Вредоносность латентных вирусов на груше и их диагностика методами ИФА и ПЦР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.11, кандидат сельскохозяйственных наук Саунина, Ирина Ивановна

• Саунина, Ирина Ивановна
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Саунина, Ирина Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Цель исследований.

Задачи исследований.

Научная новизна результатов исследований.

Предмет исследований.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Видовой состав и распространенность вирусов на груше.

1.2. Влияние вирусов на продуктивность и биохимические показатели у плодовых культур.

1.3. Действие иммуностимуляторов на фитопатогены.

1.4. Методы диагностики вирусов.

1.4.1. Диагностика вирусов методом иммуноферментного анализа.

1.4.2. Диагностика вирусов методом полимеразной цепной реакции.

1.4.2.1. Оптимизация параметров ОТ-ПЦР.

1.4.2.2. Модификации ПЦР.

1.4.2.3. Диагностика вирусов на груше методом ПЦР.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Время, место проведения исследований.

2.2. Метеорологические условия в годы проведения экспериментов.

2.3. Методика исследований.

2.3.1. Объекты исследований.

2.3.2. Характеристика изучаемых вирусов.

2.3.3. Характеристика изучаемых сортов.

2.3.4. Характеристика иммуностимуляторов.

2.3.5. Элементы учёта и наблюдений.

2.3.6. Краткие схемы опытов.

2.3.7. Методики тестирования растительных образцов на наличие вирусов.

2.3.7.1. Методика ИФА.

2.3.7.2. Методика ПЦР.

2.3.8. Методика количественного определения хлорофилла.

2.3.9. Методика определения активности пероксидазы.

2.3.10. Методика изучения антивирусных свойств препаратов рибав-экстра и циркон.

2.3.11. Методика изучения действия иммуностимуляторов на продуктивность деревьев.!.

2.3.12. Статистический анализ результатов исследований.

2.3.13. Расчет экономической эффективности результатов исследований.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Распространенность латентных вирусов на груше в

Московской области.

3.2. Совершенствование методов диагностики вирусов на груше.

3.2.1. Совершенствование метода ИФА.

3.2.2. Совершенствование метода ОТ-ПЦР.

3.2.3. Сравнительная оценка ИФА и ПНР.

3.3. Вредоносность вирусных болезней.

3.4. Изучение действия иммуностимуляторов на латентные вирусы и содержание хлорофилла в листьях груши.

3.4.1. Изучение антивирусного действия иммуностимуляторов.

3.4.2. Влияние иммуностимуляторов на содержание хлорофилла в листьях зараженных вирусами растений груши.

3.5. Изучение действия иммуностимуляторов на продуктивность деревьев груши.

ГЛАВА 4. ЭКОНОМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ.

4.1. Экономическая оценка ИФА и ОТ- ПНР.

4.2. Экономическая оценка применения иммуностимуляторов в саду.

ВЫВОДЫ.,.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Вредоносность латентных вирусов на груше и их диагностика методами ИФА и ПЦР»

Груша является одной из ведущих плодовых культур умеренного пояса, занимает второе место в мировом производстве плодов листопадных плодовых культур, уступая только яблоне. По данным ФАО, в мире ежегодно производится около 9-10 млн. тонн плодов груши на площади 1,7 млн. га. В России груша выращивается на площади 18 тыс. га с валовым сбором около 100 тыс. тонн (www.fao.org4). из них около 40 % производится в Европе: Италии, Франции, Испании и Германии. Из-за меньшей по сравнению с яблоней зимостойкости груша более требовательна к выбору зон для промышленного возделывания. Однако пищевая ценность плодов груши так высока, что ее пытаются выращивать в самых разнообразных, даже не подходящих для нее почвенно-климатических зонах. Например, в Российской Федерации ареал возделывания груши простирается от западных границ до Дальнего Востока (Туз, 1974).

Плоды десертных сортов груши отличаются маслянистой, сочной консистенцией мякоти, непревзойденным тонким ароматом и вкусом, привлекательным внешним видом. Наличие сортов с разными сроками потребления позволяет использовать свежие плоды груши 8-10 месяцев, а при современных методах хранения - практически круглый год. Деревья груши долговечны, при хорошем уходе грушевые сады прекрасно плодоносят десятки лет.

Плоды груши используются для различных видов переработки. Из них готовят варенье, компоты, повидло, грушевый мед (бекмес), соки и вина, а также сушат.

Народная медицина использует варенье, печеные плоды груш, отвар из сушеных груш, грушевый сок как диетические, профилактические и лекарственные продукты при различных заболеваниях.

Дикорастущие виды и формы груши используются в садоводстве в качестве семенных подвоев и для озеленения населенных пунктов (Душустина, 1979).

Древесина груши отличается твердостью и высоким удельным весом, имеет красивую красновато-коричневую окраску, используется в мебельной промышленности.

Деревья груши характеризуются меньшей по сравнению с яблоней периодичностью плодоношения, что частично связано с многоцветковостыо соцветий груши (Ефимова, Гиричев, 2005). Груша обладает высоким адаптационным потенциалом и способна занять достойное место в насаждениях плодовых культур средней полосы России (Каталог мировой коллекции ВИР, 1991). Поэтому в последнее время груша приобретает все большую популярность и в условиях Нечерноземной зоны России.

Одним из главных факторов, препятствующих распространению груши, является недостаток оздоровленного посадочного материала, а также слабая изученность вопросов вредоносности вирусов и эффективных способов оздоровления от них. Вирусные и фитоплазменные заболевания ввиду хронического порядка и высокой вредоносности считаются важнейшим лимитирующим фактором повышения общей урожайности плодовых культур, в том числе и груши.

Основным направлением борьбы с этими заболеваниями является перевод питомниководства на безвирусную основу и введение системы сертификации посадочного материала, что принято в большинстве европейских стран.

За последние годы мировой наукой достигнут существенный прогресс в изучении вирусных болезней плодовых культур. Отчасти это связано с разработкой высокочувствительных серологических и молекулярных методов диагностики. Однако ввиду ряда объективных факторов (латентный характер заражения растений большинством вирусов, отсутствие экспресс-ме-/ тодов диагностики для ряда возбудителей и т.д.) существующие методы диагностики не всегда показывают хорошие результаты. Дальнейшие исследования должны быть направлены на поиск решений, позволяющих быстро и качественно диагностировать вирусные болезни. Актуальность исследований в этом направлении заключается в необходимости совершенствования методов диагностики (ИФА и ПНР) применительно к биологическим особенностям груши.

В связи с выше изложенным нами определены следующие цель и задачи исследований.

Цель исследований - изучить распространенность и вредоносность латентных вирусов на груше и особенности их диагностики с использованием ИФА и ПЦР.

Задачи исследований:

1. Изучить распространенность латентных вирусов на груше;

2. Установить вредоносность вирусов на груше путем оценки действия вирусов на продуктивность и биохимические показатели растений;

3. Усовершенствовать методы диагностики (ИФА, ПЦР) вирусов на груше;

4. Установить действие иммуностимуляторов (рибав-экстра и циркон) на вирусы, биохимические показатели и продуктивность деревьев груши.

Методология настоящих исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности вирусов на груше и повышения эффективности и достоверности диагностики методов ИФА и ПЦР.

Научная новизна результатов исследований

Впервые разработана методика полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при тестировании груши на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони (АСЬ8У), бороздчатости древесины яблони (АБСУ) и ямчатости древесины яблони (АБРУ). Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика. На разработанный метод подана заявка на патент № 2008152268 от 30.12.2008 г.

Установлена локализация вирусов по побегу в зависимости от расположения листьев. Показано негативное влияние латентных вирусов на продуктивность и биохимические показатели у груши.

Впервые выявлено антивирусное действие иммуностимуляторов рибав-экстра и циркон в отношении латентных вирусов на груше, предложена методика по его оценке. Установлено положительное действие этих препаратов на продуктивность деревьев груши в саду.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Предложен новый высокоэффективный способ экстракции РНК вирусов из листьев груши для последующей надежной диагностики вирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции.

Разработанный способ диагностики внедрен в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии и прошел успешные испытания в фирме «Агродиагностика», где показано повышение эффективности выявления вирусов при выполнении ОТ-ПЦР по предложенному способу на 25 % в сравнении с известным.

Оптимизирована методика выполнения ИФА с учетом выявленных закономерностей распределения вирусов по органам и тканям груши и длительности ферментативной реакции. Указанная методика используется при тестировании груши на вирусы в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии.

Показана эффективность применения препаратов рибав-экстра и циркон в производственных условиях отдела испытания новых технологий ВСТИСП на площади 1 га.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Совершенствование методов иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции для тестирования на латентные вирусы груши.

2. Обоснование необходимости проведения посадок насаждений груши свободным от латентных вирусов посадочным материалом.

3. Обоснование целесообразности применения иммуностимуляторов в саду.

Предмет исследований:

Предметом исследований являются зависимость распространённости и вредоносности вирусов от местоположения насаждений и сортовых особенностей груши, а также эффективности диагностики вирусов от используемого метода и вида тест- образца.

Апробация работы Основные материалы диссертации доложены на VII молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» в РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (4 апреля 2007 г.) и Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые -садоводству России в XXI веке» (г. Москва, 11-12 октября 2007 г.).

Публикации

Основные результаты исследований по диссертации изложены в 4 научных работах, в том числе 2 - в рецензируемых научных журналах.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 116 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов, рекомендаций по практическому использованию, списка литературы из 157 источников, в том числе 105 - на иностранных языках, содержит 29 таблиц и 14 рисунков.

Заключение диссертации по теме «Защита растений», Саунина, Ирина Ивановна

выводы

1. Диагностика насаждений груши методом ИФА на наличие латентных вирусов в условиях Московской области показала, что наибольшим распространением характеризуется триховирус хлоротической пятнистости листьев яблони (35 % от числа обследованных деревьев). Капилловирус бороздчатости древесины яблони и фовеавирус ямчатости древесины яблони диагностированы на 24 %, иларвирус мозаики яблони - на 13 % обследованных деревьев груши.

2. При усовершенствовании метода ИФА установлена зависимость между скоростью протекания ферментативной реакции на заключительном этапе анализа и необходимостью изменения направления фотометрии. При быстром протекании ферментативной реакции требуется изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. Выявлена локализация латентных вирусов на груше в различных частях побега: преимущественно в листьях у основания побега и в средней его части. Число зараженных вирусами тест- образцов листьев, отобранных из верхушечной части побега, в 2,3-3,3 раза ниже по сравнению с листьями из других частей побега.

4. Отработана методика ОТ-ПЦР при тестировании на вирусы хлоротической пятнистости листьев яблони, бороздчатости древесины яблони и ямчатости древесины яблони. Для повышения эффективности выявления вирусной инфекции установлена необходимость использования на этапе экстракции РНК гидроксипроизводного бензойной кислоты и модифицированного метода сорбции вирусов на препарате силика.

5. Вредоносность латентных вирусов на груше проявляется в снижении числа плодов у зараженных деревьев на 41 % по сравнению со свободными от указанных вирусов деревьями.

6. Латентные вирусы оказывают негативное влияние на биохимические показатели у растений груши: содержание суммарного хлорофилла в листьях снижается на 9 %, а активность фермента растворимой пероксидазы возрастает на 60 %.

7. Обработка побегов груши препаратами рибав-экстра и циркон в оптимальных концентрациях способствует увеличению содержания хлорофилла в листьях соответственно на 38 % и 39 %.

8. Установлено антивирусное, действие изученных иммуностимуляторов. Циркон проявляет более высокую антивирусную активность (снижение экстинкции образцов по вирусам АБРУ, АСЬЭУ и АрМУ соответственно на 77 %, 89 % и 194 % по сравнению с контролем) в отличие от препарата рибав-экстра (снижение по тем же вирусам на 14 %, 13 % и 21 %).

9. Препараты рибав-экстра и циркон положительно влияют на продуктивность деревьев большинства изученных сортов груши, увеличивая число плодов соответственно на 36-93 % и 53-272 % по сравнению с необработанными деревьями. Максимальный эффект на большинстве сортов достигается при использовании данных препаратов в концентрации 0,1 мл/л.

10. Себестоимость тестирования одного образца на вирус зависит от метода диагностики. В структуре затрат наибольшие суммы приходятся на зарплату, амортизацию лабораторного оборудования и расходные материалы. Затраты на тестирование образца методом ОТ-ПЦР составляют 510-546 руб., методом ИФА — 352 руб.

11. Применение препаратов рибав-экстра и циркон при выращивании груши способствует увеличению рентабельности производства плодов в среднем на 92 %.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

1. Усовершенствованные методы иммуноферментного анализа и полимеразной цепной реакции рекомендуется использовать в лабораториях вирусологии для тестирования груши на латентные вирусы.

2. При тестировании методом ИФА для повышения достоверности получаемых результатов следует отбирать образцы листьев у основания и в средней части побега. При быстром протекании ферментативной реакции на заключительном этапе ИФА необходимо осуществлять изменение направления фотометрии путем переворота микроплаты на 180° и определения средней арифметической из двух показаний.

3. ОТ-ПЦР рекомендуется выполнять в соответствии с модифицированной нами методикой экстракции РНК, включающей применение гидроксипроизводного бензойной кислоты на этапе гомогенизации растительного материала в количестве 20-30 мг/образец и сорбцию вирусных частиц на препарате силика.

4. Перед закладкой маточных насаждений груши необходимо проводить диагностику посадочного материала на латентные вирусы методами ИФА и ПЦР.

5. При выращивании насаждений груши с целью повышения их продуктивности рекомендуется применять иммуностимуляторы рибав-экстра и циркон в концентрации ОД мл/л в фазу бутонизации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Саунина, Ирина Ивановна, 2009 год

1. Абрамова, И.Т. Электронная микроскопия возбудителя оспы слив / И.Т. Абрамова, И.С. Литвиненко, Ю.И. Помазков // Защита растений от вредителей и болезней- Сб. науч. трудов ЛСХИ, 1971- Т.156 С.113-115.

2. Андреева, В.А. Фермент пероксидаза. Участие в защитном механизме растений / В.А. Андреева // Москва: Наука, 1988 С. 128.

3. Беликов, С.И. Молекулярно-генетические подходы к изучению РНК-содержащих вирусов / С.И. Беликов // Автореф. дис.докт. биол. наук-Иркутск, 2000.-С.41.

4. Белошапкина, О.О. Защита земляники в питомнике высших репродукций / 0.0. Белошапкина, Л.В. Безобразнова // Защита и карантин растений-2001.— №9 С.42-43.

5. Белошапкина, О.О. Система оздоровления земляники садовой от вирусов / О.О. Белошапкина//Дисс. докт. с.-х. наук.-М., 2006 370 с.

6. Вартапетян, А.Б. Полимеразная цепная реакция / А.Б. Вартапетян // Молекулярная биология-М.: Наука. 1991-Т.25 -вып. 4.-С.926-933.

7. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и разработка мер борьбы с ними в Молдавской ССР / Т.Д. Вердеревская // Автореф. дисс. доктора биол. наук-Кишинев, 1973. С. 42.

8. Вердеревская, Т.Д. Система оздоровления плодовых культур от вирусных и микоплазменных заболеваний / Т.Д. Вердеревская, X. Кеглер // Интенсификация садоводства и виноградорства Кишинев, 1981- С. 53-57.

9. Вердеревский, Д.Д. Хронические болезни плодовых культур и винограда / Д.Д. Вердеревский, Т.Д. Вердеревская // Кишинев: Картя молдовенясэ, 1967.- С.27.

10. Вердеревская, Т.Д. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда в Молдавии / Т.Д. Вердеревская, В.Г. Маринеску // Кишинев, Штиинца, 1985.-С. 311.

11. Гиббс, А. Основы вирусологии растений / А. Гиббс, Б. Харрисон // М.: Мир, 1978.-С. 34-37.

12. Гнутова, Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений / Р.В. Гнутова // М.: Наука, 1993.-С. 301.

13. Гусейнов, И.Г. Мозаика яблони в Азербайджане / И.Г. Гусейнов // Защита растений 1975.- №10 - С. 55.

14. Доспехов, Б. А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // М.: Агропром-издат.-1985.-351 с.

15. Дорожкина, Л.А. Применение циркона на виноградниках / Л.А. Дорожкина // Тез. докл. науч.-практ. конф. «Применение препарата циркон в производстве сельскохозяйственной продукции», 14 апр. 2004 г-М., 2004.— С. 33-34.

16. Душустина, К.К. Селекция груши / К.К. Душустина // Кишинев, 1979.-196 с.

17. Ефимова, H.B. Новые сорта груши / Н.В. Ефимова, B.C. Гиричев // Садоводство и виноградарство 2005. - №5. - С. 28-29.

18. Каталог мировой коллекции ВИР / Груша (источник хозяйственно-ценных признаков для использования в селекции) // Л.: ВИР, вып. 588.-1991- С. 90.

19. Каширская, Н.Я. Циркон и повышение устойчивости плодово-ягодных культур к грибным болезням / Н.Я. Каширская // Тез. докл. 6 межд. конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях».- М., 2001- С. 244-245.

20. Косаковская, О.И. Серологический метод изучения неповирусов плодовых культур и винограда / О.И. Косаковская // Автореф. дис. канд. с.-х. наук: 06.01.11.- Самохваловичи, Минская обл.- 1981 22 с.

21. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук // М.: Мир, 1984.- 432 с.

22. Малеванная, H.H. Препарат циркон иммуномодулятор нового типа / H.H. Малеванная // Тез. докл. науч.- практ. конф. «Применение препарата циркон в производстве сельскохозяйственной продукции», 14 апр. 2004 г.— М., 2004.-С. 17-20.

23. Медведев, И.А. Оптимизация способов размножения и защиты роз от вредителей в условиях Москвы и Московской области / И.А. Медведев // Автореф. дис. канд. с.-х. н-Мичуринск, 2006.-22 с.

24. Мерцалова, О.С. Механическая передача одного из вирусов яблони / О.С. Мерцалова // Материалы науч. конференции молодых ученых.- Л., 1967.-С.24—25.

25. Мишина, А.П. Мозаика и розеточность яблони (этиология, патогенез) / А.П. Мишина// Автореф. дисс. канд. с/х. наук. -М., 1974 22 с.

26. ПауновисЬ, С. Проучаванье неких изолата вируса хлоротичне лисне нетаво-сти ja6yKe / С. ПауновисЬ // Зборник Радова Полвопривредног факултета. — 1990. № 594. - С.201 - 213.

27. Помазков, Ю.И. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне / Ю.И. Помазков // Автореф. дисс. доктора с.-х. наук. М., 1975.- 34 с.

28. Прусакова, Л.Д. Регуляторы роста растений с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами / Л.Д. Прусакова, H.H. Малеванная, С.Л.Белопухов, В.В. Вакуленко // Агрохимия 2005- №11.- С. 76-86.

29. ПЦР 2002,- http://molbiol.ru

30. Семина, Н.П. Изучение видового состава и распространённости вирусных инфекций на яблоне в ЦЧЗ. Пути повышения устойчивости садоводства / Н.П. Семина// Сб. науч. трудов ВНИИС им. И.В. Мичурина. -Мичуринск-1998.-С. 93-97.

31. Семина, Н.П. К вопросу о роли «латентных» вирусов яблони в явлении несовместимости / Н.П. Семина, Т.Ф. Бивол // Вирусные, микоплазменные ибактериальные болезни плодовых культур и винограда в Молдавии. — Кишинев, 1980.-С.26-38.

32. Семина, Н.П. Производство безвирусного посадочного материала яблони в Центрально Черноземной зоне / Н.П. Семина, Е.М. Цуканова // Молодые ученые - садоводству России. Тезисы докладов Всеросийского совещания. -М., ВСТИСП. - 1995. - С. 115 - 117.

33. Трофимец, Л.Н. Классификация фитопатогенных вирусов / Л.Н. Трофимец // Защита растений. 1988.- № 3 - С.22-24.

34. Тимошин, С.И. Хабаровские груши / С.И.Тимошин // Хабаровск, 1983.- С. 113.

35. Туз, A.C. Генофонд груши Советского Союза и его использование в селекции / A.C. Туз // Научные труды МОСВИР. Майкоп - 1974- вып. 8 — 120 с.

36. Тулеуов, Ж. Т. Вирусные заболевания яблони и разработка мер борьбы с ними в зонах плодоводства Казахской ССР / Ж.Т. Тулеуов // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. Алма - Ата, 1982. - С. 22.

37. Тулеуов, Ж.Т. Получение безвирусного посадочного материала яблони / Ж. Т. Тулеуов // Плодоовощное хозяйство.-1986.-№ 10.-С. 15-17.

38. Цубера, Л.В. Хемотерапия вирусов плодовых и ягодных растений в комбинации с культурой изолированных апексов / Л.В. Цубера // Автореф.дис. канд. с.-х. наук. -М., 1998.-22 с.

39. Шмыгля, В.А. Методы диагностики вирусов в селекции и семеноводстве картофеля / В.А. Шмыгля // Методические указания для АПК.- М 1987.-27 с.

40. Babovic, M.V. Appearance and distribution of chlorotic leaf spot virus on different apple cultivars / M.V. Babovic, G.P. Delibasic // Acta Horticulturae. -1986-№ 193. -P.81 88.

41. Bar-Joseph, M. The Closteroviruses: a distinct group of elongated plant viruses / M. Bar-Joseph, S.M. Garnsey, D. Consalves // Advances Vims Res. 1979 -Vol.25-P.93 -168.

42. Barbara, M. Detection of strains of apple chlorotic leafspot vims by F (ab)2 -based in derect ELISA / M.Barbara, M.F. Clark // Acta Horticulturae. 1986 -№193.-P. 297-304.

43. Cameron, H.R. Effect of viruses on deciduous fruit trees / H.R. Cameron // Hort. Sci. 1977. - Vol. 12.-№ 5. -P.484-487.

44. Campbell, A.I. Virus diseases of fruit trees: II Latent vims in apple varieties and rootstocks / A.I. Campbell //Ann. Rep. Long. Ashton Agr. Hort. Res. Stn. 1961. — P.73 —76.

45. Clark, M.F. The detection of plum pox and other viruses in woody plants by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) / M.F. Clark, A.N. Adams, J.M. Thresh, R. Casper // Acta Hort.- 1976.- № 67.- P.51-57.

46. Clark, M.F. Characterization of the microplate of enzyme — linked immunosorbent assay for detection of plant viruses / M.F. Clark, A.N. Adams // J.Gen.Virol. 1977. - Vol. 34. - P. 475-483.

47. Clever, M. Ergebnisse einer Leistingsprufung zwischen virusfreihe nicht virusfreihe Kernobstsorten / M. Clever, R. Stehr // Mitt Obstbauversuchringes Alten Landes.- 1996.- Vol.5.- № 6. P. 236-246.

48. Coffin, R.S. The enteroviruses, capilloviruses and other similar viruses; a short revive /R.S. Coffin, R.H. Coutts//Virology.- 1993.-Vol. 174.-P. 1475-1483.

49. Cropley, R. Comparison of some apple latent viruses / R. Cropley // Ann. appl. Biol. 1968 - Vol.61 №3. -P.361 -372.

50. Demeke, T. The effects of plant polysacharide and buffer additives on PCR / T. Demeke, R.P. Adams // Biotechniques. 1992. - Vol. 12. - P.332 - 334.

51. Desvignes, J.C. Use of heat treatment and cross protection to identify some specific fruit tree virus diseases / J.C. Desvignes // Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung.- 1980.- Vol. 15, № 1-4.-P. 371-374.

52. Desvignes, J.C. Different diseases caused by the chlorotic leaf spot virus on the fruit trees / J.C. Desvignes, R. Boye // Acta Hort.- 1989.- № 235.- P.31-38.

53. Desvignes, J.C. Quick detection of the principal apple and pear virus diseases / J.C. Desvignes, R. Boye, D. Cornaggia, N. Grasseau // Acta Horticulture. 1992 - № 309. - P.377 - 384.

54. Detienne, G. Use and versatility of the immunoenzymatic ELISA procedure in the detection of different strains of apple chlorotic leaf spot virus / G. Detienne, R. Delibos, J. Dunes //Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung. 1980. - Vol. 15.-№ 1-4. -P. 39-45.

55. Erlich, H.A. Polymerase chain reaction / H.A. Erlich // J. Clin. Immunol-1989.- 9. -P.437-447.

56. Fidan, U. Indexing of apple trees for apple mosaic virus, apple chlorotic leaf spot virus and apple stem grooving virus by ELISA / U. Fidan // J. Tur. Phytopathol -1994. Vol. 23.-№ 3. -P.127 - 132.

57. Flegg, C.L. The detection of apple chlorotic leafspot virus by modified procedureof enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / C.L. Flegg, M.F. Clark // Ann. Appl. Biol.-1979.-V. 91.-№ l.-P. 61-65.

58. Francki, R.I.B. Classifikation and nomenclature of viruses. 5-th report of the Int. Committee on Taxonomy of viruses / R.I.B. Francki, C.M. Fauquet, D.L. Knudson, F. Brawn // Arch.Viral.-l 991.-Supple 2.- 120 p.

59. Fuchs, E. Serological detection of apple chlorotic leaf spot virus (CLSV) and apple stem grooving virus (SGV) in apple trees / E. Fuchs // Acta Phytopath. Acad. Sei. Hung. 1980. - Vol. 15,- № 1 - 4. - P.69 - 73.

60. Fuchs, E. Untersuchungen zum serologischen nachweis mechanisch ubertragbarer viren des Kernobstes /E. Fuchs //Tag.-Ber. Acad. Landwirtsch-1980 -№ 184 — P. 453^160.

61. Fuchs, E. Vergleich verschiedener serologischet Methoden zum Nachweis des stammfurchungs viren des Apfels (SGV) und des chlorotischen blattfleckungs -virus des Apfels (CLSV) / E. Fuchs // Arch. Gartenbau. 1983. - Vol. 31.- № 5. — P.237 —245.

62. Fulton, R.W. Serology of viruses causing cherry necrotic ringspot, plum line pattern, rose mosaic / R.W. Fulton // Phytopathology. 1968. - V. 58. - P. 635638.

63. Gilmer, R.M. Latent viruses of apple. III. Indexing with Chenopodium quinoa / R.M. Gilmer, G.I. Mink // Search agriculture. 1971. - Vol. 1.- № 10. - P. 15 -21.

64. Hansen, A.J. Plant disease diagnosis present status and futhure prospects / A.J. Hansen, R.L. Wick // Adv. Plant. Pathol. 1993. - Vol. 10. - P. 65- 126.

65. Henson, J.M. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis / J.M.Henson, R. French // Ann. Rev. Phytopath. 1993.-№31.-P. 81-109.

66. Janecova, M. Vusledky testu ELISA pri zjistovani pritomnosti viru zlabkovitosti kmene jablone (ASGV) ve 24 izolatech ASGV separovanuch termoterapii / M. Janecova, Z. Pluhar // Zahradnictvi. 1987. - R. 14 - № 2. - S.86 - 91.

67. Karesova, R. Zkusenosti s testem ELISA viru poritivinch stromu jabloni / R. Karesova, L. Svobodova, F. Paprstein // Ved. Prace Ovocnarske. 2000. - № 14. -S. 59-66.

68. Kegler, H. Ein latent Virus in deutschen Apfel Sorten und Unterlagen / H. Kegler //Phytop. Zeitschrift. 1961. - Vol. 42.-P. 379 -400.

69. Kinard, G.R. Detection of apple chlorotic leaf spot and apple stem grooving viruses using RT-PCR / G.R. Kinard, S.W. Scott, O.W .Barnett // Plant Dis 80, 1996.-616-621.

70. Kirby, M.J. Comparison of a bioassay and laboratory assays for apple stem grooving virus / M.J. Kirby, C.M. Guise, A.N. Adams // 18th Intern. Symp. Virus and Virus-like discarders of temperate fruit crops, England. 2000 - P.54

71. Kirkpatrick, H.C. A mechanically transmissible virus latent in apple / H.C. Kirkpatrick, R.C. Lindner // Phytopathology.- 1964.-Vol. 54,-P. 229-232.

72. Koganezawa, H. A new type of elongated virus isolated from apple trees . containing the stem pitting agent / H. Koganezawa, H. Yanase // Plant.Dis1990,-Vol. 74 № 8.-P. 610-614.

73. Komorowska, B. Amplification of the coat protein gene of Apple stem pitting virus (ASPV) / B. Komorowska, T. Malinowski, B. Zavadzka // Phytopath. Polonica.- 1999.- Vol. 17/-№ l.-P. 49-59.

74. Korschineck, I. A PCR membrane spot assay for the detection of plum pox virus RNA in bark of infected trees / I. Korschineck, G. Himmker, R. Sagl, H. Steinkellerer, H.W.D. Katinger//J. Virol. Methods.- 1991.-V. 31.-P. 139-146.

75. Kristensen, H.R. Distribution of virus and virus like diseases of fruit trees (surveys 1965 -1985) / H.R. Kristensen // Acta Horticulture.- 1986.- № 193. -P.373 -384.

76. Kristensen, H.R. Apple mosaic virus strain interference plants and strains / H.R. Kristensen, A. Thomsen // Phytopath. Mediterranea. 1963. - Vol. 2- № 3. -P.100-103.

77. Kryczynski, S. Virus- infection status of some apple propagative material plantations in Poland / S. Kryczynski, M. S. Szyndel, E. Padych Cichal, M. Glowacki // Phytopathol. Polonica Poznan.- 1995. -№ 10 (22). -P.75 - 84.

78. Kummert, J. Detection of apple chlorotic leaf spot virus and apple stem grooving virus by RT-PCR and JC-RT-PCR / J. Kummert, G. Ruffland, D. Colinet, P. Lepoivre // Med. Fac. Landbouw. Univ. Gent. 1995,- Vol. 60.- № 2.- P. 277 -287.

79. Legrand, G. Utilization of indirect enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses / G. Legrand // Med. Fac. Rijksuniv. Gent. 1986. -Vol.51.-№ 2.-P.783-789.

80. Leone, G. Back transmission of a virus associated with apple stem pitting and pear vein yellows from Nicotiana occidentalis to apple and pear / G. Leone, J.L. Lindner, G. Jordedijk, F.A. van der Meer // Acta Hort.-1995.- № 386.-P.72-77.

81. Leone, G. Symptoms on apple and pears indicators after back transmission from

82. Nicotiana occidentalis confirm the identity of Apple stem pitting virus with Pear vein yellows virus / G. Leone, J.L. Lindner, F.A. van der Meer, C.D. Schoen // ActaHort.- 1998.-№ 472.-P.61-65.

83. Lister, R.M. Apple stem grooving virus / R.M. Lister // CMJ/AAB Descriptions of Plant Viruses. 1970.-№ 31. - P. 5.

84. Lister, R.M. The purification, characterization and serology of filamentous apple viruses / RM. Lister // Proceeding XIII th European Symp. Fruit Tree Virus Diseases, Bordeaux.- 1970. P. 365 - 371.

85. Lister, R.M. Apple chlorotic leaf spot virus / R.M. Lister // CMI/AAB Description of Plant Viruses 1970- № 30-P. 4.

86. Lopez, M.M. Innovative tools for detection of plant pathogenic viruses and bacteria / M.M. Lopez, E. Bertolini, A. Olmos, P. Caruso, M.T. Gorris, P. Llop, R. Penyalver, M. Cambra // Int Microbiol.- 2003. V. 6.- P. 233-243.

87. Mackenzie, D.J. Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcription polymerase chain reaction / D.J. Mackenzie, M.A. Melean, S. Mukeyi, M. Geen // Plant Disease. 1997. - Vol. 81 -P. 222-226.

88. Machita, J. Reactions of the Malus hope hens is to the inoculation of causal viruses of apple top working disease / J. Machita // Bull. Aomori Apple Exp. Sth. -1995.-№28.-P. 77-91.

89. Magome, H. Molecular variability of the genomes of Capiloviruses from apple, Japanese pear, European pear, and citrus trees / H. Magome, N. Yoshikawa, T. Takahashi, T. Jto, T. Miqakawa // Phytopathol. 1997. - Vol.87.- № 4. - P. 389 -396.

90. Marinho, V.L. Detection of apple stem grooving virus in dormant apple trees with crude extracts as templates for one-step RT-PCR / V.L. Marinho, J. Kummert, G. Raffard, D. Colinet // Plant Disease. 1998. - Vol. 82 - № 7. -P.785 - 790.

91. Martelli, G.P. Foveavirus, a new plant virus genus / G.P. Martelli, W. Jelkmann //Arch. Virol.- 1988.-Vol. 143.-№ 6.-P. 1245-1249.

92. Martelli, G.P. Trichovirus, a new genus of plant viruses / G.P. Martelli, T. Candresse, S. Namba//Arch. Virology.-1994.- Vol. 134.-P. 451-455.

93. Martelli, G.P. Classification and nomenclature of plant viruses: state of the art /

94. G.P. Martelli//Plant Dis.-1992.-Vol. 76.-P. 436-441.

95. Martelli, G.P. Vitivirus, a new plant virus genus / G.P. Martelli, A. Minafra, P. Saldarelli // Arch. Virology.-1997.-Vol. 142.-P. 1929-1932.

96. Minoiu, N. Diagnosticul unor virusuri latente le mar prin technica ELISA lu forfataza / N. Minoiu, K. Pattantyus, E. Cardei, M. Hatman, E. Zemcic // ICPP Patesti-LucrariStiintifice.-1995.-Vol. 18.-P. 317-323.

97. Milicic, D. Important plant virus diseases in Yugoslavia / D. Milicic // Zecz. Probl. Post. Nauk Roln. 1980. - № 244. - P. 9 - 24.

98. Murphy, F.A. Virus Taxonomy; 6th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / F.A. Murphy, C.M. Fauguet, D.H. Bishop, S.A. Ghabrial, A.W. Sarvis, G.P. Martelli, M.A. Mago, M.D. Summers // Arch. Virol. 1995. -suppl. 10.

99. Nemchinov, L. PCR-detection of apple stem pitting virus from pome fruit hosts and sequence variability among viral isolates / L. Nemchinov, A. Hadidi, F. Faggioli // Acta Hort.- 1998.- № 472,- P. 67-73.

100. Novacky, A. Peroxidase isozymes in virus-infected plants/ Novacky A., HamptomR.E. //Phytopathology. 1968. -V. 58,-№ 3.-P. 301-305.

101. Paunovich, S. Double-stranded RNA associated with fruit deformation of quince / S. Paunovich // Acta Hort.- 1995.- № 386,- P. 45-50.

102. Paunovic, S. Relationship between quince fruit deformation virus and some pome fruit viruses / S. Paunovic, M. Rancovich // Acta Hort.- 1998 № 472.-P. 125-133.

103. Paunovic, S. Characterization of a virus associated with Pear stone pit in cv. Wuttemberg / S. Paunovic, V. Maksimovic, M. Rancovic, S. Radovich // J. Phytopath.- 1999.-Vol. 147.-№ 11-12.-P. 695-700.

104. Polak, J. Diagnosis and distribution of apple chlorotic leaf spot virus in pomefruits in the Czech Republik / J. Polak, J. Zieglerova, J. Bouma // Zahradnictvi -1997. -R. 24.- № 3. S. 89 - 94.

105. Real-Time PCR- 2002., http://www.lytech.ru/Inform/pcrmethod.htm

106. Reynolds, J.E. Comparison of flowering crab apple varieties for fast detection of a common latent viruses in apples / J.E. Reynolds // Plant Dis. Rep 1962 - Vol. 46.-№4.-P. 243-245.

107. Rosner, A. Evaluating the use of immunocapture and sap-dilution PCR for the detection of Prunus necrotic ringspot virus / A. Rosner, Y. Shiboleth, S. Spiegel, L. Krisbai, M. Kolber//ActaHort. 1998. -№ 472. -P. 227-233.

108. Rowhani, A. Development of a detection system for viruses of woody plants based on PCR analysis of immobilized virions / A. Rowhani, M.A. Maningas, L.S. Lile, S.D. Daubert, D. A. Galino // Phytopath. 1995.- № 85. - P. 347-352.

109. Roy, A.S. Plum pox situation in Europe / A.S. Roy, J.M. Smith // Bulletin OEPP/EPPOBulletin. 1994. - Vol. 24 .-P. 515-523.

110. Saksena, K.N. Purification and properties of apple chlorotic leaf spot virus / K.N. Saksena, G.I. Mink//Phytopathology.-1969.-Vol. 59.-P.84-88.

111. Schwarz, K. Detection and characterization of European apple stem pitting virus isolates of apple and pear by PCR and partial sequence analysis / K. Schwarz, W. Jelkmann // Acta Hort.- 1998.- № 472,- P. 75-85.

112. Sequeira, C.A. Studies on a virus causing stem grooving and graft-union abnormalies in Virginia crab apple / O.A. Sequeira // Annal. appl. Biol. 1967. -Vol.60.-№ 1.-P. 59-66.

113. Sequeira, C.A. Application of latex fluctuation serological testing to apple viruses / C.A. Sequeira, R.M. Lister // Phytopathology. 1969. - Vol.59.- № 4. -P. 572-574.

114. Semancice, J.S. Partial purification of mechanically transmissible virus associated with tatter leaf of citrus / J.S. Semancice, L.G. Waethers // Phytopathology.-1965.-Vol. 55.-P. 1354- 1358.

115. Simons, T.J. Metabolic changes associated with systemic induced resistance to tobacco mosaic virus in Samsun NN tobacco // Phytopathology. 1971. - V. 613.-P. 293-300.

116. Sweet, J.B. Virus Diseases of some ornamental and indigenous trees an Britain / J.B. Sweet // Acta Hort.- 1976. № 5. - P.83-92.

117. Takahashi, T. Apple stem grooving virus isolated fromJapanese apricot (Prunus mumi) imported from China / T. Takahashi, N. Saito, M. Geto, A. Kawai, S. Namba, S. Jamashita // Res. Bull. Plant Prot Serv. Japan. 1990. - № 26 - P. 15 -21.

118. Thomas, H.Z. Virus diseases of apple / H.Z. Thomas // Hilgaria. 1961- Vol. 31.-№ 13—P. 435 -457.

119. Thomsen, A. Micropropagation and plant health / A. Thomsen // Combined Proceedings Int. Plant Propagators Society.- 1992.-Vol. 42.-P. 180-182.

120. Tomary, K. A proposal concerning agricultural pesticides in the twenty-first centuri: antiviral agent for plants / K. Tomary // Jap. Pest. Inf. 1987.- Vol. 50-P. 13-15.

121. Torrance, L. Development in serological methods to detect and identify plant viruses / L. Torrance // Plant Cell. Tissue and Organ Culture. 1998. - Vol. 52. -P. 27-32.

122. Torres, M. A. Reactive oxygen species signaling in response to pathogens/ M. A. Torres, D.G. J. Jonathan, and L. D. Jeffery // Phytopatology.- 1990.- V. 128.-№3.-P. 191-202.

123. Uyemoto, J.K. Apple stem grooving virus: propagating host and purification /

124. J.K. Uyemoto, R.M. Gilmer // Ann appl. Biol. 1971. - Vol. 69. - P. 17 - 21.

125. Varvery, C. Construction and use of a cloned cDNA probe for the detection of plum pox virus in plants / C. Varvery, M. Ravelonandro, J. Dunez // Phytopathology.- 1987.-Vol. 11.- P. 1221-1224.

126. Varvery, C. Use of 32P-labeled transcribed RNA probe for dot hybridization of plum pox virus / C. Varvery, T. Candresse, M. Cuqusi, M. Ravelonandro, J. Dunez //Phytopathology.-1988,-Vol. 78.-P. 1280-1283.

127. Valentines, M.C. Specific roles of enzymatic browning and lignification in apple disease resistance / M.C. Valentines, Vilaplana R., Torres R., Usall J., Larrigaudi'ere C. // Postharvest Biology and Technology 2005. - V. 36. - P. 227-234.

128. Voiler, A. The detection of viruses by enzyme-linked immunosorbent assay (ELJSA) / A. Voiler, A.Bartlett, D.E. Bidwill, M.F. Clark, A.N. Agams // J. Gen. Virol. 1976. - Vol. 33.-№ 1. - P. 165 - 167.

129. Waterworth, H. Dark green epinasty of chenopodium quinoa, a syndrome induced by a virus latent in apple and pear / H. Waterworth, R.M. Gilmer // Phytopathology. 1993. - Vol. 5. - P. 334 - 338.

130. Wetzel, T. Nucleotide sequence of the 3'-terminal region of the RNA of the El Amar strain of plum pox potyvirus / T. Wetzel, T. Candresse, M. Ravelonandro, R.P. Delbos, H. Mazyad, A.E. Aboul-Ata, J. Dunez // J. Gen. Virol 1991.- Vol. 72.-P. 1741-1746.

131. Wetzel, T. A highly sensitive immunocapture polymerase chain reaction method for plum pox potyvirus detection / T. Wetzel, T. Candresse, G. MacQuaire, M. Ravelonandro, J. Dunez //J. Virol. Methods. 1992. - Vol. 39. - P. 27-37.

132. Wood, G.A. Elimination of latent apple virus srough growth and yield improvements. // The Orchardist of NZ 1974-Vol. 47 - № 6. - P. 173.

133. Yanase, H. Correlation of pear necrotic spot with pear vein yellows and apple stem pitting and a flexious filamentous virus associated with them / H. Yanase, H. Koganezawa, P.R. Friedlund // Acta Hort.-1989 № 235.- P. 157-158.

134. Yoshikawa, N. Properties of RNAs and proteins of apple stem grooving and apple chlorotic leaf spot viruses / N. Yoshikawa, T. Takahahi // J. Gen. Virol. -1988. Vol. 69. - P. 241-245.

135. Yoshikawa, N. The nucleotide sequence of stem grooving capillovirus genome / N. Yoshikawa, E. Sasaki, M. Kato, T. Takahashi // Virology. 1992. - Vol. 191. -P.98- 105.i ,

136. Zawadzka, B. Observations and preliminary experiments on fruit tree virus diseases in Poland / B. Zawadzka // Zastita Bilja.-1965.- Vol. 16.- P. 513-516.

137. Zawadzka, B. Summer hosts of plum aphids as possible host plants of plum pox (sharka) virus / B. Zawadzka, S. Smolarz // Zesz. Prob. Post. Nauk Roln.- 1978-Vol. 214.-P.43-49.

138. Zawadzka, B. Observations and preliminary experiments on fruit tree virus diseases in Poland / B. Zawadzka // Zastita Bilja -1982,- Vol. 16.- P. 513-516.

139. Zhang, Y. Effects of apple stem grooving virus (ASGV) on growth and peroxidase activity of pear seedlings / Y. Zhang // Chinese journal of applied and environmental biology.- 2003,- V. 9.- Part 6 P. 655-656.