 1994. - № 24. - С. 137-140.
80. Сторожук П.Г., Быков И.М., Павлюченко И.И. Пептиды слизистой желудка и поджелудочной железы как вегетативно-гуморальные регуляторы пищеварения // Интеграция механизмов регуляции висцерал. функций. Майкоп, 1996. - С. 79-81.
81. Сторожук П.Г. Развитие идей И.П. Павлова в трудах ученых Кубанского медицинского института по физиологии и патологии органов пищеварения // Кубан. науч. мед. вестн. 2000. - № 2. - С. 8-13.
82. Сторожук П.Г., Быков И.М., Брещенко Е.Е., Хвостова Т.С., Быков М.И., Плахотнюкова В.В. Новый взгляд на механизмы действия препаратов ферментозаместительной терапии в гастроэнтерологии И Аллергология и иммуннология. 2001а. - Т. 2, № 1. - С. 148-154.
83. Стыскин Е.Л., Илинсон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Мир, 1986. - 246 с.
84. Теплюк С.Г. Влияние даларгина на уровень желудочной секреции // Бюлл. ВКЦН АМН СССР. 1988. - № 2. - С. 67-68.
85. Тимофеева Н.М. Роль пептидаз в ассимиляции белков // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1993. - Т. 79, № 6. - С. 1-18.
86. Тимофеева Н.М. Гидролазы тонкой кишки // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2000. - Т. 10, N 1. - С. 41-47.
87. Уголев A.M. Энтериновая (кишечная гормональная) система. JL: Наука, 1978.-314 с.
88. Уголев A.M. Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций. Л.: Наука, 1985. - 544 с.
89. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. Л.: Наука, 1987. - 304 с.
90. Уголев A.M. Теория адекаватного питания и трофология. СПб.: Наука, 1991.-271 с.1. М.: Наука, 1995.-283 с.
91. Физиология пищеварения: Рук. по физиологии / Под ред. A.B. Соловьева. Л.: Наука, 1974. - 761 с.
92. Хангалдова Т.Н. Новые отечественные препараты пепсина и их влияние на желудочную секрецию у собак: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Краснодар, 1977. - 15 с.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.