Выделение и физико-химические свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта сома европейского Silurus glanis L. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Улитина, Нина Николаевна

• Улитина, Нина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Улитина, Нина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР.

1.1. Характеристика исследуемых ферментов рыб и других позвоночных животных.

1.1.1. Пепсины.

1.1.2. Трипсины.

1.1.3. Химотрипсины.

1.1.4. Эластазы.

1.1.5. Аминопептидазы.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Материал и реактивы.

2.2. Очистка ферментов.

2.2.1. Приготовление водных экстрактов, определение инактивации исследуемого материала при обработке ацетоном.

2.2.2. Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов.

2.2.3. Гель-хроматография, обессоливание препаратов.

2.2.4. Ионообменная хроматография.

2.2.5. Изоэлектрофокусирование, определение изоэлектрических точек ферментов.

2.3. Определение активности ферментов.

2.3.1. Определение активности протеиназ по природным субстратам.

2.3.2. Определение активности протеиназ по синтетическим субстратам.

2.4. Определение количества белка.

2.5. Изучение физико-химических свойств ферментов.

2.5.1. Определение диапазонов рН стабильности и активности.

2.5.2. Определение температурного оптимума действия.

2.5.3. Определение влияния ионов металлов и ингибиторов.

2.5.4. Определение молекулярных масс.

2.6. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта сома.

3.2. Выделение и очистка протеолитических ферментов сома европейского.

3.2.1. Определение содержания протеиназ в желудочно-кишечном тракте и влияние обработки ацетоном на их активность.

3.2.2. Осаждение исследуемых ферментов сульфатом аммония.

3.2.3. Разделение и обессоливание водорастворимых белков слизистой оболочки желудка гель-хроматографией.

3.2.4. Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка.

3.2.5. Разделение ферментов слизистой оболочки желудка ионообменной хроматографией.

3.2.6. Разделение и обессоливание водорастворимых белков поджелудочной железы гель-хроматографией.

3.2.7. Определение изоэлектрических точек протеиназ поджелудочной железы.

3.2.8. Разделение ферментов поджелудочной железы ионообменной хроматографией.

3.3. Свойства протеолитических ферментов сома европейского.

3.3.1. Пепсины.

3.3.2. Трипсины.

3.3.3. Химотрипсины.

3.3.4. Эластазы.

3.3.5. Аминопептидазы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и физико-химические свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта сома европейского Silurus glanis L.»

Актуальность исследования. Протеолитические ферменты давно используются в пищевой промышленности [Ратушный J1.C., 1976; Журавская Н.К., Изотов О.В., 2002] и сельском хозяйстве [Сницарь А. и соавт., 1989; Цыперович А.С., 1971]. Важнейшей областью применения протеиназ является медицина. Препараты на их основе, наружно или в виде инъекций, назначают при лечении различных гастро-энтерологических заболеваний [Яковенко Э.П., 1998], гнойно-некротических процессов [Березов Т.Т, 1996; Стручков В.И. и соавт., 1970], офтальмологии, стоматологии и гинекологии [Боровский Е.В., 2003; Кузнецова Т.А. и соавт., 1997]. Несмотря на высокую эффективность применения, существующих препаратов протеиназ, они имеют ряд существенных недостатков: не стабильность при используемых значениях рН и индуцирование аллергических реакций. В фундаментальных исследованиях белковой химии протеиназы широко используются в качестве рабочего инструмента для изучения первичной структуры белков и пептидов. В молекулярной биотехнологии высокоочищен-ные препараты протеиназ используют для модификации белков путем частичного протеолиза [Глик Б., Пастернак Д., 2002]. В связи с этим в настоящее время остается актуальным поиск новых источников протеиназ с более высокой удельной активностью. Кроме этого, изучение свойств протеолитических ферментов рыб и их сравнение с соответствующими ферментами животных других классов позволяет получить дополнительные сведения об их происхождении и эволюции.

Многочисленные исследования протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта показали наличие у многих видов рыб протеиназ с высокой молярной активностью. Jonas Е. et al. в 1983 г. обнаружили в желудочно-кишечном тракте сома европейского Silurus glanis L. высокоактивные протеиназы, но исследование этих ферментов было не достаточно подробным. Кроме этого, сом европейский является ценным объектом прудового рыбоводства [Петрушин А.Б. и соавт., 1999]. В настоящее время, промысловый вылов этого вида в крупных масштабах ведется в дельте р. Волги в районе г. Астрахани. По требованиям санэпиднадзора выловленная рыба перед замораживанием потрошится, а большое количество потенциального сырья используется малоэффективно: только в качестве добавок в рационы птиц в сыром виде и частично перерабатывается на рыбную муку. Поэтому протеиназы пищеварительного тракта сома являются интересным и перспективным объектом исследования.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось определение спектра протеиназ желудочно-кишечного тракта сома с высокой удельной активностью и установление особенностей их физико-химических свойств.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка протеолитических ферментов из слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского (пепсина, трипсина, химотрипсина, эластазы и аминопептидазы).

2. Исследование физико-химических свойств этих протеиназ (молекулярная масса, значения изоэлектрических точек, оптимумы рН стабильности и активности, ингибиторный анализ).

3. Сравнение свойств протеиназ сома европейского с аналогичными ферментами других рыб и позвоночных животных других классов.

Научная новизна. При изучении протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского впервые установлено, что исследуемые протеиназы представлены несколькими изоформами, определены значения изоэлектрических точек этих протеиназ. Впервые определены молекулярные массы исследуемых протеиназ. Выяснены диапазоны рН стабильности и активности протеолитических ферментов с использованием природных и синтетических субстратов, с определением рН оптимумов.

Впервые у сома выделена и исследована аминопептидаза, обладающая свойствами сближающими ее с трипептид аминопептидазами больше, чем с лейцил аминопептидазами.

Впервые исследовано влияние синтетических ингибиторов на протеиназы слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы. Проведено сравнение молярной активности протеиназ пищеварительного тракта сома европейского и пищеварительных протеиназ млекопитающих. На основании ингибиторного анализа сделан вывод о строении активных центров исследуемых протеиназ.

Проведено сравнение протеолитических ферментов сома европейского с аналогичными ферментами других видов рыб и позвоночных животных других классов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют сведения о физико-химических свойствах протеолитических ферментов рыб и выявляют особенности в свойствах протеиназ сома европейского. В работе показано, что одна из трех изоформ пепсинов слизистой оболочки желудка сома европейского по свойствам и молярной активности ближе к пепсинам млекопитающих, чем рыб. Протеолитические ферменты сома европейского, также как и других видов рыб, в сравнении с аналогичными протеиназами других позвоночных животных имеют как сходство, так и отличия.

Благодаря высокой удельной активности протеолитических ферментов сома европейского слизистая оболочка желудка и поджелудочная железа могут служить недорогим источником ферментных препаратов с широким спектром применения.

Основные полоэюения, выносимые на защиту: 1. Распределение протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте сома неравномерно. Большая часть протеиназ секретируется в слизистой оболочке желудка и поджелудочной железе.

2. В слизистой оболочке желудка обнаружено три изоформы пепсина, из которых две являлись пепсинами типа II, характерными для многих хищных рыб, а одна обладала свойствами близкими к пепсинам млекопитающих.

3. В поджелудочной железе сома обнаружено по три изоформы трипсина и хи-мотрипсина, а также эластазы I и II типа.

4. Одна изоформа пепсина и две изоформы трипсина сома имеют молярную активность выше, чем соответствующие ферменты млекопитающих.

5. Протеолитические ферменты поджелудочной железы сома и соответствующие ферменты позвоночных животных других классов обладают, как общими свойствами, так и отличительными особенностями.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Улитина, Нина Николаевна

выводы

1. Из желудочно-кишечного тракта сома европейского впервые были выделены и очищены по три изоформы пепсина, трипсина и химотрипсина, а также две изоформы эластазы и одна изоформа аминопептидазы.

2. Изоточки исследуемых ферментов были определены при следующих рН: у пепсинов - 1,90, 3,20 и 4,75, у трипсинов - 4,42, 5,64 и 6,90, у химотрипсинов - 4,93, 5,23 и 6,18, у эластаз - 6,17 и 8,48. Изоточка аминопептидазы была определена при рН 4,87.

3. Значения молекулярных масс протеолитических ферментов составили: для пепсинов - 30 200 Да и 39 800 Да, трипсинов - 30 100 Да, химотрипсинов -39 800 Да и для эластаз - 24 000 Да.

4. Установлено, что пепсины сома с изоточками 3,20 и pi 4,75 обладали свойствами характерными для пепсинов типа II, описанных Гилдбергом для рыб. Молярная активность пепсина с изоточкой 3,20 была выше в 1,5 раза, чем у пепсина свиньи.

5. Изоформа пепсина с изоточкой 1,90 по своим свойствам ближе к пепсинам млекопитающих, чем рыб.

6. Сериновые протеиназы поджелудочной железы сома не обладали стабильностью ниже рН 5,0 и выше рН 10.0. Оптимумы действия щелочных протеиназ были определены при щелочных значениях рН от 8,0 до 10,5. Эластаза с изоточкой 6,17 обладала максимальной активностью при рН 11,8.

7. Химотрипсины сома, в отличие от химотрипсинов рыб не имеющих желудка, имели низкую молярную активность, а молярная активность трипсинов сома, также как и у других видов рыб, была в несколько раз выше по сравнению с соответствующими ферментами млекопитающих.

8. Эластаза с изоточкой 6,17 проявляла свойства типичные для панкреатических эластаз I типа других позвоночных животных. Эластаза с изоточкой 8,48 обладала свойствами характерными для панкреатических эластаз II типа, обнаруженных у представителей всех классов позвоночных животных.

9. Для аминопептидазы сома характерны свойства сближающие ее с трипептид аминопепти дазами.

Ю.Протеолитические ферменты поджелудочной железы сома европейского и соответствующие ферменты других видов рыб обладают общими физико-химическим свойствами, но отличаются от аналогичных ферментов млекопитающих (преобладание анионных изоформ, кислотонестабильность, сравнительно широкие диапазоны стабильности, высокие оптимумы рН активности, высокая молярная активность).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы из слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома европейского были выделены и охарактеризованы протеолитические ферменты. Пепсины (аспартильные протеиназы слизистой оболочки желудка), а также сериновые протеиназы поджелудочной железы (трипсин, химотрипсин и эластаза) сома - ферменты встречающиеся у всех позвоночных животных. Выделенные ферменты обнаружили много сходных свойств с протеиназами других позвоночных животных, но имелись и отличительные особенности. Впервые было установлено, что исследуемые протеиназы сома представлены несколькими изоформами, значения изоточек которых нами были определены. Также впервые были определены молекулярные массы большинства исследуемых ферментов, установлены диапазоны рН стабильности и активности, по различным субстратам, с указанием оптимумов. Впервые исследовано взаимодействие этих протеиназ с ингибиторами.

Для разделения протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и поджелудочной железы сома по молекулярным массам был использован сефадекс G-75. Изоэлектрические точки исследуемых протеиназ определяли изоэлектрофокусированием в градиенте плотности сахарозы. Ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе удалось разделить изоформы пепсинов, трипсинов, химотрипсинов и эластаз. У аминопептидазы сома изоформ обнаружено не было.

Отличительной особенностью слизистой оболочки желудка сома являлось наличие многослойного эпителия, как у лососевых рыб [Воронина Е.П., 1997 (1)], тогда как у других видов рыб и амфибий эпителий однослойный [Воронина Е.П., Неелов А.В., 2001; Фиц И.В., 2001]. Из трех выделенных пепсинов, две изоформы с pi 3,20 и pi 4,75 обладали свойствами типичными для пепсинов типа II рыб, а изоформа с pi 1,90 по некоторым свойствам (оптимумы рН стабильности и активности, температурный оптимум действия) имела больше сходства с пепсинами млекопитающих, чем рыб. Пепсин с pi 3,20 в слизистой оболочке желудка сома был представлен в большем количестве, чем другие изоформы. Эта же изоформа пепсина обладала молярной активностью в 1,5 раза выше, чем пепсин свиньи.

Поджелудочная железа сома является вполне компактным органом, состоящим из нескольких лопастей, общий проток которой перед впадением в двенадцатиперстную кишку соединяется с желчным. Протеолитические ферменты, выделенные из поджелудочной железы сома, и соответствующие протеиназы позвоночных животных других классов имеют как общие черты, так и отличия. Общие свойства трипсинов: примерно одинаковые молекулярные массы, оптимумы рН активности находятся в щелочном диапазоне, протеиназы стабилизируются ионами Са , обладают единой субстратной специфичностью, их активность угнетается ингибиторами сериновых протеиназ. Отличительные особенности трипсинов сома, как и других видов рыб: все изоформы трипсинов - анионные, тогда как большинство трипсинов млекопитающих являются кати-онными [Kleine R., 1969; Walsh К., 1970]; трипсины не стабильны в кислой среде, а соответствующие ферменты млекопитающих стабильны около рН 3,0-4,0 [Voytek P., Gjessing Е., 1971; Проскуряков М.Т., 1973; Нортроп Д. и соавт., 1950]; оптимум рН действия ферментов сома и других видов рыб находится при более щелочных значениях рН, чем у млекопитающих [Smillie L. et al., 1968; Проскуряков М.Т., 1973]; широкие диапазоны рН стабильности и активности, в отличие от трипсинов млекопитающих; трипсины сома и некоторых других видов рыб [Хаблюк В.В., 1983; Зозуля Л.В., 1996] угнетаются ингибиторами сильнее, чем трипсины млекопитающих.

Особенности свойств, присущие трипсинам сома, можно применить и к химотрипсинам его поджелудочной железы, исключая высокую молярную активность. Кроме перечисленных отличий, нами были выделены особенности химотрипсинов сома, как вида имеющего желудок. Количество изоформ химотрипсинов видов рыб обладающих желудком не превышает трех, в отличие от них у безжелудочных видов было обнаружено около шести изоформ [Хаблюк В.В., 1983; Зозуля JI.B., 1996]. Все изоформы химотрипсина сома — анионные, а у соответствующих ферментов безжелудочных видов (карпа и толстолобика) имеются и катионные изоформы. Химотрипсины сома, в отличие от аналогичных ферментов карпа и толстолобика, не обладают высокой молярной активностью. Вероятно, это связано с наличием желудочного пищеварения.

Эластазы сома, выделенные из поджелудочной железы, по субстратной специфичности и некоторым другим свойствам (значения изоточек, оптимумы рН действия, молекулярные массы) были отнесены нами к эластазам I (эластаза сома с pi 6,17) и II (эластаза сома с pi 8,48). Наличие в поджелудочной железе двух типов эластаз характерно для многих видов рыб [Asgeirsson В. et al., 1998; Reeck G. et al., 1970; Gildberg A., Overbo K., 1990] и большинства позвоночных животных других классов [Фиц И.В., 2001; Нечепуренко В.В., 1998; Pubols М., 1991; Lewis U. et al. 1956; Tiegelkamp S., Quandt J., 1997; Szilagyi C. et al., 1995; Largman C. et al., 1976]. Катионная эластаза II сома была представлена в значительно большем количестве, чем анионная эластаза I. Подобное соотношение эластаз наблюдалось и у других видов рыб [Хаблюк В.В., 1983; Reeck G. et al., 1970], земноводных [Фиц И.В., 2001] и птиц [Нечепуренко В.В., 1998]. Имеется ли такое соотношение эластаз I и II у млекопитающих утверждать трудно, так как в доступной нам литературе не оказалось данных по сравнительному содержанию 2-х форм эластазы.

Аминопептидаза сома, очищенная из экстракта поджелудочной железы, не проявляла свойств типичных для лейцил аминопептидаз, так как не активировалась ионами Mg и Мп , слабо ингибировалась ЭДТА и проявляла субстратную специфичность не совсем характерную для лейцил аминопептидаз. По этим свойствам аминопептидаза сома ближе к трипептид аминопептидазам, чем к другим аминопептидазам.

Благодаря высокой удельной активности протеолитических ферментов сома европейского слизистая оболочка желудка и поджелудочная железа могут служить недорогим источником ферментных препаратов с широким спектром применения.

Таким образом, на основании полученных данных и сравнительного анализа протеолитических ферментов сома европейского и позвоночных животных других классов можно сделать вывод, что сходство распределения и свойств протеиназ в желудочно-кишечных трактах различных видов свидетельствует о единых молекулярных механизмах приспособления к быстрому и более полному перевариванию белковой пищи, а отличия являются адаптивными приспособлениями, характерными для представителей различных классов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Улитина, Нина Николаевна, 2005 год

1. Ахмеджанов Р.А. Ингибитор трипсина из люцерны / Р.А. Ахмеджанов, Е.Я. Софьина, P.P. Шарипов, Т.Т. Рахимов // Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 1. - С. 37- 44.

2. Беленький Н.Г. Новое в производстве ферментов и ферментативных препаратов из животного сырья / Н.Г. Беленький, Л.Б. Полонская, Н.Н. Чамин. — М.: ЦИНТИ Пищепром, 1966. 102 с.

3. Березов Т.Т. Применение ферментов в медицине / Т.Т. Березов // Соросовский образоват. журн. 1996. - № 3. - С. 23 - 27.

4. Боровский Е.В. Клиническая эндодонтия / Е.В. Боровский. М.: АО Стоматология, 2003.- 176 с.

5. Ванчугова Л.В. Взаимодействие овомукоида из белка куриных яиц с сериновы-ми протеиназами / Л.В. Ванчугова, Т.А. Валуева, В.И. Ромашкин, М.А. Розен-фельд, Л.И. Валуев, В.В. Мосолов // Биохимия. 1988. - Т. 53, № 9. - С. 1455 -1461.

6. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в медицинской практике / К.Н. Веремеенко. Киев: Здоровье, 1971. - 216 с.

7. Воронина Е.П. Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта молоди некоторых дальневосточных лососевых рыб (семейство Salmonidae) / Е.П. Воронина // Вопросы ихтиологии. 1997 (1). - Т. 37, № 5. - С. 667 - 675.

8. Воронина Е.П. Анатомо-гистологические особенности пищеварительного тракта лососевидных рыб (Salmonoidei) / Е.П. Воронина // Вопросы ихтиологии. -1997 (2). Т. 37, № 5. - С. 676 - 688.

9. Воронина Е.П. Особенности строения пищеварительного тракта рыб семейства Channichthyidae (Notothenioidei) / Е.П. Воронина, А.В. Неелов // Вопросы ихтиологии.-2001.-Т. 41, № 6. С. 816- 827.

10. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. М.: Мир, 2002. - 577 с.

11. Журавская Н. К. Использование протеолитических ферментов и антиоксидан-тов для производства рубленных полуфабрикатов / Н.К. Журавская, О.В. Изотов // Мясная индустрия. 2002. - № 9. - С. 23 - 26.

12. Кудинов С.А. Получение и исследование ферментативных препаратов поджелудочной железы китов / С.А. Кудинов, М.Р. Колодзейская, JI.A. Коноплич, Л.Б. Маленьких, Н.Б. Аюшин // Прикладная биохимия и микробиология. — 1986. Т. 22, № 1. - С. 53 - 58.

13. Кузьмина В.В. Особенности становления пищеварительной функции рыб /В.В. Кузьмина, А.Г. Гельман // Вопр. ихтиологии. 1998. - Т. 38, № 1. - С. 113 — 122.

14. Методическое руководство по приготовлению буферных растворов. — Краснодар, 1973.- 45 с.

15. Мосолов В.В Протеолитические ферменты / В.В. Мосолов. М.: Наука, 1971. — 414 с.

16. Нечепуренко В.В. Протеолитические ферменты поджелудочной железы кур: дис. канд. техн. наук / В.В. Нечепуренко. Краснодар, 1998. - 163 с.

17. Нортроп Д. Кристаллические ферменты / Д. Нортроп, М. Кунитц, Р. Херриотт.- М.: Изд-во иностр. лит., 1950. 346 с.

18. Остерман JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / JI.A. Остерман. -М.: Наука, 1983.-304 с.

19. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / JI.A. Остерман. — М.: Наука, 1985.-535 с.

20. Петрушин А.Б. Сом обыкновенный / А.Б. Петрушин, Г.М. Приданов, А.Н. Дьяконов // Рыбоводство и рыболовство. 1999. - №2. - С. 14.

21. Пивенко Т.Н. Получение и свойства трипсина из пилорических придатков тихоокеанских лососей / Т.Н. Пивенко, JI.M. Эпштейн, М.В. Колодзейская, С.А. Кудинов // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. - Т. 25, № 4. - С. 490-497.

22. Проскуряков М.Т. Сравнительно-биохимическая характеристика трипсинов и химотрипсинов различных животных: дис. д-ра биол. наук / М.Т. Проскуряков.- Краснодар, 1973. 296 с.

23. Пятницкий Н.П. Исследование над природой пепсина холоднокровных и теплокровных животных / Н.П. Пятницкий // Тр. Куб. мед. института 1920-1945. -Краснодар, 1947. С. 50 - 62.

24. Пятницкий Н.П. Простой способ определения пепсина в желудочном соке / Н.П. Пятницкий // Клинич. медицина. 1955. - №4. - С. 74 - 75.

25. Пятницкий Н.П. Определение активности химотрипсина по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси / Н.П. Пятницкий, М.Т. Проскуряков // Материалы 17-й научн. конференции физиологов юга РСФСР. — Ставрополь, 1969. — Т. 2. С. 80 - 82.

26. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: теория, методы и применение / П. Ригетги. М.: Мир, 1986. - 398 с.

27. Румш Л.Д. Химия протеолиза / Л.Д. Румш // Биоорганическая химия. — 1994. — Т. 20, №2. С. 85 - 99.

28. Скоупс Р. Методы очистки белков / Р. Скоупс. М.: Мир, 1985. — 343 с. Сницарь А. Переработка рого-копытного сырья / А. Сницарь, И. Чернуха, М. Альмурзиев // Международный агропромышленный журнал. - 1989, № 6. - С. 118-121.

29. Суворов Е.К. Основы ихтиологии / Е.К. Суворов. Л.: Советская наука, 1948. — 579 с.

30. Фиц И.В. Очистка и свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта озерной лягушки: дис. канд. биол. наук / И.В. Фиц. — Краснодар, 2001.- 195 с.

31. Хаблюк В. В. Очистка и свойства пищеварительных ферментов из гепатопанкреаса карпа: дис. канд. биол. наук / В.В. Хаблюк. Краснодар, 1983 (1). - 191 с.

32. Хаблюк В. В. Очистка и некоторые свойства лейцинаминопептидазы из гепатопанкреаса карпа / В.В. Хаблюк, М.Т. Проскуряков // Прикладная биохимия и микробиология. 1983 (2). - Т. 19, № 4. С. 537 - 540.

33. Хоштария Д.Э. Стабилизирующее влияние хлористого калия на активную кон-формацию а — химотрипсина / Д.Э. Хоштария, В.В. Тополев // Биоорг. химия. — 1980. Т. 6, № 3. - С. 455 - 560.

34. Хочачко П. Стратегия биохимической адаптации / П. Хочачко, Дж. Самеро. -М.: Мир, 1977.-398 с.

35. Цыперович А.С. Ферменты / А.С. Цыперович. Киев: Техшка, 1971. - 358 с. Шугалей B.C. Ферментология / B.C. Шугалей, P.M. Кесслер. — Изд-во Ростов, ун-та, 1986.-94 с.

36. Ahsan M.N. Molecular Cloning and Characterization of Two Isoforms of Trypsinogen from Anchovy Pyloric Caeca / M.N. Ahsan, D. Funabara, S. Watabe // Mar. Biotechnol. 2001. - Vol. 3, № 1. - P. 80 - 90.

37. J. Alarcon, M. Diaz, F.J. Moyano, E. Abellan // Fish Physiol, and Biochem. 1998. -Vol. 19, №2.-P. 257-267.

38. Allan B. J. Human pancreatic proteins: amylase, proelastase and trypsinogen / B.J. Allan, N.I. Zagen, P.J. Keller // Arch, of Biochem. and Biophys. 1970. - Vol. 136, № 4. - P. 529 - 540.

39. Appel W. Chymotrypsin: Molecular and Catalytic Properties / W. Appel // Clinical Biochemistry. 1986. - Vol. 19, № 6. - P. 317 - 322.

40. Asgeirsson B. Structural and kinetic properties of chymotrypsin from atlantic cod {Gadus morhua) / B. Asgeirsson, B. Bjarnason // Сотр. Biochem. and Physiol. — 1991. Vol. 99B, № 3. - P. 327 - 335.

41. Azuma K. Bovine Pancreatic Elastase II cleaves Gin lie Bond / K. Azuma, Y. Banshou, H. Suzuki // J. of Protein Chemistry. - 2001. - Vol. 20, № 7. - P. 577 -584.

42. Bateman K.S. Crystal structurew of human pepsinogen A / K.S. Bateman, M.M. Chernaia, N.I. Tarasova, M.N. James // Adv. Exp. Med. Biol. 1998. - Vol. 436, № 2.-P. 259-263.

43. Birk Y. Trypsin and Chymotrypsin Inhibitors from Soybean / Y. Birk // Methods in Enzymology. — L.: Acad. Press., 1976 (1). P. 700 - 707.

44. Birk Y. Protease Inhibitors from Potatoes / Y. Birk // Methods in Enzymology. L.: Acad. Press., 1976 (5). - P. 728 - 736.

45. Bieth J. Elastases: Structure, Function and Pathological Role / J. Bieth // Front. Matrix. Biol. Karger: Basel, 1978. - P. 1 - 82.

46. Burley S.K. Molecular structure of leucine aminopeptidase at 2,7-A resolution / S.K. Burley, P.R. David, A. Taylor, W.N. Lipscomb // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. Vol. 87, № 17. - P. 6878 - 6882.

47. Campos L.A. The active site of pepsin is formed in the intermediate conformation dominant at mildly acid pH / L.A. Campos, J. Sancho // FEBS Lett. 2003. - Vol. 538,№ 1-3.-P. 89-95.

48. Caruso G. Attivita enzimatica nell'apparato digerente di Seriola dumerilli (Risso, 1810) in allevamento intensivo / G. Caruso, L. Genovese // Proc. 23rd Congress S.I.B.M. Ravenna. 1992. - P. 45 - 50.

49. Chiu S.-T. Digestive protease activities of juvenile and adult eel (Anguilla japonica) fed with floating feed / S.-T. Chiu, B.S. Pan // Aquaculture 2002. - Vol. 205, № i 2.-P. 141-156.

50. Colomb E. The two human trypsinogens: catalytic properties of corresponding trypsins / E. Colomb, O. Guy, P. Deprex, P. Michel, C. Figarella // Biochim. et Biophys. Acta. 1979. - Vol. 525, № 1. - P. 186 - 193.

51. Cs-Szabo G. Specifity of Pancreatic Elastase with Tripeptidyl-p-nitroanilide Substrates / G. Cs-Szabo, M. Pozgay, R. Gaspar, P. Elodi // Acta. Biochim. et Biophys. Acad. Sci. Hung. 1980. - Vol. 15, № 4. - P. 263 - 273.

52. Cuvier-Peres A. Development of some digestive enzymes in Eurasian perch larvae Perca fluviatilis / A. Cuvier-Peres, P. Kestemont // Fish Physiol, and Biochem. — 2001. Vol. 24, № 4. - P. 279 - 285

53. Donta S.T. Chicken Pepsinogens / S.T. Donta, H.V. Vunakis // Methods in Enzymology. L.: Acad. Press., 1970. - P. 358 - 363.

54. Esumi H. Purification of mouse pepsinogens by pepstatin affinity chromotography / H. Esumi, S. Sato, T. Sugimura, C. Furihata // North-Holland Biomedical Press. -1978. - Vol. 86, № 1. - P. 33 - 36.

55. Feinstein G. Human Pancreatic Proteolytic Enzymes and Protein Inhibitors: Isolation and Molecular Properties / G. Feinstein, R. Hofstein, J. Koifmann, M. Sokolovsky // Eur. J. Biochem. 1974. - Vol. 43, № 3. - P. 569 - 581.

56. Fletcher T.S. Primary structure of human pancreatic elastase 2 determined by sequence analysis of the cloned mRNA / T.S. Fletcher, W-F Shen, C. Largman // Biochemistry. 1987. Vol. 26. - P. 7256 - 7261.

57. Folk J.E. Chymotrypsin C. Isolation of the Zymogen and the Active Enzyme: Preliminary Structure and Specificity Studies / J.E. Folk, E.W. Schirmer // J. Biol. Chemistry. 1965. - Vol. 240, № 1. - P. 181 - 192.

58. Foltmann B. Prochymosin and chymosin / B. Foltmann // Methods in Enzymology. — L.: Acad. Press., 1970. P. 421 - 436.

59. Foltmann B. A developmental analysis of the production of chymosin and pepsin in pigs / B. Foltmann, A.L. Jensen, P. Lonblad, E. Smidt, N. Axelsen // Сотр. Biochem. and Physiol. 1981.-Vol. 68B, № l.-P. 9- 13.

60. Gjessing E. Crystallization and Characterization of an Esteroproteolytic Enzyme from Porcine Pancreas / E. Gjessing, J. Harnett // J. Biol. Chem. 1962. - Vol. 237, №7.-P. 2201 -2206.

61. Hall D.A. The Reactions between Elastase and Elastic Tissue. II. Preparation and Properties of the Enzyme / D.A. Haal, J.E. Gardiner // Biochem. J. 1955. — Vol. 59, № 3. - P. 465-470.

62. Hartley T. The isolation and partial characterization of trypsin from the pancreas of the ostrich (Struthio camelys) / T. Hartley, R.J. Naude, W. Delofsen // Сотр. Bio-chem. and Physiol. 1987. - Vol. 86B, № 4. - P. 705 - 710.

63. Heu M.S. Comparison of trypsin and chymotrypsin from the viscera of anchovy, Engraulis japonica / M.S. Heu, H.R. Kim, J.H. Pyeun // Сотр. Biochem. and Physiol.-1995.-Vol. 112B,№3.-P. 557-567.

64. Hirjii K.N. Leucine Aminopeptidase Activity in the Digestive Tract of Perch, Perca fluviatillis / K.N. Hirjii, W.A.M. Courthey // J. Fish. Biol. 1982. - Vol. 21, № 6. -P. 515-622.

65. Hirasawa A. Purification and characterization of turtle pepsinogens and pepsins / A. Hirasawa, B.P.A. Senarata, K. Takahashi // J. Biochem. 1996. - Vol. 120, № 2. - P. 407-414.

66. Hjelmeland K. Characteristics of two trypsin type isozymes isolated from the Arctic fish capelin (Mallotus villosus) / K. Hjelmeland, J. Raa // Сотр. Biochem. and Physiol. 1982. - Vol. 71B, № 3. - P. 557 - 562.

67. Kageyama T. The Complemete Amino Acid Sequence of Monkey Pepsinogen A / T. Kageyama, K. Takahashi //J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, № 10. - P. 4395 -4405.

68. Katagiri K. One step purification procedure of elastase from pancreatic powder by affinity chromatography / K. Katagiri, T. Takeuchi, M. Sasaki // Anal. Biochem. -1978.-Vol. 86.-P. 159- 165.

69. Kawai M. High-molecular-mass isoform of aminopeptidase N/CD 13 in serum from cholestatic patients / M. Kawai, Y. Hara // Clin. Chim. Acta. 2003. - Vol. 330, № 1-2.-P. 141-149.

70. Kleine R. Die Evolution der Proteine unter besonderer Berucksichtigung der proteolytischen Enzyme / R. Kleine // Biologische Rundschau. 1969. - H. 4, № 7. — S. 159- 169.

71. Kristiansson M.M. Purification and characterization in two chymotrypsin-like proteases from the pyloric caeca of rainbow trout (Oncorhynchys mykiss) / M.M. Kristiansson, H.H. Nielsen // Сотр. Biochem. and Physiol. 1992. - Vol. 101B, № 2.-P. 247-253.

72. C. Largman, J. W. Brodrick, M.C. Geokas // Biochemistry. 1976. - Vol. 15, № 11. -P. 2491 -2500.1.wis U.Y. Pancreatic Elastase: Purification, Properties and Function / U.Y. Lewis,

73. Mares-Guia M. Studies on the Active Center of Trypsin. The Binding of Amidines and Guanidines as Models of the Substrate Site Chaik / M. Mares-Guia, E. Shaw // J. Biol. Chem. 1965.-Vol. 240.-P. 1579.

74. Martinez A. Purification and characterization of a two trypsin-like enzyme from the digestive tract of anchovy (Engraullis encrasicholus) / A. Martinez, R.L. Olsen, Y.J. Serra // Сотр. Biochem. and Physiol. 1988. - Vol. 9, № 4. - P. 677 - 684.

75. Martinez A. Proteolytic activities in the digestive tract of anchovy (Engraulis encrasicholus) / A. Martinez, J.L. Serra 11 Сотр. Biochem. and Physiol. — 1989. -Vol. 93B, № 1.-P. 61-66.

76. McDonald M.R. The effect of calcium and other ions on the autocatalytic formation of trypsin from trypsinogen / M.R. McDonald, M. Kunitz // J. Gen. Physiol. Vol. 25.-P. 53.

77. Mockel W. Isolation and properties of some reptilian and fish chymotrypsins / W. Mockel, E.A. Barnard // Biochim. et Biophys. Acta. 1969. - Vol. 178, № 2. - P. 354-363.

78. Moutou K.A. Effects of salinity on digestive protease activity in the euryhaline sparid Sparus aurata L.: a preliminary study / K.A. Moutou, P. Panagiotaki, Z. Mamuris // Aquaculture Research. 2004. - Vol. 35. - P. 912 - 914.

79. Murakami K. Studies on proteinases from the digestive organs of sardine. I. Purification and characterization of three alkaline proteinases from the pyloric caeca / K. Murakami, M. Noda // Biochim. et Biophys. Acta 1981. - Vol. 658, № 1. - P. 17 -26.

80. Muto N. Purification and Characterization of Rat Pepsinogens Whole Contents Increase with Developmental Progress / N. Muto, S. Tani // J. Biochem. 1979.- Vol. 85, №6.-P. 1143- 1149.

81. Nielsen P.K. Purification and characterization of porcine pepsinogen В and pepsin В / P.K. Nielsen, B. Foltmann // Arch. Biochem. and Biophys. 1995. - Vol. 322, № 2. -P. 417-422.

82. Overnell J. Digestive Enzymes of the Pyloryc Caeca and of Their Associated Mesentery in the Cod (Gagus morhua) / J. Overnell // Сотр. Biochem. and Physiol. 1973. Vol. 46B, № 3.-P. 519-531.

83. Pemberton P.W. An aminopeptidase N deficiency in dog small intestine / P.W. Pem-berton, R.W. Lobley, S.H. Sorensen, R.M. Batt // Res. Vet. Sci. 1997. - Vol. 63, № 2.-P. 133- 138.

84. Prahl J.W. Pancreatic Enzymes of the Spiny Pacific Dogfish. 1. Cationic Chymotrypsinogen and Chymotrypsin // J.W. Prahl, H. Neurath // Biochemistry. — 1966. Vol. 5, № 6. - P. 2131 - 2146.

85. Pubols M. H. Ratio of digestive enzymes in the chick pancreas / M.H. Pubols // Poultry Science. 1991. - Vol. 70. - P. 337 - 342.

86. Richter C. Mechnism of activation of the gastric aspartic proteinases: Pepsinogen, progastricsin and prochymosin / C. Pichter, T. Tanaka, R. Yada // Biochem. J. — 1998. Vol. 335, № 3. - P. 481 - 490.

87. Ryle A.P. The Porcine Pepsins and Pepsinogens / A.P. Ryle // Methods in Enzymology. L.: Acad. Press., 1970 . - P. 316 - 336.

88. Seemuller U. Structure of the Elastase Cathepsin G Inhibitor of the Leech Hirudo medicinalis / U. Seemuller, M. Eulitz, H. Fritz, A. Stroll // Hoppe Seyler^s Z. Physiol. Chem.- 1980.-Vol. 361,№ 12.-P. 1841 -1846.

89. SefadexR. Gel Filtration in Theory and Practice / Uppsala: Uplands Graflska AB, 1974. 64 p.

90. Sekar V. Specificity of the Serine Protease Inhibitor, Phenylmethylsulfonil Fluoride / V. Sekar, J.H. Hageman // Biochem. and Biophys. Res. Comm. 1979. — Vol. 89, № 2.-P. 474-478.

91. Sharma K.K. Isolation and characterization of a new aminopeptidase from bovine lens / K.K. Sharma, B.J. Ortwerth // J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, № 9. - P. 4295-4301.

92. Shearwin K.E. Effect of ion on the dimerization of a-chymotrypsin / K.E. Shearwin, DJ. Winzor // Biochim. and Biophys. Acta. Protein. Struct, and Mol. Enzymol. -1990.-Vol. 1038,№ l.-P. 136- 138.

93. Shotton D. Elastase / D. Shotton // Methods in Enzymology. L.: Acad. Press., 1970. -P. 113-140.

94. Sielecki A.R. Refined structure of porcine pepsinogen at 1.8 A resolution / A.R. Si-elecki, M. Fujinada, R.J. Read, M.N. James // J. Mol. Biol. 1991. - Vol. 219. - P. 671-692.

95. Sielecki A.R. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution / A.R. Sielecki, A.A. Fedorov, A. Boodhoo, N.S. Andreeva, M.N. James // J. Mol. Biol. 1990. - Vol. 214. - P. 143 - 170.

96. Simpson В. K. Trypsin from Greenland cod (Gadus ogas). Isolation and comparative properties / B.K. Simpson, N.F. Haard // Сотр. Biochem. and Physiol. 1984. -Vol. 79B, № 4. - P. 613 - 622.

97. Simpson В. K. Characterization of the trypsin fraction from cunner (Tautogolabrus adspersus) / B.K. Simpson, N.F. Haard // Сотр. Biochem. and Physiol. 1985. -Vol. 80B, № 3. - P. 474 - 480.

98. Smillie L. Structure of chymotrypsinogen-B comparated with chymotrypsinogen-A and trypsinogen / L. Smillie, A. Furka, N. Nagabhushan, K. Stevenson // Nature. -1968. Vol. 218, № 5139. - P. 343-346.

99. Smine A. Extraction purification et characterization duine elastase pancreatique de thon (Thunnus albacora) / A. Smine, F. Guerard, J. Le Gal // Oceanis. 1992. - Vol. 18, №2.-P. 207-209.

100. Smith E.L. Leucine Aminopeptidase V. Activation, Specificity, and Mechanism of Action / E.L. Smith, D.H. Spackman // J. Biol. Chem. 1955. - Vol. 212, № 1. - P. 271 -299.

101. Squires E. J. Gastric proteases of the Greenland cod Gadus ogas. II Structural properties / E.J. Squires, N.F. Haard, L.A.W. Feltham // Biochem. Cell Biol. 1986. -Vol. 64.- P. 215-222.

102. Szilagyi C.M. Purification, characterization and substrate specificity of rat pancreatic elastase II / C.M. Szilagyi, P. Sarfati, L. Pradayrol, J. Morisset // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - Vol. 1251, № 1 - P. 55 - 65.

103. Tang J. Amino-acid sequence of porcine pepsin / J. Tang, P. Sepulveda, J.Jr. Marciniszyn, K.C. Chen, W.Y. Huang, N. Tao et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1973. Vol. 70. - P. 3437 - 3439.

104. Tanji M. The primary structure of the major pepsinogen from the gastric mucosa of tuna stomach / M. Tanji, E. Yakabe // J. Biochim. 1996. - Vol. 120, № 3. - P. 647 -656.

105. Taylor A. Aminopeptidases: structure and function / A. Taylor // FASEB J. — 1993. -Vol. 7, №2.-P. 290-298.

106. Tiegelkamp S. Pancreatic elastase I / S. Tiegelkamp // Labolife. 1997. - Vol. 6, № 6.-P.7-9.

107. Uchida N. Properties of two trypsin from a Oncorhyncus keta / N. Uchida, K. Tsukayama, E. Nichide // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1984. - Vol. 50, № 2. - P. 313 -321.

108. Umezawa H. Structures and Activities of Protease Inhibitors of Microbial Origin / H. Umezawa // Methods in Enzymology. L.: Acad. Press, 1976. - Vol. 45. - P. 678 -695.

109. Vander W.N. The isolation and partial characterization of chymotrypsinogen from the pancreas of the ostrich {Strurhio camelus) / W.N. Vander, R.J. Naude, W.

110. Oelofsen // Ind. J. Biochim. 1989. - Vol. 21, № 1. - P. 91 97.

111. Voytek P. Studies of an anionic trypsinogen and its active enzyme from porcinepancreas / P. Voytek, E.C. Gjessing // J. Biological. 1971. - Vol. 246, № 2. - P.508.516.

112. Walsh K. A. Trypsinogen and trypsin of various species / K.A. Walsh // Metods in Enzymol. -L.: Acad. Press., 1970.-Vol. 19.-P.41-63.

113. Westrom B.R. Identification and Characterization of Trypsin Chymotrypsin and Elastase Inhibitors in Porcine Serum / B.R. Westrom // Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem.- 1979.-bd. 36, h. 12.- S. 1869- 1878.

114. Wilcox P. E. Chymotrypsinogens Chymotrypsins / P.E. Wilcox // Metods in Enzymol. - L.: Acad. Press., 1970. - Vol. 19. - P. 64 - 108.

115. Willadsen P.A. A Chymotrypsin Inhibitor from the Parasitic Nematode Oesophagostomum radiatum / P.A. Willadsen // Austral. J. Biol. Sci. 1977. — Vol. 30,№ 5.-P. 411 -419.

116. Yoshinaka R. Distribution of trypsin and chymotrypsin and their zymogens in digestive system of catfish / R. Yoshinaka, M. Sato, S. Ikeda // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish.-1981 (2).-Vol. 47, № 12.-P. 1615-1618.

117. Yoshinaka R. Purification and some properties of elastase from the pancreas of catfish / R. Yoshinaka, H. Tanaka, M. Sato, S. Ikeda // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. -1982. Vol. 48, № 4. - P. 573 - 579.

118. Yoshinaka R. Purification and some properties of anionic trypsin from the catfish pancreas / R. Yoshinaka, T. Suzuki, M. Sato, S. Ikeda // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. — 1983 (1). Vol. 49, № 2. - P. 207 - 212.

119. Yoshinaka R. Characterization of catfish pancreatic elastase / R. Yoshinaka, H. Tanaka, M. Sato, S. Ikeda // Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 1983 (2). - Vol. 49, № 4. p. 637-642.

120. Yoshinaka R. Enzymatic characterization of anionic trypsin of tile catfish (Parasilurus asotus) / R. Yoshinaka, M. Sato, T. Suzuki, S. Ikeda // Сотр. Biochem. and Physiol. 1984 (1). - Vol. 77B, № 1. - P. 1 - 6.

121. Zhaowen Z. Trypsin inhibitor in Hydrophis cyanocinctus venom / Z. Zhao wen, C. Mingzhe, K. Hengming, S. Baxian, P. Fuxiong // Zool. Res. 1988. - Vol. 9, № 4. -P. 426-436.